Обнаружение нуклеиновой кислоты Mycoplasma pneumoniae и гена лекарственной устойчивости

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает быстрый и надежный способ выявления инфекций , вызванных Mycoplasma pneumoniae, и выявления устойчивости к антибиотикам. Это помогает практикующим врачам быстрее выбирать правильные методы лечения, улучшая уход за пациентами с пневмонией и способствуя более эффективному использованию антибиотиков

Аннотация

Mycoplasma pneumoniae (Mp) представляет собой один из наиболее распространенных патогенов, ответственных за внебольничную пневмонию (ВП) в педиатрических популяциях. Обнаружение генов резистентности Mycoplasma pneumoniae обеспечивает надежную техническую поддержку и теоретическую основу для точной клинической диагностики и лечения инфекций МП. Точная диагностика и оценка лекарственной устойчивости при Mp-инфекции имеют важное значение для клинического лечения. Общие методы обнаружения Mycoplasma pneumoniae включают бактериологическое исследование, обнаружение антител и молекулярно-биологические анализы. Бактериологическое исследование МП является золотым стандартом для диагностики, но требует определенной среды, занимает много времени и имеет низкую чувствительность. Широко используется обнаружение Mp на основе антител; Однако ложноотрицательные результаты могут возникать на ранней стадии инфекции. Обнаружение на основе молекулярной биологии обеспечивает быстрый оборот, низкий риск заражения, высокую чувствительность, высокую специфичность и не ограничено временем сбора образца или иммунным статусом. Таким образом, он был признан новым золотым стандартом диагностики инфекции Mycoplasma pneumoniae . Макролидные препараты являются препаратами первого выбора для лечения Mp-инфекции у детей. Однако с широким использованием макролидов при инфекциях дыхательных путей у детей заболеваемость лекарственно-устойчивой инфекцией Mycoplasma pneumoniae увеличивается. У пациентов, инфицированных устойчивыми штаммами, наблюдается значительно более высокая продолжительность лихорадки, длительная госпитализация и длительная лихорадка после введения по сравнению с пациентами, инфицированными чувствительными штаммами. На сегодняшний день идентифицированы сайты мутаций 2063, 2064, 2067 и 2617. В Китае точечные мутации были зарегистрированы только в положениях 2063 и 2064, при этом наиболее распространенной является замена A-to-G в положении 2063. Для этих участков полимеразная цепная реакция (ПЦР) в сочетании с технологией флуоресцентных зондов была использована для обнаружения нуклеиновых кислот и мутаций лекарственной устойчивости Mycoplasma pneumoniae в образцах мокроты человека. Обнаружение генов резистентности Mycoplasma pneumoniae обеспечивает важнейшую техническую поддержку и теоретическую основу для точной диагностики и эффективного лечения Mp-инфекции.

Введение

Mycoplasma pneumoniae (Mp) – самый мелкий патогенный микроорганизм, способный к самостоятельному выживанию, расположенный на промежуточном положении между бактериями и вирусами. Он распространяется в основном воздушно-капельным путем или аэрозолями и является вторым по распространенности патогеном, ассоциированным с внебольничной пневмонией (ВП) у детей¹, на долю которого приходится от 20% до 40% случаев ВП². Mp проявляет врожденную устойчивость к β-лактамным антибиотикам, таким как пенициллин и цефалоспорины, из-за отсутствия клеточной стенки, на которую эти антибиотики нацелены, препятствуя синтезу клеточной стенки. Основными терапевтическими методами лечения Mp-инфекций являются препараты, препятствующие синтезу белка, в том числе макролиды и тетрациклины, а также фармацевтические препараты, препятствующие репликации ДНК, такие как тетрациклины и фторхинолоны^. Таким образом, быстрая лабораторная идентификация Mp имеет важное значение для информирования о разумном применении антибиотиков. Современные методы лабораторного обнаружения Мп включают выделение и культивирование, обнаружение антигенов, антител и методы генетической диагностики.

В качестве традиционного метода выявления изоляция и бактериологическое исследование продолжают оставаться окончательным стандартом диагностики инфекции Mycoplasma pneumoniae . Kashyap et al. отметили, что культивирование Mp из мазков из горла или образцов мокроты является надежным диагностическим методом⁶. Этот подход наталкивается на значительные препятствия, такие как строгие культурные предпосылки Мп, длительные периоды культивирования и, как правило, низкие показатели положительного обнаружения, которые ограничивают его рутинное клиническое использование. Обнаружение Mp-антигена зависит от Mp-специфических антител. Miyashita et al. использовали моноклональные антитела из различных штаммов Mp в качестве покрывающих агентов в сэндвиче с двойными антителами ИФА и оценили их эффективность с помощью ПЦР⁷. Полученные результаты не выявили существенной разницы между этими двумя методологиями. Однако потребность в высокоспецифичных моноклональных антителах с высоким титром ограничивает широкое применение этого метода.

После Mp-инфекции иммунная система вырабатывает специфические антитела IgM и IgG. Антитела IgM обычно становятся обнаруживаемыми в течение 1 недели после заражения и достигают своего пика через 3-4 недели, что делает их ценными диагностическими индикаторами для ранней инфекции. Однако на начальных стадиях могут возникать ложноотрицательные результаты из-за снижения уровня антител⁸. И наоборот, антитела IgG проявляются позже и обычно указывают на предыдущую инфекцию ^9,10. Серологическое обнаружение МП классифицируется на неспецифические и специфические анализы на антитела. В то время как тесты на неспецифические антитела просты в применении, их специфичность ограничена, поскольку инфекции от других патогенов, включая риккетсию и аденовирус, также могут повышать уровень холодового агглютинина, что приводит к ложноположительным результатам. Специфические анализы антител включают в себя тест фиксации комплемента, тест на агглютинацию частиц, тест на непрямую гемагглютинацию, непрямой иммунофлуоресцентный анализ и иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА широко используется в Китае благодаря своей устоявшейся технологии и коммерческой доступности, обеспечивая высокую чувствительность и простоту эксплуатации, тем самым выступая в качестве практичного и надежного метода диагностики Мп-инфекций в рутинной^{клинической практике.}

Флуоресцентная количественная ПЦР в реальном времени отличается быстрым временем обработки, повышенной специфичностью, высокой чувствительностью и отсутствием перекрестной реактивности. Этот метод идентифицирует Mp ДНК в образцах мокроты, мазка из горла или жидкости бронхиального лаважа и требует от 1 до 100 нг ДНК на одну реакцию. Определение проводили с помощью ПЦР-инструмента в реальном времени. Матрица ДНК подвергается денатурации при более высоких температурах с последующим отжигом праймера и гибридизацией флуоресцентного зонда. Технология амплификации генов позволяет воспроизводить фрагменты нуклеиновых кислот в чрезвычайно низких концентрациях до миллионов копий за короткий промежуток времени, достигая чувствительности обнаружения ≥10 КОЕ/мл¹². По сравнению с обычной ПЦР, флуоресцентная количественная ПЦР в реальном времени снижает риск заражения, обеспечивая при этом высокую пропускную способность и автоматизацию анализа. Таким образом, он стал предпочтительным методом прямого обнаружения Mp в клинической практике¹³. Из-за его повышенной чувствительности необходимы строгие меры для предотвращения заражения, которое может привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам.

В клиническом лечении макролиды являются основным терапевтическим вмешательством при Mycoplasma pneumoniae pneumonia (MPP). Чрезмерное использование и неправильное применение антибиотиков оказали селективное давление, что привело к появлению макролид-резистентных Mp. Эта стойкость вносит существенный вклад в тугоплавкость МПП. Устойчивость к макролидам у Mycoplasma pneumoniae заметно повышена в Восточной Азии, особенно в Китае и Японии, в то время как в Европе и Соединенных Штатах наблюдаются относительно более низкие показатели резистентности. Педиатрические пациенты обычно демонстрируют повышенные показатели резистентности по сравнению со взрослыми, что требует повышенного внимания¹⁴. С 2000 года заболеваемость инфекциями, вызванными Mycoplasma pneumoniae (MRMPI), значительно возросла в глобальном масштабе, особенно в Восточной Азии. В Китае штаммы MRMPI составляют от 69% до 95% случаев¹⁵, что в значительной степени способствует тяжелому заболеванию, неэффективности лечения, осложнениям и долгосрочным последствиям. Исследования показывают, что мутации в гене 23S рРНК ингибируют связывание макролидов с сайтами-мишенями, что приводит к снижению эффективности лекарств. Локусы частых мутаций охватывают позиции 2063, 2064, 2067 и 2617. В Китае мутации были выявлены исключительно в позициях 2063 и 2064 ^16,17. Исследование 2016 года показало, что уровень устойчивости к макролидам в Пекине, Харбине, Шанхае и Синьцзяне варьировался от 66,7% до 86,7%, в то время как в Нанкине этот показатель был ниже — 20%¹⁸. Штаммы, устойчивые к макролидам, появились в различных регионах, при этом показатели устойчивости следующие: 8,3%-9,8% во Франции, 3,0%-3,6% в Германии, 8,2% в США, 0,9%-2,9% в Дании, 12,1% в Канаде, 20% в Италии, 22% в Израиле, 8% в Испании и 9,3% в Великобритании 19,20,21,22,23,24,25,26^{, 27}. Эта тенденция подчеркивает распространение устойчивости к макролидам во всем мире. В 2008 году Hindley et al. сообщили о 46 случаях устойчивых к макролидам Mycoplasma pneumoniae, из которых 40 случаев демонстрировали мутацию A2063G, один случай представлял мутацию A2063C и пять случаев демонстрировали мутацию A2064G²⁸. Сопоставимые мутации резистентности были выявлены в Японии и Соединенных Штатах, причем первичные мутации произошли в положениях 2063 и 2064²⁹. Исследования показывают связь между сайтами мутаций и фенотипами лекарственной устойчивости: мутация A2063G придает устойчивость к 14-членным макролидам (ML), мутация A2064G придает устойчивость как 14-, так и 16-членному ML, C2617G придает устойчивость 14- и 15-членному ML, а мутация A2067G придает устойчивость 16-членному ML³⁰. Мониторинг резистентности к Mp имеет решающее значение для раннего выявления лекарственно-устойчивых инфекций и для информирования о выборе клинического лечения. Исследования показали, что тестирование чувствительности к противомикробным препаратам in vitro может предсказать клиническую эффективность препарата³¹. В 2011 году Американский институт клинических и лабораторных стандартов обнародовал руководящие принципы, пропагандирующие метод микроразведения для определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) для оценки устойчивости к макролидам³². Тем не менее, определение МПК может занять несколько недель, что ограничивает его клиническую полезность в назначении антибиотикотерапии в реальном времени.

Секвенирование по Сэнгеру — это прямой метод идентификации мутаций в гене 23S рРНК Mp. Этот метод использует флуоресцентно меченные нуклеотиды и электрофоретический анализ для установления последовательностей ДНК, облегчая идентификацию генетических вариаций Mp. Секвенирование по Сэнгеру, хотя и способно одновременно идентифицировать множественные мутации и количественно оценить соотношения резистентных и восприимчивых штаммов, является трудоемким и занимает много времени, что ограничивает его клиническую полезность^33,34. Напротив, пиросеквенирование обеспечивает более точную оценку вариаций последовательности ДНК путем идентификации высвобождения пирофосфата во время включения нуклеотидов. Этот метод позволяет идентифицировать штаммы MRMPI и количественно оценить соотношения резистентных и восприимчивых штаммов в клинических образцах с большей точностью, чем секвенирование по Сэнгеру. Кроме того, пиросеквенирование позволяет осуществлять продольный мониторинг отдельных пациентов, что позволяет в режиме реального времени оценивать развивающуюся резистентность и информировать о^{модификациях лечения}. Однако его клиническое применение ограничено необходимостью специализированного оборудования, квалифицированного персонала и длительной продолжительности обработки.

На основе анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP) гена P1, Mp классифицируется на два типа: тип I (далее разделен на пять подтипов: 1a-1e) и тип II (далее разделен на три подтипа: 2a-2c). Этот тест может выявить 8 подтипов гена Mycoplasma pneumoniae³⁵. Этот метод способствует качественной идентификации мутаций Mycoplasma pneumoniae и устойчивости к макролидам (сайты мутаций 23S рРНК 2063 (A:G) и 2064 (A:G)) в образцах мокроты у детей, обеспечивая быстрый и простой дополнительный диагностический инструмент для микоплазменных инфекций и надзора за устойчивостью к антибиотикам.

Протокол

Все протоколы исследований были рассмотрены и одобрены Комитетом по медицинской этике Народной больницы провинции Хэюань (Approval No. YXYJLL-LW2025001). Все пациенты предоставили письменное информированное согласие до начала участия.

1. Сбор образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность при соблюдении асептической техники во время отбора проб.

1. Соберите образцы мокроты пациента или пациента с подозрением на это. Получите образцы в течение 3 дней от начала заболевания у пациента.
2. Проинструктируйте пациента прополоскать рот водой, глубоко дышать, задерживать дыхание на 5 с и выдыхать постепенно.
3. Попросите пациента еще раз глубоко выдохнуть, попытаться вывести мокроту, поместить ее в специальный пластиковый стаканчик и закрыть крышку. Мокрота должна быть своевременно доставлена в клиническую лабораторию при комнатной температуре (ЛТ). Храните образцы при температуре 2-8 °C в холодильнике.

2. Приготовление реагентов для амплификации

1. В зоне подготовки реагентов в лаборатории ПЦР разморозьте буфер, праймерный щуп и воду из набора при температуре 4 °C после извлечения их из морозильной камеры при температуре -20 °C. Удалите фермент, аккуратно перемешайте его, встряхивая, а затем центрифугируйте при 1006 x g в течение 10 с.
2. Извлеките стерильную центрифужную пробирку, не содержащую нуклеаз, пометьте ее и подготовьте реакционную систему для каждого индивидуума, как показано в таблице 1. Общее количество реакций ПЦР должно быть равно сумме образцов: один слабый положительный контроль качества, один продукт контроля качества W и один отрицательный контроль экстракции.
3. Определите количество каждого реагента, поместите его в центрифужную пробирку подходящего размера, тщательно перемешайте и кратковременно центрифугируйте на низкой скорости. Диспонируйте по 20 мкл реагента в каждую реакционную пробирку ПЦР и переместите его в зону обработки образца.

3. Обработка образца

1. Обработайте 1 мл образцов мокроты 2 мл буфера для расщепления мокроты, тщательно перемешайте вихрем и инкубируйте в течение 30 минут до полного разжижения.
2. В зависимости от количества образца добавьте 5 мкл внутреннего стандарта последовательно в^1-ю и^7-ю колонки экстракционного планшета для нуклеиновых кислот, после чего последовательно добавьте 200 мкл сжиженных образцов, нормального физиологического раствора и слабого положительного контроля качества ММ.
3. Извлечение планшета для экстракции нуклеиновых кислот с помощью автоматизированного прибора для экстракции нуклеиновых кислот. Экстрагированные нуклеиновые кислоты добавляют после проведения последующих анализов в столбцах 6 и 12 экстракционного планшета.
4. Добавление образца: В зоне подготовки образцов лаборатории ПЦР добавьте экстрагированную нуклеиновую кислоту в^6-ю и^12-ю колонки экстракционной пластины. Затем 5,0 мкл подготовленного образца нуклеиновой кислоты переносят в реакционную пробирку для ПЦР, которая содержит реакционную смесь ПЦР (включая пробу, сильный и слабый положительные контроля качества, контроль качества W и отрицательный контроль экстракции).
5. Закрепите жидкость в реакционной пробирке ПЦР и немедленно выполните центрифугирование, чтобы убедиться, что жидкость правильно герметизирована и лишена пузырьков.

4. Усиление

1. Вставьте реакционную пробирку в флуоресцентный ПЦР-детектор и настройте параметры цикла следующим образом, как показано в таблице 2.
2. Регистрируйте флуоресцентные сигналы в FAM (мутация 2063 или 2064 A:G), VIC (Mycoplasma pneumoniae) и CY5 (внутренний стандарт) при сборе данных при температуре 64 °C.

5. Анализ данных

Примечание: В этом исследовании использовалась количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР), с репрезентативными результатами, указывающими на мутации, связанные с устойчивостью к A:G, в положениях 2063 или 2064 Mycoplasma pneumoniae. Пациенты с положительным результатом теста должны избегать макролидных антибиотиков в клиническом лечении.

1. После реакции прибор автономно анализирует и архивирует результаты. Убедитесь, что гены-мишени для отрицательного контроля демонстрируют флуоресценцию FAM Ct ≥ 35,33 и флуоресценцию VIC Ct ≥ 35,01, в то время как гены-мишени для контроля качества W демонстрируют флуоресценцию FAM Ct ≥ 35,33 и флуоресценцию VIC Ct ≥ 35,01. Значения Ct для флуоресценции FAM и VIC в слабоположительных продуктах контроля качества варьировались от 29,00 до 34,00.
2. Как правило, значение Ct по внутреннему стандарту составляет ≤ 35,00. Если наблюдается характерная кривая амплификации S, но внутренний стандарт не амплифицируется из-за повышенной концентрации гена-мишени, сообщите об этом непосредственно как о положительном образце или повторно оцените образец с помощью 10-кратного градиентного разведения.
3. Классифицировать образец, демонстрирующий UNDECT или отсутствие типичной кривой амплификации S-типа, как отрицательный.
4. Образцы считаются отрицательными при флуоресценции FAM (мутация 2063 или 2064 A:G) Ct ≥ 35,33, флуоресценции VIC (Mycoplasma pneumoniae) Ct ≥ 35,01 или при отсутствии типичной кривой амплификации S-типа. Сэмплы считаются положительными, когда их значение Ct соответствует таблице 3 и демонстрирует характерную кривую амплификации S-типа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты обнаружения проб зависят от качества сбора, обработки, транспортировки и сохранения проб; Любые ошибки могут привести к ложноотрицательным результатам. Неспособность контролировать перекрестное загрязнение во время обработки образцов может привести к ложноположительным результатам.

Результаты

После разжижения, экстракции нуклеиновых кислот и флуоресцентной ПЦР-амплификации образцов мокроты начальное значение, конечное значение и пороговое значение исходного уровня были изменены после анализа кривой амплификации. Начальное значение было равно 3, а конечное значение — 20.

Репрезентативные результаты этого эксперимента были положительными для нуклеиновой кислоты Mp, а мутация резистентности A : G произошла в 2063 или 20...

Обсуждение

ПЦР и ее производные демонстрируют более высокую чувствительность и специфичность по сравнению с серологическими методами в идентификации, типировании и выявлении лекарственной устойчивости Mycoplasma pneumoniae (MP). Кроме того, методы на основе ПЦР обеспечивают простоту эксплуатации и снижение затрат, что делает их жизнеспособной альтернативой рутинной клинической диагностике³⁶. Mp является заметным патогеном, ассоциированным с CAP, и демонстрирует знач...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Автоматизированный прибор для экстракции нуклеиновых кислот	Гуанчжоу Да'ань Джин Ко., Лтд.	Смарт 32
Советы по фильтрам	Корпорация «Коринг Лайф Сайенс Ко., Лтд.»	29822001	0-10&микро; L
Советы по фильтрам	Корпорация «Коринг Лайф Сайенс Ко., Лтд.»	03023001	1-50&микро; L
Советы по фильтрам	Корпорация «Коринг Лайф Сайенс Ко., Лтд.»	05623001	5-300&микро; L
Микротрубки	Корпорация «Коринг Лайф Сайенс Ко., Лтд.»	14124934	1,5 мл
Mycoplasma pneumoniae набор для обнаружения мутаций нуклеиновых кислот и устойчивости к лекарствам (метод флуоресцентной ПЦР)	Цзянсу Моле Биотехнология Ко., Лтд.	20241111
Реагент для экстракции ядерных кислот (метод магнитных шариков)	Шэнсян Биотехнология Ко., Лтд.	Г24004
ПЦР-пробирки	DN Biotech(Гонконг)  Ко., Лтд.	6121003	0,2 мл
Флуоресцентный прибор для ПЦР в реальном времени	БИО-РАД	КФХ96