Ослабление нейронального ферроптоза путем ингибирования RKIP после спонтанного внутримозгового кровоизлияния посредством активации пути NRF2/HO-1

Спонтанное внутримозговое кровоизлияние (ВМК) — это цереброваскулярное состояние, характеризующееся кровотечением из-за внутричерепного повреждения сосудов, некроза и разрыва сосудов, обычно поражающее базальные ганглии и представляющее собой основной подтип геморрагического инсульта¹. Смертность среди пациентов с диагнозом ВМК составляет примерно 50%, и значительная часть выживших испытывает тяжелую потерю независимости². Современные варианты лечения спонтанной ВМК ограничены, при этом не было показано, что существующие методы лечения значительно снижают смертность или заметно улучшают неврологические исходы после ВМК.

Ферроптоз, железозависимая форма запрограммированной клеточной смерти, определяется перекисным окислением липидов, накоплением ионов железа и истощением глутатиона, что отличает его от других форм запрограммированной клеточной смерти в генетическом, морфологическом и биологическом^{терминах}. Все больше доказательств подчеркивают роль нейронального ферроптоза в патологии ВМК. Белок-ингибитор раф-киназы (RKIP), также известный как фосфатидилэтаноламин-связывающий белок 1 (PEBP1), участвует в развитии нервной системы и образует комплекс 15LOX/PEBP1 путем его связывания с 15-липоксигеназой (15LOX), ключевым регулятором ферроптоза⁴. Тем не менее, специфическая роль и механизмы RKIP в ферроптозе, связанном с прогрессированием спонтанной ВМЗ, остаются неизученными.

В этом исследовании изучались антиферроптозные эффекты ингибирования RKIP на нейроны, демонстрируя, что ингибирование экспрессии RKIP может подавлять нейрональный ферроптоз после ВМК, потенциально за счет активации связанного с ядерным фактором E2 фактора 2/гемоксигеназы-1 (NRF2/HO-1). Эти результаты имеют важное значение для разработки новых терапевтических стратегий, направленных на патогенез ВМК.

Культивирование клеток PC12
Клеточную линию PC12 размножали в Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) в питательной среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина, с рутинным поддержанием в стандартных условиях культивирования (37 °C, 5%_CO2 в увлажненной атмосфере). Для проведения экспериментов адгезивные клетки наносили на культуральные сосуды и позволяли им размножаться до достижения почти сливающихся монослоев (примерно 90% покрытия поверхности). Клеточную диссоциацию осуществляли с помощью ферментативной обработки с использованием 0,25% раствора трипсина-ЭДТА с последующим проведением трех последовательных циклов субкультивирования для обеспечения стабильности популяции. Впоследствии обработанные ячейки были выделены для последующего экспериментального применения и аналитических оценок.

Анализ жизнеспособности клеток
Жизнеспособность клеток оценивали для оценки цитотоксичности гемина и локостатина на клетках PC12 в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем набора для анализа. Клетки PC12 равномерно засеивали в 96-луночные планшеты и культивировали гемином или локостатином в течение 24 ч. После промывки фосфатно-соевым буфером (PBS) клетки инкубировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% раствор соли тетразолия, в течение 90 мин при 37 °С. Затем значения оптической плотности (OD) были измерены на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов.

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР)
Общую РНК экстрагировали из клеток PC12 с помощью реагента для экстракции РНК. Сначала образец гомогенизировали в экстракционном реагенте, обеспечив тщательный лизис. В смесь добавляли хлороформ, энергично встряхивали и центрифугировали для разделения фаз (12 000 × г, 15 мин, 4 °C). Собирали водную фазу, содержащую РНК, и осаждали РНК путем добавления изопропанола (водная фаза: iPrOH = 1:1) и инкубации при комнатной температуре. Центрифугирование проводили для гранулирования РНК (12 000 × г, 10 мин, 4 °C), добавляли 1 мл 70% этанола для удаления примесей, и, наконец, гранулу РНК растворяли в воде, не содержащей РНКазы, для хранения при -80 °C. Матрицы комплементарной ДНК (кДНК) были получены путем обратной транскрипции с помощью RT Master Mix. Полученные матрицы затем разбавляли в соотношении 1:5 и подвергали количественной ПЦР в реальном времени на приборе для ПЦР в реальном времени. Каждый образец амплифицировали в трех экземплярах, а относительное количество продукта ПЦР усредняли. Используемые праймеры перечислены в таблице 1, где β-актин служит в качестве гена-домохозяйки. Относительную концентрацию мРНК определяли по формуле E = 2^−ΔΔCt, а для каждой реакции регистрировали значение критического порогового цикла (СТ).

Внутриклеточные анализы активных форм кислорода (АФК) и гидропероксида липидов (ПОЛ)
Уровни АФК и ПОЛ определяли с помощью проточной цитометрии. Клетки PC12 обрабатывали гемином (80 мкМ), локостатином (5 мкМ) и ML385 (5 мкМ) в течение 24 ч и 3 раза промывали PBS в посуде. Затем клетки инкубировали при 37 °C с 5%_CO2 в течение 40 мин в присутствии 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата (DCFH-DA), зонда ROS, и BODIPY 581/591 C11, зонда LPO. После промывки PBS для удаления избытка зондов интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии. Для всех образцов была применена последовательная стратегия стробирования: сначала клетки были закрыты на FSC-A против SSC-A для исключения мусора, затем отдельные клетки были отобраны с помощью FSC-A и FSC-H. Неокрашенные клетки и клетки, обработанные только гемином, использовали в качестве отрицательного и положительного контроля для установления компенсации флуоресценции и ворот. Данные были проанализированы с помощью связанного программного обеспечения.

Экстракция белка и вестерн-блоттинг
Экстракция общего белка
Надосадочная жидкость обработанных клеток PC12 была отброшена, после чего последовали три промывки ледяным PBS. Клетки собирали с помощью трипсина и центрифугировали при 200 × г в течение 5 минут. После удаления надосадочной жидкости клеточную гранулу гомогенизировали в холодном буфере для лизиса методом радиоиммунопреципитации (RIPA), содержащем 10% ингибитора протеазы и 10% ингибитора фосфатазы. После 30-минутной инкубации на льду лизат центрифугировали при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °С. Прозрачную надосадочную жидкость смешивали с загрузочным буфером (4:1) и нагревали при 95 °C в течение 5 минут для денатурации белков. Образцы белка хранили при -80 °C для последующего использования.

Вестерн-блоттинг
Белки разделяли с помощью SDS-PAGE с использованием стекирующего геля и разрешающего геля, а образцы загружали в лунки. Электрофорез проводили при напряжении 80 В для стекирующего геля и 120 В для разрешающего геля. Белки переносили на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) (предварительно активированную в метаноле в течение 1 мин) с помощью системы переноса при постоянном токе 300 мА в течение 1-2 ч. Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком в TBST в течение 2 ч при комнатной температуре для предотвращения неспецифического связывания. После трех промываний TBST (по 10 мин каждая) мембрану инкубировали в течение ночи при 4 °C со следующими первичными антителами, разведенными в TBST: Rabbit anti-ACSL4 (1:1,000), Rabbit anti-GPX4 (1:1,000), Rabbit anti-HO-1 (1:2,000), Rabbit anti-NRF2 (1:1,000), Rabbit anti-RKIP (1:1,500) и Mouse anti-β-actin (1:5,000). Мембрану промывали в течение 3 х 10 мин TBST и инкубировали с HRP-конъюгированными вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре: HRP-меченый козий антимышиный IgG (1:1000), меченный HRP козий антикролик IgG (1:1000). После дополнительных промываний TBST в течение 3 x 5 минут сигналы белков визуализировали с помощью набора ECL Western Blot Kit и количественно оценивали с помощью программного обеспечения ImageJ.

Иммунофлуоресцентное окрашивание
Клетки высевали на покровные листы, предварительно помещенные в культивальные планшеты, и давали им прилипнуть. После экспериментальных обработок надосадочная жидкость была отброшена, а клетки были промыты 3 раза PBS. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в течение 15 мин при комнатной температуре, после чего проводили три промывки PBS. Впоследствии клетки проникали 0,1% Triton X-100 в течение 10 мин при комнатной температуре и 3 раза промывали PBS. Неспецифическое связывание блокировали путем инкубации с 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в течение 30 мин при комнатной температуре. Первичные антитела применяли в течение ночи при 4 °C: Rabbit anti-HO-1 (1:500), Rabbit anti-NRF2 (1:500). После трех промывок PBS на следующий день клетки инкубировали с флуоресцентными вторичными антителами в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре: Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). После окончательной промывки образцы монтировали с монтажной средой, содержащей 4',6-диамидино-2'-фенилиндол (DAPI) для ядерного противозакрашивания. Изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

Статистический анализ
Данные измерений выражали в виде среднего значения ± стандартного отклонения (S.D.). Для анализа были взяты количественные данные, представляющие собой результаты трех независимых повторных анализов. Для сравнения между двумя группами был применен t-критерий, в то время как для сравнения между несколькими группами использовался односторонний дисперсионный анализ (ANOVA), за которым последовал апостериорный тест Тьюки для множественных сравнений. p-значение < 0,05 считалось статистически значимым.

Гемин может вызывать повреждение плазматической мембраны, поэтому его часто используют для создания моделей клеток ВМК in vitro. В этом исследовании изучали влияние обработки гемином в различных концентрациях и продолжительности на жизнеспособность клеток PC12, одновременно анализируя динамику экспрессии белка RKIP в соответствующих экспериментальных условиях с помощью вестерн-блоттинга (рис. 1A). Жизнеспособность клеток была значительно снижена при концентрациях гемина 60 мкМ или выше (рис. 1B), и это снижение происходило дозозависимым образом с увеличением концентраций. Кроме того, цитотоксичность гемина зависела от времени, достигая максимума в течение первых 24 часов после воздействия, а затем постепенно снижаясь (рис. 1C). Вестерн-блоттинг показал, что экспрессия белка RKIP была значительно повышена при 80 мкМ гемине (рис. 1D,E) и достигла своего пика через 24 ч после стимуляции (рис. 1F,G). Основываясь на этих результатах, мы выбрали 80 мкМ гемин и 24-часовой период лечения для последующих экспериментов, чтобы выяснить основные механизмы и сигнальные пути.

Чтобы исследовать роль RKIP в нейрональном ферроптозе после ВМК, мы использовали локостатин для ингибирования экспрессии RKIP (рис. 2A). Локостатин связывается с RKIP, нарушает взаимодействие между RKIP и киназой Raf-1 и GRK2, тем самым ослабляя функциональные эффекты RKIP для достижения ингибирующей цели. В этом исследовании мы использовали локостатин в качестве ингибитора RKIP для изучения связанных с ним молекулярных механизмов 5,6. Цитотоксичность локостатина впервые оценивали в диапазоне концентраций 0-40 мкМ с помощью анализа жизнеспособности. Результаты показали отсутствие значимой цитотоксичности при ≤5 мкМ, что позволило установить безопасный диапазон концентраций для последующих экспериментов (рис. 2B). Кроме того, мы подтвердили ингибирующее влияние 5 мкМ локостатина на экспрессию RKIP с помощью вестерн-блоттинга и анализов ОТ-кПЦР. Вестерн-блот показал значительное снижение уровня белка RKIP (рис. 2C,D), в то время как ОТ-кПЦР показал снижение уровня мРНК RKIP (рис. 2E). Эти результаты демонстрируют эффективность 5 мкМ локостатина в ингибировании экспрессии RKIP.

В этом исследовании была разработана модель внутримозгового кровоизлияния (ВМК) в гемин-индуцированные клетки PC12 для определения регуляторной функции RKIP при ферроптозе. Наши результаты показали, что стимуляция гемина значительно увеличивает экспрессию RKIP при одновременном снижении жизнеспособности клеток. Основываясь на существующих исследованиях, мы предположили, что индуцированная гемином гибель клеток может быть тесно связана с ферроптозом, процессом перекисного окисления липидов, катализируемым железом, отмеченным патологическим отложением железа в клеточных компартментах и повышенным уровнем активных форм кислорода (АФК).

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между RKIP и ферроптозом мы обрабатывали гемин-стимулированные клетки PC12 локостатином. Вестерн-блоттинг показал, что экспрессия длинноцепочечной ацил-КоА-синтетазы семейства 4 (ACSL4), ключевого фактора ферроптоза, была значительно увеличена в группе, получавшей гемин (рис. 3A, B). ACSL4 является важнейшим геном, способствующим смерти в ферроптозе, способствуя этерификации полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и тем самым повышая клеточную чувствительность к ферроптозу. Кроме того, экспрессия глутатионпероксидазы 4 (GPX4), ингибитора ферроптоза, была значительно снижена в группе, получавшей гемин (рис. 3A, C). GPX4 является ключевым регулятором ферроптоза, который ингибирует перекисное окисление липидов путем удаления перекисей липидов, тем самым защищая клетки от окислительного повреждения. Эти результаты указывают на то, что стимуляция гемина увеличивает ферроптоз в клетках PC12. Однако, по сравнению с группой гемина, фармакологическое ингибирование RKIP локостатином обратило эти изменения вспять, что указывает на то, что подавление экспрессии RKIP ингибировало ферроптоз в клетках PC12. Последовательные результаты наблюдались и на уровне мРНК (рис. 3 F,G).

Мы также исследовали экспрессию молекул пути, связанных с ферроптозом. Было показано, что путь NRF2/HO-1 играет ключевую роль в ферроптозе. Исходя из этого, мы предположили, что ингибирование RKIP может подавлять нейрональный ферроптоз путем активации пути NRF2/HO-1 . Чтобы проверить эту гипотезу, мы сначала стимулировали клетки PC12 гемином и обнаружили, что экспрессия белка NRF2 была значительно увеличена (рис. 3A, D), наряду со значительным увеличением его последующего продукта HO-1 (рис. 3A, E). Эти данные свидетельствуют о том, что гемин-индуцированный ферроптоз активирует путь NRF2/HO-1 , который оказывает защитное действие на клетки. Являясь основным регулятором клеточных антиоксидантных реакций, NRF2 усиливает клеточную антиоксидантную способность, регулируя экспрессию нижележащих генов-мишеней, таких как HO-1, тем самым ингибируя ферроптоз. Впоследствии, лечение локостатином еще больше увеличило экспрессию HO-1 и NRF2 по сравнению с группой, получавшей гемин (рис. 3A, D). Последовательные результаты также наблюдались на уровне мРНК (рис. 3I, J), что еще раз подтверждает, что ингибирование RKIP подавляет ферроптоз в гемин-стимулированных клетках PC12 путем модуляции NRF2 и его нижележащей молекулы HO-1.

Примечательно, что другой ингибитор ферроптоза, тяжелая цепь ферритина 1 (FTH1), показал повышенную экспрессию при стимуляции гемина, и его экспрессия была еще более повышена при ингибировании RKIP (Рисунок 3H). FTH1 является основным компонентом ферритина, отвечающим за хранение и окисление железа. Он преобразует ионы железа в более стабильную форму, снижая окислительный стресс, вызванный свободным железом. Повышение регуляции FTH1 при стимуляции гемина может представлять собой компенсаторную реакцию на перегрузку железом, поскольку клетки пытаются сохранить избыток железа, чтобы избежать окислительного повреждения. Дальнейшее увеличение экспрессии FTH1 при лечении локостатином предполагает снижение уровня свободного железа и повышение антиоксидантной способности, что подтверждает вывод о том, что ингибирование RKIP подавляет гемин-индуцированный ферроптоз в клетках PC12.

Уровни АФК и гидропероксида липидов (ПОЛ) в клетках PC12 оценивали с помощью проточной цитометрии. Лечение гемином приводило к значительному повышению уровней АФК и ПОЛ, которое было обращено вспять после введения локостатина. Это открытие указывает на то, что ингибирование RKIP может помочь подавить ферроптоз в нейронах (рис. 4A-D).

Таким образом, гемин-индуцированная доза и зависящее от времени снижение жизнеспособности клеток PC12 совпало с заметным повышением уровня белка RKIP . Этот процесс был связан с повышенным уровнем ACSL4 и подавленной экспрессией GPX4. В то же время наблюдалось значительное накопление маркеров окислительного повреждения (АФК и ПОЛ), которые служат основными факторами ферроптоза, опосредуя окислительный стресс и разрушение липидной мембраны. Кроме того, повышение регуляции белка FTH1 , накапливающего железо, предполагает компенсаторную клеточную реакцию на перегрузку железом. Важно отметить, что фармакологическое ингибирование RKIP локостатином обратило вспять эти изменения и аннулировало гемин-индуцированный ферроптоз (рис. 1, рис. 2, рис. 3 и рис. 4).

Результаты анализов показали, что ингибирование RKIP эффективно подавляет нейрональный ферроптоз и регулирует экспрессию NRF2/HO-1 . Учитывая, что путь NRF2/HO-1 играет ключевую роль в ферроптозе, была выдвинута гипотеза, что подавление нейронального ферроптоза, наблюдаемое при ингибировании RKIP , может быть опосредовано за счет стимуляции этого пути. Чтобы проверить эту гипотезу, были проведены дальнейшие эксперименты (рис. 5А).

Был использован ML385, селективный ингибитор NRF2, и результаты подтвердили, что экспрессия NRF2 эффективно снижается как на уровне белка (Рисунок 5B, C), так и на уровне мРНК (Рисунок 5E). Кроме того, была оценена экспрессия HO-1, молекулы, расположенной ниже по потоку NRF2. Полученные данные показали, что, хотя ингибирование RKIP первоначально увеличивало экспрессию HO-1, этот эффект был обращен вспять после ингибирования NRF2 (рис. 5B, D, F). Эти результаты свидетельствуют о том, что ингибирование RKIP может ослаблять нейрональный ферроптоз путем активации пути NRF2/HO-1. Иммунофлуоресцентное окрашивание также подтвердило эти выводы, поскольку ядерная транслокация NRF2 наблюдалась после ингибирования RKIP (рис. 5G-J).

Впоследствии мы дополнительно оценили уровни АФК и ПОЛ в клетках РС12 с помощью проточной цитометрии. Мы обнаружили, что ингибирование NRF2 ML385 обращает вспять индуцированное локостатином снижение уровней АФК и ПОЛ. Эти данные свидетельствуют о том, что подавление RKIP может ингибировать нейрональный ферроптоз путем активации пути NRF2/HO-1 (рис. 6A-D).

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Наборы данных, полученные в ходе текущего исследования, включены в Дополнительный файл 1.

Рисунок 1: Построение модели заболевания in vitro с помощью гемин-стимулированных клеток PC12. (A) Схематическая иллюстрация конструкции модели гемин-стимулированной клетки PC12. (B) Определение оптимальной концентрации гемина для создания in vitro модели внутримозгового кровоизлияния с использованием анализа жизнеспособности клеток для оценки жизнеспособности клеток. (C) Анализ жизнеспособности клеток с клетками PC12, обработанными гемином (80 мкМ) в различные моменты времени. (Д,Э) Репрезентативный вестерн-блоттинг и количественная оценка уровней экспрессии RKIP в клетках PC12, обработанных различными концентрациями гемина (24 ч). (Ф,Г) Репрезентативный вестерн-блоттинг и количественная оценка уровней экспрессии RKIP в клетках PC12, подвергшихся воздействию гемина (80 мкМ) в течение различной продолжительности времени. Все данные представлены в виде среднего ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Сокращения: CCK8 = набор для подсчета клеток-8; WB = вестерн-блот; RKIP = белок-ингибитор Raf-киназы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Влияние локостатина на экспрессию RKIP в клетках PC12, стимулируемых гемином. (А) Схематическая иллюстрация экспериментальной процедуры лечения локостатином в клетках PC12. (B) Клеточную жизнеспособность клеток PC12, обработанных различными концентрациями локостатина, оценивали с помощью анализа жизнеспособности клеток. (К,Г) Экспрессию RKIP в клетках PC12, обработанных гемином (80 мкМ, 24 ч) и/или локостатином (5 мкМ, 24 ч), анализировали с помощью вестерн-блоттинга, с демонстрацией репрезентативных блоттингов и статистического анализа. (E) Экспрессию мРНК RKIP в клетках PC12, обработанных гемином (80 мкМ, 24 ч) и/или локостатином (5 мкМ, 24 ч), измеряли с помощью ОТ-кПЦР. Все данные представлены в виде среднего ± SD (n=3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Сокращения: CCK8 = набор для подсчета клеток-8; WB = вестерн-блот; ОТ-кПЦР = количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; АФК = активные формы кислорода; ЛПО = перекисное окисление липидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Влияние ингибирования RKIP на ферроптоз в клетках PC12 после стимуляции гемином. (A-E) Вестерн-блоттинг изменений экспрессии белков в ACSL4, GPX4, NRF2 и HO-1 в клетках PC12, обработанных гемином (80 мкМ, 24 ч) и/или локостатином (5 мкМ, 24 ч). (Ф-Дж) Анализ ОТ-кПЦР уровней экспрессии мРНК ACSL4, GPX4, NRF2, HO-1 и FTH1 в клетках РС12, обработанных гемином (80 мкМ, 24 ч) и/или локостатином (5 мкМ, 24 ч). Все данные представлены в виде среднего ± SD (n=3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Сокращения: WB = вестерн-блот; ОТ-кПЦР = количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; RKIP = белок-ингибитор Raf-киназы; ACSL4 = семейство длинноцепочечных ацил-КоА-синтетаз 4; GPX4 = глутатионпероксидаза 4; NRF2 = фактор, связанный с ядерным фактором E2 2; HO-1 = гемоксигеназа-1; FTH1 = тяжелая цепь ферритина 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Влияние ингибирования RKIP на окислительный стресс в клетках PC12 после стимуляции гемином. (A,C) Анализ проточной цитометрии продукции активных форм кислорода в клетках PC12, обработанных гемином (80 мкМ, 24 ч) и/или локостатином (5 мкМ, 24 ч). (Б,Г) Анализ перекисного окисления липидов в клетках PC12, обработанных гемином (80 мкМ, 24 ч) и/или локостатином (5 мкМ, 24 ч). Все данные представлены в виде среднего ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Сокращения: АФК = активные формы кислорода; ЛПО = перекисное окисление липидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Роль NRF2 в антиферроптотических эффектах, опосредованных ингибированием RKIP. (А) Схематическое изображение экспериментальной процедуры лечения клеток PC12 в различных условиях. (Б-Г) Вестерн-блоттинг изменений экспрессии белков NRF2 и HO-1 при различных условиях лечения в клетках PC12 гемином (80 мкМ, 24 ч) и/или локостатином (5 мкМ, 24 ч) и/или ML385 (5 мкМ, 24 ч). (Э,Ж) Анализ ОТ-кПЦР уровней экспрессии мРНК NRF2 и HO-1 в клетках РС12, обработанных гемином (80 мкМ, 24 ч) и/или локостатином (5 мкМ, 24 ч) и/или ML385 (5 мкМ, 24 ч). (Г-Дж) Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии NRF2 и HO-1 и количественная оценка средней интенсивности флуоресценции в клетках PC12, обработанных гемином (80 мкМ, 24 ч) и/или локостатином (5 мкМ, 24 ч) и/или ML385 (5 мкМ, 24 ч). Масштабные линейки = 50 μм. Все данные представлены в виде среднего ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Сокращения: WB = вестерн-блот; ОТ-кПЦР = количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией; Окрашивание ПЧ = иммунофлуоресцентное окрашивание; NRF2 = фактор, связанный с ядерным фактором E2 2; HO-1 = Гемоксигеназа-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Роль NRF2 в подавлении окислительного стресса, опосредованного ингибированием RKIP.(А,В) Анализ проточной цитометрии продукции активных форм кислорода в клетках PC12 с помощью гемина (80 мкМ, 24 ч) и/или локостатина (5 мкМ, 24 ч) и/или ML385 (5 мкМ, 24 ч). (Б,Г) Анализ перекисного окисления липидов в клетках PC12, обработанных гемином (80 мкМ, 24 ч) и/или локостатином (5 мкМ, 24 ч) и/или ML385 (5 мкМ, 24 ч). Все данные представлены в виде среднего ± SD (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Сокращения: АФК = активные формы кислорода; ЛПО = перекисное окисление липидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Схематическое изображение ингибирования RKIP, ослабляющего нейрональный ферроптоз после спонтанной ВМК путем активации пути NRF2/HO-1. Наши результаты показывают, что ингибирование RKIP эффективно способствует ядерной транслокации NRF2, подавляет накопление липидов АФК и, следовательно, защищает от гемин-индуцированного ферроптоза и окислительного стресса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Праймеры для количественной обратной транскрипции-ПЦР.

Дополнительный файл 1: Исходные и обработанные количественные данные, подтверждающие первые шесть цифр, включая анализы CCK-8, вестерн-блоттинг, ОТ-кПЦР и анализы проточной цитометрии. Данные организованы по подпанелям рисунков и включают все повторяющиеся значения, используемые для статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.