Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Ослабление нейронального ферроптоза путем ингибирования RKIP после спонтанного внутримозгового кровоизлияния посредством активации пути NRF2/HO-1

486 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68511

⸱

31 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital 2 of Nantong University

В этой статье

Краткое содержание

Проведя исследования на организмах и клеточных культурах, было продемонстрировано, что ингибирование белка-ингибитора Raf-киназы (RKIP) может смягчить нейрональный ферроптоз после спонтанного внутримозгового кровоизлияния, тем самым уменьшая повреждение головного мозга. Наблюдаемая цитопротекция возникает за счет модуляции сигнальной оси NRF2/HO-1 .

Аннотация

Белок-ингибитор Raf-киназы (RKIP), основной член семейства фосфатидилэтаноламин-связывающих белков, признан за его участие в различных физиологических процессах, включая дифференцировку клеток, миграцию, клеточный цикл и апоптоз. В этом исследовании изучалась его функция в нейрональном ферроптозе после спонтанного внутримозгового кровоизлияния (ВМК) и связанные с этим механизмы. Клеточная модель спонтанной ВМК была разработана с использованием культивируемых клеток феохромоцитомы крысы (PC12), стимулированных гемином. Оценивали жизнеспособность клеток, экспрессию РНК, уровни активных форм кислорода (АФК) и гидропероксида липидов (ПОЛ). Кроме того, измеряли уровни экспрессии белка. Это исследование подтвердило, что ингибирование RKIP является нейропротекторным in vitro после ВМК. Этот эффект был связан с повышением экспрессии глутатионпероксидазы 4 (GPX4) и снижением экспрессии длинноцепочечной ацил-КоА-синтетазы семейства 4 (ACSL4), а также с уровнями АФК и ПОЛ в нейронах. Ингибирование RKIP продемонстрировало защитную роль против нейронального ферроптоза in vitro после ВМК, потенциально через активацию связанного с ядерным фактором E2 фактора 2/гемоксигеназы-1 (NRF2/HO-1). Этот механизм может дать представление о терапевтических стратегиях, нацеленных на нейрональный ферроптоз при ВМК.

Введение

Спонтанное внутримозговое кровоизлияние (ВМК) — это цереброваскулярное состояние, характеризующееся кровотечением из-за внутричерепного повреждения сосудов, некроза и разрыва сосудов, обычно поражающее базальные ганглии и представляющее собой основной подтип геморрагического инсульта1. Смертность среди пациентов с диагнозом ВМК составляет примерно 50%, и значительная часть выживших испытывает тяжелую потерю независимости2. Современные варианты лечения спонтанной ВМК ограничены, при этом не было показано, что существующие методы лечения значительно снижают смертность или заметно улучшают неврологические исходы после ВМК.

Ферроптоз, железозависимая форма запрограммированной клеточной смерти, определяется перекисным окислением липидов, накоплением ионов железа и истощением глутатиона, что отличает его от других форм запрограммированной клеточной смерти в генетическом, морфологическом и биологическомтерминах. Все больше доказательств подчеркивают роль нейронального ферроптоза в патологии ВМК. Белок-ингибитор раф-киназы (RKIP), также известный как фосфатидилэтаноламин-связывающий белок 1 (PEBP1), участвует в развитии нервной системы и образует комплекс 15LOX/PEBP1 путем его связывания с 15-липоксигеназой (15LOX), ключевым регулятором ферроптоза4. Тем не менее, специфическая роль и механизмы RKIP в ферроптозе, связанном с прогрессированием спонтанной ВМЗ, остаются неизученными.

В этом исследовании изучались антиферроптозные эффекты ингибирования RKIP на нейроны, демонстрируя, что ингибирование экспрессии RKIP может подавлять нейрональный ферроптоз после ВМК, потенциально за счет активации связанного с ядерным фактором E2 фактора 2/гемоксигеназы-1 (NRF2/HO-1). Эти результаты имеют важное значение для разработки новых терапевтических стратегий, направленных на патогенез ВМК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Культивирование клеток PC12
Клеточную линию PC12 размножали в Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) в питательной среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина, с рутинным поддержанием в стандартных условиях культивирования (37 °C, 5%CO2 в увлажненной атмосфере). Для проведения экспериментов адгезивные клетки наносили на культуральные сосуды и позволяли им размножаться до достижения почти сливающихся монослоев (примерно 90% покрытия поверхности). Клеточную диссоциацию осуществляли с помощью ферментативной обработки с использованием 0,25% раствора трипсина-ЭДТА с последующим проведением трех последовательных циклов субкультивирования для обеспечения стабильности популяции. Впоследствии обработанные ячейки были выделены для последующего экспериментального применения и аналитических оценок.

Анализ жизнеспособности клеток
Жизнеспособность клеток оценивали для оценки цитотоксичности гемина и локостатина на клетках PC12 в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем набора для анализа. Клетки PC12 равномерно засеивали в 96-луночные планшеты и культивировали гемином или локостатином в течение 24 ч. После промывки фосфатно-соевым буфером (PBS) клетки инкубировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% раствор соли тетразолия, в течение 90 мин при 37 °С. Затем значения оптической плотности (OD) были измерены на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов.

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР)
Общую РНК экстрагировали из клеток PC12 с помощью реагента для экстракции РНК. Сначала образец гомогенизировали в экстракционном реагенте, обеспечив тщательный лизис. В смесь добавляли хлороформ, энергично встряхивали и центрифугировали для разделения фаз (12 000 × г, 15 мин, 4 °C). Собирали водную фазу, содержащую РНК, и осаждали РНК путем добавления изопропанола (водная фаза: iPrOH = 1:1) и инкубации при комнатной температуре. Центрифугирование проводили для гранулирования РНК (12 000 × г, 10 мин, 4 °C), добавляли 1 мл 70% этанола для удаления примесей, и, наконец, гранулу РНК растворяли в воде, не содержащей РНКазы, для хранения при -80 °C. Матрицы комплементарной ДНК (кДНК) были получены путем обратной транскрипции с помощью RT Master Mix. Полученные матрицы затем разбавляли в соотношении 1:5 и подвергали количественной ПЦР в реальном времени на приборе для ПЦР в реальном времени. Каждый образец амплифицировали в трех экземплярах, а относительное количество продукта ПЦР усредняли. Используемые праймеры перечислены в таблице 1, где β-актин служит в качестве гена-домохозяйки. Относительную концентрацию мРНК определяли по формуле E = 2−ΔΔCt, а для каждой реакции регистрировали значение критического порогового цикла (СТ).

Внутриклеточные анализы активных форм кислорода (АФК) и гидропероксида липидов (ПОЛ)
Уровни АФК и ПОЛ определяли с помощью проточной цитометрии. Клетки PC12 обрабатывали гемином (80 мкМ), локостатином (5 мкМ) и ML385 (5 мкМ) в течение 24 ч и 3 раза промывали PBS в посуде. Затем клетки инкубировали при 37 °C с 5%CO2 в течение 40 мин в присутствии 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата (DCFH-DA), зонда ROS, и BODIPY 581/591 C11, зонда LPO. После промывки PBS для удаления избытка зондов интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии. Для всех образцов была применена последовательная стратегия стробирования: сначала клетки были закрыты на FSC-A против SSC-A для исключения мусора, затем отдельные клетки были отобраны с помощью FSC-A и FSC-H. Неокрашенные клетки и клетки, обработанные только гемином, использовали в качестве отрицательного и положительного контроля для установления компенсации флуоресценции и ворот. Данные были проанализированы с помощью связанного программного обеспечения.

Экстракция белка и вестерн-блоттинг
Экстракция общего белка
Надосадочная жидкость обработанных клеток PC12 была отброшена, после чего последовали три промывки ледяным PBS. Клетки собирали с помощью трипсина и центрифугировали при 200 × г в течение 5 минут. После удаления надосадочной жидкости клеточную гранулу гомогенизировали в холодном буфере для лизиса методом радиоиммунопреципитации (RIPA), содержащем 10% ингибитора протеазы и 10% ингибитора фосфатазы. После 30-минутной инкубации на льду лизат центрифугировали при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °С. Прозрачную надосадочную жидкость смешивали с загрузочным буфером (4:1) и нагревали при 95 °C в течение 5 минут для денатурации белков. Образцы белка хранили при -80 °C для последующего использования.

Вестерн-блоттинг
Белки разделяли с помощью SDS-PAGE с использованием стекирующего геля и разрешающего геля, а образцы загружали в лунки. Электрофорез проводили при напряжении 80 В для стекирующего геля и 120 В для разрешающего геля. Белки переносили на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) (предварительно активированную в метаноле в течение 1 мин) с помощью системы переноса при постоянном токе 300 мА в течение 1-2 ч. Мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком в TBST в течение 2 ч при комнатной температуре для предотвращения неспецифического связывания. После трех промываний TBST (по 10 мин каждая) мембрану инкубировали в течение ночи при 4 °C со следующими первичными антителами, разведенными в TBST: Rabbit anti-ACSL4 (1:1,000), Rabbit anti-GPX4 (1:1,000), Rabbit anti-HO-1 (1:2,000), Rabbit anti-NRF2 (1:1,000), Rabbit anti-RKIP (1:1,500) и Mouse anti-β-actin (1:5,000). Мембрану промывали в течение 3 х 10 мин TBST и инкубировали с HRP-конъюгированными вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре: HRP-меченый козий антимышиный IgG (1:1000), меченный HRP козий антикролик IgG (1:1000). После дополнительных промываний TBST в течение 3 x 5 минут сигналы белков визуализировали с помощью набора ECL Western Blot Kit и количественно оценивали с помощью программного обеспечения ImageJ.

Иммунофлуоресцентное окрашивание
Клетки высевали на покровные листы, предварительно помещенные в культивальные планшеты, и давали им прилипнуть. После экспериментальных обработок надосадочная жидкость была отброшена, а клетки были промыты 3 раза PBS. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в течение 15 мин при комнатной температуре, после чего проводили три промывки PBS. Впоследствии клетки проникали 0,1% Triton X-100 в течение 10 мин при комнатной температуре и 3 раза промывали PBS. Неспецифическое связывание блокировали путем инкубации с 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в течение 30 мин при комнатной температуре. Первичные антитела применяли в течение ночи при 4 °C: Rabbit anti-HO-1 (1:500), Rabbit anti-NRF2 (1:500). После трех промывок PBS на следующий день клетки инкубировали с флуоресцентными вторичными антителами в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре: Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). После окончательной промывки образцы монтировали с монтажной средой, содержащей 4',6-диамидино-2'-фенилиндол (DAPI) для ядерного противозакрашивания. Изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

Статистический анализ
Данные измерений выражали в виде среднего значения ± стандартного отклонения (S.D.). Для анализа были взяты количественные данные, представляющие собой результаты трех независимых повторных анализов. Для сравнения между двумя группами был применен t-критерий, в то время как для сравнения между несколькими группами использовался односторонний дисперсионный анализ (ANOVA), за которым последовал апостериорный тест Тьюки для множественных сравнений. p-значение < 0,05 считалось статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Гемин может вызывать повреждение плазматической мембраны, поэтому его часто используют для создания моделей клеток ВМК in vitro. В этом исследовании изучали влияние обработки гемином в различных концентрациях и продолжительности на жизнеспособность клеток PC12, одновременно анализируя динамику экспрессии белка RKIP в соответствующих экспериментальных условиях с помощью вестерн-блоттинга (рис. 1A). Жизнеспособность клеток была значительно снижена при концентрациях гемина 60 мкМ или в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании изучались эффекты и основные механизмы нокдауна RKIP на ферроптоз, индуцированный ВМК in vitro . Стимуляция клеток гемином запускает окислительный стресс, сопровождающийся избыточной генерацией АФК и ПОЛ, тем самым способствуя ферроптозу. Ингибирование эндогенной экспрессии RKIP ускоряет транслокацию высвобожденного NRF2 в ядро и связывание с элементом антиоксидантного ответа (ARE), инициируя транскрипцию нижестоящих антиоксидантных...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами от проекта Муниципальной комиссии по здравоохранению Наньтун (MS2022015) и проекта Научно-технического бюро Наньтун (JCZ2023022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 488 с маркировкой Goat Anti-Rabbit IgGBeyotime BiotechA0423
Анти-ACSL4 антителаКлеточная сигнализация38493T
Анти-GPX4 антителаКлеточная сигнализация59735S
Антитела к анти-HO-1MedChemExpressHY-P80499
Анти-NRF2 антителаКлеточная сигнализация12721T
Антитела к RKIPAbcamab76582
Анти-&бета;-актиновые антителаAbcamab179467
BeyoECL PlusBeyotime BiotechP0018M
BSANCM BiotechWB6504-100g
Набор для подсчёта клеток 8Beyotime BiotechC0037
CELLSAVINGNCM BiotechC40050
ChamQ SYBR Color qPCR мастер-миксВазимеQ411-02
ДМСОBeyotime BiotechST038
Сыворотка плода для быкаGibcoA5670801
GraphPad Prism
HeminMedChemExpressHY-19424
HiScript Q RT SuperMix для qPCR (+gDNA Wiper)ВазимеR123-01
IgG с маркировкой HRP Goat Anti-MouseТермоC31430100
IgG с маркировкой HRP Goat Anti-RabbitТермоC31460100
Набор для анализа содержания липидного пероксида (LPO)SolarbioBC5245
ЛокостатинMedChemExpressHY-W013411A
ML385MedChemExpressHY-100523
Монтаж среды?антифейдинг (с DAPI)SolarbioS2110
ОБЕЗЖИРЕННОЕ Сухое молокоSolarbioD8340
PBS (порошок?pH7.2-7.4)SolarbioP1010
PC-12ADHNanjing BioChannel BiotechnologyBC-C-RA-005
Жидкость пенициллина-стрептомицинаSolarbioP1400
PRMI-1640GibcoA1049101
Коктейль с ингибиторами протеазы и фосфатазы для общего употребления, 50xBeyotime BiotechP1045
Белковый маркерТермо26617
PVDF МиллипорRIKB43638
Набор для анализа реактивных видов кислородаSolarbioCA1410
Буфер RIPA (высокий)SolarbioR0010
Набор для быстрой подготовки геля SDS-PAGEЭпизимPG110
SDS-PAGE Буфер загрузки образцов, 5xBeyotime BiotechP0015
TritonX-100SolarbioIT9100
ТРИзолТермо15596018CN
Раствор трипсина и ЭДТА? 0,25% (без фенол-красного)SolarbioT1300

Ссылки

  1. Puy, L., et al. Intracerebral haemorrhage. Nat Rev Dis Primers. 9 (1), 14(2023).
  2. Shao, A., Zhu, Z., Li, L., Zhang, S., Zhang, J. Emerging therapeutic targets associated with the immune system in patients with intracerebral haemorrhage (ICH): from mechanisms to translation. EBioMedicine. 45, 615-623 (2019).
  3. Jiang, X., Stockwell, B. R., Conrad, M. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (4), 266-282 (2021).
  4. Wenzel, S. E., et al. PEBP1 wardens ferroptosis by enabling lipoxygenase generation of lipid death signals. Cell. 171 (3), 628-641 (2017).
  5. Beshir, A. B., Argueta, C. E., Menikarachchi, L. C., Gascón, J. A., Fenteany, G. Locostatin disrupts association of Raf kinase inhibitor protein with binding proteins by modifying a conserved histidine residue in the ligand-binding pocket. Forum Immunopathol Dis Therap. 2 (1), 47-58 (2011).
  6. Janjusevic, M., et al. a disrupter of Raf kinase inhibitor protein, inhibits extracellular matrix production, proliferation, and migration in human uterine leiomyoma and myometrial cells. Fertil Steril. 106 (6), 1530-1538 (2016).
  7. Xiao, Z., et al. Reduction of lactoferrin aggravates neuronal ferroptosis after intracerebral hemorrhagic stroke in hyperglycemic mice. Redox Biol. 50, 102256(2022).
  8. Li, Q., et al. Inhibition of neuronal ferroptosis protects hemorrhagic brain. JCI Insight. 2 (7), e90777(2017).
  9. Zhou, Z. X., et al. Withaferin A inhibits ferroptosis and protects against intracerebral hemorrhage. Neural Regen Res. 18 (6), 1308-1315 (2023).
  10. Sun, Y., Li, Q., Guo, H., He, Q. Ferroptosis and iron metabolism after intracerebral hemorrhage. Cells. 12 (1), 90(2022).
  11. Duan, L., et al. Baicalin inhibits ferroptosis in intracerebral hemorrhage. Front Pharmacol. 12, 629379(2021).
  12. Wang, Y., Wu, S., Li, Q., Sun, H., Wang, H. Pharmacological inhibition of ferroptosis as a therapeutic target for neurodegenerative diseases and strokes. Adv Sci (Wein)h. 10 (24), e2300325(2023).
  13. Dodson, M., Castro-Portuguez, R., Zhang, D. D. NRF2 plays a critical role in mitigating lipid peroxidation and ferroptosis. Redox Biol. 23, 101107(2019).
  14. Xiang, Y., Song, X., Long, D. Ferroptosis regulation through Nrf2 and implications for neurodegenerative diseases. Arch Toxicol. 98 (3), 579-615 (2024).
  15. Anandhan, A., et al. NRF2 controls iron homeostasis and ferroptosis through HERC2 and VAMP8. Sci Adv. 9 (5), eade9585(2023).
  16. Fan, Z., et al. Nrf2-Keap1 pathway promotes cell proliferation and diminishes ferroptosis. Oncogenesis. 6 (8), e371(2017).
  17. Tu, W., Wang, H., Li, S., Liu, Q., Sha, H. The anti-inflammatory and anti-oxidant mechanisms of the Keap1/Nrf2/ARE signaling pathway in chronic diseases. Aging Dis. 10 (3), 637-651 (2019).
  18. Sun, Y. Y., et al. Remote ischemic conditioning attenuates oxidative stress and inflammation via the Nrf2/HO-1 pathway in MCAO mice. Redox Biol. 66, 102852(2023).
  19. Ge, M., et al. Brg1-mediated Nrf2/HO-1 pathway activation alleviates hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Dis. 8 (6), e2841(2017).
  20. Wang, H., et al. VDR activation attenuates renal tubular epithelial cell ferroptosis by regulating Nrf2/HO-1 signaling pathway in diabetic nephropathy. Adv Sci (Weinh). 11 (10), e2305563(2024).
  21. Lin, Q., et al. Mitophagy alleviates cisplatin-induced renal tubular epithelial cell ferroptosis through ROS/HO-1/GPX4 axis. Int J Biol Sci. 19 (4), 1192-1210 (2023).
  22. Jiang, T., et al. Gastrodin protects against glutamate-induced ferroptosis in HT-22 cells through Nrf2/HO-1 signaling pathway. Toxicol In Vitro. 62, 104715(2020).
  23. Gong, F., et al. Trehalose inhibits ferroptosis via NRF2/HO-1 pathway and promotes functional recovery in mice with spinal cord injury. Aging (Albany NY). 14 (7), 3216-3232 (2022).
  24. Luo, L., et al. Astaxanthin attenuates ferroptosis via Keap1-Nrf2/HO-1 signaling pathways in LPS-induced acute lung injury. Life Sci. 311 (Pt A), 121091(2022).
  25. Zhao, J., et al. PEBP1 acts as a rheostat between prosurvival autophagy and ferroptotic death in asthmatic epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (25), 14376-14385 (2020).
  26. Wang, H., Xu, L., Tang, X., Jiang, Z., Feng, X. Lipid peroxidation-induced ferroptosis as a therapeutic target for mitigating neuronal injury and inflammation in sepsis-associated encephalopathy: insights into the hippocampal PEBP1/15-LOX/GPX4 pathway. Lipids Health Dis. 23 (1), 128(2024).
  27. Manivarma, T., et al. Membrane regulation of 15LOX-1/PEBP1 complex prompts the generation of ferroptotic signals, oxygenated PEs. Free Radic Biol Med. 208, 458-467 (2023).
  28. Huang, W., et al. Downregulation of RKIP promotes radioresistance of nasopharyngeal carcinoma by activating NRF2/NQO1 axis via downregulating miR-450b-5p. Cell Death Dis. 11 (7), 504(2020).
  29. Al-Mulla, F., Bitar, M. S., Feng, J., Park, S., Yeung, K. C. A new model for Raf kinase inhibitory protein induced chemotherapeutic resistance. PLoS One. 7 (1), e29532(2012).
  30. Zuo, H., et al. RKIP-mediated NF-κB signaling is involved in ELF-MF-mediated improvement in AD rat. Int J Med Sci. 15 (14), 1658-1666 (2018).
  31. Liu, H., et al. RKIP promotes cisplatin-induced gastric cancer cell death through NF-κB/Snail pathway. Tumour Biol. 36 (3), 1445-1453 (2015).
  32. Casper, E. The crosstalk between Nrf2 and NF-κB pathways in coronary artery disease: can it be regulated by SIRT6. Life Sci. 330, 122007(2023).
  33. Hu, B., et al. NF-κB and Keap1 interaction represses Nrf2-mediated antioxidant response in rabbit hemorrhagic disease virus infection. J Virol. 94 (10), e00016-e00020 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Путь NRF2активация HO-1клетки PC12активные формы кислородалипидные гидропероксидыэкспрессия GPX4экспрессия ACSL4
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.