Мультимодальный широкопольный микроскоп Фурье-преобразования Рамана

Краткое содержание

Широкопольный микроскоп преобразования Фурье, основанный на компактном и сверхстабильном интерферометре с двупреломлением, позволяет параллельно получать спектры для всех пикселей двумерного детектора. Подход во временной области позволяет распутывать фотолюминесценцию и рамановские сигналы, а также позволяет быстро отображивать рамановское отображение (~5 мс/пиксель) с пространственным разрешением ~1 мкм и спектральным разрешением 23 ^см-1 .

Аннотация

Рамановская микроскопия — это мощный метод для определения химического состава образца. Основной проблемой современных спонтанных рамановских микроскопов, основанных на точковом сканировании частотных областей, является получение рамановских карт больших площадей, обусловленных обычно длительным временем задержки пикселей (0,1–1 с). Микроскоп широкого поля преобразования Фурье, представленный здесь, позволяет быстро измерять расширенные образцы с пространственным разрешением ~1 мкм и спектральным разрешением ~23 см^. Он основан на ультра-стабильном и компактном двустороннем интерферометре с общим путём, добавленном вдоль пути обнаружения коммерческого микроскопа, который позволяет параллельно получать спектры для всех пикселей 2D-детектора, значительно сокращая время измерения (в 10–100 раз быстрее). Подход во временной области эффективно решает ещё одно ограничение техники частотной области — распутывание рамановского сигнала от фотолюминесцентного фона, в котором рамановый сигнал может быть зарыт. Этот протокол описывает, как выполнять гиперспектральные измерения с помощью модернизированного коммерческого микроскопа: выравнивание схемы освещения, критерии выбора параметров измерения и анализ данных для извлечения и исследования спектров.

Введение

Спектральная визуализация — это метод, предоставляющий как спектральную, так и пространственную информацию, применяемый в различных областях — от^{микроскопии 1} до дистанционного^{зондирования 2}. Мультиспектральное и гиперспектральное изображение различается на основе того, записываются ли несколько отдельных спектральных полос или непрерывный спектр для каждого пикселя 2D-сенсора. Рамановская визуализация — это особая реализация спектральной визуализации.

Рамановская рассеяющая микроскопия — это мощный метод измерения колебательных частот ν_R системы. Колебательные моды связаны с химическими связями, поэтому рамановская^{спектроскопия 3} позволяет исследовать химический состав образцов в^{биологических областях 4} и^{материаловедении 5}. В спонтанной рамановской спектроскопии образец освещается монохроматическим излучением на частоте ν₀, называемым насосом. Часть света насоса, взаимодействуя с колебательными режимами, может подвергаться неупругому рассеянию, в результате чего фотоны на частотах ν_S (ν_AS)=ν₀-(+) ν_R, где ν_R — молекулярная колебательная частота внутри образца. Рассеянный свет с низкой энергией (ν_S) называется излучением Стокса, а свет с более высокой энергией (ν_AS) — излучением анти-Стокса. В тепловом равновесии большинство молекул занимают более низкие энергетические состояния, поэтому анти-стоксовские компоненты значительно слабее, чем компоненты Стокса. По этой причине микроскопия рассеяния Рамана обычно обнаруживает фотоны Стокса. Поскольку молекулы и твёрдые тела имеют несколько колебательных режимов, рамановский спектр характеризуется чёткими полосами, которые вместе образуют уникальную химическую подпись, позволяющую идентифицировать и анализировать материалы. Основная сложность такого подхода — крайне низкое сечение спонтанного рамановского рассеяния, при этом только один из более чем 10^{фотонов из 9-10 12} проходит через этот процесс.

В стандартной конфигурации рамановского рассеяющего микроскопа возбуждающий свет плотно фокусируется на одной точке образца. После отторжения упруго рассеянных фотонов помпы (обычно со спектральными фильтрами) оставшийся свет собирается и характеризуется с помощью частотно-рассеянного спектрометра (например, дисперсионной решёткой); Спектральное разрешение этих устройств может достигать ~0,5–1 ^см-1. Измерение повторяется для каждой точки (x,y) в поле зрения (FOV) образца методом, называемым точечным или растровым^{сканированием 6}. Существует две основные проблемы этого подхода: (1) низкое сечение спонтанного рамановского рассеяния обычно требует длительного времени интегрирования (0,1–1 с) для сбора достаточного количества фотонов для каждого пикселя спектрометра, поэтому рамановское отображение расширенного образца может требовать длительного времени измерения; (2) возбуждение насосным светом также приводит к образованию фотолюминесценции (PL), которая перекрывается со спонтанным раманским сигналом и часто может его подавить.

Для увеличения скорости захвата можно применить метод линейного сканирования⁷ , при котором насос фокусируется вдоль линии FOV (например, по координате x), а собранный сигнал (PL или рассеяние Рамана) рассеивается спектрометром с двумерным датчиком, что позволяет для заданной координаты x получить 2D-набор данных, в котором одна ось соответствует спектру, а другая — одной пространственной координате y. Тем не менее, эта реализация по-прежнему страдает от значительных потерь, связанных с входной щелью спектрометра, узкая ширина которой обеспечивает лучшее спектральное разрешение, но также ограничивает количество собранного света.

Конфигурация широкого поля поля может быть более адекватной для сокращения времени измерения: при этом методе освещётся большая часть образца, и спектр получается для всех пикселей 2D-сенсора одновременно. В этом случае спектральная информация может быть собрана либо с помощью набора полосных^{фильтров 8}, либо регулируемого спектрального^{фильтра 9} перед монохромной камерой. Кроме того, этот метод основан на подходе частотной области и получает только дискретное количество спектральных диапазонов.

Альтернативным методом измерения спектра является подход преобразования Фурье (FT). Это временная методика, основанная на теореме¹⁰ Винера-Кинчина, которая утверждает, что мощностная спектральная плотность сигнала равна преобразованию Фурье его автокорреляции по времени. В оптике это достигается на практике путем генерации двух задерживаемых реплик формы волны с помощью интерферометра. Их интерференция измеряется детектором в зависимости от относительной задержки, что приводит к образованию так называемой ^{интерферограммы 11}. Метод FT широко используется для измерения спектров в инфракрасной области, где он называется инфракрасной спектроскопией преобразования Фурье (FTIR)¹². FTIR регулярно используется для измерения спектра поглощения колебательных переходов в среднеинфракрасном спектральном диапазоне (~2,5−25 мкм длина волны).

Метод FT во временной области имеет некоторые преимущества по сравнению с традиционными дисперсионными спектрометрами: он достигает большей пропускной способности за счёт отсутствия щелей (преимущество этендю Жакино¹²); Она обеспечивает гибкое спектральное разрешение, которое зависит только от диапазона сканирования. Кроме того, он хорошо подходит для широкоугольных конфигураций: фактически, при использовании двумерного детектора метод измеряет одну интерферограмму для каждого пикселя параллельно, что позволяет одновременно записывать непрерывные спектры на всех пикселях. С другой стороны, система FT должна соответствовать двум сложным требованиям: (1) относительная задержка между двумя репликами света должна контролироваться с ограниченной долей оптического цикла; (2) фазовый сдвиг между лучами, интерферирующими в одном пикселе, должен быть ограничен для обеспечения хорошей когерентности и, следовательно, высокого контраста. Некоторые решения были предложены на основе интерферометров с общей^{траекторией 13, 14} или почти¹⁵, но они довольно громоздки или имеют спектральное разрешение больше 100 ^см-1.

В этой работе описан новый широкопольный микроскоп, позволяющий получать фотолюминесцентные и рамановские изображения рассеяния. Инновационным блоком этой системы является компактный и ультра-стабильный двупреломляющий интерферометр с общим направлением, называемый Translating-Wedge based Identical Pulses eNcoding System (TWINS)¹⁶. Он обеспечивает сканирование задержки сотен оптических циклов с фазовой точностью небольшой доли самого оптического цикла и высокой стабильностью. Две световые реплики имеют ортогональные поляризации и коллинируют по одному и тому же общему пути, поэтому на них не влияют колебания длины пути, типичные для интерферометра с двумя лучами. Схема, показанная на вставке на рисунке 1, состоит из двух блоков двупреломляющего кристалла с ортогональными оптическими осями: один (B₂) с фиксированной длиной, другой (B₁), разделённый на два клина, которые можно перемещать по общему направлению гипотенузы. Падающий свет поляризуется P₁ под углом 45° относительно оптической оси двупреломляющего кристалла, так что половина энергии находится вдоль обычной поляризации, а половина — вдоль экстраординарной. При движении по двупреломляющим блокам два ортогональных компонента накапливают относительную задержку, которая тонко регулируется изменением общей толщины блока_{B 1} путём изменения вставки клина. Второй поляризатор P₂ проецирует компоненты поля на общую линейную поляризацию, чтобы заставить их интерференцировать. Задержка τ между репликами зависит от клиновидного смещения x вдоль общей гипотенузы как (Уравнение 1) , с c скоростью света α углом вершины клиньев, Δn = n_{e-n o} разности в обычных и экстраординарных показателях преломления (двупреломление). Поскольку спектральное разрешение Δv обратно пропорционально диапазону сканирования, T=|T_{2-T 1}|, с начальной и конечной задержкой интерферограммы T₁, T₂ , высокое спектральное разрешение, необходимое для рамановской спектроскопии, требует высокой двойной преломления и длинных клиновидных трансляций. Среди наиболее распространённых двупреломлённых кристаллов_{YVO 4} (иттрий ортованададат) особенно подходит благодаря высокому диапазону Δn и прозрачности в видимо-ближнем инфракрасном диапазоне. Клинья спроектированы с углом вершины 10°, поэтому при длине сканирования 15,3 мм интерферометр может выдавать задержку 2500 fs при 600 нм, достигая спектрального разрешения 23 ^см-1 по всему интересуемому спектральному диапазону (чувствительность кремниевой камеры определяет верхний предел). В данной работе будет представлена стратегия правильной настройки интерферограммной дискретизации (то есть шага и диапазона сканирования) для достижения желаемого спектрального разрешения и работы с широкополосным фоном, отделяя рамановский сигнал от фотолюминесценции.

Как описано Кандео и ^{др. 17}, этот двупреломляющий спектрометр может сочетаться с коммерческим оптическим микроскопом для проведения гиперспектральных измерений. Требования таковы: перенастраиваемый корпус оптического микроскопа, двупреломляемый интерферометр TWINS, монохромная камера с низким уровнем шума (например, CCD или sCMOS) и узкополосный лазерный источник. Для последнего типичные длины волн возбуждения для Рамана и флуоресцентной спектроскопии включают 355 нм, 488 нм, 514 нм, 532 нм, 633 нм и 785 нм. Несмотря на то, что лазеры с высокой спектральной чистотой, такие как тот, что перечислён в Таблице материалов, являются лучшим выбором, также может использоваться лазер с более широкой шириной линии, например, ~0,1 нм, учитывая ограниченное спектральное разрешение прибора. Микроскоп модернизируется путём размещения TWINS на пути обнаружения между трубочной линзой и монохромным детектором. Такая конфигурация обеспечивает равномерную задержку траектории по полю зрения и средний контраст 55%. Путь возбуждения предназначен для равномерного освещения образца: на практике выходной кончик многомодового волокна с большим ядром визуализируется на плоскости образца. С помощью механического скремблера моды тесно связаны в ядре волокна, создавая профиль с плоским верхом на плоскости образца. Кроме того, вибрирующая голосовая катушка усредняет пятнистый узор, типичный для монохроматического излучения. Характеристика этой иллюминации цилиндра показана на дополнительном рисунке 1. Пучок фокусируется на образце с помощью объектива, скорректированного бесконечностью, который также собирает обратно рассеянный рамановский и люминесцентный свет в направлении обнаружения. Фильтры, необходимые для отражения освещения, будут подробно описаны.

Чтобы показать, как измерять широкополосные и узкополосные спектральные особенности с помощью этого гиперспектрального микроскопа, для тестового образца, специально выбранного для иллюстративных целей, измеряются как люминесценция, так и рамановское рассеяние. Образец состоит из смеси трёх порошковых пигментов с хорошо известными рамановскими спектрами: двух полиморфов титанового белого (_{TiO 2}), а именно рутилового и анатазного, и кадмиев сульфидного жёлтого (CdS). Однако та же процедура может применяться в более широком спектре применений — от материаловедения до биологии.

Цель этой статьи — иллюстрировать шаги проведения гиперспектрального измерения, а сборка и выравнивание интерферометра TWINS подробно описаны Кандео и ^{др. 17}. Поэтому заинтересованный экспериментатор должен начать с предварительно собранного интерферометра на основе этой технологии.

Протокол начинается с подготовки образца и настройки микроскопа для возбуждения и сбора рамановских фотонов и PL. Затем параметры сканирования (длина сканирования, шаг дискретизации) и параметры получения (время экспозиции, аппаратное бинирование) устанавливаются в соответствии с требованиями исследуемого сигнала. Наконец, будет представлен конвейер постобработки, подробно описывающий процедуру извлечения спектра на каждом пикселе (спектральный гиперкуб, рисунок 2B) из полученного временного набора данных (временной гиперкуб, рисунок 2A) и изложены алгоритмы снижения шума и продвинутой спектральной анализа. Весь рабочий процесс показан на рисунке 3.

Протокол

Реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка образца

ВНИМАНИЕ: Во время приготовления надевайте латексные перчатки, так как пигмент CdS токсичен, особенно при вдыхании.

1. Используйте скребок для нанесения 20 мг каждого пигментного порошка на прецизионный вес, получая соотношение веса 1:1:1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно очистите кончик скребка для каждого образца, чтобы избежать перекрёстного загрязнения.
2. Смешайте порошки в ступке, чтобы удалить комки.
3. Вылить полученную смесь на стекло микроскопа; Используйте наконечник скребка, чтобы аккуратно прижать слой и получить почти равномерную толщину.
4. Нанесите лак для ногтей на края покрытия микроскопа. Нанесите его на смесь, лицом к ногтям вниз, и приложите достаточное давление, чтобы запечатать. Дайте высохнуть несколько секунд, чтобы лак затвердел.

2. Установка микроскопа

ВНИМАНИЕ: Носите защитные очки, когда лазер включён, так как максимальная мощность на плоскости образца составляет 300 мВт.

ПРИМЕЧАНИЕ: Производительность лазера насоса не влияет на изменения температуры, при условии, что он работает в температурном диапазоне, указанном в техническом листе (например, 10-40 °C для лазера, указанного в Таблице материалов).

1. Выровнять интерферометр TWINS вдоль пути обнаружения микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как подробно описано Кандео и ^{др. 17}, модуль интерферометра должен быть добавлен между линзой трубки и детектором, обеспечивая правильное расстояние между ними. Для микроскопа, используемого в этой работе, это гарантировано только при снятии модуля окуляра.
2. Чтобы адаптировать схему подсветки Кёлера к лазерному возбуждению, убрать встроенную лампу микроскопа и использовать объектив для сбора света на выходе многомодового волокна с большим ядром.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение объектива задаёт размер картины освещения, когда кончик волокна сопрягается с плоскостью образца. Возможный вариант — цель 10x/0.25-0.30.
3. Выберите длину волны возбуждения и сфокусируйте возбуждающий лазер на входе многомодового волокна с большим ядром. Включите камеру и запустите программу визуализации.
   1. Соедините среднюю часть волокна с вибрирующей мембраной звуковой катушки, которая уберёт пятнистость. Механически перемешайте волокно, плотно согнув его, чтобы объединить все пространственные режимы. Включи лазер.
   2. Подготовьте тестовый образец для выравнивания, например, флуоресцентные красные маркерные полосы на крышке микроскопа.
   3. Скорректируйте положение наконечника волокна относительно оптической системы освещения, перемещая волокно с точной ступенью трансляции, чтобы получить пятно с равномерной интенсивностью и чётко очерченными краями на плоскости образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех зарегистрированных измерений используется лазер диаметром 532 нм. С волокном размером ядра 400 мкм диаметр пятна покрывает 82% ширины FOV камеры.
4. Использовать набор фильтров для путей возбуждения и обнаружения, принимая следующие критерии (дополнительный рисунок 2):
   1. Используйте узкополосный фильтр с шириной пропускания 532 нм (ширина пропускания 2,0 нм) для очистки лазерной линии и отклонения боковых полос насоса, возникающих из-за нелинейного расширения из-за распространения в волокне.
   2. Используйте дихроическое зеркало (DM на рисунке 1), чтобы отразить лазерный свет к образцу и передать красный смещённый обратно рассеянный излучение, собранный объективом.
   3. Используйте длинночастотный фильтр (LPF на рисунке 1) при 532 нм для отторжения остаточного освещения.
   4. Во время измерения рамана-рассеяния используйте короткопроходочный фильтр (SPF на рисунке 1) при 600 нм для подавления фоновой флуоресценции.
5. Измерьте мощность на плоскости выборки с помощью измерителя мощности. Ослабить пучок насоса, чтобы получить интенсивность на образце, которая не приводит к повреждению (порядка 2 Вт/см^², как указано в Таблице 1). Используйте затвор для лазера, одновременно устанавливая другие параметры измерения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за низкого сечения спонтанного рамановского рассеяния требуется высокая плотность мощности для улучшения сбора сигнала. Однако порог повреждения образца должен учитываться. В отличие от систем точечного сканирования, система широкого угла освещает большую область, что снижает эффективность рассеивания энергии и требует тщательного управления питанием для предотвращения повреждения образца.
6. Положите образец на стадию микроскопа и отрегулируйте фокус.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы легко найти фокус, сначала осветите образец белой лампой в момент пропуска или отражения. В последнем случае можно было использовать лампочку, размещённую рядом с микроскопом. Фокус образца будет впоследствии оптимизирован с помощью лазерного света помпы.

3. Параметры измерения

1. Включите драйвер мотора, который выполняет клиновидное перемещение. Управление аппаратными компонентами (камерой и мотором) одновременно для проведения гиперспектральных измерений (пример пользовательского интерфейса, показан на дополнительном рисунке 3).
2. Настройте параметры захвата камеры, время экспозиции и аппаратное бинирование для оптимизации интенсивности сигнала, выполняя следующие инструкции:
   1. Поскольку высокое отношение сигнал/шум (SNR) во временном сигнале приводит к высокому SNR в полученных спектрах, отдайте предпочтение длительному времени экспозиции, что лучше заполняет динамический диапазон сенсора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для низких сигналов, как и для рамановского рассеяния, необходимо найти компромисс между уровнем сигнала и общим временем измерения: максимальное время экспозиции может быть невозможным.
   2. Выберите аппаратное бинирование, чтобы собрать заряд с большего количества пикселей перед считыванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Суммирование заряда и выполнение одного показания даёт лучшую производительность шума, чем считывание нескольких пикселей и потом суммирование их сигнала в постобработке. Выбор биннинга также обусловлен приемлемым снижением пространственного разрешения.
3. Выберите параметры сканирования, общую длину сканирования и шаг выборки согласно следующим критериям:
   1. Для достижения высокого спектрального разрешения для рамановских пиков установите асимметричное длинное клиновидное перемещение (-2526 fs→ -36 fs). С другой стороны, выполните симметричное сканирование вокруг позиции нулевой задержки (-65 fs → 65 fs), чтобы получить больше широкополосных спектральных признаков сигнала PL.
   2. Используя уравнение 1 для задержки τ как функцию клинового сдвигa x, выберите шаг дискретизации, чтобы выполнить предел Найквиста для интересующей спектральной полосы пропускания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Имея минимальную длину волны спектра_{λ min}, наложите (Уравнение 2).
      
      где двупреломление Δn зависит от длины волны (см. уравнения Селлемейера).
4. Откройте затвор, чтобы осветить образец лазером. Если наблюдается снижение интенсивности сигнала, дождитесь, пока образец не достигнет стационарного состояния (обычно несколько секунд).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы компенсировать снижение интенсивности сигнала, скорректируйте биннинг и время экспозиции для поддержания хорошего SNR.
5. Начните получение монохромного изображения для каждой позиции клина, то есть временной задержки между репликами из каждой точки 2D-датчика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для получения должно сохранять две переменные: временной гиперкуб (набор 2D-изображений) и вектор моторных позиций, записанный энкодером во время сканирования.
6. После завершения измерения выключайте лазер и приступайте к анализу данных.

4. Обработка приобретённого куба данных

1. Генерируйте спектральный гиперкуб из полученного набора данных, следуя следующим инструкциям:
   1. Загрузите файл коррекции положения мотора для конкретного шагового мотора (см. обсуждение).
   2. Загрузите файл калибровки частоты для конкретного интерферометра, чтобы связать измеренные пространственные частоты (псевдочастоты) с реальными оптическими частотами (см. раздел «Обсуждение»).
   3. Выберите диапазон частот для спектров, который будет вычислен с помощью Фурье с помощью интерферограмм всех пикселей.
   4. Среди доступных функций аподизации¹² для окна измеренной интерферограммы выберите ту, которая предлагает хороший компромисс между расширением спектра и редукцией артефактов в полученных спектрах, например, окно Хапп-Генцеля (Хэмминга).
   5. Генерируйте спектральный гиперкуб путём преобразования Фурье аподизированных интерферограмм для всех пикселей. Сохраняйте его в сложных значениях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Комплексный спектр из FT содержит дополнительную информацию, которая будет полезна для устранения шума в наборе данных и извлечения средних спектров выбранных пикселей.
2. После вычисления спектрального гиперкуба проводите различные исследования, например, получите средний спектр в отдельных областях; генерировать изображение с ложным цветом в RGB; картографические спектральные пики; Вычтите предысторию.
3. Чтобы уменьшить спектральный шум, который может подавлять значительные пики, особенно в спектрах Рамана, реализуйте разложение сингулярных значений (SVD)¹⁸ , следуя следующим шагам:
   1. Переформируйте височный гиперкуб в матрицу A с интерферограммами вдоль рядов.
   2. Выполните SVD матрицы, получая матрицы U, S и V такие, что A = USV^T.
      ПРИМЕЧАНИЕ: U столбцы — это пространственные распределения собственных векторов V (столбцов), тогда как S — диагональная матрица с сингулярными значениями (SV) в убывающем порядке.
   3. Переформируйте каждый столбец U в матрицу пикселей и выполните 2D FT для получения пространственных частот.
   4. Поскольку высокие частоты связаны с очень резкими изменениями в карте, рассматривайте их как шум; определить квадратную область, центрированную в вычисленном пространстве Фурье, которая разделяет низкие (преимущественно сигнал) и высокие (преимущественно шум) частоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможным выбором для этой области является сторона 1/4 относительно размера пространства Фурье.
   5. Вычислите пространственное отношение сигналов (SSR) для каждого SV, деля сумму интенсивностей пикселей (комплексный модуль) внутри границы на сумму интенсивностей за пределами границы. Постройте SSR как функцию числа SV.
   6. Определите порог для SSR, то есть количество значимых SV, которые нужно сохранять, чтобы снизить вклад шума в набор данных, избегая артефактов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SSR обычно показывает убывающий тренд, который стабилизируется в плато по мере увеличения числа сингулярных значений. Общее правило — сохранять сингулярные значения до начала плато.
   7. Установите все нижние SV на ноль в диагональной матрице S, получая_{S без шума} , и вычислите дешумированный временной гиперкуб как US_{дешумированный} V^T.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SVD — это факторизация матриц, которая также может применяться к перестроенному спектральному гиперкубу (с рядами, содержащими спектры, а не интерферограммы).
4. Повторите шаги 4.1-4.2 с дешумированным временным гиперкубом для извлечения спектров.
5. Скачайте программу по ссылке в^{Ссылке 19} , чтобы провести более глубокий анализ набора данных с помощью алгоритма Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разработчики программного обеспечения предоставляют подробное описание^{алгоритма 20}. Это итеративный метод решения задачи анализа смесей: каждый спектр выражается как линейная комбинация чистых спектральных профилей. При матричном представлении: B = C^{R T}+E, где B — набор данных, C содержит концентрации для каждого спектра, столбцы R — эталонные спектры компонентов, а E выражает ошибку.
   1. Переформируйте спектральный гиперкуб в матрицу частот N_{пикселей} x N,_{с общим} количеством пикселей и длиной вектора_{частоты} N пикселей.
   2. Выберите количество видов, ожидаемых в выборке, и загрузите их эталонные спектры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эталонные спектры можно измерять отдельно для каждого пигмента. В противном случае программа создаёт SVD набора данных и использует столько же основных компонентов, сколько выбранных компонентов для начальных догадок.
   3. Выберите ограничения: полученные спектральные профили должны быть неотрицательными и максимально похожими на эталонные спектры.
   4. Постройте карту концентрации (изменённые колонки C) и спектры (столбцы R) для каждого вида.
   5. Экспортируйте эти карты и используйте их для создания изображения ложного цвета (рисунок 4A), завершая анализ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программы, использованные для получения представленных здесь результатов, не являются публично доступными, но могут быть получены у авторов по запросу.

Результаты

Рисунок 4A показывает карту Рамана для выбранной области порошковой смеси. Это ложноцветное представление карт численности, полученных с помощью MCR-ALS, как описано на шаге 4.5. Он предоставляет информацию о составе образца, поскольку три вида можно чётко различать внутри поля зрения. Рисунок 4B показывает средние спектры в выбранных областях карты с разрешением спектра 23 ^см-1, определяемым выбранной длиной сканиров...

Обсуждение

Для получения спонтанных рамановских изображений рассеяния и люминесценции был внедрён широкоугольный мультимодальный микроскоп FT, который применим в материаловедении. Применимость к биологическим образцам демонстрируется Кандео и ^др.17, которые представляют гиперспектральное флуоресцентное изображение окрашенных человеческих клеток. Основная задача измерений рамана-рассеяния в этой области — предотвратить фотоповреждения, вызванные неэффективным рассеиванием теп...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Anatase	Кронос	1200	Полиморф белого TiO2 пигмента
Порошок сульфида кадмия	Kremer Pigmente GmbH & Компания.	21060	Кадмиевый жёлтый, цветовой индекс тёмный/PY35
Камера	Андор	Лука Р.	Электронная умножающая CCD-камера с 1004x1002 пикселями 8µ m x 8 и микро; m
Фильтр очистки	Семрок	LL01-532-12.5	и Ослэш; 1/2" 2,0 нм — FWHM лазерный фильтр при 532 нм
Коверслипы	BRAND GmbH & Ко	4700 55	Боросиликатные стеклянные крышки микроскопа 22x22x0,15 мм
Дихроическое зеркало	Семрок	Di02-R532-25x36	25,2x35,6 мм однорзонный дихроический лазерный лучевой распределитель на расстоянии 532 нм
Волокно	Торлабы	M74L05	400µ размер m-ядра, многомодовое волокно NA 0.39
Лазер	Hubner Photonics	Cobolt Samba 1000	CW-диодный лазер с накачкой мощностью 532 нм, максимальная мощность 1000 мВт
Длиннопроходящий фильтр	Семрок	LP03-532RU-25	Ультракрутой фильтр с длинным проходом по краю на 532 нм
Микроскоп	Leica	DMRBE	Тринокулярный исследовательский микроскоп
Цель	Leica	PL-FLUOTAR, 10x/0.30	Объектив для возбуждения и сбора с увеличением в 10 раз, 0,3 NA
Цель	Ньюпорт	M-10X	Объективная линза в пути освещения, с увеличением 10x, 0,25 NA
Рутил	Кронос	2900	Полиморф белого TiO2 пигмента
Короткопроходный фильтр	Торлабы	FESH600	и Ослэш; Короткопропускающий фильтр 25,0 мм с отсечной длиной волны 600
Слайды	Мариенфельд	1000612	Микроскопические стекли размером 76x26x1 мм