Методическая статья

Применение схемы Диксона «вверх и вниз» для оценки минимальной альвеолярной концентрации севофлурана у крыс с уточненной классификацией движений

DOI:

10.3791/68520

⸱

25 июля 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Anaesthesia, Intensive Care Medicine and Pain Medicine, Clinical Division of General Anaesthesia and Intensive Care Medicine, Medical University of Vienna

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленный здесь протокол направлен на оценку глубины анестезии с использованием Up-and-Down Design Диксона у крыс под действием седативных препаратов, подвергшихся стандартизированному болевому стимулу. Кроме того, в нем очерчена классификация различных наблюдаемых моделей движения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При использовании летучих анестетиков стандартной мерой потенции является минимальная альвеолярная концентрация (ПДК), определяемая как альвеолярная концентрация, при которой у 50% испытуемых не проявляется двигательная реакция на болевой раздражитель. В клинических и экспериментальных исследованиях в настоящее время существует консенсус о том, что только «грубые целенаправленные движения» считаются положительной двигательной реакцией и, следовательно, могут указывать на слишком мягкую седацию. Тем не менее, подходящий уровень анестезии, как у людей, так и у животных, варьируется индивидуально в зависимости от различных влияющих факторов, таких как другие вводимые лекарства. Два исследования на крысах были проведены с целью изучения влияния тетрагидроканнабинола и этанола на севофлуран, один из наиболее часто используемых летучих анестетиков. Для оценки MAC была использована конструкция Dixon Up-and-Down. Для первого животного была выбрана заранее определенная доза севофлурана. После периода равновесия в течение 15 минут стандартизированный болевой стимул был нанесен на дистальную треть хвоста крысы с помощью хирургического зажима. Реакция животного на раздражитель была задокументирована как положительная или отрицательная. Если возникала положительная двигательная реакция, дозу для следующего животного увеличивали. И наоборот, если крыса не проявляла двигательной реакции, доза для следующего животного уменьшалась. Для оценки MAC и 95% доверительных интервалов использовали изотоническую регрессию и метод бутстрепа. В этой статье описан подробный протокол оценки глубины анестетика у крыс с использованием схемы «вверх и вниз». В нем также содержится новое и подробное описание и категоризация двигательных паттернов у крыс под действием седативных препаратов при применении стандартизированного болевого стимула для повышения воспроизводимости для будущих исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Севофлуран является одним из наиболее часто используемых летучих ингаляционных анестетиков1. Его активность оценивается с помощью минимальной альвеолярной концентрации (ПДК), которая определяется как альвеолярная концентрация, при которой у 50% пациентов не проявляется двигательная реакция на болевой раздражитель 2,3,4. Для создания КПК крысы могут быть использованы в качестве животных моделей из-за их большей гомогенности по сравнению с человеком. Болевой стимул обычно применяется с помощью хирургического зажима на дистальной трети хвоста крысы2. Использование альтернативных методов для тестирования боли не гарантирует сопоставимости с ранее проведенными исследованиями и, следовательно, может привести к различным результатам. Из-за большого разнообразия моделей движений в ответ на стимул в настоящее время консенсус гласит, что только «грубые целенаправленные движения» следует считать положительными двигательными реакциями. Тем не менее, это определение не имеет дальнейшего уточнения в отношении того, какие конкретно категории можно квалифицировать как «грубо целенаправленные» и в какой степени движение должно соответствовать этому критерию. Это имеет первостепенное значение, так как моторная реакция на стимул может указывать в клинических условиях на недостаточную глубину седации.

На состояние анестезии влияют различные факторы, в том числе возраст5 лет, сопутствующие заболевания6, нарушение функции печени7 или гипотермия8. Более того, лекарства, вводимые вместе с анестетиками, существенно влияют на глубину анестезии. Например, фентанил и пропофол, часто используемые во время фазы индукции, снижают необходимое количество севофлуранав 9,10. Кроме того, было показано, что лидокаин или прегабалин могут снижать МАК севофлурана11,12. Кроме того, недавнее употребление алкоголя или таких веществ, как тетрагидроканнабинол (ТГК), также может снизить ПДК, тем самым увеличивая глубину анестезии13,14. И наоборот, было высказано предположение, что симпатомиметические агенты могут облегчать седативный эффект, стимулируя центральную нервную систему15.

Для повышения воспроизводимости для будущих исследований предоставлен подробный протокол и видеоописания для оценки MAC у крыс с использованием схемы Диксона16 . В отличие от предыдущих исследований MAC, в этом протоколе подробно описаны процедурные шаги для обеспечения воспроизводимости в лабораториях. Кроме того, были повторно проанализированы видеоматериалы из двух ранее опубликованных исследований, и двигательные реакции были классифицированы на основе их протяженности и характера (скоординированные движения - перекатывание, растяжение, сальтационное и нескоординированное скручивание движений). Таким образом, данное исследование также предлагает инновационное и тщательное описание и классификацию моделей движения у крыс под действием седативных препаратов в ответ на стандартизированный болевой стимул, с целью улучшения воспроизводимости для будущих исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные исследования на животных были одобрены Внутренним комитетом по экспериментам на животных Медицинского университета Вены и компетентным регулирующим органом (Федеральным министерством по делам женщин, науки и исследований Австрии). Эксперименты проводились под постоянно поддерживаемой анестезией. Животные сознательно не воспринимают боль даже в том случае, если произойдет какое-либо движение17. Использовали взрослых крыс Вистар в возрасте от 81 до 95 дней.

1. Изучение животных и содержание

  1. Размещайте животных в соответствии с весом и полом. Разделите самцов и самок и поселите их минимум на 14 дней до начала эксперимента, чтобы обеспечить акклиматизацию. Поместите в клетку не более трех крыс весом более 400 г или четырех крыс весом менее 400 г.
  2. Поддерживайте условия окружающей среды с 12-часовым циклом света/темноты, температурой окружающей среды 22 °C и уровнем влажности от 45% до 65%.
  3. Регулярно взвешивайте каждое животное и записывайте массу тела перед каждой процедурой.
  4. Транспортируйте животных индивидуально от места содержания до испытательного полигона. Накройте каждую клетку тканью, чтобы снизить зрительное напряжение, и разместите непроверенных животных в отдельном помещении, чтобы избежать воздействия экспериментальных процедур.

2. Настройка оборудования

  1. Перед началом эксперимента убедитесь, что все необходимое оборудование функционирует и доступно. Выполняйте проверки оборудования в соответствии с институциональными рекомендациями или стандартными операционными процедурами, включая тестирование на герметичность, калибровку и функциональные испытания мощности, где это применимо.
  2. Используйте герметичную прозрачную камеру (15 см × 20 см × 9 см) для размещения крысы. Убедитесь, что камера оснащена отверстием 15 мм для внешнего направления хвостовой части и минимизации утечки газа.
  3. Подключите подводящую магистраль к испарителю севофлурана и источнику кислорода.
  4. Подключите линию оттока на противоположной стороне камеры к системе извлечения газа и монитору анестезии для регистрации концентраций севофлурана.
  5. Убедитесь, что ректальный термометр, нагревательное одеяло и инфракрасная нагревательная лампа исправны. Сравните термометр с эталонным устройством, убедитесь, что нагревательное одеяло достигает целевых температурных диапазонов, и убедитесь, что инфракрасная лампа включается и поддерживает стабильную мощность. Расположите лампу непосредственно над испытательной камерой на безопасном расстоянии в соответствии с местными процедурами безопасности.
  6. Подготовьте артериальный зажим длиной 25 см, который будет использоваться для стандартизированного болевого стимула.

3. Приготовление лекарственных препаратов

  1. Приготовление ТГК (по желанию)
    1. Используйте препарат с ТГК в концентрации 25 мг/мл. Рассчитайте необходимый объем для каждого животного, умножив массу тела в килограммах на (10 мг/кг/25 мг/мл), в результате чего получится 0,4 мл на кг массы тела.
    2. Используйте пипетку прямого вытеснения, чтобы составить точный рассчитанный объем для каждого животного. Не вводите на этом этапе. Подготовьте пипетку и отложите ее в сторону для последующего введения на этапе введения препарата (см. шаг 4.6).
    3. Используйте наконечник для дозатора, подходящий для зондирования, например, такой, который может безопасно удерживать до 0,3 мл жидкости. Выполняйте пероральный зондометр непосредственно с помощью загруженной пипетки. Выбрасывайте наконечник для дозатора после каждого использования, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
  2. Получение этанола (по желанию):
    1. Приготовьте этанол в необходимой дозировке в концентрации 1 г/кг или 2 г/кг. Используйте высококонцентрированный состав этанола (например, 96-100%) в качестве основы и растворите его в 0,9% физиологическом растворе до общего объема 10 мл/кг массы тела для каждого отдельного животного. Используйте только тот же объем физиологического раствора, что и соответствующее плацебо. Соблюдайте все правила безопасности учреждения, особенно те, которые касаются обращения и хранения легковоспламеняющихся веществ.
    2. Используйте подходящий шприц (5 мл или 10 мл, в зависимости от веса животного), чтобы составить точный рассчитанный объем для каждого отдельного животного. Не вводите вещество на этом этапе. Подготовьте шприц и отложите его в сторону для внутрибрюшинного введения на этапе введения препарата (см. шаг 4.6). Приложите иглу 23 G для введения и накройте ее соответствующим колпачком, чтобы предотвратить травмы до использования.

4. Применение препарата

  1. Вызвать анестезию для введения препарата путем помещения крысы в камеру и введения в нее 3,5 об.% севофлурана в 100% кислороде со скоростью 3 л/мин.
  2. Подождите примерно 3-5 минут, пока животное не потеряет визуальное сознание.
  3. Проведите тест на выпрямляющий рефлекс, осторожно наклонив камеру, чтобы перевернуть животное на спину. Если он не пытается вправиться в течение 10 секунд, предпримите достаточную глубину анестезии.
  4. Временно уменьшите концентрацию севофлурана до 0 и промойте камеру 100% кислородом в течение 15 с, чтобы свести к минимуму воздействие анестезирующего газа на экспериментатора.
  5. Извлеките животное из камеры и поместите его перед газоотводящей трубкой, доставляющей севофлуран той же концентрации для поддержания анестезии во время введения. Пропустите этот шаг, если введение исследуемого вещества достаточно кратковременно, чтобы избежать восстановления после анестезии.
  6. Вводите вещества в соответствии с экспериментальным планом: Введите 10 мг/кг ТГК через желудочный зонд или введите 1 г/кг или 2 г/кг этанола внутрибрюшинно. Обратитесь к Разделу 3 для получения подробной информации о подготовке и следуйте рекомендациям учреждения по проведению процедур как через зонд, так и внутрибрюшинное введение.
  7. Верните животное в клетку, чтобы прийти в себя.
  8. Подождите 1 час для этанола и 2 часа для ТГК, прежде чем продолжить процедуру.

5. Индукция анестезии для тестирования MAC

  1. После периода ожидания поместите крысу обратно в герметичную камеру для тестирования и заполните ее определенной смесью севофлурана и кислорода. Обеспечьте постоянный поток кислорода 3 л/мин. Определите индивидуальную концентрацию севофлурана (шаг 9.1) для каждого животного, начиная с 2,6 об.% (или другой заранее определенной отправной точки на основе статистического планирования) для первого животного в каждой группе. Подробное описание конструкции Up-and-Down-Design приведено ниже.
  2. Включите инфракрасную лампу обогрева.
  3. Подождите примерно 3-5 минут, пока животное не потеряет визуальное сознание.
  4. Проведите тест на выпрямляющий рефлекс, осторожно наклонив камеру, чтобы перевернуть животное на спину. Если он не пытается вправиться в течение 10 секунд, предпримите достаточную глубину анестезии.
  5. Временно уменьшите концентрацию севофлурана до 0 и промойте камеру 100% кислородом в течение 15 с, чтобы свести к минимуму воздействие анестезирующего газа на экспериментатора.
  6. Быстро откройте камеру и вставьте ректальный термометр. Следите за внутренней температурой тела на протяжении всей процедуры и соответственно регулируйте интенсивность инфракрасной нагревательной лампы и нагревательного одеяла.
  7. Выведите хвост наружу через небольшое отверстие в камере.
  8. Быстро закройте камеру.
  9. Прежде чем продолжить, немедленно восстановите желаемую концентрацию севофлурана.

6. Время уравновешивания

  1. Подождите период 15 минут для уравновешивания.
  2. Постоянно контролируйте температуру тела животного (37,2 °C ± 0,3 °C) и соответствующим образом регулируйте нагревательные приборы для поддержания нормотермии.

7. Болевой раздражитель

  1. Определите дистальную треть хвоста.
  2. Примените болевой стимул, зафиксировав зажим в третьем положении (примерно 50 Н силы).
  3. Оставьте зажим заблокированным в третьем положении до тех пор, пока крыса не проявит положительную реакцию на движение, но не более чем на 1 минуту.
  4. Запишите в протокол наличие или отсутствие двигательной реакции. Кратко опишите наблюдаемое движение с точки зрения его характера и протяженности. Классификацию моделей движения см. в пункте 11.

8. Восстановление

  1. Выключите испаритель и нагревательную лампу и поместите крысу обратно в клетку.

9. Дизайн вверх-вниз

  1. Определите концентрацию севофлурана для следующего эксперимента с помощью Dixon's Up-and-Down-Design. Если предыдущее животное проявило двигательную реакцию на раздражитель, увеличьте концентрацию для следующего животного на 0,2%pt. И наоборот, если предыдущее животное не проявило никакой двигательной реакции, уменьшите концентрацию на 0,2% pt.

10. Эвтаназия (если применимо)

Примечание: Эвтаназия по своей сути не является необходимой частью экспериментов. Необходимо проконсультироваться с компетентным Внутренним комитетом по экспериментам на животных. В двух упомянутых исследованиях было решено провести забор крови внутрисердечно и впоследствии усыпить животных. Животных не возвращали в клетку, как описано на шаге 8.1, а вместо этого процедуру продолжили непосредственно с шага 9.1.

  1. Приготовьте раствор для эвтаназии, растворив 300 мг пентобарбитала в 1 мл физиологического раствора. Наберите раствор в шприц и держите его наготове для немедленного использования после забора крови.
  2. Достаньте крысу из коробки и поместите ее перед дыхательной трубкой, поставляющей 3,5 об.% севофлурана в 100% кислороде для поддержания постоянной анестезии. Положите животное на спину, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к грудной области.
  3. Выполните внутрисердечный забор крови с помощью иглы 23 G и шприца объемом 5 мл. Аккуратно пропальпируйте сердцебиение пальцем, чтобы найти сердце. Вводите иглу как раз каудально к мечевидному отростку, немного левее средней линии и под небольшим углом.
  4. Осторожно отсаживайте, регулируя положение иглы, пока не будет наблюдаться кровоток. Соберите необходимый объем.
  5. После завершения забора крови осторожно извлеките шприц из иглы и прикрепите предварительно загруженный шприц, содержащий раствор пентобарбитала. Вводите весь 1 мл раствора внутрисердечно для обеспечения эвтаназии в соответствии с этическими принципами учреждения.

11. Продолжение экспериментов

  1. Повторите эксперимент, начиная с шага 3, для каждого исследуемого животного в отдельности.

12. Классификация паттернов движения (опционально)

  1. Классифицируйте поведенческие реакции по следующим категориям:
    1. Перекатывание: классифицируется как перекатывание, когда поведенческая реакция включает осевое вращение тела, обычно вдоль продольной оси.
    2. Растяжение: классифицируется как растяжение, когда поведенческая реакция характеризуется двусторонним, симметричным расширением конечностей и тела наружу.
    3. Сальтаторное движение: классифицируется как сальтационное движение, когда поведенческая реакция состоит из внезапных, сфокусированных на задних конечностях толчков или рывков, напоминающих короткие, прыгающие всплески всего тела.
    4. Кёрлинг: классифицируется как кёрлинг, когда поведенческая реакция включает в себя нескоординированные, направленные внутрь движения различной интенсивности, заставляющие тело изгибаться к своему центру.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В исследовании ТГК начальная оценка ПДК составила 2,8 об.% в контрольной группе (95% ДИ: 2,7-2,9 об.) и 2,1 об.% в группе 10 мг/кг ТГК (95% ДИ: 1,8-2,4 об.%)13.

В исследовании этанола расчетный ПДК составил 2,24 об.% в контрольной группе (95% ДИ: 1,97-2,94 об.). В группе этанола 1 г/кг оно составляло 1,65 об.% (95% ДИ: 1,40-1,98 об.%), а в группе этанола 2 г/кг – 1,08 об.% (95% ДИ: 0,73-1,42 об.%)14. Различное количество знаков после запятой отра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование уточняет протокол определения МАК севофлурана у крыс путем детализации критических методологических шагов и решения общих проблем, чтобы внести свой вклад в более стандартизированный и воспроизводимый подход к оценке глубины анестетика.

Точное определение МАС имеет важное значение как для экспериментальной, так и для клинической анестезиологической практики. Эта работа вносит вклад в существующую литературу, предоставляя четкий и воспроизводим...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось Венским медицинским университетом. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Томаса Хэмпа за его научные советы и команду Центра биомедицинских исследований Медицинского университета Вены за поддержку в проведении исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Герметичная прозрачная камераН/ДН/ДРодовой
Артериальный зажим КЛС Мартин13-410-22-0725 см
Drä ger PrimusDrä ger Austria GmbHПримус
Drä ger Vapor 2000Drä ger Austria GmbHПар 2000
Гомеотермический блок управления одеяломГарвардский аппарат, Холлистон, Массачусетс, США50-7137230 В
Ручной мобильный подогреватель для младенцевФишер/Пэйкл, Окленд, Новая ЗеландияИВ9210/920

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sury, M. R. J., Palmer, J. H. M. G., Cook, T. M., Pandit, J. J. The state of UK anaesthesia: a survey of National Health Service activity in 2013. Br J Anaesth. 113 (4), 575-584 (2014).
  2. Quasha, A. L., Eger, E. I., Tinker, J. H. Determination and applications of MAC. Anesthesiology. 53 (4), 315-334 (1980).
  3. Eger, E. I., Saidman, L. J., Brandstater, B. Minimum alveolar anesthetic concentration: a standard of anesthetic potency. Anesthesiology. 26 (6), 756-763 (1965).
  4. Merkel, G., Eger, E. I. A comparative study of halothane and halopropane anesthesia including method for determining equipotency. Anesthesiology. 24 (3), 346-357 (1963).
  5. Eger, E. I. Age, minimum alveolar anesthetic concentration, and minimum alveolar anesthetic concentration-awake. Anesth Analg. 93 (4), 947-953 (2001).
  6. Hardt, K., Wappler, F. Anesthesia for morbidly obese patients. Dtsch Arztebl Int. 120 (46), 779-779 (2023).
  7. Toprak, H. I., et al. Bispectral index monitoring to guide end-tidal isoflurane concentration at three phases of operation in patients with end-stage liver disease undergoing orthotopic liver transplantation. Transplant Proc. 43 (3), 892-895 (2011).
  8. Liu, M., Hu, X., Liu, J. The effect of hypothermia on isoflurane MAC in children. Anesthesiology. 94 (3), 429-432 (2001).
  9. SingsankCoats, J., Seddighi, R., Rohrbach, B. W., Cox, S. K., Egger, C. M., Doherty, T. J. The anesthetic interaction of propofol and sevoflurane on the minimum alveolar concentration preventing motor movement (MACNM) in dogs. Can J Vet Res. 79 (2), 95-95 (2015).
  10. Katoh, T., Ikeda, K. The effects of fentanyl on sevoflurane requirements for loss of consciousness and skin incision. Anesthesiology. 88 (1), 18-24 (1998).
  11. Hamp, T., et al. The effect of a bolus dose of intravenous lidocaine on the minimum alveolar concentration of sevoflurane. Anesth Analg. 117 (2), 323-328 (2013).
  12. Müller, J., et al. The effect of pregabalin on the minimum alveolar concentration of sevoflurane: a randomized, placebo-controlled, double-blind clinical trial. Front Med. 9, 883181(2022).
  13. Müller, J., et al. The effect of oral Δ-9-tetrahydrocannabinol on the minimal alveolar concentration of sevoflurane. Eur J Anaesthesiol. 38 (1), 58-63 (2021).
  14. Müller, J., et al. Ethanol reduces the minimum alveolar concentration of sevoflurane in rats. Sci Rep. 12 (1), 280(2022).
  15. Ishiyama, T., Oguchi, T., Iijima, T., Matsukawa, T., Kashimoto, S., Kumazawa, T. Ephedrine, but not phenylephrine, increases bispectral index values during combined general and epidural anesthesia. Anesth Analg. 97 (3), 980-984 (2003).
  16. Dixon, W. J. Staircase bioassay: the up-and-down method. Neurosci Biobehav Rev. 15 (1), 47-50 (1991).
  17. Stoelting, R. K., Longnecker, D. E., Eger, E. I. Minimum alveolar concentrations in man on awakening from methoxyflurane, halothane, ether and fluroxene anesthesia. Anesthesiology. 33 (1), 5-9 (1970).
  18. D'Amour, F. E., Smith, D. L. A method for determining loss of pain sensation. J Pharmacol Exp Ther. 72 (1), 74-79 (1941).
  19. Dixon, W. J. The up-and-down method for small samples. J Am Stat Assoc. 60 (312), 967-967 (1965).
  20. Kashimoto, S., Furuya, A., Nonaka, A., Oguchi, T., Koshimizu, M., Kumazawa, T. The minimum alveolar concentration of sevoflurane in rats. Eur J Anaesthesiol. 14 (4), 359-361 (1997).
  21. Olofsen, E., Dahan, A. The dynamic relationship between end-tidal sevoflurane and isoflurane concentrations and bispectral index and spectral edge frequency of the electroencephalogram. Anesthesiology. 90 (5), 1345-1353 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи