Методическая статья

In vitro Восстановление цитоскелетных сетей внутри разделенных по фазам гигантских униламеллярных везикул (ГУВ)

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68530

⸱

20 июня 2025 г.

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье представлена простая однореакторная реконструкция цитоскелетных сетей внутри разделенных по фазам гигантских везикул. Метод может быть обобщен и применен для инкапсуляции или удержания широкого спектра биомолекул.

Аннотация

Биомиметические липидные мембраны в форме гигантских униламеллярных везикул (ГУВ) обычно используются для имитации поведения клеточных мембран из-за простоты восстановления белка внутри ГУВ, визуализации, а также понимания клеточной мембранно-белковой динамики. Тем не менее, клеточные мембраны содержат липидные рафты (или домены), возникающие в результате присутствия различных липидов в клеточной мембране. Такая повышенная сложность в модельных системах может быть включена в создание фазоразделенных GUV, в которых липидный состав может быть точно настроен. В то время как методы инкапсуляции для получения гомогенных GUV широко известны, методы инкапсуляции белков внутри фазово разделенных GUV ограничены. В данном случае этот протокол представляет собой упрощенное однореакторное производство фазовых разделенных GUV, состоящих из жидкостно-неупорядоченных (Ld) и жидких упорядоченных (Lo) доменов, эффективно инкапсулирующих различные цитоскелетные белки, т.е. FtsZ и актин, что делает метод универсальным инструментом для минимального производства клеток. В частности, этот подход использует протокол переноса эмульсии для производства GUV с высокой эффективностью инкапсуляции. В этом способе липидный монослой сначала получают путем эмульгирования белкового раствора в липидно-масляной смеси, где выбираются липиды с различными температурами фазового перехода для получения фазового разделения в полученных GUV. Эта эмульсия аккуратно переносится поверх липидного раствора в масле в другой трубке, что приводит к образованию границы раздела вода-масло. Затем раствор центрифугируют при повышенных температурах (в идеале при 37 °C для сохранения активности белка), после чего собирают GUV для визуализации. Этот метод упрощает in vitro восстановление белков цитоскелета в фазово-разделенных GUV без использования громоздкой лабораторной установки и, таким образом, служит удобным методом для изучения механики взаимодействий цитоскелетных мембран в замкнутом пространстве.

Введение

Гигантские везикулы служат моделью систем для понимания клеточных функций 1,2. Простота их создания, визуализации, настраиваемости и восстановления биомолекул in vitro делает эти биомиметические модели предпочтительной системой для многих научных исследований 3,4,5. Существует несколько известных методов изготовления GUV, таких как электрообразование6, cDICE 7,8, перенос эмульсии и другие методы на основе микрофлюидики 9,10. О производстве ГУВ такими методами сообщается в литературе 3,11. Более того, in vitro восстановление цитоскелетных сетей внутри GUV было ранее описано с использованием метода переноса эмульсии из-за простоты этого метода однореакторного формирования, который не требует какой-либо сложной настройки. Тем не менее, такое воссоздание очень часто встречается в гомогенных GUV, системах, которые не полностью имитируют сложность клеточных мембран.

Этот протокол описывает in vitro восстановление цитоскелетных сетей внутри фазовых разделенных GUV, демонстрируя сложность липидной мембраны. В то время как ранее сообщалось, что такие сети связываются на поверхности мембраны (снаружи), но не ограничены внутри гигантских везикул 13,14, настоящая техника переноса эмульсии фокусируется на протоколе, позволяющем получить фазовое разделение, а также сохранить активность формирования сети цитоскелета. Одной из основных проблем в этом методе является температура. Стандартные методы производства для создания фазоразделенных GUV требуют использования повышенных температур, которые варьируются в зависимости от температуры фазового перехода составляющих липидов. Однако цитоскелетные белки не способны полимеризоваться в структуры более высокого порядка при таких высоких температурах 15,16,17. Таким образом, этот протокол не только использует липидную композицию для получения фазового разделения в GUV при комнатной температуре, но и оптимизирует условия для получения хорошего выхода GUV при физиологических температурах.

Еще одним аспектом, который следует учитывать при производстве восстановленных систем GUV, является объем необходимых инкапсулированных биомолекул. Для большинства белков производство больших объемов может быть дорогостоящим и трудоемким, включая несколько циклов очистки. Кроме того, эксперименты по восстановлению in vitro обычно требуют начальной исследовательской фазы, на которой сначала тестируются концентрации биомолекул, буферные композиции и т.д. для достижения оптимального содержания внутреннего раствора. Таким образом, этот протокол оптимизирует протокол производства GUV для двух различных анализов, которые адаптируются к вышеупомянутым предпосылкам. С одной стороны, этот протокол описывает один анализ, который оптимизирует стандартный протокол инвертированной эмульсии, который включает относительно большие объемы белков и генерирует высокопроизводительное производство GUV в пробирках, которые затем переносятся на 96-луночные планшеты для визуализации. С другой стороны, описанный здесь подход также оптимизирует протокол для производства GUV с разделением фаз непосредственно в планшетах для визуализации, в котором используются меньшие объемы биомолекул (~1/4 от количества, необходимого для производства в пробирках) и позволяет генерировать GUV последовательно, достигая многих инкапсулированных условий за одну стадию центрифугирования. Таким образом, представленный здесь протокол показывает один метод инкапсуляции, но позволяет пользователю выбрать любую из этих настроек в зависимости от своих требований.

Более того, этот протокол описывает оптимизированный метод инкапсуляции для двух различных цитоскелетных сетей: FtsZ и актина. Поскольку эти два белка требуют различных условий буферизации и скученности, в протоколе рассматриваются последующие необходимые изменения для достижения оптимального восстановления сети. Таким образом, представленный здесь подход может быть использован и обобщен для инкапсуляции любых необходимых биомолекул в фазоразделенных GUV.

Протокол

Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Приготовление липидной смеси

  1. Возьмите 0,5 мл хлороформа в стеклянном флаконе объемом 5 мл. Добавьте 17,5 мкл DOPC, 7,4 мкл DOPG, 29,6 мкл DPPC (все из 25 г/л липидных запасов, приготовленных в хлороформе), 32,2 мкл 10 г/л DPPG и 20,6 мкл 18 г/л холестерина. Добавьте 1,2 мкл 1 г/л красителя Atto655-DOPE. Осторожно смешайте липидную смесь, испарите хлороформ под действием азота и повторно суспендируйте тонкую пленку в общей сложности 400 мкл хлороформа.
  2. Для инкапсуляции FtsZ полученную окончательную липидную смесь готовят в соотношении DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol (17,499: 7,5: 31,5: 13,5: 30 моль), меченную 0,001 мол.% Atto655-DOPE. Для производства GUVs с инкапсулированным пучковым актином липидная смесь содержит биотинилированные липиды, и ее готовят в соотношении DOPC:DOPG:DPPC:DPPG:Chol:Biotinyl CAP PE (17,499:7,5:30,5:13,5:30:1) меченного 0,001 мол.% Atto655-DOPE.
  3. Растворите липидную смесь (32 мМ, 50 μл) в хлороформе и высушите в стеклянном флаконе под потоком газаN2 в течение ~15 минут.
  4. Затем стеклянный флакон хранится под вакуумом в эксикаторе в течение ~30 минут, чтобы избавиться от следов остаточного хлороформа.
  5. Высушенную пленку диспергировать в смеси декана (20 мкл) и минерального масла (500 мкл) в стеклянном флаконе до получения конечной концентрации 3,2 мМ и обработать ультразвуком при повышенных температурах (~50 °C) в течение ~30 мин с помощью ультразвуковой канны.
  6. Перелейте смесь липидов и масла в пробирку и инкубируйте пробирку при 37 °C в течение ~10 минут, прежде чем перейти к следующим шагам.
  7. Приготовьте внутреннюю инкапсуляционную смесь для белков.

2. Приготовление внутренних растворов для инкапсуляции

  1. Смесь филаментов FtsZ
    1. Приготовьте белковую смесь FtsZ в общем объеме 10 мкл в микропробирке. Для нитевидной сети FtsZ добавьте 0,87 мкл 23 мкМ FtsZ-YFP-mts, 1,31 мкл 381 г/л Ficoll70, 1,11 мкл 271 г/л BSA и 1 мкл 25 мМ GTP к 5,71 мкл реакционного буфера (RB). Общий объем раствора составляет 10 μл, содержащий в конечном растворе 2 μM FtsZ-YFP-mts, 50 г/л Ficoll70, 30 г/л BSA и 2,5 мМ ГТФ. Держите его на льду перед использованием для инкапсуляции в GUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакционный буфер FtsZ (RB) содержит 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 150 мМ GluK, 5 мМ GluMg.
  2. Актиново-пучковая смесь
    1. Для инкапсуляции актиновых пучков сначала готовят мастер-смесь актина объемом 10 мкл (A-Mix), содержащую в воде 86% G-актина, 10% Atto488-актина и 4% биотинилированного актина. Для этого этапа приготовьте белковые исходные растворы в соответствии с инструкциями производителя. Затем для получения конечной концентрации 35,42 мкМ A-Mix добавьте 6,39 μ л 2 г/л G-актина, 1,48 мкл 1 г/л Atto488-актина, 1,19 мкл 0,5 г/л биотинилированного актина и 0,9 мкл H2O. Храните на льду и накрывайте от света.
    2. Чтобы предотвратить предварительную полимеризацию и связывание актина за пределами GUV, приготовьте окончательный раствор актина за несколько минут до инкапсуляции. Конечный раствор состоит из 7% йодиксанола, 0,01 г/л нейтравидина, 2,4 мкМ A-Mix, 0,6 мкМ Фашина, 10 г/л БСА, 20 г/л Ficoll70 и 5 мМ АТФ в буфере для полимеризации актина.
      1. Для приготовления этого окончательного раствора, который необходимо постоянно держать на льду, добавьте в следующем порядке: 2,92 мкл 60% йодиксанола, 10,25 мкл Н2О, 2,5 мкл 0,1 г/л нейтравидина, 0,92 мкл 271 г/л БСА, 1,31 мкл 381 г/л Ficoll70, 2,5 мкл 10-кратного буфера для полимеризации актина, 1,69 мкл 35,42 мкМ A-Mix, 1,65 мкл 9 мкМ Fascin и 1,25 мкл 100 мМ АТФ. Хорошо перемешайте и быстро возьмите 5 μл, необходимых для капсулирования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: измерьте осмолярность этого внутреннего раствора с помощью осмометра (~430 мОсм/кг). Подходящая наружная растворная смесь с одинаковой осмолярностью должна быть приготовлена путем разведения глюкозы в воде до достижения того же значения осмолярности (см. шаг 3.2). 10x Актиновый полимеризационный буфер содержит 100 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM KCl и 50 мМ MgCl2.

3. Производство GUV и инкапсуляция in vitro

  1. Производство GUV в трубах: инкапсуляция FtsZ
    1. Для инкапсуляции FtsZ добавьте 500 мкл реакционного буфера (RB) FtsZ в пластиковую пробирку объемом 1,5 мл и осторожно добавьте 200 мкл липидно-масляной смеси (приготовленной на шаге 1.6 выше), чтобы обеспечить образование границы раздела нефть-вода и осаждение монослоя липидов на этой границе.
    2. Чтобы образовать эмульсию, сначала возьмите еще одну 1,5 мл тюбика и добавьте 200 мкл липида в масло. Инкубируйте эту пробирку при 37 °C в течение ~10 минут перед формированием эмульсии.
    3. После инкубации добавьте в эту пробирку 5 мкл белковой смеси FtsZ (приготовленной в соответствии с 2.1.1). Белок объемом 5 мкл в водных средах опускается на дно пробирки в виде капель.
    4. Сделайте эмульсию, слегка постукивая по дну тюбика 5-6 раз, пока раствор не станет заметно мутным.
    5. Аккуратно нанесите эту эмульсию пипеткой и поместите ее поверх границы раздела «вода-масло» (приготовлено в шаге 3.1.1 выше).
    6. Центрифугируйте при 6000 x g в течение 30 минут при предварительно нагретой температуре 37 °C и поддерживайте эту температуру до окончания производства везикулы.
    7. Дайте образцу остыть до комнатной температуры в течение почти 30 минут перед визуализацией.
    8. Удалите верхний слой масла, аккуратно пипетируя с верхней части пробирки, оставив около 100-200 мкл раствора для визуализации.
    9. Разрежьте ножницами наконечник пипетки под наклоном и аккуратно наберите 50-100 мкл раствора GUV со дна пробирки. Это решение будет использоваться для визуализации.
  2. Производство GUV непосредственно в 96-луночных планшетах: инкапсуляция актина
    1. Для инкапсуляции актина сначала приготовьте смесь внешнего раствора (глюкозу в воде) с той же осмолярностью, что и внутренняя смесь актина. Чтобы соответствовать ~430 мОсм/кг внутренней смеси, приготовьте внешнюю смесь раствора, добавив 198 мкл 2 М глюкозы в 802 мкл H2O.
    2. Чтобы сделать везикулы непосредственно на луночной пластине, сначала пассивируйте одну лунку из 96-луночной пластины. Добавьте в лунку 100 мкл 10 г/л BSA и инкубируйте в течение 10-15 минут. Затем промойте лунку наружным раствором объемом 100 мкл пять раз, осторожно, чтобы не коснуться кончиком пипетки дна пассивированного стекла. После завершения промывки оставьте в лунке 100 мкл наружной смеси раствора.
    3. Аккуратно добавьте в лунку смесь липидов в масле объемом 50 μл, чтобы приготовить монослой липидов поверх наружного раствора. Чтобы обеспечить правильное осаждение масла на вершине водной фазы, положите наконечник пипетки на одну сторону лунки и дайте маслу соскользнуть со стенки скважины.
    4. Чтобы получить эмульсию, сначала возьмите тюбик объемом 1,5 мл и добавьте 100 мкл липидов в масло. Инкубируйте эту пробирку при 37 °C в течение ~10 минут перед формированием эмульсии.
    5. Добавьте 2,5 мкл конечного раствора актина (из шага 2.2.2) в пробирку, содержащую 100 мкл липидно-масляной смеси (шаг 1.6 выше). Белок объемом 2,5 мкл в водной среде опускается на дно пробирки в виде капель.
    6. Приготовьте эмульсию, слегка постукивая по дну тюбика 10-20 раз, пока раствор не станет заметно мутным.
    7. Аккуратно нанесите эту эмульсию пипеткой и поместите ее поверх границы раздела «вода-масло» (приготовлено на шаге 3.2.3 выше). Погрузите кончик пипетки осторожно в середину масляного монослоя и нанесите эмульсию. Эмульсия образует мутное облако, заключенное в масляной монослойной фазе.
    8. Центрифугируйте 96-луночный планшет при давлении 200 x g в течение 20 мин при предварительно нагретой температуре 37 °C и поддерживайте эту температуру до окончания производства везикул.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугируйте при 400 x g в течение 10 минут, чтобы сократить время производства везикул. Тем не менее, придерживайтесь этих параметров центрифугирования для достижения наилучших результатов. Центрифугирование при давлении свыше 400 x g приводит к образованию уплотненных везикул с липидными агрегатами, накапливающимися в нижней части рентгенографической пластины.
    9. Дайте образцу остыть до комнатной температуры в течение почти 30 минут перед визуализацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прямая визуализация может быть выполнена на скважине без необходимости удаления верхнего слоя нефти или переноса везикул в другую камеру/скважину.

4. Визуализация и реконструкция 3D-изображений

  1. Возьмите планшет для визуализации 96 и пассивируйте его с помощью BSA в течение ~10 минут перед переносом образца на планшет для визуализации (см. шаг 3.2.2).
  2. Перенесите раствор GUV на пассивированную луночную пластину.
  3. Установите пластину лунки на предметный столик инвертированного конфокального микроскопа на 40-кратном водяном объективе.
  4. Сосредоточьтесь на любой области интереса (ROI) и сделайте последовательность изображений z-стека из выбранной ROI с фиксированными интервалами z-шага. В результате протокола получаются GUV размером 5-30 мкм, поэтому интервал может быть зафиксирован на уровне 0,5-1 мкм, по мере необходимости.
  5. Сохраните каждую последовательность изображений z-стека в .tiff формате.
  6. Откройте интересующую вас последовательность изображений в программном обеспечении для обработки изображений (ImageJ/Fiji). Определите изображение с максимальной интенсивностью. Удерживайте ctrl+shift+c, чтобы открыть окно «Яркость и контрастность», и нажмите « Авто».
  7. В меню ImageJ/Fiji перейдите в раздел «Анализ» > «Установить масштаб » и введите известное физическое расстояние и его единицы измерения для каждого пикселя изображения.
  8. В меню ImageJ/Fiji перейдите в проект Image > Stacks > Z , чтобы воссоздать 3D-изображение из z-стека. Установите для параметра Тип проекции значение Стандартное отклонение. Для остальных настроек можно использовать параметры по умолчанию (Начать срез и Остановить срез).
    ПРИМЕЧАНИЕ: остерегайтесь артефактов проекции стандартного отклонения, возникающих из-за наложения z-стеков в 3D-реконструкции. Чтобы убедиться в отсутствии артефактов, удалите z-стеки в нижней полусфере сферы, чтобы наблюдать только за проекцией верхней половины.

5. Статистический анализ частоты GUV на основе размера

  1. Получите изображения Z-стека интересующих вас GUV, как описано в шагах 4.4 и 4.5. Чтобы получить изображение как можно большего количества GUV в широком поле зрения, приобретайте конфокальные стеки с 1-кратным или 2-кратным зумом.
  2. Откройте последовательности Z-стека в программном обеспечении для обработки изображений (в данном случае ImageJ/Fiji), как описано в пункте 4.6.
  3. Выберите канал отображения, на котором был получен мембранный флуоресцентный сигнал, щелкнув полосу с буквой c под изображением. Отрегулируйте яркость и контрастность изображения, как описано в пункте 4.6.
  4. Перемещайтесь по различным плоскостям, полученным путем нажатия на z-полосу под открытым изображением. Выберите плоскость, в которой диаметр анализируемого везикулы является наибольшим.
  5. Откройте менеджер ROI в ImageJ/Fiji, нажав « Анализ > Инструменты» > Менеджер ROI.
  6. В инструментах, доступных на главной панели ImageJ/Fiji, нажмите на овальное выделение.
  7. Нарисуйте круг, который подходит к GUV, следуя интенсивности флуоресценции мембраны GUV. Чтобы нарисовать выделенный круг, нажмите клавишу Shift и перетащите мышь, чтобы расширить круг до размера пузырька. Выделение круга можно перемещать, одновременно щелкнув левой кнопкой мыши по центру везикулы и перетащив мышь в нужное место.
  8. Сохраните выбранный круг в Менеджере ROI, нажав кнопку Добавить [t], расположенную на панели параметров Менеджера ROI.
  9. Чтобы получить размер везикулы в микронах, нажмите на кнопку «Измерить », расположенную на панели менеджера ROI. Появится новое окно. В качестве измерения диаметра везикулы примите значение, отображаемое в столбце Основной или Младший (оба столбца должны иметь одно и то же значение, так как они относятся к осям эллипса).
  10. Используйте программное обеспечение для построения графиков (Excel, Origin, Prism) для создания гистограммы, в которой указана доля GUV для различных диапазонов размеров.

Результаты

В качестве первого шага были получены GUV с мембранным разделением фаз с использованием модифицированного метода инвертированной эмульсии (рис. 1A). Это приводит к высокому выходу GUV, которые демонстрируют мембрану, разделеннуюна домены Ld и Lo , представленные меткой Atto 655-DOPE на домене Ld и темными областями, соответствующими немеченым доменам Lo (рис. 1B). Этот метод позволяет получить фазоразделенные GUV размером от 5 до 30 мкм (рис. 1C) при повышенных температурах (все этапы выполняются при 37 °C и визуализируются на RT). Кроме того, скорости центрифугирования были отрегулированы таким образом, чтобы обеспечить включение исходных составляющих липидов в GUV, а также избежать чрезмерного перенаселения.

Кроме того, чтобы продемонстрировать успешную инкапсуляцию биомолекул с использованием эмульсионного метода, описанного в настоящем протоколе, в отдельных экспериментах были восстановлены как FtsZ, так и актиновые сети. Сети FtsZ повторяются внутри GUV, которые проявляются в виде филаментов, преимущественно связывающихся с доменами Ld через их мембранную целевую последовательность (MTS) в присутствии 2,5 мМ GTP и 50 г/л Ficoll70 (как показано на рисунке 2). Сети наблюдали примерно через 1 ч после стадии инкапсуляции. Тем не менее, сети актомиозинов проявляются в виде тонких пучков (в отличие от толстых сетей FtsZ) после восстановления в GUV (рис. 3). Следует отметить, что биотинилированные липиды играют решающую роль в связывании сетей актомиозинов с мембраной GUVs. Без биотинилированных липидов пучки актомиозина не могут принимать изогнутую конфигурацию и остаются прямыми, короткими и жесткими пучками в просвете вместо того, чтобы прилипать к мембране в виде запутанной сетки длинных пучков (рис. 4).

В протоколе модифицированной эмульсии скорость центрифугирования регулируется для получения фазовых разделенных GUV, как упоминалось ранее. Действительно, более высокие скорости центрифугирования с образцами, содержащими сети актомиозинов (600 x g в течение 15 мин), приводят к агрегации везикул в тканеподобную конфигурацию внутри продуктивной скважины. Таким образом, во всех стандартных экспериментах по восстановлению актомиозиновых сетей оптимальная скорость центрифугирования была установлена равной 200 x g для получения неагрегированных GUV (рис. 5).

figure-results-1
Рисунок 1: Однокамерная генерация фазово-разделенных GUV с использованием метода переноса двойной эмульсии. (A) Экспериментальная схема ключевых этапов однокамерного производства фазово-разделенных везикул с помощью переноса двойной эмульсии. (B) Конфокальная Z-проекция полученных GUV, полученная в соответствии с методом, описанным в A. Масштабная линейка составляет 50 мкм. (C) Гистограмма с долей фазово разделенных GUV, сгенерированных в соответствии с их диаметром. Проведенных экспериментов n = 3, общее количество проанализированных GUV в одном эксперименте = 100. Данные, отображаемые в виде средних значений, отдельные точки данных являются тремя независимыми экспериментами. Погрешности представляют собой стандартное отклонение трех экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Фазоразделенные везикулы с инкапсулированными сетями FtsZ. (A) Конфокальные 3D-проекционные изображения, выполненные на полностью захваченном z-стеке фазово-разделенного GUV, содержащего сеть FtsZ. (B) Конфокальные Z-проекционные изображения, выполненные только на верхней половине пузырька. Из-за неоднородного образования доменов на поверхности GUV 3D-реконструкция приобретенных конфокальных срезов показывает перекрытие липидных доменов из верхней и нижней областей везикулы. Чтобы предотвратить наложение и облегчить визуальный осмотр доменов, нижняя половина полученных z-стеков удаляется из файла. Полученная верхняя половина затем используется для ее 3D-проекции с помощью стандартного отклонения. Масштабные линейки имеют размер 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Фазоразделенные везикулы с инкапсулированными актомиозиновыми сетями. (A) Конфокальные Z-проекционные изображения всей полученной стопки с увеличенным изображением скважины после добычи везикул. Полученный высокий выход везикул позволяет изучать различные структуры актомиозина внутри везикул. Масштабная линейка представляет собой 50 мкм. (B) Конфокальные Z-проекционные изображения, выполненные на верхней половине везикулы. Для облегчения визуального анализа липидных доменов для выполнения 3D-проекции используется только верхняя половина срезов изображения. Масштабная линейка составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Важность биотинилированных липидов для генерации мембранно-связанных актомиозиновых сетей внутри фазовых разделенных везикул. Конфокальные 3D-проекции, изображающие фазоразделенные везикулы с неприкрепленными актомиозиновыми сетями. Если биотинилированные липиды не включаются в смесь, то структуры актомиозина образуются в просвете и не приобретают изогнутую конфигурацию на внутренней створке везикул (правая панель, актин помечен Atto488). Масштабная линейка составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Иллюстрация 5: Влияние скорости центрифугирования на образование фазоразделенных везикул путем переноса эмульсии. Конфокальные 2D-изображения, показывающие образец GUV, полученный с использованием силы центрифугирования 600 x g в течение 15 минут. Используемая скорость центрифугирования, превышающая оптимизированные 200 x g, приводит к агрегации везикул в тканеподобную конфигурацию внутри лунки. Масштабная линейка составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Одной из основных проблем для восстановления in vitro мембранных модельных систем является инкапсуляция белков внутри фазовых разделенных GUV за счет их подготовки при высоких температурах. Действительно, генерация этого типа фазовых разделенных везикул с помощью одногорчкового синтеза может привести к трудностям, возникающим из-за деградации белков при повышенных температурах. Таким образом, данный протокол описывает оптимизированные условия для наблюдения за разделением фаз мембраны при использовании метода двойной эмульсии для производства GUV при физиологических температурах при одновременном поддержании активности инкапсулированных белков. Этот подход вводит отрицательный заряд в оба домена, чтобы облегчить связывание любых желаемых белков, когда электростатические взаимодействия являются предпосылкой. В случае инкапсуляции FtsZ, несмотря на наличие отрицательного заряда в обоих доменах, цитоскелетные сети развиваются и связываются преимущественнос доменами Ld, что указывает на то, что наряду с отрицательным зарядом текучесть мембраны является существенным требованием для связывания белка18. Кроме того, в случае инкапсуляции актина сети развиваются над областями мембраны, в которые включены биотинилированные липиды19.

Несмотря на то, что анализ переноса эмульсии широко используется в литературе, он был применен только для производства однородных GUV. Таким образом, данный протокол состоит из нескольких модифицированных аспектов анализа, которые позволяют наблюдать за образованием доменов в мембране. Одним из основных аспектов в этом отношении является температура. Для наблюдения за доменами, а также для поддержания функциональности белков (в частности, формирования цитоскелетной сети) этот протокол использует температуру 37 °C для производства GUV. С одной стороны, при производстве GUV при более высокой температуре, инкапсулированные белки теряют свою функциональность, пребывая в просвете и не полимеризуясь в структуры более высокого порядка. С другой стороны, если ГУВ производятся при более низкой температуре, то фазового разделения в мембране не наблюдается. Таким образом, 37 °C становится оптимальной температурой для производства GUV в экспериментах.

Важно отметить, что этот протокол предусматривает две возможные системы анализа для производства GUV по одному и тому же принципу переноса эмульсии: внутри трубок и луночных планшетов. Оба имеют преимущества и недостатки, которые пользователю может потребоваться принять во внимание на этапе планирования эксперимента, чтобы определить, какая система лучше всего соответствует его потребностям. Действительно, пластиковые пробирки не требуют центрифуги, оснащенной ротором для луночных планшетов, они проще в обращении и позволяют контролировать коэффициент разбавления везикул после производства и перед визуализацией. Тем не менее, они требуют больших объемов (как для нефти, так и для водной фазы) и удаления масляного слоя после добычи для экстракции GUV, что может оставить остатки нефти в лунке для визуализации, если этот этап не будет выполнен тщательно. В качестве альтернативы, планшеты для лунок требуют использования меньшего объема образца, позволяют инкапсулировать различные внутренние условия последовательно и одновременно, а также не требуют экстракции GUV, поскольку везикулы могут быть визуализированы сразу после добычи в той же добывающей скважине. Основным недостатком планшетов для лунок является агрегация везикул и необходимость корректировки параметров центрифугирования для достижения выхода продукта, аналогичного тому, который наблюдается в пробирках.

Независимо от используемой системы инкапсуляции (трубки или луночные планшеты), этот подход показывает, что для производства GUV, а также для облегчения полимеризации инкапсулированных белков требуются оптимальные условия скученности. В частности, следуя этому протоколу, наилучшее состояние для GUV с инкапсулированным FtsZ наблюдалось при концентрации 30 г/л BSA и 50 г/л Ficoll7018; тогда как для актина требовалась смесь 10 г/л BSA, 7% йодиксанола и 20 г/л Ficoll7019.

Еще одним важным аспектом производства GUV является скорость и время центрифугирования. Для формирования сетей FtsZ при вышеупомянутых концентрациях скученности центрифугирование при 6000 x g в течение 30 мин приводит к образованию популяции GUV, которые хорошо распределены и разделены по планшету с изображением. И наоборот, для актина 200 x g в течение 20 мин позволяет получить высокий выход GUV. Если скорость центрифугирования или время центрифугирования уменьшаются, это сказывается на выходе GUV, в то время как увеличение его выше указанных значений приводит к агрегации GUV. В указанных условиях этот протокол генерирует GUV с максимальной эффективностью инкапсуляции, а также отдельные GUV, не слипающиеся друг с другом.

В то время как этот протокол может быть обобщен на любые липиды и инкапсулированные биомолекулы, желаемый состав мембраны и содержимое везикул диктуют параметры центрифугирования, которые позволяют генерировать фазоразделенные везикулы. Таким образом, этот протокол служит руководством для обеспечения производства различных везикул с мембранными доменами.

Такие методологии восстановления in vitro в фазовых разделенных GUV имеют решающее значение для понимания сложной динамики белковых мембран, опосредованной через липидные домены, учитывая при этом сложность клеточных мембран14. Небольшой размер и высокая динамическая природа этих липидных доменов затрудняют характеристику межфазных взаимодействий in vivo. Таким образом, GUV служат жизненно важным инструментом из-за их относительной простоты приготовления и физико-химической модуляции, а также их пригодности для анализа с помощью световой микроскопии.

Кроме того, инкапсуляция функциональных молекул в гетерогенных биоинтерфейсах представляет собой многообещающее применение в области наномедицины. В частности, разработка функционализированных систем доставки лекарств с различными свойствами, возникающими в результате асимметричного распределения и разделения биомолекул на ограниченные участки на их поверхности21. Лекарственно-липидные взаимодействия играют значительную роль в фармакокинетических свойствах лекарственных средств, таких как их транспорт, распределение и накопление, что в конечном итоге влияет наэффективность используемых препаратов. Таким образом, понимание роли этих взаимодействий в фармакокинетических свойствах лекарств имеет решающее значение для разработки эффективных лекарств. Модельные липидные мембраны могут быть исследованы для понимания механизмов их взаимодействия с пептидами, полимерами и наноносителями23. Таким образом, изменения в липидном составе клеток и тканей при определенных заболеваниях могут изменять биофизические взаимодействия, которые могут быть изучены для разработки целевых препаратови систем доставки лекарств.

В заключение, описанный здесь протокол обеспечивает простую стратегию создания фазово-разделенных GUV с инкапсулированными белками, закрепленными на их внутренней липидной створке. Создание этих везикулярных систем имеет многообещающее применение в таких областях, как биотехнология и синтетическая биология, где многокомпонентные сборки со сложными функциональными возможностями для имитации клеточных функций могут принести инновационные решения и новые приложения.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить MPIB Core Facility за помощь в очистке белка, Микаэлу Шапер за клонирование плазмид, Керстин Рёрль за очистку белка и Сандру Ортмайер за липидные препараты. Авторы также хотели бы поблагодарить Адриана Мерино-Саломона и Сюнши Кохьяму за полезные дискуссии о условиях краудпера и инкапсуляции белков. М.Р.-Л. является частью проекта IMPRS-ML и проекта ONE MUNICH, поддерживаемого Федеральным министерством образования и научных исследований (BMBF), а также Свободным государством Бавария в рамках Стратегии совершенствования Федерального правительства и земель. Авторы также хотели бы выразить признательность за поддержку Центру нанонауки (CeNS) в Мюнхене.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-rac-глицерин) (натриевая соль) (DOPG)Avanti Polar липиды840475В хлороформе
1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC)Avanti Полярные липиды850375В хлороформе
1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-(кап биотинил) (соль натрия) (18:1 биотинил кэп ПЭ) АвантиПолярные липиды870273в хлороформ
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рак-глицерин) (соль натрия) (DPPG)Avanti Polar липиды840455В хлороформе
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC)Avanti Polar липиды850355в хлороформе
96-Well Flat-Bottom Microplate (SensoPlate)
Актин (альфа-актин скелетных мышц, кролика)HYPERMOL8101-01
Atto488-Актин (альфа-актин скелетных мышц, кролика)HYPERMOL8153-01
Atto655-DOPEATTO-TECAD 655-16Порошковая
ванна СоникаторБрэнсон 1510R-MTHБрэнсоник Ультразвуковой очиститель
биотин-актин (альфа-актин скелетных мышц, кролика)HYPERMOL8109-01
BSASigma AldrichA6003
ЦентрифугаEppendorf5424R
ЦентрифугаEppendorf5804 R
ХлороформSigma Aldrich67-66-3
Холестерин (овец)Avanti Polar липиды700000In chloroform
DecaneTCI Deutschland GmbHD0011
Fascin (человеческий, рекомбинантный)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)CS-FSC01-A
Ficoll70Sigma AldrichF2878
Iodixanol (OptiPrep)Sigma AldrichD1556
LSM800 конфокальный лазер сканирующий микроскопCarl ZeissC-Apochromat 40  ×  /1.2 Объектив для погружения в воду. Твердотельные лазеры с диодной накачкой: 488  нм и 640  Нм.
Минеральное маслоSigma Aldrich8042-47-5
Myosin II (скелетные мышцы кролика)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)MY02-A
NeutravidinThermo Fisher Scientific Inc.31000
ОсмометрFiske AssociatesFiske Micro-Osmometer модель 120
Greiner Bio-One  ГмбХ07-000-109

Ссылки

  1. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  2. Imai, M., Walde, P. Giant unilamellar vesicles: From protocell models to the construction of minimal cells. The Giant Vesicle Book. , (2019).
  3. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Res Lett. 8 (1), 102(2013).
  4. Litschel, T., Schwille, P. Protein Reconstitution Inside Giant Unilamellar Vesicles. Annu Rev Biophys. 50 (1), 100620-114132 (2021).
  5. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  6. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss Chem Soc. 81 (0), 303-311 (1986).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  8. Dürre, K., Bausch, A. R. Formation of phase separated vesicles by double layer cDICE. Soft Matter. 15 (47), 9676-9681 (2019).
  9. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  10. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nat Commun. 7 (1), 10447(2016).
  11. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  12. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the Inverted Emulsion Method for High-Yield Production of Biomimetic Giant Unilamellar Vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  13. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys J. 91 (11), 4064-4070 (2006).
  14. Lopes dos Santos, R., Malo, M., Campillo, C. Spatial Control of Arp2/3-Induced Actin Polymerization on Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. ACS Synth Biol. 12 (11), 3267-3274 (2023).
  15. Sun, Q., Fu, Y., Wang, W. Temperature effects on hydrophobic interactions: Implications for protein unfolding. Chem. Phys. 559, 111550(2022).
  16. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of temperature on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 25 (21), 6432-6438 (1986).
  17. Concha-Marambio, L., Maldonado, P., Lagos, R., Monasterio, O., Montecinos-Franjola, F. Thermal adaptation of mesophilic and thermophilic FtsZ assembly by modulation of the critical concentration. PLoS One. 12 (10), e0185707(2017).
  18. Kanwa, N., Kohyama, S., Fröhlich, L., Desai, A., Schwille, P. Mutual dependence between membrane phase separation and bacterial division protein dynamics in synthetic cell models. Angew Chem Int Ed Engl. 64 (6), e202417800(2025).
  19. Reverte-López, M., et al. Self-organized spatial targeting of contractile actomyosin rings for synthetic cell division. Nat Commun. 15 (1), 10415(2024).
  20. dos Santos, R. L., Campillo, C. Studying actin-induced cell shape changes using Giant Unilamellar Vesicles and reconstituted actin networks. Biochem Soc Trans. 50 (5), 1527(2022).
  21. Staufer, O., et al. Microfluidic production and characterization of biofunctionalized giant unilamellar vesicles for targeted intracellular cargo delivery. Biomaterials. 264, 120203(2021).
  22. Lopes, D., Jakobtorweihen, S., Nunes, C., Sarmento, B., Reis, S. Shedding light on the puzzle of drug-membrane interactions: Experimental techniques and molecular dynamics simulations. Prog Lipid Res. 65, 24-44 (2017).
  23. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: applications in drug discovery and drug delivery. Mol Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  24. Schulz, M., Werner, S., Bacia, K., Binder, W. H. Controlling Molecular Recognition with Lipid/Polymer Domains in Vesicle Membranes. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (6), 1829-1833 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GUVFtsZ

Похожие статьи