Методическая статья

Синтез 13С2-ретинилацетата и подготовка дозы для испытаний на разбавление изотопов ретинола

603 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68535

⸱

22 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

В этой статье

Краткое содержание

Ретинилацетат обычно обозначается двумя 13С, когда масс-спектрометрия газовой хроматографии-горения-изотопного отношения используется для анализа сыворотки крови и грудного молока. В данной работе описан синтез 13С2-ретинилацетата и подготовка доз для тестов на разбавление изотопов ретинола, которые должны быть доставлены с помощью пипетки положительного вытеснения или туберкулинового шприца.

Аннотация

Тест на разведение изотопов ретинола (RID) является наиболее чувствительным методом оценки статуса витамина А путем оценки общих запасов печени, считающихся референтным стандартом. Для масс-спектрометрического детектирования газовой хроматографии-горения-изотопного отношения к ретиноловому фрагменту добавляют 13С. Процесс синтеза 13С-ретинилацетата начинается с встречающегося в природе β-ионона. Вкратце, С18-тетраенкетон синтезируется из β-ионона и очищается. Если желателен 13С-4-ретинилацетат, карбанион 13С-2-меченого триэтилфосфоноацетата может быть использован для добавления двух 13С к β-иононному фрагменту перед добавлением трех атомов углерода ацетона для синтеза С18-тетраенкетона. Если требуется 13С-3-ретинилацетат, то три атома углерода ацетона могут быть помечены 13С.

Для наиболее часто используемого 13С-2-ретинилацетата для будущего анализа с помощью масс-спектрометрии соотношения газовых хроматографий-изотопов горения используют модифицированную процедуру Виттига-Хорнера, и немеченый тетраенкетон С18 вступают в реакцию с карбанионом 13 С-2-меченого триэтилфосфоноацетата с добавлением двух-13С к 14 и 15 положениям молекулы ретинола. Полученный этиловый эфир восстанавливают до спирта и этерифицируют до 13С2-ретинилацетата с уксусным ангидридом. Полностью транс-изомер очищается на 8%-ном дезактивированном водой оксиде алюминия с использованием относительно безвредных, высоколетучих растворителей – гексанов и диэтилового эфира, которые удаляются путем ротационного испарения и сонификации масляных доз. Продукт характеризуется ультрафиолетово-видимой (UV-Vis) спектроскопией, тонкослойной хроматографией (TLC) и жидкостной хроматографией высокого давления (ВЭЖХ) в соответствии с аналитическими стандартами. Концентрированная доза хранится растворенной в соевом масле при температуре -80 °С. Конечные дозы разбавляют в соевом масле (~200 мкл/доза) и количественно оценивают с помощью УФ-ВИД спектроскопии против транспортного соевого масла. Дозы измеряются для доставки человеку с помощью дозатора вытеснения или туберкулиновых шприцев для теста RID. С использованием соответствующих предположений рассчитываются общие запасы в организме, а также оцениваются общие запасы печени.

Введение

Разведение изотопов ретинола (РИД) является единственным биомаркером статуса витамина А, который количественно измеряет общие запасы витамина А в организме и с соответствующими допущениями может оценить общие запасы витамина А (ТЛР). Это наиболее чувствительный способ измерения статуса витамина А и воздействия вмешательств, содержащих либо преформированный ретинол, либо провитамин А каротиноиды. Несмотря на техническую сложность RID, она является точной и минимально инвазивной, поскольку для нее требуются только образцы крови, а не биопсия печени1. Тест RID включает в себя введение дейтерированного или меченного 13С ретинилацетата, в зависимости от платформы масс-спектрометра. Перед введением дозы берется исходный образец крови, что важно при использовании 13С-меток, но может быть сделано в случайно выбранной подгруппе. Второй образец собирают после того, как меченный 13С ретинилацетат был смешан с TBS1.

Меры по профилактике дефицита витамина А включают обогащение продуктов питания, биофортификацию, диверсификацию рациона питания и прием добавок. Тем не менее, в некоторых странах имели место дублирующие друг друга вмешательства, нацеленные на одних и тех же людей, что приводило к гипервитаминозуА2, что требовало создания системы мониторинга для оценки результатов программы. Таким образом, необходимы методы, которые количественно измеряют статус витамина А. Работая с государствами-членами, Международное агентство по атомной энергии (МАГАТЭ) содействует мирному использованию изотопов в исследованиях и оценках, что способствует применению теста RID. Тест RID набирает обороты и в скором времени может быть использован в крупных обследованиях населения для оценки состояния витамина А от дефицита до избытка в странах, осуществляющих мероприятия по витамину А3.

Ранее 10,11,14,15-13 С 4-ретинилацетатом синтезировали с использованием модификаций Bergen et al. для дейтерированного ретинилацетата 4,5. Это соединение использовалось в экспериментах накрысах 6 и людях с помощью газовой хроматографии-горения-изотопного отношения (GCCIRMS), адаптированной для анализа7. Из этих ценных экспериментов мы определили, что GCCIRMS настолько чувствителен, что для теста RID с использованием GCCIRMS не потребовалось четыре 13C. Таким образом, затраты на индикатор снижаются при использовании только двух 13C в 14 и 15 положениях молекулы ретинола (рис. 1). Эта модификация снижает затраты, связанные с синтезом, и приводит к увеличению выхода продукции за счет синтетического пути. В данной работе описан масштабируемый протокол для его синтеза.

GCCIRMS более чувствителен, чем другие типы масс-спектрометрии, для измерения стабильных изотопов8 и может реагировать на изменения в рационе питания и изменения естественного обогащения С13в сывороточном ретиноле. Это было описано у песчанок9 илюдей 10, потреблявших кукурузу, и у людей, включенных в овощную интервенцию11. Действительно, естественная распространенность 13С варьируется в разных популяциях и должна быть определена у субъектов, включенных в оценку RID12. Тем не менее, для измерения естественного обогащения с помощью RID использовались небольшие подгруппы у детей из Ганы и Таиланда13,14 лет и тайских женщин15 лет. Для наиболее точного определения ТБС на индивидуальном уровнеследует определить индивидуальный исходный уровень обогащения 13С.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: При включении людей в качестве субъектов исследований, интервенций или оценочных исследований одобрение Институционального наблюдательного совета (IRB) должно быть получено с соответствующими процедурами информированного согласия.

1. Синтез 13С2-ретинилацетата (рис. 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры синтеза и количественного определения выполняются при флуоресцентном освещении золотом для предотвращения деградации и изомеризации соединений.

  1. Синтезируйте β-ионилацетат в большой партии из коммерчески доступного β-ионона. Например, покройте гидрид натрия () (4 г, 0,16 моль) 100 мл эфира. Добавьте немеченый триэтилфосфоноацетат (36 г, 0,16 моль) в 100 мл эфира по каплям и перемешивайте в течение 2 ч.Н2 высвобождается, и исходная суспензия становится прозрачной и янтарной.
    ВНИМАНИЕ: Гидрид натрия () является сильным восстановителем, который полезен в широком спектре химических реакций. Тем не менее, лабораторные пожары могут произойти из-за его высокой экзотермической реакции с водой в атмосфере16,17. Рекомендуется получить доступ к паспорту безопасности; опубликованы дополнительные рекомендации по обращению с умеренно пирофорными твердыми веществами, такими как18. Держите его во взвешенном состоянии в масле или нереактивном растворителе при работе, промывке реакционных сосудов и контейнерах для хранения инертным газом (например, азотом или аргоном), охлаждении реакционного сосуда и хранении в герметичных контейнерах, хранящихся в сухой среде. В нашей лаборатории в небольших количествах (~1 г) переносится в азотную среду во флаконы, а затем хранится в герметичном эксикаторе до использования.
  2. Добавьте β-ионон (21 г, 0,12 моль) в 40 мл эфира и проведите реакцию в течение ночи (~15 ч при 20 °C). На 2-й день погасите реакцию водой и извлеките этил-β-ионилиденацетат в гексаны и многократно промойте водой в серии разделительных воронок для максимального восстановления. Высушите органический слой (безводный MgSO4), профильтруйте и сконцентрируйте
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тонкослойная хроматография (ТСХ) обычно обнаруживает лишь незначительные примеси на этой стадии синтеза. Его можно хранить в течение длительного периода времени при температуре -80 °C, прежде чем перейти к следующим шагам.
  3. Реакция этил-β-ионилиденацетата (28 г, 0,11 моль) со 120 мл 1 моляра литий-гидрида алюминия (LiAlH4) в диэтиловом эфире. Погрузите реакционный сосуд в ванну с ацетоном сухого льда и непрерывно помешивайте раствор до получения β-ионилиденэтанола.
    ВНИМАНИЕ: Гидрид лития-алюминия (LiAlH4) является сильным восстановителем. Получите доступ к паспорту безопасности и ознакомьтесь с дополнительными рекомендациями по обращению с умеренно пирофорными твердыми веществами, такими как LiAlH418,19. Основной целью большинства мер предосторожности является сведение к минимуму риска воздействия LiAlH4 в атмосферу и предотвращение неконтролируемых реакций. Как правило, это включает в себя содержание этих соединений во взвешенном состоянии в масле или нереактивном растворителе при работе, промывку реакционных сосудов и контейнеров для хранения инертным газом (таким как азот или аргон), охлаждение реакционного сосуда и хранение LiAlH4 в герметичных контейнерах, хранящихся в сухой среде. В нашей лаборатории гидрид лития и алюминия приобретается в герметичных бутылях по 1 моляру вместо порошкообразной формы, при этом необходимые объемы удаляются с помощью шприца и атмосфера бутылки заменяется азотом.
  4. Растворите 28 г (0,12 моль) β-ионилиденэтанола в 300 мл гексанов. Добавляйте примерно 50 г в день 90%MnO2 в течение 3 дней (51 г, 52 г и 54 г) и перемешивайте реакционную смесь в течение большего времени (часто 2 дня при 20 °C). Наконец, добавьте 35 гMnO2 и оставьте на ночь примерно на 15 часов; Реакция завершена примерно на 90%. Отфильтруйте и промойте β-ионилиденацетальдегид изMnO2 дихлорметаном.
  5. Растворите сырой β-ионилиденацетальдегид (22 г, 0,10 моль) в 150 мл ацетона при постоянном помешивании и добавьте по каплям 10 мл 1 Н гидроксида натрия. Оставьте реакцию на 6 ч.
  6. Извлеките тетраенкетон C18 с гексанами и многократно промойте водой, используя серию разделительных воронок для максимального извлечения. Высушите полученный раствор с помощью ротационного испарителя до получения сырого тетраенкетона цис-транс C18. Поскольку транс-изомер наиболее желателен для исследований на людях, очистите смесь на 4% дезактивированном водой силикагеле (300 г) с использованием медленного градиента 0-10% этилацетата в гексане.
  7. Размешайте (1,2 г, 0,05 моль) с 50 мл эфира. Добавьте 13С 2-триэтилфосфоноацетат (11 г, 0,049 моль), растворенный в 50 мл эфира, по каплям и перемешивайте в течение 2 ч. Растворите тетраенкетон C18 (12 г, 0,044 моль) в 50 мл эфира и вмешайте в течение ночи в течение примерно 15 ч при 20 °С.
  8. Погасить реакцию водой и извлечь этиловый эфир 14,15-13 С2-ретиноевой кислоты с гексанами и промыть водой в разделительной воронке. Высушить органический слой безводным MgSO4 и концентратом; Очистите на 8% дезактивированном водой нейтральном оксиде алюминия (400 г) с медленным 0-3% диэтиловым эфиром в гексановом градиенте с получением цис/транс-изомеров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часто первая очистка содержит загрязняющие вещества, если судить по TLC. Загрязняющие вещества визуализируются путем реакции пластины TLC с парами йода. При наличии загрязняющих веществ крайне важно повторно очистить на 400 г 8% дезактивированного водой нейтрального оксида алюминия со 100% гексанами для получения чистого этилового эфира 14,15-13 C 2-ретиноевой кислоты.
  9. Уменьшите содержание этилового эфира 14,15-13 C 2-ретиноевой кислоты (3,7 г) с 15 мл 1 моляра гидрида лития и алюминия в ванне с ацетоном сухого льда при перемешивании до получения 14,15-13 C2-ретинола (рис. 1).
  10. Растворите 14,15-13 С 2-ретинола (3,5 г) в 20 мл триэтиламина. Помешивая раствор, смешайте 3,5 мл уксусного ангидрида с 7 мл триэтиламина и добавьте по каплям в колбу. Оставьте колбу на ночь в холодильнике для образования 14,15-13 С 2-ретинилацетата (примерно 15 ч).
  11. Извлечь 3,9 г сырого 14,15-13 С 2-ретинилацетата в гексаны, высушить, сконцентрировать и очистить на 500 г 8% обезвреженного водой нейтрального оксида алюминия с медленным 0-3% диэтиловым эфиром в гексановом градиенте. Мониторинг фракций с помощью ультрафиолетового видимого (UV-Vis) спектрофотометра с длиной волны 325 нм. Удалите все остатки растворителей с помощью ротационного испарителя. Оцените конечный продукт с помощью обнаружения ВЭЖХ и фотодиодов, чтобы определить соотношение цис/транс. Пример усовершенствованной градиентной системы для разделения цис/транс-профиля с помощью жидкостной хроматографии сверхвысокого давления доступен на дополнительном рисунке S1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение цис/транс обычно составляет >95% от общего числа трансгендеров на этом этапе.
  12. Для хранения в пищевом соевом масле растворить all-trans 14,15-13 С 2-ретинилацетат без других добавок и хранить в янтарном стекле, промытом азотом, при -80 °С и маркировать как концентрированное сырье.

2. Дозирование масляных растворов меченого стабильными изотопами ретинилацетата

ПРИМЕЧАНИЕ: Изотопно меченный ретинилацетат вводили в капсулах20 или в масляных растворах, поставляемых с пипеткой 21 положительного вытеснения объемом250 мкл или медицинским шприцем22 (рисунок 3). Мы проверили стабильность капсул (рис. 4), описанную ниже.

  1. Сразу после синтеза растворите меченый ретинилацетат в ~15 мл необогащенного растительного масла (например, пищевого соевого масла) до того, как он начнет кристаллизоваться, и храните в янтарном флаконе объемом 24 мл при температуре от -30 до -80 °C до готовности к получению окончательных доз.
    1. Если был куплен ретинилацетат с маркировкой, осторожно отломите верхнюю часть вакуумной ампулы, надрезав напильником, или сломайте пломбу на бутылке с завинчивающейся крышкой. В зависимости от необходимой массы налейте взвешенное количество в коричневую янтарную бутылку объемом 24 мл и добавьте небольшое количество растительного масла (скорее всего, будет достаточно 10 мл). Обрабатывайте смесь ультразвуком до тех пор, пока она не станет прозрачным раствором.
  2. Оцените необходимое количество конечного масла, умножив количество испытуемых на 200 мкл. Например, если необходимо включить 60 субъектов, соберите примерно 70 доз, чтобы их хватило на потери (примерно 10-20%). Таким образом, 70 × 200 мкл – это 14 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не полагайтесь на массу синтетического масла или кристаллов. Для количественной оценки доз необходимо использовать спектрофотометр. Весь синтетический витамин А содержит остаточные растворители. Они могут рассеиваться при сонификации или под действием слабой струи азота, но являются основной причиной, по которой только масса не может быть использована для определения изотопных доз.
    Если меченые растворы ретинилацетата хранятся в морозильной камере в течение очень длительного времени без использования, их следует повторно проанализировать, чтобы определить, произошла ли существенная деградация.
  3. Чтобы количественно определить ретинилацетат:
    1. Включите УФ-ВИД спектрофотометр (предпочтительно сканирующий двухлучевой спектрофотометр) и подключенный компьютер, если применимо. Запустите УФ-ВИД спектрофотометр в соответствии с инструкциями производителя. Дайте спектрофотометру нагреться не менее чем за 30 минут до считывания показаний.
    2. Установите две мерные колбы и крышки по 25 мл и наполните каждую по 25 мл гексанов почти до линии. Пометьте одну колбу «Масло» или «Бланк», а другую — «Витамин А» или «Доза»; затем отложите колбу с витамином А до тех пор, пока заготовки не закончатся.
    3. Налейте немного чистого соевого масла в одноразовый пластиковый стаканчик и добавьте 20-40 μL в масляную колбу, чтобы заглушить систему.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы часто используем 20 μл, но если объем холостой и изотопной дозы одинаковы, можно использовать больше.
    4. Переверните в 4-5 раз, чтобы смешать масло и гексаны, затем промойте этим раствором обе кюветы спектрофотометра из кварца и заполните оба на ~75%.
    5. Поместите обе кюветы в спектрофотометр, стараясь не касаться прозрачной передней и задней части (ручка только за матовые стороны). Для достижения наилучшей точности поверните пронумерованную лицевую сторону каждой подобранной кюветы к пользователю.
    6. Закройте над образцами дверцу, блокирующую свет.
    7. Нажмите на функцию «Пусто» или «Базовая линия » и позвольте системе измерить базовую абсорбцию масла и гексанов. Это корректирует абсорбцию раствора гексанов Oil Blank. Сканирование от 260 до 400 нм; Убедитесь, что показания равны нулю на длине волны 400 нм после завершения этого процесса. Если нет, нажмите кнопку «Ноль » и повторите сканирование. После завершения работы система готова к измерению поглощения дозы ретинилацетата.
    8. Выбросьте содержимое кюветы для образца и залейте ее раствором гексанов Доза. Поместите образец в соответствующее место и отсканируйте спектры. Выберите пик и считайте поглощение. Чистый ретинилацетат имеет только один максимум лямбды при 325 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если у вас более одного пика или один с длиной волны 280 нм, ретинилацетат деградировал и его не следует использовать для дозирования.
  4. Расчеты для шага 2.3
    ПРИМЕЧАНИЕ: E 1%, 1 см для ретинола составляет 1810 при 325 нм в гексанах. Вы будете количественно определять содержание ретинилацетата в эквивалентах ретинола.
    1. Разделите поглощение на 0,181, чтобы получить μг/мл раствора.
    2. Умножьте на 25 мл, чтобы получить μг в 20 микролитрах масляного раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример: Абсорбция 20 мкл масла в 25 мл гексанов составляет 0,295.
      0,295/0,181 = 1,630 мкг/мл × 25 мл = 40,75 мкг в 20 мкл масла
      Если для приема требуется 286 мкг, то это 140,4 мкл. Это 1 моль, но 288 г 13С2-ретинола будет вырабатываться в кишечнике из-за этикетки. Возможно, вы захотите провести разбавление, чтобы приблизиться к дозе 200 μл, и повторить вышеуказанное количественное определение.
  5. Подготовка капсул для проверки стабильности
    1. Разделите капсулы на большую белую дно и меньшие синие крышки.
    2. Поместите белые дны капсул в коробки с наконечниками для пипеток (96 капсул в коробке) и закройте, чтобы предотвратить попадание пыли внутрь капсул, и положите синие колпачки в пластиковый пакет на молнию на ночь. Выбросьте капсулы, которые треснули.
    3. Дайте масляному раствору ретинилацетата дойти до комнатной температуры. Налейте небольшое количество (~5 мл) в небольшой неиспользованный пластиковый стаканчик.
    4. Приготовьте пипетку-репитер, загрузив шприц объемом 5 мл (где 1 = 100 μл) и установив его значение «2» для дозирования 200 μL на триггерный пресс.
    5. Загрузите масло ретинилацетата в пипетку-репитер, вытянув загрузочный рукав. Выдавите не менее 4 x 200 μL аликвот обратно в чашку, чтобы очистить кончик от пузырьков воздуха.
    6. Выдайте 1 x 200 мкл аликвоты на белое дно капсулы, слегка коснувшись кончика пипетки к внутренней стенке капсулы и нажав на спусковой крючок.
    7. Когда пипетка репитера будет близка к разрядке, наберите еще масла.
    8. После того, как вы приготовите весь набор из 96 капсул, вылейте масло обратно в чашку, а затем начните слегка надевать синие колпачки на каждое белое дно, стараясь не треснуть крышки.
    9. После того, как все колпачки будут на капсулах, поднимите каждую капсулу, слегка убедитесь, что колпачок надежно закреплен, затем положите ее в коробку для наконечников.
    10. Храните капсулы при выбранной температуре и в выбранных условиях. Темноты можно достичь, храня капсулы в стеллажах под алюминиевой фольгой. Ниже приведены примеры:
      a.  в морозильной камере: -20 °C в темное время суток
      b.  в холодильнике: 4 °C в темноте
      c. на скамейке: 20 °C (комнатная температура) в темноте
      d. на скамейке, но оставленный на улице: 20 °C (комнатная температура) при стандартном флуоресцентном освещении
      e.  в печи, воспроизводя более высокие температуры окружающей среды в других местах: 37 °C в темное время суток

3. Введение дозы

ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетка положительного вытеснения была сравнена непосредственно с туберкулиновыми шприцами для определения точности и прецизионности среди техников (Рисунок 5).

Дозы вводят с помощью пипеток положительного вытеснения Rainin объемом 250 мкл или туберкулиновых шприцев объемом 1 мл.

  1. Разморозьте замороженные дозы или поместите их в холодильник с пакетами со льдом, если собираетесь на участок поля. Во время транспортировки дозы обычно оттаивают.
  2. Достаньте флакон из янтарного стекла из холодильника и откройте. Храните флакон в «кружке» или стакане, чтобы он не опрокинулся.
  3. Вставьте наконечник пипетки или туберкулиновый шприц в масло и наберите небольшое количество. Быстро нажмите на поршень, чтобы вытеснить все образовавшиеся пузырьки. Медленно наберите необходимое количество объема в пипетку или шприц. Следите за тем, чтобы не было пузырей.
  4. Протрите внешнюю сторону кончика салфеткой. Не прикасайтесь к концу наконечника пипетки или шприца, так как это приведет к вытягиванию жидкости.
  5. Положите кончик в рот участника, выпустите масло в рот и попросите человека закрыть рот и проглотить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно, если участники могут слегка запрокинуть голову назад для приема дозы.
  6. После приема дозы принимайте «чейзер» или жирную закуску, содержащую не менее 10 г жира. Детям младшего возраста следует вводить 1 мл необогащенного масла, которое подается на пластиковой ложке в качестве погонного корма. Для детей постарше и взрослых хорошим последующим перекусом станут полбутерброда с арахисовым маслом, жареный белый картофель или багет с шоколадной пастой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует провести информативное исследование, чтобы определить, какая закуска является приемлемой на местном уровне.

Результаты

Начиная с коммерчески доступного β-ионона, синтезировали 28 г этил-β-ионилиденацетата. После восстановления 22 г β-ионилиденацетальдегида взаимодействовали с ацетоном в основных условиях с образованием C18-тетраена кетона; Получено 12 г очищенного С18-тетраенкетенкетона, который на ~90% состоял из транс-транса. Впоследствии его прореагировали с карбанионом 13С 2-триэтилфосфоноацетата с использованием модифицированной процедуры Виттига-Хорнера для добавления двух 13С в положениях 14, 15 молекулы ретинола. Полученный этиловый эфир (выход 3,7 г) восстанавливали до спирта и этерифицировали до 13С-2-ретинилацетата с уксусным ангидридом, растворенным в триэтиламине. Синтетический витамин был очищен на 8% дезактивированном водой оксиде алюминия с использованием высоколетучих органических растворителей – гексанов и диэтилового эфира. Полученный препарат характеризовали с помощью УФ-ВИД спектроскопии, ТСХ и ВЭЖХ. Для длительного хранения меченый ретинилацетат хранят растворенным в соевом масле при температуре -80 °С.

Описанная выше успешная схема синтеза 14,15-13С-2-ретинилацетата изображена на рисунке 2. Общий путь, начинающийся с β-ионона, состоит из семи ступеней. Первый выход составил 0,9 г цель-транс 14,15-13 С 2-ретинилацетата. Фракции цис/транс-изомеров (1,2 г) объединяли и повторно очищали на 300 г 8% обезвреженного водой нейтрального оксида алюминия с получением дополнительных 0,3 г полностью транс-14,15-13 С-2-ретинилацетата.

Для определения стабильности ретинилацетата в капсулах ретинилацетат (1 г) растворяли в гексанах и очищали методом открытой колоночной хроматографии с использованием 300 г 8% дезактивированного водой оксида алюминия с гексанами в качестве растворителя. Ретинилацетат контролировали методами ТСХ и УФ-ВИД спектроскопии, и использовали только чистые фракции. Этот процесс идентичен тому, который используется при синтезе и очистке 13С2-ретинилацетата в лаборатории Танумихарджо для испытания RID, как описано выше. Очищенный ретинилацетат растворяли в соевом масле, органический растворитель удаляли с помощью ротационного испарителя и добавляли больше масла до конечной концентрации 7,5 мкМ (с получением 1,5 мкм на 200 мкл, среднюю точку между дозой для взрослого и ребенка для теста RID, когда для анализа использовали GCCIRMS). Концентрацию определяли методом УФ-ВИД спектроскопии, как описано выше.

Аликвоту в 200 мкл масла распределили по целлюлозным капсулам размера 3 (максимальный объем 300 мкл) для исследования стабильности. Капсулы каждой дозы хранились в пяти условиях. Темнота достигалась за счет хранения капсул в стеллажах под алюминиевой фольгой. Капсулы (150) были приготовлены для каждого состояния в общей сложности 750 капсул: i) в морозильной камере: -20 °C в темноте; ii) в холодильнике: 4 °C в темное время суток; iii) на скамейке: 20 °C (комнатная температура) в темное время суток; iv) на скамейке, но оставленной на улице: 20 °C (комнатная температура) при стандартном флуоресцентном освещении; v) в печи, воспроизводя более высокие температуры окружающей среды в других местах: 37 °C в темноте.

В исследовании стабильности капсулы измеряли по три капсулы из каждого состояния в каждой временной точке (-20 °C, 4 °C, темная комнатная температура, светлая комнатная температура, 37 °C). Всем капсулам дали дойти до комнатной температуры (сначала анализировали капсулы комнатной температуры); Изменение температуры приводит к изменению абсорбции. Капсулы отмеряли до 480 дней. Капсулы оставались стабильными в течение девяти месяцев при температуре от -20 °C до 4 °C (Рисунок 4).

Было проведено сравнение методов сравнения одноразовых туберкулиновых шприцев с пипетками положительного вытеснения Rainin в качестве эталонного стандарта. Дозатор объемного действия Rainin был откалиброван с помощью воды с учетом местной температуры и давления, а затем протестирован с помощью трех наконечников в трех экземплярах для определения целевого объема масла, выдаваемого при настройке 200 мкл на тарированную весовую лодку. Протокол дозирования проводился 10 техниками с разным уровнем опыта. Для каждого техника было протестировано восемь шприцев в трех экземплярах и сравнено с эталоном пипетки. Боковые стороны пипетки были протерты салфеткой, и масло подавалось в весовую лодку под углом, обеспечивая максимальный выброс масла. Техники были ослеплены результатами дозированной массы на протяжении всего протокола; Масса масла фиксировалась отдельным техником. Процесс повторяли с 200 мкл соевого масла с использованием восьми туберкулиновых (например, Norm-Ject) шприцев.

Статистическое программное обеспечение R было использовано для подгонки модели компонент дисперсии (FitVCA)22 (рис. 5). Измеряемые факторы вариабельности включали техника, шприц в технике и ошибку повторения. Среднее значение нормализованной доставки шприца (95% ДИ) по сравнению с объемом доставки пипетки составило 0,996 (0,912; 1,08). Дисперсия от ошибки повторения составила 64,8% от общей дисперсии, что указывает на то, что наибольшим источником вариабельности были повторные измерения в одном и том же шприце. Процентная разница между техником и шприцем внутри техника была намного ниже, составляя 22,9% и 12,3% соответственно.

Анализ подгрупп был проведен путем разделения техников на две группы (n = 5/группа) на основе опыта. Средняя нормализованная доставка шприца была одинаковой в обеих группах, но 95% ДИ была ниже для техников с большим опытом; 1,001 (0,939, 1,063) и 0,998 (0,900, 1,100) соответственно. Среди более опытных техников большая часть отклонений произошла из-за шприца в технике (57,0%) и ошибки репликации (42,9%), в то время как у менее опытных техников большая вариативность произошла из-за ошибки техника (32,7%) и ошибки репликации (67,2%).

figure-results-1
Рисунок 1: Структура ретинола с пронумерованными атомами углерода. 13С обычно добавляются в 14 и 15 положениях для использования в газовой хроматографии и масс-спектрометрии горения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Схема синтеза 14,15-13 C2-ретинилацетата, используемого в испытаниях на разбавление изотопов ретинола при использовании масс-спектрометрии газовой хроматографии-горения-изотопного отношения, используется для анализа сыворотки крови или грудного молока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Туберкулиновый шприц объемом 1 мл без мертвого объема на кончике и пипетка положительного вытеснения объемом 250 мкл, используемая для дозирования в исследованиях с использованием индикаторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Кривые деградации ретинилацетата, хранящегося в капсулах в пяти различных условиях. Условия составляют -20 °C, 4 °C, 20 °C (комнатная температура) в темноте, 20 °C (комнатная температура) при стандартном флуоресцентном свете и 37 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Дисперсионный компонентный анализ количества доставляемой дозы при сравнении туберкулиновых шприцев объемом 1 мл с пипеткой положительного вытеснения объемом 250 мкл среди 10 техников, ослепленных результатами во время оценки. Значения дозируются массой масла (200 мкл) из шприцев, нормализованных до пипетки положительного объема. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок S1: Пример окончательной проверки чистоты 14,15-13C-ретинилацетата с помощью жидкостной хроматографии под ультрадавлением. Соответствующие спектры характерны для цис/транс форм витамина. Условия UPLC были следующими: растворитель A 70:25:5 (ацетонитрил:вода:изопропанол) с 10 мМ ацетатом аммония, а растворитель B состоял из 75% ацетонитрила, 25% изопропанола. В качестве колонки использовалась колонка Acquity UPLC, BEH C18 1,7 мкМ, 2,1 x 100 мм. Колонка была установлена на 29 °C, а скорость потока составила 0,4 мл/мин. Градиент начинался со 100% растворителя А и держался в течение 5,0 мин, затем переход к 98% растворителю В через 7 мин и держался в течение 8 мин, прежде чем вернуться к 100% растворителю А в течение 1 мин и удерживаться в течение 4 мин равновесия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Несмотря на то, что существуют коммерческие источники дейтерированного и меченого 13С ретинилацетата, в литературе для квалифицированных химиков-органиков существует множество синтетических путей для ретинола. Мы выбрали синтетический путь для дейтерированного ретинилацетата и внесли соответствующие коррективы для добавления 13С в основу ретиноловой части, которые описаны выше. Синтез 14,15-13 С-2-ретинилацетата осуществляли с помощью семиступенчатой методики, начиная с коммерчески доступного β-ионона. β-ионон является природным растительным компонентом и способствует приданию ароматов, например, роз. Наиболее важным этапом на пути синтеза является образование тетраена кетона C18. Это промежуточное соединение должно быть не менее 90% чистым для последующих этапов, чтобы получить хороший урожай.

Мечение проводили с использованием модифицированной методики Виттига-Гомера с коммерчески доступным 13С2-триэтилфосфоноацетатом. Меченые соединения используются в тесте RID для определения TBS и оценки TLR. Метод использует GCCIRMS для анализа ретинола, выделенного из сыворотки или грудного молока людей, которым были дозированы физиологические уровни меченых соединений. Наиболее распространенными дозами являются 1 μмоль для детей и 2 μмоль для взрослых. В то время как анализ GCCIRMS чувствителен к обогащению изотопами, анализ сыворотки требует минимум 400 мкл сыворотки для получения достаточной массы ретинола для введения в GC.

Тест 13C-RID использовался в клинических исследованиях23, 24 и в группах африканских детей25 человек, и в будущем планируется сделать его доступным для работы на уровне населения. Мы проводили эксперименты с капсулами и шприцами, чтобы выяснить, подходят ли эти модификации для работы с населением. Капсулы должны были находиться в вертикальном положении, иначе они протекали; Мы быстро отбросили идею о том, что их можно хранить в обычных янтарных бутылках для таблеток для использования в полевых условиях. Капсулы были стабильны только в течение ~9 месяцев при температуре холодильника и морозильной камеры. Производство герметичных капсул может повысить стабильность за счет уменьшения незначительного воздействия атмосферы во время хранения. Использование капсул должно быть протестировано и подтверждено группами пользователей перед внедрением.

Конечные масляные растворы стабильны при комнатной температуре в течение ~2 месяцев, но как только они начинают разлагаться, деградация продолжается быстро. Частичная активность для тестов RID не является приемлемой, так как количество дозы используется при расчете TBS. Лучше всего хранить растворы на пакетах со льдом в полевых условиях во время использования и повторно замораживать их как можно скорее после завершения дозирования. Лучше всего взять с собой всего несколько доз больше, чем необходимо на день, а остальное держать замороженным. Замораживание и размораживание не влияют на эти растворы, потому что в самом масле есть антиоксиданты. Масляные растворы более надежны, чем образцы крови, но все же их необходимо постоянно хранить в темноте и замораживать, когда они не используются.

Дозы вводят с помощью пипеток положительного вытеснения Rainin объемом 250 мкл или туберкулиновых шприцев объемом 1 мл. Дозаторы вытеснения не подходят для доз, растворенных в масле. Наша лаборатория экспериментально сравнила эти два метода (см. Репрезентативные результаты). Введение с помощью пипетки или шприца аналогично с некоторыми отклонениями. Пипетки Rainin положительного вытеснения рекомендуются для научных или клинических исследований, но шприцы можно использовать и для работы с населением. Для максимальной точности дозирования рекомендуется использовать шприцы с небольшим мертвым объемом в наконечнике (например, Norm-Ject).

Расчеты для теста RID включают количество введенной дозы, а ошибка в величине введенной дозы пропорциональна ошибке в результирующей оценке TBS. При использовании туберкулиновых шприцев по сравнению с пипетками с положительным вытеснением среднее нормализованное количество доставок шприца было близко к 1, что указывает на то, что шприцы могут обеспечить точную доставку дозы для популяционных исследований. 95% доверительные пределы составляли примерно ± 8% от целевой дозы. Техники с большим опытом работы со шприцами имели более узкий 95% ДИ (± 6%) и меньший вклад вариативности от техника по сравнению с техниками с меньшим опытом (± 10%). Это говорит о том, что протокол обучения и валидация с использованием автомобильного масла должны быть выполнены до внедрения в полевых условиях. Эти результаты заслуживают дальнейшей проверки в каждой лаборатории, которая хочет использовать одноразовые туберкулиновые шприцы в качестве экономически эффективного и экономящего время метода доставки доз в тестах «доза-ответ» и RID в популяционных исследованиях.

Для научных и клинических исследований с использованием теста RID мы выбрали пипетку с положительным смещением, чтобы максимизировать точность на индивидуальном уровне, поскольку их точность и прецизионность составляют ≤1%. Для сравнения, модифицированный тест относительной реакции на дозу является качественным, и никакие расчеты не основаны на количестве дозы, полученной1. Поэтому мы рекомендовали использовать шприцы для теста в популяционных обследованиях и растворять дозу примерно в 0,7 мл носителя.

Тест RID является чувствительным методом количественной оценки TBS и оценки TLR, который является эталоном для оценки уровня витамина А. Он использовался во многих исследовательских приложениях с использованием дейтерия или мечения 13C. В текущих и будущих приложениях тест RID будет использоваться в клинических условиях и в подгруппах населения в опросах. Упрощение дозирования будет иметь важное значение для этих применений.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов с содержанием данной рукописи.

Благодарности

Эта работа финансировалась NIH-R01 DC019357 и Проектом координированных исследований МАГАТЭ E43035. Благодарим Николаса Кьюлера из группы статистического консалтинга Университета Висконсин-Мэдисон за помощь в анализе сравнения метода одноразового шприца.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ангидрид уксусной кислотыСигма Олдрич242845
ацетонСигма Олдрич179124
оксид алюминияСигма Олдрич199974
СтаканыЛюбойЛюбая компания по поставке стекла 
бета-иононСигма ОлдричW259500
эфирСигма Олдрич673811
Стеклянные пастеровские пипеткиЛюбойЛюбая компания по поставке стекла 
гексаныСигма178918
меченый триэтилфосфоноацетатСигма Олдрич293202
раствор гидрида лития и алюминияАкрос органика199511000
оксид марганцаСидма Олдрич310700
Пипетки прямого вытесненияРайнин17008579
ретинилацетатСигма ОлдричР4632
Разделительные воронкиЛюбойЛюбая компания по поставке стекла 
СиликагельСигма Олдрич1.07734
гидрид натрияОлдрич223441
гидроксид натрияНаучный центр ФишераС318-100
спектрофотометрЛюбое сканированиеПредпочтение отдается двойному свету
триэтиламинСигма Олдрич471283
триэтилфосфоноацетатОлдричТ61301
туберкулиновый шприцНорм-Джект19Г334
растительное маслосояПродуктовый магазин
мерные колбы (25 мл)ЛюбойЛюбая компания по поставке стекла 

Ссылки

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND) - Vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Tanumihardjo, S. A., Kaliwile, C., Boy, E., Dhansay, M. A., van Stuijvenberg, M. E. Overlapping vitamin A interventions in the United States, Guatemala, Zambia, and South Africa: case studies. Annals NY Acad Sci. 1446 (1), 102-116 (2019).
  3. Sheftel, J., Loechl, C., Mokhtar, N., Tanumihardjo, S. A. Use of stable isotopes to evaluate bioefficacy of provitamin A carotenoids, vitamin A status, and bioavailability of iron and zinc. Adv Nutr. 9 (5), 625-636 (2018).
  4. Bergen, H. R., Furr, H. C., Olson, J. A. Synthesis of tri-, tetra-, and penta-deuterated forms of vitamin A. J Labelled Cpd Radiopharm. 25 (1), 11-21 (1988).
  5. Tanumihardjo, S. A. Synthesis of 10, 11, 14, 15-13C4- and 14, 15-13C2-retinyl acetate. J Labelled Cpd Radiopharm. 44 (5), 365-372 (2001).
  6. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats using 13C4-retinyl acetate and gas chromatography-combustion isotope ratio mass spectrometry (GCCIRMS). J Nutr. 130 (1), 2844-2849 (2000).
  7. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med. 242 (15), 1508-1514 (2017).
  11. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med. 234 (2), 140-147 (2009).
  12. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in 6 diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  13. Newton, S., et al. Vitamin A status and body pool size of infants before and after consuming fortified home-based complementary foods. Arch Public Health. 74, 10(2016).
  14. Pinkaew, S., et al. Triple-fortified rice containing vitamin A reduced marginal vitamin A deficiency and increased vitamin A liver stores in school-aged Thai children. J Nutr. 144 (4), 519-524 (2014).
  15. Nimmannun, K., et al. Breast milk retinol concentrations reflect total liver vitamin A reserves and dietary exposure in Thai lactating women from urban and rural areas. J Nutr. 152 (12), 2689-2698 (2023).
  16. A campus laboratory fire involving lithium aluminum hydride. , https://ehs.stanford.edu/reference/campus-laboratory-fire-involvinglithium- aluminum-hydride (2025).
  17. Merlic, C. A., Ferber, C. J., Schroder, I. Lessons learned− lithium aluminum hydride fires. ACS Chem. Health Saf. 29 (4), 362-365 (2002).
  18. Chandra, T., Zebrowski, J. P. A safety guidance document for lithium aluminum hydride (LAH) reduction: A resource for developing specific SOPs on LAH manipulations. ACS Chemical Health & Safety. 31 (2), 162-171 (2024).
  19. Procedures for safe use of pyrophoric solids accessed. , https://ehs.ucsc.edu/programs/research-safety/documents/ucla-pyrophoric-solid.pdf (2025).
  20. Tang, G., et al. Green and yellow vegetables can maintain body stores of vitamin A in Chinese children. Am J Clin Nutr. 70 (6), 1069-1076 (1999).
  21. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  22. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2024).
  23. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).
  24. Sheftel, J., et al. Findings in 3 clinical trials challenge the accuracy of the Institute of Medicine's estimated average requirements for vitamin A in children and women. Am J Clin Nutr. 113 (5), 1322-1331 (2021).
  25. Suri, D., et al. Association between biomarkers of inflammation and total liver vitamin A reserves estimated by 13C-retinol isotope dilution among preschool children in five African countries. J Nutr. 153 (3), 622-635 (2023).

Перепечатки и разрешения

Теги

Статус витамина A13C-ретинилацетатсодержание витамина A в печенигазовая хроматографиямасс-спектрометрия изотопных отношенийсинтез по Виттигу-Хорнерутонкослойная хроматографияУФ-видимая спектроскопиявысокоэффективная жидкостная хроматография

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.