Обнаружение метаболизма в живых клетках в реальном времени с помощью гиперполяризованного 13С ЯМР

Краткое содержание

Этот протокол объединяет специально созданную биореакторную систему с гиперполяризованной ¹³C ЯМР-спектроскопии для измерения метаболизма пирувата в живых клетках в режиме реального времени, улучшая воспроизводимость и кинетическую точность для метаболических исследований и приложений для скрининга лекарственных препаратов.

Аннотация

Протокол представляет собой метод интеграции биореакторной системы собственного производства с гиперполяризованной ¹³С спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для измерения метаболизма пирувата в живых клетках в режиме реального времени. Протокол описывает конструкцию биореакторной системы, которая позволяет точно рассчитать время впрыска гиперполяризованного субстрата и получить сигнал ЯМР, сохраняя при этом стабильную среду для культивирования клеток. Метод надежно обнаруживает метаболическое превращение пирувата в лактат в течение 60 секунд измерения при сохранении достаточного соотношения сигнал/шум на протяжении всего процесса. Возможность смешивания in situ в системе ускоряет обнаружение сигнала ЯМР и снижает потери на релаксацию_T1. Протокол также включает подробные инструкции по приготовлению альгинатных гелей для инкапсуляции клеток и помещения их в биореактор. Предложенный метод демонстрирует улучшенную воспроизводимость и кинетическую точность по сравнению с традиционными методами, что указывает на потенциальное применение в исследованиях метаболизма рака и скрининге лекарств. Дальнейшие усовершенствования системы, такие как внедрение альтернативных гелевых матриц, могут повысить ее универсальность в различных биологических исследованиях.

Введение

Гиперполяризованный ЯМР, в частности за счет динамической ядерной поляризации (ДНФ), значительно повышает интенсивность сигнала ЯМР¹ и позволяет отслеживать метаболические изменения в режиме реального времени со значительно улучшенной чувствительностью ^2,3. Этот метод был успешно применен к различным биологическим системам, включая дрожжи ^4,5, модели раковых клеток ^6,7,8 и микроорганизмы ^9,10. Он также используется для мониторинга ключевых метаболических путей, таких как гликолиз^11,12, окислительно-восстановительный гомеостаз^13,14 и регуляция pH^15,16. Помимо фундаментальных исследований, гиперполяризованный ЯМР в настоящее время используется в клинической визуализации с помощью МРТ, что позволяет проводить метаболическую оценку от^{клеточного до всего} тела. Эти разработки подчеркивают растущий спрос на доступные протоколы, которые способствуют более широкому использованию гиперполяризованного ЯМР в различных биологических контекстах.

Несмотря на свою универсальность, реализация метаболических измерений в живых клетках в режиме реального времени с использованием гиперполяризованного ЯМР остается технически сложной. Традиционные системы часто полагаются на сложные, специализированные лабораторные установки, которые не обладают воспроизводимостью и сложны в эксплуатации без обширных знаний 8,18,19,20. Это представляет собой серьезное препятствие для исследователей, стремящихся внедрить эту технологию для биологических или трансляционных исследований. По сравнению с альтернативными методами, такими как оптическая визуализация или масс-спектрометрия, гиперполяризованный ¹³С ЯМР позволяет проводить неинвазивный мониторинг конкретных метаболических реакций с временным разрешением без деструктивного отбора проб. Он предоставляет прямую биохимическую информацию с временной точностью, что делает его хорошо подходящим для динамических исследований клеточного метаболизма.

Чтобы устранить эти ограничения, в данном исследовании представлен практический и воспроизводимый протокол, специально разработанный для того, чтобы позволить исследователям выполнять гиперполяризованные ЯМР-измерения метаболизма живых клеток с минимальными техническими препятствиями. Описан комплексный метод базового измерения метаболизма пируватов в живых клетках. В то время как этот протокол может быть применен к другим ¹³С-меченым зондам, пируват особенно подходит из-за его быстрого поглощения клетками, хорошо охарактеризованных метаболических путей и его центральной роли в клеточном метаболизме. Процедура состоит из: (i) подготовки образцов клеток, (ii) инкапсуляции в альгинатные гели, (iii) гиперполяризации с использованием поляризатора DNP и (iv) измерения ЯМР ¹³C в реальном времени на спектрометре с частотой 400 МГц (рис. 1). Кроме того, приведены ключевые параметры для построения биореакторной системы, обеспечивающие воспроизводимость и совместимость со стандартным оборудованием ЯМР. Протокол оптимизирован для простоты реализации с использованием коммерчески доступных компонентов и предназначен для того, чтобы помочь исследователям, особенно новичкам в этой технологии, определить ее пригодность для своих экспериментальных нужд.

Протокол

1. Настройка биореактора (Рисунок 2A-B)

1. Сборка ЯМР-трубки
   1. Для введения трубки используйте ЯМР-трубку с завинчивающейся крышкой (диаметр 10 мм, длина 178 мм) с открытой крышкой.
   2. Подготовьте перегородку флакона из силикона/ПТФЭ (диаметр 9 мм) и вставьте через нее трубку из ПЭЭК для плотной герметизации (дополнительный рисунок 1).
   3. В отверстие модифицированной крышки вставьте перегородку с химически стойкой трубкой PEEK (внутренний диаметр 1,0 мм, наружный диаметр 1,6 мм, толщина стенки 0,3 мм, длина 1 м).
   4. Поместите перегородку между ЯМР-трубкой и ее открытой крышкой и надежно закройте ее, плотно закрыв крышку. Эта установка удерживает перегородку на месте и обеспечивает достаточную герметичность для предотвращения утечки во время перфузии или инъекции.
2. Настройка трубок средней подачи (рис. 2C)
   1. Подсоедините трубку PEEK к входному и выходному отверстиям ЯМР-трубки, чтобы обеспечить непрерывную перфузию. Закрепите соединения с помощью комплекта фитингов без фланцев для предотвращения утечки.
3. Установка компонентов среднего утепления
   1. Подсоедините трубку PEEK к перистальтическому насосу, регулируемому на стабильный расход около 0,2 мл/мин, обеспечивая непрерывную циркуляцию среды с помощью комплекта для внешней циркуляции. Поместите резервуар со средой в водяную баню, установленную на 37 °C для поддержания температуры.
4. Добавление компонента для предотвращения утечки геля
   1. Вырежьте плотную губку по диаметру ЯМР-трубки. Вставьте губку в дно тюбика, чтобы предотвратить утечку альгинатного геля и обеспечить поток среды.
5. Изготовление и установка напечатанного на 3D-принтере компонента крепления губки (Рисунок 2D-F)
   1. 3D-печать цилиндрического держателя (внешний диаметр 9,1 мм, длина 20 мм, с центральным отверстием диаметром 1,5 мм) с использованием фотополимерной смолы, совместимой со стереолитографической 3D-печатью. Технические характеристики проекта приведены в прилагаемом Дополнительном файле 1.
   2. Вставьте капилляр из боросиликатного стекла (внешний диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр примерно 0,9 мм, длина 90 мм) через предварительно сформированное отверстие напечатанного на 3D-принтере держателя.
   3. Прикрепите губку к платформе на держателе с помощью УФ-отверждаемой смолы с водостойкими свойствами. Отверждение в течение 30 с под ультрафиолетовым светом для обеспечения затвердевания.
   4. Вставьте собранный держатель с губкой в ЯМР-трубку.

2. Подготовка клеток (начать за 2 недели до измерения)

1. Быстро разморозьте замороженные ячейки (SCCVII или HeLa) в водяной бане при температуре 37 °C. Перенесите примерно 1 × 10⁶ клеток в среду объемом 10 мл RPMI-1640 с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки и 1% (v/v) пенициллин-стрептомицина.
2. Культивируйте клетки при 37 °C с 5%_CO2 и пропускайте их каждые 2-3 дня после достижения 70%-80% конфлюенции. Продолжайте культивирование в течение примерно 2 недель, чтобы получить ~4 x 10⁷ клеток, оцененных из пяти 10-сантиметровых чашек, выращенных примерно до 90% слияния (каждая дает ~8 x 10⁶ клеток).

3. Приготовление альгинатного геля

1. Приготовление раствора альгината
   1. Растворите порошок альгината натрия биологического исследовательского качества в деионизированной воде для приготовления 2% раствора. Инкубируйте раствор в течение ночи при температуре 25 °C или выше с помощью осторожного перемешивания из конца в конец. Используйте вращатель трубок, установленный примерно на 10-20 об/мин, чтобы предотвратить образование пузырей и обеспечить равномерное растворение.
2. Инкапсуляция клеток в альгинатный гель
   1. Добавьте 2 мл 0,25% (v/v) трипсина-ЭДТА в чашку диаметром 10 см. Наклоните чашку, чтобы покрыть всю поверхность и аспирировать избыток трипсина-ЭДТА.
   2. Выдерживайте блюдо при температуре 37 °C в течение 2 минут.
   3. Добавьте в чашку 10 мл питательной среды. Аккуратно проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы отделить ячейки. Соберите всю клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл.
   4. Возьмите примерно 10 μл суспензии и подсчитайте количество клеток с помощью счетчика клеток. Как правило, для последующих процедур требуется около 1 × 10⁷ клеток, но фактическое количество должно быть подтверждено измерениями.
   5. Оставшуюся клеточную суспензию центрифугировать при 120 × г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 4 мл 2% (w/v) раствора альгината. Делайте пипетку медленно, чтобы свести к минимуму образование пузырьков.
3. Образование геля путем поперечного сшивания кальция (Рисунок 3)
   1. Добавьте 10 мл 50 мМ раствора CaCl₂ в центрифужную пробирку объемом 50 мл (рис. 3A).
   2. Возьмите 300 мкл клеточно-альгинатной смеси в шприц объемом 0,5 мл, оснащенный иглой 30G 10 мм, и закрепите его на колпачке центрифужной пробирки (рис. 3B).
   3. Плотно закройте крышку центрифужной пробирки закрепленным на ней шприцем и осторожно центрифугируйте всю сборку при давлении 200 × г в течение 5 минут. После центрифугирования удалите раствор надосадочной жидкости и повторно суспендируйте загруженный клетками гель в среде (рисунок 3C-D).
4. Загрузка геля в ЯМР-пробирку
   1. Перенесите инкапсулированный в клетку гель в ЯМР-пробирку с помощью пипетки Пастера. Вставьте приспособление для губки и убедитесь в его плотном прилегании.
   2. Предварительно нагрейте резервуар для среды (содержащий 5% (v/v) D₂O), приготовленный на шаге 1.3.2, на водяной бане до 37 °C и циркулируйте его со скоростью приблизительно 500 мкл/ч для стабилизации условий.
   3. Убедитесь в отсутствии утечек, прежде чем вставлять ЯМР-трубку в магнит. Держа трубку PEEK прямо, вставьте трубку ЯМР в магнит. Отрегулируйте размер геля, количество шариков и скорость пипетирования в соответствии с типом клетки и требованиями эксперимента.

4. Подготовка гиперполяризованного зонда с помощью поляризатора ДНФ (рис. 4)

1. Подготовка пробирки для образца
   1. Добавьте 18 мкл [^1-13°C] пировиноградной кислоты (14,2 М), легированной 25 мМ OX063, во флакон с образцом. Подсоедините флакон к каналу подачи жидкости поляризационной системы DNP.
2. Поляризация образца
   1. Вставьте флакон в отверстие поляризатора DNP (6,7 Тл, 1,25 К, 1,2 мбар). Применяйте микроволновое излучение на частоте примерно 188 ГГц (22 мВт) в течение 60-80 минут.
3. Контроль сигнала при поляризации
   1. Используйте твердотельный ЯМР-спектрометр, встроенный в систему DNP, для контроля интенсивности сигнала ¹³C. Записывайте данные сигнала каждые 5 минут с помощью программного обеспечения ЯМР (SPINit).
4. Растворите и приготовьте гиперполяризованный раствор
   1. Быстро растворите поляризованный образец в 3,2 мл предварительно нагретого буфера для растворения (40 мМ Tris, 50 мМ NaCl, 80 мМ NaOH, 100 мг/л ЭДТА). Убедитесь, что раствор достигает биологической температуры (308-313 K, pH ~7) перед передачей на измерение ЯМР.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность при работе с компонентами высокого давления. Предварительно нагрейте буфер для растворения до ~461 K для обеспечения эффективного переноса и целостности образца.

5. Настройка ЯМР

1. Подготовка ЯМР-спектрометра
   1. Загрузите образец в ЯМР-трубку и вставьте его в спектрометр.
   2. Выполняйте блокировку, настройку, согласование и шимминг на консоли ЯМР с помощью автоматизированной процедуры со вставленным образцом для оптимизации спектрального разрешения и стабильности сигнала.
2. Настройка параметров сбора данных
   1. Загрузите последовательность захвата импульсов ¹³C (например, zg2d) с включенной развязкой протонов (например, 13-CPD).
   2. Установите угол поворота на 90° с помощью импульса длительностью 1 μс (P1). Установите время сбора данных на 1,376 с, спектральную ширину на 23 663 Гц и количество точек сбора данных (TD) на 65 536. Установите задержку релаксации (D1) равным 0 с.
   3. Установите количество приращений времени (TD1) равным 150, чтобы получить 150 последовательных спектров в псевдо-2D-режиме. Отрегулируйте коэффициент усиления приемника на низкое значение (например, ~1), чтобы избежать насыщения сигнала от гиперполяризованных сэмплов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокой интенсивности сигнала гиперполяризованного ЯМР установите коэффициент усиления приемника на низкое значение (например, ~1), которое обычно соответствует менее чем 1% от максимально доступного усиления. Коэффициент усиления приемника — это внутренний, безразмерный параметр, который управляет усилением сигнала. Чрезмерно высокие значения могут привести к насыщению сигнала.

6. ЯМР-измерение

1. Подготовка к измерению
   1. Заполните весь путь впускной трубки от входной трубки до ЯМР-трубки растворительным буфером, чтобы избежать попадания воздуха в ловушку (Рисунок 2B). Входная трубка используется как для перфузии среды, так и для впрыска гиперполяризованного зонда.
   2. Внимательно убедитесь, что во входной трубке или внутри ЯМР-трубки нет пузырьков воздуха, так как пузырьки в этой области могут мешать получению сигнала во время измерений ЯМР.
2. Подготовка к введению гиперполяризованного раствора
   1. Остановите перистальтический насос, чтобы временно остановить циркуляцию среды, прежде чем вводить гиперполяризованный раствор через входную трубку.
   2. Начните спектральный сбор примерно за 10 секунд до растворения гиперполяризованной подложки, чтобы гарантировать, что сигнал будет захвачен сразу после прибытия в место обнаружения ЯМР после инъекции.
   3. Наберите 1 мл раствора с помощью шприца, когда он выйдет из поляризатора DNP.
3. Инъекция гиперполяризованного раствора и подтверждение сигнала
   1. Переключите трехходовой клапан на входе в биореактор в положение В, чтобы ввести гиперполяризованный раствор в ЯМР-трубку.
   2. Переключите клапан обратно в положение A после впрыска, чтобы возобновить циркуляцию среды и предотвратить обратный поток.
   3. Подтвердите успешную инжекцию и поступление подложки, наблюдая за увеличением сигнала свободного индукционного затухания (FID) в программном обеспечении для сбора данных.

7. Обработка и анализ данных

1. Обработка спектральных данных
   1. Загрузите ЯМР-спектр с временным разрешением в программное обеспечение для обработки данных. Если данные хранятся в формате ser file, найдите и загрузите соответствующий файл.
2. Анализ спектров
   1. Выполните преобразование Фурье (FT) для преобразования исходного FID в частотную область. Применяйте коррекцию фазы вручную или автоматически. Проведите коррекцию базовой линии для устранения искажений.
3. Визуализация конверсии метаболитов
   1. Построение графика временных сигналов для пирувата С1 (~171 ppm) и лактата C1 (~183 ppm).
4. Количественная оценка метаболической конверсии
   1. Рассчитайте площадь под кривой (AUC) для пиков пирувата и лактата.
   2. Определите соотношение [лактата]/[пирувата], разделив AUC лактата на AUC пирувата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: AUC используется вместо высоты пика, чтобы свести к минимуму влияние артефактов звона, вызванных большим гиперполяризованным сигналом пирувата [1-¹³C]. Значения AUC получаются путем простого суммирования интенсивностей сигнала в пределах заданного диапазона интегрирования для каждого пика.

Результаты

В этом исследовании изготовленная система была соединена с гиперполяризованной ¹³С ЯМР-спектроскопии для измерения метаболизма пирувата в живых клетках в режиме реального времени. Основные сигналы, обнаруженные в спектре 1D ¹³C ЯМР, соответствовали пирувату (примерно 171 ppm) и лактату (примерно 183 ppm)²¹, что позволило оценить метаболическое превращение пирувата в лактат в физиологических условиях (рис. 4).

Спектральное качество и динамика сигнала
Репрезентативные результаты повторных измерений на одном и том же образце с использованием клеток SCCVII — линии плоскоклеточного рака мышей, часто используемой в гиперполяризованных МРТ-исследованиях, — показаны на рисунке 5. Первое измерение показало явное увеличение лактатного сигнала, что указывает на активное метаболическое преобразование. Однако последующие измерения, проведенные с интервалом в 1,5 часа, показали прогрессирующее снижение метаболической активности. Это зависящее от времени снижение, вероятно, отражает биологический стресс или адаптацию, вызванную первоначальной инъекцией пирувата. Примечательно, что аналогичная транзиторная метаболическая модуляция была зарегистрирована in vivo с использованием гиперполяризованной МРТ и EPRI, где оксигенация опухоли временно снизилась после введения пирувата²². Эти результаты демонстрируют, что повторяемость этих измерений позволяет неразрушающим образом отслеживать динамические метаболические изменения — преимущество, которого трудно достичь с помощью деструктивных^{методов.}

Чтобы оценить применимость этого протокола к другим типам клеток, были проведены дополнительные измерения с использованием клеток HeLa, широко используемой линии раковых клеток человека. Как показано на рисунке 6, клетки HeLa также продемонстрировали четкую конверсию пирувата в лактат. Несмотря на то, что интенсивность сигнала постепенно снижалась из-за релаксации_Т1, отношение сигнал/шум оставалось достаточным на протяжении всего периода сбора данных в 60 с. Эти результаты свидетельствуют о том, что текущий протокол широко применим и может служить универсальным инструментом для метаболического профилирования в режиме реального времени в различных типах клеток.

В то время как быстрое затухание сигнала является неотъемлемым ограничением ЯМР на основе ДНФ, наша система смешивания in situ сводит к минимуму задержку между растворением и измерением, тем самым повышая чувствительность обнаружения. Дальнейшие усовершенствования, такие как оптимизация состава гелевой матрицы, могут расширить применимость этого метода к более широкому спектру биологических систем.

Рисунок 1: Принципиальная схема общего рабочего процесса от культивирования клеток до измерения гиперполяризованного ЯМР. Процесс начинается с культивирования клеток (~2 недели), за которым следует подготовка альгинатного геля (~60 мин) для инкапсуляции клеток для стабильного измерения. Далее выполняется гиперполяризация с помощью поляризационной системы DNP (~60 мин), а измерение ЯМР проводится с помощью ЯМР-спектрометра с частотой 400 МГц (~5 мин). На фотографиях справа показаны соответствующие инструменты, используемые в этом рабочем процессе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Установка биореактора для измерения гиперполяризованного ЯМР. (А) Принципиальная схема установки биореактора. Питательная среда вводится в ЯМР-трубку через вход А и затем направляется в отходы. Альгинатные шарики, содержащие живые клетки, помещаются внутрь ЯМР-трубки. Во время гиперполяризованных измерений ЯМР гиперполяризованный зонд вводится через вход B, помеченный как вход гиперполяризованного зонда. (B) Фотография всей установки биореактора с четкой маркировкой входных и выходных трубок. (C) Крупный план входного трубочного выключателя, показывающий вход A (перфузия среды) и вход B (впрыск гиперполяризованного зонда). (D) проектирование САПР и (E) репрезентативная фотография напечатанного на 3D-принтере компонента крепления губки, помещенного внутрь ЯМР-трубки. Компонент включает в себя отверстие для направления стеклянного капилляра, который подает гиперполяризованный раствор подложки, и платформу для удержания губки. Сам компонент не плотно прилегает к внутренней стенке ЯМР-трубки; (F) вместо этого вокруг него вставляется губка, чтобы заполнить зазор. Такая структура стабилизирует компонент и позволяет отработанной среде течь вверх через губку, устраняя необходимость в дополнительном выпускном отверстии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Приготовление альгинатного геля. (A) Схематическое изображение и (B) фотография устройства для формирования шариков из альгинатного геля. На левом изображении показана вся установка, включая центрифужную пробирку со шприцем, закрепленным на ее модифицированной крышке. На верхнем правом изображении показана крышка с небольшим отверстием для наконечника шприца, а на нижнем правом изображении — крышка с квадратным отверстием для стабильного положения шприца. Центрифужная пробирка предварительно заполнена 10 мл раствора хлорида кальция, что позволяет раствору альгината, выходящему из наконечника шприца, претерпевать гелеобразование, образуя шарики альгинатного геля. (C) Репрезентативное микроскопическое изображение, показывающее морфологию альгинатных гелевых шариков. (D) Репрезентативное микроскопическое изображение, показывающее морфологию альгинатных гелевых шариков, содержащих клетки HeLa. Масштабная линейка = 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Схематическое изображение этапов подготовки к измерению ЯМР и гиперполяризации. Во время процесса наращивания DNP в течение ~60 минут настройка ЯМР выполняется параллельно, чтобы свести к минимуму задержки. Подготовка включает в себя загрузку альгинатных шариков в ЯМР-трубку, за которой следует регулировка блокировки ¹H, шимминг и настройка зонда, чтобы убедиться, что система готова к немедленным измерениям. После растворения и смешивания in situ ЯМР-спектроскопия с временным разрешением ¹³°C позволяет выявить четкие пики пирувата и лактата. Пики, наблюдаемые примерно на уровне 171 ppm, 179 ppm и 183 ppm, соответствуют пирувату, гидрату пирувата и лактату соответственно. Для измерения ЯМР использовали примерно 4 × 10⁷ клеток HeLa, инкапсулированных в альгинатный гель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Обнаружение сигналов пирувата и лактата с временным разрешением при повторных измерениях. Гиперполяризованные ¹³С ЯМР-спектры одного и того же образца SCCVII, инкапсулированного клетками, были получены с интервалом в 1,5 ч для оценки возможности повторных неразрушающих измерений. Пируват (разомкнутые круги) и лактат (закрашенные круги, масштабированные на 1000×) пиковые интенсивности строятся по времени для каждого приобретения. (А) Первое измерение. (В) Второе измерение, проведенное через 1,5 ч, показывает заметное снижение выработки лактата. (C) Третье измерение, проведенное еще через 1,5 ч, подтвердило устойчиво низкую метаболическую активность. Количественный анализ, основанный на площади под кривой (AUC), показал, что соотношение [лактата]/[пирувата] уменьшилось с 0,00134 (первое измерение) до 0,00019 (второе) и 0,00027 (третье). Конечная концентрация клеток в альгинатном геле составляла примерно 1,0 × 10⁷ клеток/мл (4 × 10⁷ клеток в 4 мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Превращение пирувата в лактат в клетках HeLa. В живых клетках HeLa были измерены гиперполяризованные ¹³С ЯМР сигналы пирувата и лактата с временным разрешением. Интенсивность пируватного сигнала нормализуется до его максимального значения в нулевой момент времени. Интенсивность сигнала лактата масштабируется в 10:³ для обеспечения видимости. Количественный анализ, основанный на площади под кривой (AUC), показал соотношение [лактата]/[пирувата] 0,00121. Конечная концентрация клеток в альгинатном геле составляла примерно 7,5 × 10⁶ клеток/мл (3 × 10⁷ клеток в 4 мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1. Репрезентативные изображения перегородки флакона, используемой в биореакторной системе. (A) Перегородка из силикона/ПТФЭ (диаметр 9 мм) перед использованием. (B) Та же перегородка в реальном использовании, с трубкой PEEK, вставленной через проколотые отверстия. Эластичность материала перегородки позволяет ему повторно герметизироваться вокруг трубки, сохраняя герметичность во время впрыска гиперполяризованного подложки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру

Дополнительный рисунок 2: Гиперполяризованный ЯМР-спектр ¹³С с временным разрешением, полученный после внешнего смешивания. Репрезентативный спектр метаболизма пирувата [^1-13C] с временным разрешением, измеренный с помощью настольной ЯМР-системы после внешнего смешивания гиперполяризованного пирувата и клеток за пределами ЯМР-трубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру

Дополнительный файл 1: CAD-проектирование цилиндрического держателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл

Обсуждение

Важнейшие этапы протокола
Успех этого протокола зависит от нескольких важных шагов. Во-первых, важно обеспечить правильное растворение и перенос гиперполяризованного ^{пирувата 13}C для поддержания высокого соотношения сигнал/шум. Чтобы зафиксировать раннее метаболическое превращение пирувата в лактат, время введения гиперполяризованного зонда и получение ЯМР должны быть синхронизированы. Кроме того, важно поддерживать жизнеспособность клеток на протяжении всего эксперимента. Отклонения от этих параметров могут привести к снижению метаболической активности и потере сигнала.

Модификации и устранение неполадок метода
Несмотря на то, что этот протокол обеспечивает надежный подход к метаболическому мониторингу в режиме реального времени, некоторые модификации могут улучшить его применимость. Например, регулировка угла поворота ЯМР может сбалансировать интенсивность сигнала и затухание поляризации для оптимизации сбора данных. Кроме того, несмотря на то, что был введен способ стабильного приготовления альгинатных гелей определенного размера, размер создаваемых гелей можно легко регулировать, подбирая шприц или иглу. Это может способствовать воспроизведению гипоксической среды²⁴ в дополнение к предотвращению выхода клеток из ЯМР-трубки. Кроме того, альгинатный гель становится плотным и вязким внутри ЯМР-трубки, особенно в области измерения ЯМР. Если при введении питательной среды или гиперполяризованного зонда из трубки PEEK воздух попадет внутрь, то он, скорее всего, останется в месте измерения ЯМР, что приведет к снижению качества спектра.

Ограничения метода
Несмотря на то, что гиперполяризационные измерения имеют преимущество в виде высокой чувствительности сигналов ЯМР, они имеют присущие им ограничения. Из-за Т1-релаксации гиперполяризованного ¹³С пирувата продолжительность метаболических измерений ограничена примерно 1 минутой, что ограничивает наблюдение за долгосрочными метаболическими сдвигами. Кроме того, трудно измерить образец клетки через несколько часов после того, как он был измерен один раз, что может быть связано с капанием большого количества пирувата за одно измерение. Это то же самое, что если бы родственные группы измерили спектры на один день позже¹⁸, и интервал измерений должен быть именно таким длинным.

Важность метода по сравнению с существующими методиками
По сравнению с обычными метаболическими анализами, наш метод имеет преимущество перед конечными измерениями, такими как масс-спектрометрия и биохимические анализы, в том, что он обеспечивает понимание клеточного метаболизма в режиме реального времени. Несмотря на то, что подобные гиперполяризованные ЯМР-спектры могут быть получены без использования биореактора, возможность начать измерения сразу с смешивания in situ является полезной, учитывая быстроту релаксации. Кроме того, клетки могут быть предварительно настроены в стабильной среде перед инъекцией, что улучшает воспроизводимость и кинетическую точность метаболического анализа. Это преимущество подтверждается дополнительным экспериментом (дополнительный рисунок 2), в котором спектры с временным разрешением были получены с помощью настольной ЯМР-системы после внешнего смешивания. В этой конфигурации задержка примерно в 30 с между смешиванием и регистрацией сигнала приводила к значительным потерям поляризации, особенно влияя на обнаружение лактата. Это подтверждает, что перемешивание in situ повышает точность кинетических измерений в условиях быстрого распада_T1 . Тем не менее, стоит отметить, что интенсивность сигнала в этой установке in situ была ниже, вероятно, из-за разбавления, вызванного перфузией среды — проблема, которую еще предстоит оптимизировать.

Важность и потенциальное применение
Этот метод может проложить путь к пониманию метаболических свойств различных форм жизни. Измерение метаболических потоков в режиме реального времени позволяет исследователям динамически оценивать эффекты метаболических ингибиторов. Интеграция этого подхода с другими методами измерения может еще больше повысить точность анализа внутриклеточного метаболизма.

Мы представляем себе практический экспериментальный рабочий процесс, в котором деструктивная метаболомика с высокой пропускной способностью используется для идентификации потенциальных путей с последующей валидацией в реальном времени с использованием гиперполяризованного ¹³С ЯМР для оценки функции фермента и динамики потока в живых клетках. Этот подход позволяет напрямую обнаруживать транзиторные метаболические реакции в физиологических условиях, чего трудно достичь с помощью иммунологических анализов или флуоресцентных датчиков, которые обычно измеряют уровни статических метаболитов или требуют экзогенных зондов. В то время как флуоресцентная визуализация и иммунологические анализы необходимы для пространственной локализации и высокопроизводительного скрининга соответственно, гиперполяризованный ЯМР обеспечивает дополнительное функциональное считывание, которое фиксирует кинетику реакции неразрушающим способом. Эта стратегия не только облегчает механистическое понимание на клеточном уровне, но и служит мостом к диагностическим приложениям на уровне тканей или организмов. В частности, способность фиксировать функциональные метаболические сдвиги в режиме реального времени может способствовать раннему выявлению метаболических нарушений и терапевтических реакций в сложных биологических системах.

Также был достигнут прогресс в разработке метаболических зондов, нацеленных на различные метаболические пути, и синтетических субстратов, предназначенных для конкретных ферментов, что расширяет возможности метаболических исследований^25,26. Кроме того, достижения в области методов гиперполяризации, таких как доставка гиперполяризованных субстратов непосредственно от поляризатора к ЯМР через магнитный туннель²⁷, могут улучшить удержание сигнала и расширить потенциальные возможности применения этого метода в биомедицинских исследованиях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
[1-13C] пировиноградная кислота	Кембридж Изот опе Лабораториз, Инк.	КЛМ-8077
3D-принтер	Элегоо	Сатурн-2
Хлорид кальция	Накалай Теске, Инк.	06729-55
D2O	Сигма-Олдрич	151882
Комплект внешней циркуляции для насоса	КАК ЕДИНОЕ ЦЕЛОЕ	1-4141-02
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10270106
Комплект фитингов без фланцев	GL Sciences Inc.	6010-46390
Стеклянный капилляр с сердцевиной	Нарисигэ	ГДК-1.5	Внутренний диаметр ~0,9 мм, длина 90 мм
Магнитный циркуляционный насос	КАК ЕДИНОЕ ЦЕЛОЕ	1-4141-01
MestReNova	Mestrelab Research		Программное обеспечение для обработки и анализа спектров ЯМР
Мой шприц для выстрела	Корпорация Nipro	8277	0,5 мл/100U, 30G x 10 мм, 140 шт
ОХ063	Оксфорд Инструментс Ко. Лтд.  и Polarize IVS Co. Ltd.	-
Трубка PEEK	КАК ЕДИНОЕ ЦЕЛОЕ	3-780-05
пенициллин-стрептомицин	Накалай Теске, Инк.	26252-94
Перистальтический био мини насос	АТТО	1221200	Высокая точность, широкий расход для стабильного расхода среды
Смола	Сирая Тех	Дымчато-черный
RPMI-1640 Средний	Накалай Теске, Инк.	30264-85
Перегородка из силикона/фторопласта	GL Sciences Inc.	1030-50009
Альгинат натрия 80-120	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	194-13321
Программное обеспечение SPINit	RS2D		Программное обеспечение ЯМР в поляризаторе DNP
Губка	-	-	Коммерчески доступная губка, обрезанная по размеру для стабилизации геля
Трехходовой запорный кран	КАК ЕДИНОЕ ЦЕЛОЕ	3-6247-04
ТопСпин	Брукер		Программное обеспечение для сбора и обработки данных ЯМР
Трипсин-ЭДТА (0,25%)	Thermo Fisher Scientific	07086-74
УФ-отверждаемая смола	БОНДИК	BD-SKCJ
Водяная баня	КАК ЕДИНОЕ ЦЕЛОЕ	1-5832-41	Тепловой робот TR серии TR-1α для поддержания 37° Температура С
Wilmad Трубка для ЯМР с винтовой крышкой	Сигма	Z271977	Частота 400 МГц, диаметр 10 мм, длина 178 мм.