Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Специфические для пациента органоиды роговицы, полученные из iPSC, для исследования заболеваний, связанных с аниридиями,

160 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68556

⸱

28 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол получения органоидов роговицы из iPSC, полученных у пациентов с аниридией, создавая специфическую модель для каждого пациента для изучения заболеваний роговицы. Эти органоиды имитируют ключевые структурные и функциональные особенности, предоставляя надежную in vitro платформу для изучения механизмов заболеваний, тестирования возможных методов лечения и продвижения персонализированных регенеративных подходов для лечения заболеваний передних глаз.

Аннотация

Аниридия — это редкое врождённое заболевание глаз, характеризующееся частичным или полным отсутствием радужки, и часто сопровождается мутнением роговицы и дефицитом лимбальных стволовых клеток. Лежащие в основе генетические мутации, главным образом поражающие ген PAX6, нарушают как развитие, так и функцию роговицы. Наиболее распространёнными глазными признаками, помимо дефектов радужки, являются нистагм, фовеальная гипоплазия, катаракта, глаукома и кератопатия, ассоциированная с аниридиями, (AAK). Хотя in vivo модели дают ценные данные о патологии аниридии, полученные пациентами модели in vitro имеют решающее значение для изучения механизмов заболевания и оценки возможных методов терапии. В этом исследовании мы представляем модель in vitro AAK с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), полученных пациентами. Наш протокол включает поэтапную дифференцировку iPSC в клетки, похожие на эпителиальные роговицы, внутри самособранных трёхмерных органоидов, имитирующих нативную микросреду роговицы. Оптимизируя условия дифференциационной культуры, мы успешно сгенерировали органоиды роговицы, содержащие отдельные популяции роговицы клеток, повторяя ключевые структурные и функциональные особенности человеческой роговицы.

Введение

Роговица — это аваскулярная, прозрачная ткань, образующая внешний слой глаза, состоящая в основном из трёх слоёв: эпителиального внешнего слоя, стромального слоя с богатым коллагеном внеклеточного матрикса, заполненного кератоцитами, и эндотелиальногоклеточного слоя 1. Роговица играет важную роль в зрении, защищая внутренние структуры зрения и преломляя свет.

Аниридия — это редкое врождённое паннокулярное заболевание, вызванное главным образом гетерозиготными мутациями в парном боксовом гене 6 (PAX6), главном регуляторе развития глаз, и характеризуется частичным или полным отсутствием радужки2. Помимо гипоплазии или отсутствия радужки, у большинства пациентов развиваются прогрессирующие аномалии роговицы, известные как кератопатия, ассоциированная с аниридиями (AAK), которая включает дефекты эпителия, дисфункцию лимбальных стволовых клеток, изменения стромы и прогрессирующую затуманенность роговицы, что в конечном итоге приводит к нарушению зрения. ААК поражает примерно 78–90% пациентов с аниридией, с возрастающей тяжестьюсо временем 3. Мы стремились создать подробный и воспроизводимый протокол для получения органоидов роговицы из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), полученных пациентами в аниридии, для моделирования заболеваний-реальных изменений роговицы in vitro. Хотя животные модели и экс виво исследования дали ценные сведения о патогенезе аниридии, различия в отношении вида и ограниченный доступ к тканям пациентов ограничивают их трансляционную значимость.

Органоиды, полученные от iPSC, стали мощными in vitro системами для моделирования развития человека и заболеваний 4,5. Органоиды роговицы, в частности, позволяют создавать трёхмерные тканеподобные структуры, более близкие к нативной архитектуре роговицы, включая стратифицированную эпителиальную организацию, стромально-эпителиальные взаимодействия и внеклеточное отложение матрикса, по сравнению с традиционными двумерными монослойными культурами, которые не имеют пространственной организации, физиологических взаимодействий между клетками и микроэкологическойсложности 4,5. Несколько стратегий дифференцировки, включая методы SEAM и глазные предшественники, приводят к образованию тканей, похожих на роговицу, изiPSC 6. Эти подходы обычно включают начальную фазу индукции глазной линии, затем прогрессивную спецификацию тканей и отбор из гетерогенных популяций глазных предков. Создание органоидов роговицы даёт возможность изучать различные типы клеток, присутствующие в тканироговицы 7,8. Кроме того, органоиды роговицы у пациентов с аниридиями, полученные на основе iPSC, позволяют изучать генетический фон заболевания и предоставляют уникальную возможность для изучения аниридии.

В настоящем протоколе как линии iPSC, так и дикого типа, происходящие из аниридий, подвергаются идентичной многоступенчатой стратегии дифференцировки, включающей последовательное воздействие дифференцированию (СД), дифференциации сетчатки (РДМ) и среде дифференцировки роговицы (КДМ) в течение длительного недельного периода культурирования. Критически важным экспериментальным этапом является переход от адхерентной культуры к условиям подвешения, в ходе которых поддерживаются отдельные области, похожие на роговицу, для стимулирования самоорганизации эпителия.

Хотя этот подход поддерживает воспроизводимое создание эпителиальных структур, похожих на роговицу, подходящих для сравнительного моделирования заболеваний, он не полностью воспроизводит сложные признаки in vivo , такие как нейронная иннервация или полная организация лимбальных нишей, которые следует учитывать при оценке применимости метода.

В этом контексте мы описываем стандартизированный протокол получения органоидов роговицы из iPSC, полученных пациентами, несущих мутации PAX6 , связанные с аниридией. Важно, что сама стратегия дифференцировки не изменяется между линиями дикого типа и аниридий; вместо этого специфические для заболевания фенотипы возникают из генетического фона, специфичного для пациента, в рамках единой экспериментальной структуры.

В целом этот метод предоставляет надёжную и воспроизводимую платформу для изучения развития роговицы и механизмов заболеваний, связанных с аниридиями, и может служить основой для будущих механистических и трансляционных исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами этического комитета. Исследование зарегистрировано в базе данных Human Pluripotent Stem Cells Registry (hPSCreg), а этические одобрения задокументированы в рамках Министерства высшей разведки и инноваций Франции (MESRI; IE-2018-967)9. iPSC обозначаются кодами AAKIPSi001-A (AAK1), AAKIPSi002-A (AAK2), AAKIPSi003-A (AAK3) и WT (от доноров здоровья). Кроме того, комитет по этике Университета Хаджеттепе одобрил использование этих исследований, как указано в номере 16969557-1213. Человеческие клеточные линии, использованные в этом исследовании, требовали национального регуляторного одобрения на момент приобретения. Одобрение было получено в рамках консорциума, в котором участвовал один из авторов. Хотя данная рукопись напрямую не связана с этим проектом консорциума, используемые биологические материалы были получены и одобрены в рамках этой этической рамки. Поэтому одобрение этого университета было уместно использовано для обеспечения полной прозрачности регулирования. Все детали, связанные с материалами, реагентами и оборудованием, используемыми в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов. Все экспериментальные процедуры проводились в ламинарном потоковом шкафу (BSL-2) для поддержания стерильной среды. Такая схема обеспечивает надлежащую стерилизацию всех материалов и оборудования, используемых в исследовании, минимизируя риск загрязнения и обеспечивая целостность экспериментальных результатов.

1. Генерация органоидов роговицы, индуцируемых человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC), полученных

  1. Поддержание и первичная культура индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, вызванных аниридией пациентов (AAK1, AAK2, AAK3)10 под кондиционируемой средой без питания (Рисунок 1)
    1. Заранее подготовьте следующее: покройте одну скважину в пластине с 6 лунками 1 мл ледяного раствора внеклеточного матриса (ECM) при концентрации 0,1 мг/мл. Процедуру нанесения покрытия необходимо проводить на льду, а не для затвердевания РЭК, и дать инкубировать при 37 °C минимум 30 минут, соблюдая инструкции производителя для правильной подготовки подложки.
    2. Оттаять криоконсервированный аликвот 1 x 106 hiPSC (WT, AAK1, AAK2, AAK3). Не размораживайте полностью замороженные клетки; Вместо этого дайте замороженной клеточной суспензии в криовиальном слое оттаять, пока примерно половина объёма не останется замороженной.
    3. Немедленно переместить частично оттаявшую суспензию в 1 мл полного поддерживающего среды комнатной температуры (RT), содержащего 10 мкм ингибитора протеинкиназы (ROCK), ассоциированного с Rho, предварительно помещаемого в трубку объёмом 15 мл. Не используйте пипетки во время переноса.
    4. Центрифугуйте при 300 г на 5 минут и уберите супернатант.
    5. Затем суспендировать клетки в 1 мл полного поддерживающего среды, содержащего ингибитор ROCK с концентрацией 10 мкм.
    6. Определите плотность клеток с исключением трипана синего. Считайте клетки с помощью гемоцитометра после окрашивания жизнеспособности трипановым цветом. Кратко смешайте 20 мкл суспензии клетки 1:1 с 20 мкл 0,4% трипана синего, затем добавите 60 мкл PBS, что приводит к окончательному разбавлению исходной суспензии ячейки в соотношении 1:5. Из этой смеси загрузите 10 мкл в камеру гемоцитометра. Считать жизнеспособные (трипан-сине–отрицательные) клетки в четырёх больших квадратах. Вычислите среднее количество ячеек на квадрат и умножьте на 5 (коэффициент разбавления суспензии ячейки) и 10 000, чтобы определить конечную концентрацию ячеек (клетки/мл).
      Ячейки/мл = (Среднее количество ячеек на квадрат) x 5 x 104
    7. Посейте клетки в предварительно покрытую ЭБМ в пластине из 6 ямак, обеспечивая плотность ячейки 2 x 104 клетки/см² на каждую яму.
    8. Наблюдайте морфологию и прикрепление клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии при увеличении в 10 раз. Затем инкубировать 6-колодцевые пластины при 37 °C с 5% CO₂ для оптимальных условий роста.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибитор ROCK должен использоваться только ночью во время пассии или разтаивания клеток. Во время ежедневных изменений средней жидкости аккуратно добавляйте среду вдоль стенки колодца. Избегайте нагрева полного поддерживающего материала в водяной бане; Вместо этого уравновесьте среду при комнатной температуре в течение 15 минут перед использованием.
  2. Фаза спонтанной дифференцировки (День 0–2)
    1. Подготовьте дифференциационную среду (DM), смешав следующее: 8% замены сыворотки KnockOut (KSR), 1x несущественных аминокислот (NEAA), 1x глутамакс, 1x пенициллин-стрептомицин и Dulbecco Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F-12).
    2. Когда культуры hiPSC достигают примерно 70%–80% слияния, чтобы вызвать спонтаннуюдифференциацию 8, аккуратно аспирируйте и полностью удаляйте среду, затем ежедневно заменяйте её 1 мл свежего DM на скважину до третьего дня, когда начинается фаза дифференцировки сетчатки согласно экспериментальной графике.
  3. Фаза дифференцировки сетчатки (День 3 – 47)
    ПРИМЕЧАНИЕ: среда для дифференцировки сетчатки используется длительное время для формирования гетерогенных популяций глазных предков.
    1. Подготовьте среду для дифференцировки сетчатки (RDM), смешивая следующее: 8% KSR, 1x NEAA, 1x глутамакс, 2% B27, 1x пенициллин-стрептомицин и DMEM/F-12.
    2. После двух дней спонтанного дифференцирования ежедневно обновляйте посевную среду, аккуратно аспирируя DM-среду и заменяя её 1 мл свежей среды RDM на каждую скважину. Продолжайте это в течение 30 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается значительное увеличение плотности клеток в течение этих 30 дней. Необходимо проводить микроскопические наблюдения плотности клеток в различных областях каждой скважины. Чтобы предотвратить поднятие клеток, необходимо избегать мытья, а при смене средних средств — осторожно. Добавьте медиа через стену колодца. Уравновесьте среду на RT в течение 15 минут перед использованием.
    3. К 32-му дню клетки достигают кажущегося состояния слияния и образуют многослойные 2,5D-агрегаты. На этом этапе начинайте переход к суспензионной культуре, аккуратно соскребая всю скважину с помощью наконечника пипетки объёмом 1000 мкл. В ходе этого процесса фрагментируйте клеточный слой на небольшие кластеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя все клетки высвобождаются с поверхности культуры, многослойные агрегаты 2,5D преимущественно собираются и переносятся в суспензионную культуру (дополнительный рисунок 1), поскольку их обогащение способствует более быстрой самосборке и образованию крупных органоидов по сравнению с отдельными клетками или монослойными фрагментами.
    4. Сразу после соскребания соберите полученные клеточные кластеры и переместите их в посевные пластины с низким уровнем прикрепления 6 колодц, содержащие RDM, для создания условий суспензионной культуры.
    5. Сохраняйте клетки в суспензионной культуре ещё 15 дней, с ежедневной средней заменой с использованием 2 мл свежего RDM на каждую скважину. В течение первых двух дней суспензионной культуры избегайте средних изменений, чтобы предотвратить потерю мелклеточных кластеров. Во время суспензионной культуры клетки постепенно самоорганизуются и образуют трёхмерные, прозрачные, похожие на роговицу структуры, которые регулярно контролируются с помощью фазово-контрастной микроскопии при увеличении в 4 и 10 раз.
  4. Фаза дифференцировки роговицы (день 48 – 90)
    1. Подготовьте среду для дифференцировки роговицы (CDM), смешивая следующее: 8% KOSR, 1x NEAA, 1x глутамакс, 1x N2-MAX, 1x инсулин-трансферрин-селен, 5 нг/мл FGF2, 10 нг/мл EGF и DMEM/F-12.
    2. После первых 15 дней (с 32-го по 47-й день) суспензионной культуры в пластинах с низким уровнем крепления (37 °C, 5% CO₂) замените RDM на CDM, сохраняя заполнители в условиях подвешивания на 47-й день. Обновляйте CDM через день с 2 мл на скважину, чтобы органоиды всегда полностью погружались в культурную среду. В этот период постепенно формируются прозрачные, пузырчатые первичные структуры роговицы (CP).
    3. Продолжайте суспензированную культуру в CDM до 90-го дня, что позволит дальнейшее созревание и пространственное отделение прозрачных CP-областей от более непрозрачных тканевых компартментов.
    4. На 90-й день механически отделяйте прозрачные области CP от более непрозрачных тканевых компартментов с помощью стерильных щипцев и пинцета, когда предназначены специфические для CP анализы по последующим потоку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Механическая изоляция CP-областей выполняется, когда анализы специально требуют структур, обогащённых CP. Если интересны другие тканевые компартменты или общая органоидная архитектура, органоиды могут сохраняться целыми для сохранения структурной гетерогенности.
    5. Продолжайте суспензионную культуру в CDM для изолированных структур CP или целостных органоидов, в зависимости от целей.

2. Характеристика роговицовых органоидов

  1. Морфологическая и структурная оценка органоидов
    1. Регулярно контролируйте органоиды роговицы с помощью яркой микроскопии с увеличением в 4 и 10 раз. Оценивайте размер, прозрачность и общую морфологию в определённые временные моменты и документируйте структурные изменения путем получения изображений.
  2. Характеристика на основе иммунофлуоресценции
    1. Фиксация органоидов роговицы
      1. Подготовьте растворы 4% PFA и сахарозы 30% перед фиксацией. Возьмите органоид роговицы из посева с помощью автоклавной лопатки. Переместите органоид в 4% PFA в пробирку на 1,5 мл и инкубировать 20 минут при комнатной температуре.
      2. После инкубации аккуратно убрать PFA из трубки, не повредив органоид роговицы. Добавьте 1 мл раствора сахарозы 30% в пробирку и поставьте при температуре 4 °C. Через 24 часа подготовьте и маркируйте трубки объёмом 5 мл и жидкий азот для фиксации ОКТ.
      3. Аккуратно сбросьте раствор сахарозы из пробирки. Переложите органоид в стерильный совок. С помощью пипетки на 20 мкл аккуратно удалять лишний раствор сахарозы из органоида.
      4. Налейте ОКТ в крышку трубки объемом 5 мл и поместите органоид в ОКТ. Используйте ещё одну стерильную лопатку, чтобы перенести органоид в колпачок с ОКТ.
      5. Добавьте ОКТ, чтобы покрыть поверхность роговицы. Лопните шарики в ОКТ иглой, чтобы получить прозрачные участки органоида.
      6. Закройте крышку трубок объёмом 5 мл и используйте пинцет, чтобы окунуть в жидкий азот. Храните образцы при -20 °C до секционирования.
      7. Разделите их толщиной 5 мкм с помощью криостата и храните при -20 °C до окрашивания. Поддерживайте единообразную толщину срезов и ориентацию тканей, чтобы обеспечить воспроизводимое окрашивание.
    2. Окрашивание IF
      1. Чтобы подготовить органоидные срезы роговицы к IF-окрашиванию, смойте стекли 3 раза PBS-T (0,3% Triton X-100) при RT в течение 10 минут.
      2. Очистите слайд бумагой и сделайте бордюр PAP-ручкой. Добавьте соответствующее количество блокирующего раствора, чтобы полностью покрыть срез ткани (обычно 100–200 мкл на слайд, в зависимости от границы PAP-ручки) и инкубировать его в RT в течение 1 часа.
      3. Аспирируйте раствор для блокировки и сделайте рамку с помощью PAP-ручки. Добавьте 150 мкл первичных растворов Ab (PAX6, p63, OCT3/4, NANOG, Na+/K+-ATPase, AQP1, CK3, CK5, CK14, CK19, N-cad, KERA, COLIV, скорости разбавления указаны в таблице материалов) на затвор и инкубируют его при RT в течение 1 часа.
      4. Промыйте 2 раза PBS-T (0,3% Triton X-100) на RT в течение 10 минут. Снова сделайте бордюр PAP-ручкой.
      5. Добавьте 150 мкл вторичного раствора Ab (Anti Rabbit-488, Anti Mouse-594, скорости разбавления указаны в Таблице материалов) на затвор и инкубируют его в RT в тёмных условиях в течение 2 часа. Промывайте 2 раза PBS-T (0,3% Triton-X) на RT в течение 10 минут. Очистите затворы и установите с помощью DAPI-раствора.
      6. Для недифференцированных iPSC проводите блокировку и пермеабилизацию после фиксации и продолжайте окрашивание по тому же протоколу. Визуализируйте окрашенные образцы с помощью флуоресценции или конфокальной микроскопии при увеличении 4x и 10x.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Стволость индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC)

Для оценки ствола человеческих iPSC, использованных в экспериментах, мы провели яркую визуализацию, иммунное окрашивание и qRT-PCR-анализ. Мы оценили экспрессию ключевых маркеров плюрипотентности, включая OCT3/4, SOX2 и NANOG, которые являются ключевыми транскрипционными факторами, необходимыми для поддержания плюрипотентности и самообновления в человеческих пл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сравнительный анализ между контрольными органоидами и органоидами, полученными у пациентов с аниридией, выявил дефекты эпителиальной стратификации, аномальное отложение внеклеточного матрикса и дисрегулированную экспрессию гена PAX6 9.

Скорость роста iPSC, полученных из различных образцов пациентов с аниридиями, в частности линий AAK1, AAK2 и AAK3, демонстрирует вариабельность, что потенциально отражает основное генетическое ра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не раскрывали информацию.

Благодарности

Это исследование финансируется TÜBİTAK 121N276 и Европейской совместной программой по редким заболеваниям и частично поддерживается Европейским союзом (Horizon 2020 ERA Chair Program, грант проекта RareBoost No 952346). A.C.K. поддерживается стипендией YÖK 100/2000 PhD и стипендиями TÜBİTAK-BİDEB 2211A.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 мл серологические пипеткиZA BioteknoLabselect SP-003-10
15 мл конические пробиркиLabselectCT-002-15A
2 мл серологические пипеткиLabselectLabselect SP-003-2
5 мл серологические пипеткиCleanteksBiofil GSP010005
50 мл конические пробиркиGolden GateCT-002-50
50 мл серологические пипеткиBIOFILLGSP020050
Anti Mouse 594Jackson Immuno715-585-150Диапазон разбавления: 1:100 - 1:800
Anti Rabbit 488Jackson Immuno711-545-152Диапазон разбавления: 1:100 - 1:800
Автоклав VAPOUR-Line liteVWR chemicalsVAPOUR-Lineeco 25
Дополнение B27GIBCO12587010с витамином A
Настольная центрифугаEppendorf5702
Настольный микроскоп DMI1OlympusCKX41
Шафы безопасности класса IIThermoSafe 2020
Белок сыворотки быка (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
Предметные стёкла 24 мм x 50 ммISOLAB280
OCT-крио-матрицаFisher Healthcare30226281
Крио-ампулаBioSigmaN403522
DAPINEOFROXX1322
DAPINEOFROXX15390.5 мкг/мл
Среда DMEM/F12GIBCO31330-038
Фосфатный буфер Дульбекко (DPBS)Gibco141901441X
Фактор роста эпидермиса (EGF)GIBCOPHG0311
Этанол 100%Sigma64-17-5
Этанол 70%Sigma64-17-5Разбавления этанола
Внеклеточная матрица (ECM)Corning354277без LDEV
Фактор роста фибробластов 2 (FGF2)GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
ИнкубаторMemmert INCO 153 med44043
Инсулин-селецитовый-трансферриновый комплексGIBCO41400045
KnockOut Serum (KOSR)GIBCO10828028
Микртом RM2235LeicaRM2235
Монтажное средствоabcamab104135
Среда mTSERSTEMCELL85850
Культуральные пластинки (6-лунные)CORNING3516
Дополнение N2R&DAR003
Незаменимые аминокислоты (NEAA)LONZABE13-114E
Пипетки P20, P200 и P1000GilsonF167350
ПарафинVWR chemicals10048502
ПараформальдегидSigma-AldrichF8775
Первичное антитело Aquaporin mAbabcamab9566Диапазон разбавления: 1:50-1:200
Первичное антитело CK14Santa Cruz Biotechnologysc-53253Диапазон разбавления: 1:50-1:500
Первичное антитело CK19ProteinTech14965-1-APДиапазон разбавления: 1:150-1:600
Первичное антитело CK3NOVUSNBP2-91997 0.1 MLДиапазон разбавления: 1:50-1:200
Первичное антитело CK5ThermoMA517057Диапазон разбавления: 1:200-1:1000
Первичное антитело Коллаген типа IVabcamab6586Диапазон разбавления: 1:100-1:500
Первичное антитело KeratocanBiossbs-11054RДиапазон разбавления: 1:50-1:200
Первичное антитело Na/K - АТФазаSanta Cruz Biotechnologysc-21712Диапазон разбавления: 1:50-1:500
Первичное антитело N-Кадгеринabcamab76011Диапазон разбавления: 1:50-1:500
Первичное антитело p63SANTACRUZsc-25268Диапазон разбавления: 1:50-1:500
Первичное антитело Pax6NovusNBP2-44576Диапазон разбавления: 1:50-1:200
Набор для выделения РНКMacherey–Nagel740984.50
Ингибитор ROCK (Y-27632)TOCRIS1254
Предметные стёклаStarFrostMBB-0302-55AС липким покрытием
Нержавеющие пинцеты № 5SigmaF6521-1EA
С

Ссылки

  1. Hassell, J. R., Birk, D. E. The molecular basis of corneal transparency. Exp Eye Res. 91 (3), 326-335 (2010).
  2. Daruich, A., et al. Congenital aniridia beyond black eyes: From phenotype and novel genetic mechanisms to innovative therapeutic approaches. Prog Retin Eye Res. 95, 101133(2023).
  3. Eden, U., Riise, R., Tornqvist, K. Corneal involvement in congenital aniridia. Cornea. 29 (10), 1096-1102 (2010).
  4. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  7. Foster, J. W., et al. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 7, 41286(2017).
  8. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
  9. Koc, A. C., et al. Patient-derived cornea organoid model to study metabolomic characterization of rare disease: aniridia-associated keratopathy. BMC Ophthalmol. 25 (1), 14(2025).
  10. Ilmarinen, T., et al. Production and Limbal Lineage Commitment of Aniridia Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 41 (12), 1133-1141 (2023).
  11. Chambers, I., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
  12. Okur, F. V., Cevher, I., Ozdemir, C., Kocaefe, C., Cetinkaya, D. U. Osteopetrotic induced pluripotent stem cells derived from patients with different disease-associated mutations by non-integrating reprogramming methods. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 211(2019).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Lima Cunha, D., Arno, G., Corton, M., Moosajee, M. The Spectrum of PAX6 Mutations and Genotype-Phenotype Correlations in the Eye. Genes (Basel). 10 (12), 1050(2019).
  15. Hayashi, R., et al. Co-ordinated ocular development from human iPS cells and recovery of corneal function. Nature. 531 (7594), 376-380 (2016).
  16. Gonzalez, G., Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Limbal stem cells: identity, developmental origin, and therapeutic potential. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (2), (2018).
  17. Ji, H. P., et al. MicroRNA-28 potentially regulates the photoreceptor lineage commitment of Muller glia-derived progenitors. Sci Rep. 7 (1), 11374(2017).
  18. Hatou, S., et al. Role of insulin in regulation of Na+-/K+-dependent ATPase activity and pump function in corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (8), 3935-3942 (2010).
  19. Higa, K., et al. Aquaporin 1-positive stromal niche-like cells directly interact with N-cadherin-positive clusters in the basal limbal epithelium. Stem Cell Res. 10 (2), 147-155 (2013).
  20. Chen, Q., et al. Stromal fibroblasts derived from mammary gland of bovine with mastitis display inflammation-specific changes. Sci Rep. 6, 27462(2016).
  21. Soiberman, U., Foster, J. W., Jun, A. S., Chakravarti, S. Pathophysiology of Keratoconus: What Do We Know Today. Open Ophthalmol J. 11, 252-261 (2017).
  22. Lima Cunha, D., et al. Restoration of functional PAX6 in aniridia patient iPSC-derived ocular tissue models using repurposed nonsense suppression drugs. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 240-253 (2023).
  23. Harding, P., et al. Variant-specific disruption to notch signalling in PAX6 microphthalmia and aniridia patient-derived hiPSC optic cup-like organoids. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (6), 167869(2025).
  24. Cunha, D. L., Smits, J., Zhou, H. Q., Moosajee, M. Transcriptomic analysis of aniridia iPSC-derived limbal epithelial stem cells reveals early changes linked to the limbal niche. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2821(2023).
  25. Harding, P., et al. Generation of human iPSC line (UCLi013-A) from a patient with microphthalmia and aniridia, carrying a heterozygous missense mutation c.372C>A p.(Asn124Lys) in. Stem Cell Res. 51, (2021).
  26. Theerakittayakorn, K., et al. Differentiation Induction of Human Stem Cells for Corneal Epithelial Regeneration. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  27. Bar-Nur, O., et al. Small molecules facilitate rapid and synchronous iPSC generation. Nat Methods. 11 (11), 1170-1176 (2014).
  28. Maiti, G., et al. Single cell RNA-seq of human cornea organoids identifies cell fates of a developing immature cornea. PNAS Nexus. 1 (5), pgac246(2022).
  29. Dorot, O., et al. The antipsychotropic drug Duloxetine rescues PAX6 haploinsufficiency of mutant limbal stem cells through inhibition of the MEK/ERK signaling pathway. Ocul Surf. 23, 140-142 (2022).
  30. van Velthoven, A. J. H., et al. Future directions in managing aniridia-associated keratopathy. Surv Ophthalmol. 68 (5), 940-956 (2023).
  31. Kocak, G., et al. Generation of Anterior Segment of the Eye Cells from hiPSCs in Microfluidic Platforms. Adv Biol (Weinh). 8 (5), e2400018(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

233233JoVE

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.