Методическая статья

Оптимизированный рабочий процесс для выделения и долгосрочного культивирования клеток глиомы, полученных от пациента, с сохранением исходных характеристик опухоли

DOI:

10.3791/68566

⸱

8 июля 2025 г.

 , 
1Beijing Institute for Brain Research, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Chinese Institute for Brain Research

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлен стандартизированный протокол для создания клеточных линий глиомы пациента (PDGC), обеспечивающий их генетическую и фенотипическую точность. Система адгезивных культур на основе базальной мембраны с помощью экстракта усиливает рост и гомогенность клеток, что делает эти модели ценными для скрининга лекарств и исследований GBM.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глиобластома (ГБМ) является наиболее агрессивной первичной опухолью головного мозга, характеризующейся высокой гетерогенностью и устойчивостью к стандартным методам лечения. Традиционные клеточные линии глиомы часто не сохраняют специфические для пациента генетические и фенотипические характеристики, что ограничивает их трансляционную значимость. Чтобы решить эту проблему, мы создали 50 клеточных линий глиомы (PDGC) пациента с использованием системы культивирования нейральных стволовых клеток без сыворотки. Этот протокол описывает сбор, обработку и долгосрочное культивирование образцов опухолей, полученных от пациентов с GBM, обеспечивая сохранение ключевых молекулярных особенностей. Наша методология включает в себя ферментативную диссоциацию тканей, лизис эритроцитов и адгезивную культуру с экстрактом базальной мембраны, что улучшает жизнеспособность клеток и способствует высокопроизводительному скринингу лекарственных препаратов. Характеристика PDGC с помощью полногеномного и транскриптомного секвенирования и иммунофлуоресцентного окрашивания подтверждает сохранение в них общих генетических изменений GBM и маркеров нейральных стволовых клеток и предшественников. Кроме того, эти клетки проявляют опухолевый потенциал в моделях ксенотрансплантатов. Оптимизируя условия культивирования, этот протокол обеспечивает стандартизированную основу для создания биологически значимых моделей GBM для поддержки терапевтических открытий и механистических исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глиома, наиболее распространенная первичная внутричерепная опухоль, происходит из нейральных стволовых или прогениторных клеток, подвергшихся генетическим мутациям1. Всемирная организация здравоохранения классифицирует глиомы на степени 1-4 на основе патологических и молекулярных характеристик, начиная от низкой степени до высокой степени2. Глиобластома (ГБМ), глиома 4 степени, составляет примерно 57% всех глиом и 48% всех первичных злокачественных опухолей центральной нервнойсистемы. Пациенты с ГБМ сталкиваются с плохим прогнозом, при этом среднее время выживаемости составляет менее 2 лет, а 5-летняя выживаемость составляет всего 5,4%4. Стандартное лечение включает максимально безопасную резекцию с последующей лучевой терапией и химиотерапией темозоломидом5. Несмотря на эти вмешательства, ГБМ остается неизлечимым из-за своей инфильтративной природы и врожденной устойчивости к терапии, что создает острую потребность в новых подходах к лечению.

Исследователи обычно используют опухолевые клеточные линии, полученные от человека, в качестве моделей для изучения развития рака и терапевтических механизмов. Тем не менее, классические клеточные линии глиомы, поддерживаемые в сывороткесодержащей среде и широко пассирующиеся in vitro, демонстрируют значительные изменения фенотипических характеристик и генетических профилей по сравнению с опухолями пациентов 6,7,8. Следовательно, модели доклинического скрининга, основанные на этих клеточных линиях, часто не могут идентифицировать терапевтические мишени и молекулы, которые эффективно переносятся в клинические условия. Успех лечения ГБМ еще больше осложняется гетерогенностью и пластичностью опухоли9. Эта гетерогенность проявляется не только в транскриптомных подтипах (например, проневральном, мезенхимальном), но и в различных состояниях развития составляющих клеток10. ГБМ использует механизмы развития нервной системы и содержит субпопуляции стволовых клеток глиобластомы (ГСК), которые стимулируют пролиферацию опухоли и проявляют повышенную устойчивость к лучевой и химиотерапии11,12. Культивирование клеток глиомы, полученных от пациента, в бессывороточной среде нейральных стволовых клеток эффективно сохраняет спектр мутаций и паттерны экспрессии генов исходной опухоли при сохранении частичных характеристик GSC8.

По сравнению с моделями нейросферных культур, адгезивная культура с базальной мембраной с экстрактом способствует более стабильному и быстрому росту клеток, что делает их более подходящими для химического и генетического скрининга13. Используя этот подход, мы создали 50 клеточных линий GBM, полученных от пациентов, и охарактеризовали их с помощью полногеномного секвенирования, транскриптомного секвенирования и скрининга библиотеки лекарств FDA для изучения потенциальных терапевтических стратегий. Этот ресурс продвигает исследования глиомы, а подробные результаты опубликованы в наших предыдущих исследованиях14. В данной статье мы описываем методологию, используемую для разработки клеточных линий глиомы, полученных от пациента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе используются образцы ткани глиомы и крови пациента, полученные в результате сотрудничества с больницей. Все процедуры отбора проб и протоколы экспериментов получили одобрение Комитета по этике Пекинской больницы Тяньтань, Столичного медицинского университета (KY 2020-093-02 и KY 2014-021-02). Пациенты предоставляют подписанное информированное согласие перед операцией, а вся идентификационная информация проходит анонимизацию перед передачей образцов в лабораторию. Исследователи должны получить одобрение своего институционального комитета по этике и получить согласие пациента перед внедрением этого протокола.

1. Подготовка перед обработкой образца

  1. Стерилизуйте ножницы, пинцет и другие инструменты методом автоклавирования.
  2. Приготовьте питательную среду PDGC, соединив 47,5 мл DMEM/F12, 500 мкл N2, 1 мл B27, 500 мкл 100-кратного пенициллина/стрептомицина, 250 мкл 100-кратного заменителя глутамина, 100 мкл 2,5 М HEPES, 100 мкл 30% глюкозы, 50 мкл 50 мМ β-меркаптоэтанола, 1,5 мл 1 г/мл эпидермального фактора роста (EGF), и 1,5 мл 1 мкг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF).
  3. Приготовьте 1x Буфер для лизиса эритроцитов (ACK), растворив в воде 8,29 г хлорида аммония, 1 г бикарбоната калия и 37 мг ЭДТА, а затем разбавив до 1 л.
  4. Поместите стерилизованные инструменты, буфер PBS, контейнеры для отходов, центрифужные пробирки и другие принадлежности в шкаф для биобезопасности и проведите УФ-дезинфекцию в течение 30 минут.
  5. Поместите жидкий азот в утепленную емкость.

2. Забор образцов у пациента

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите все процедуры сбора тканей в строгих стерильных условиях, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение последующих клеточных культур. Поддерживайте асептическую технику на протяжении всего рабочего процесса.

  1. Соберите образцы крови перед операцией и удалите опухолевую ткань из головного мозга пациента. Для больших, высокоинфильтративных опухолей, где трудно отличить опухоль от окружающих нормальных тканей, максимизируйте резекцию периопухолевой ткани при сохранении критических функциональных областей мозга. Отделите примерно 500-2000мм3 ткани ядра опухоли и поместите в центрифужные пробирки объемом 15 мл, содержащие 10 мл гипотермической консервационной среды.
  2. Запечатайте пробирки с образцами, поместите их в ящик со льдом и быстро транспортируйте в лабораторию для обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что интервал между сбором и обработкой проб не превышает 6 часов при температуре 4 °C. Во время сбора пробы тщательно исключите обожженные ткани и участки некроза опухоли. Поверхность разрезов тканей часто обжигается электрическим ножом, используемым во время операции, что может поставить под угрозу жизнеспособность клеток в культуре.

3. Обработка образцов крови

  1. Центрифугируйте пробирки с образцами крови при давлении 1000 × г в течение 10 мин и выбросьте верхний слой плазмы.
  2. Перенесите оставшиеся лейкоциты и слой эритроцитов в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Добавьте 10 мл 1x ACK и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут для лизирования эритроцитов.
  3. Добавьте 40 мл PBS для прекращения лизиса, аккуратно перемешайте и центрифугируйте при 1000 × г в течение 10 минут.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 3 мл 1x ACK и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут для второго этапа лизиса эритроцитов.
  5. Добавьте 12 мл PBS для прекращения лизиса, аккуратно перемешайте и центрифугируйте при 1000 × г в течение 10 минут.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулу мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) в 1 мл PBS, переложите в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 510 × г в течение 10 мин.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость, заморозьте гранулу PBMC в жидком азоте и храните при температуре -80 °C.

4. Обработка опухолевой ткани

  1. Удалите раствор для консервации тканей из пробирки с образцом и промойте ткань в PBS, чтобы удалить видимые сгустки крови и некротическую ткань. Проведите повторное промывание PBS на оставшейся ткани.
  2. Вырежьте самую неповрежденную часть ткани и зафиксируйте на ночь в 4% параформальдегиде (PFA) при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер неподвижной ткани составляет примерно 10 мм. Пропустите этот шаг, если выборка небольшая.
  3. Разрежьте 2-4 небольших кусочка ткани, переложите в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C.
    Примечание: Размер небольших кусочков ткани обычно колеблется от 5 до 10 мм, в зависимости от количества ДНК и РНК, необходимого для секвенирования.
  4. Поместите оставшуюся опухолевую ткань в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и измельчите в мелкую пасту с помощью ножниц, держа на льду.
  5. Добавьте 1-3 мл раствора для отслоения клеток и перенесите измельченную ткань в пищеварительную трубку. Расщепляйте ткань с помощью диссоциатора тканей при температуре 37 °C в течение 16 минут.
  6. Добавьте 3-кратный объем PBS, чтобы остановить сбраживание, и перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку с клеточным фильтром 70 мкм. Аккуратно протрите ткань через ситечко с помощью небольшого стержня, чтобы максимально увеличить сбор клеток. Центрифугируйте при 510 × г в течение 10 мин и удалите надосадочную жидкость.
  7. Добавьте 1-3 мл 1x ACK и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут для лизирования эритроцитов. Добавьте 4-кратный объем PBS, чтобы остановить лизис, аккуратно перемешайте и центрифугируйте при 510 × г в течение 10 минут, чтобы удалить надосадочную жидкость.
  8. Ресуспензируют клетки в среде PDGC и затравочную часть клеточной суспензии в культуральных планшетах. Поместите планшеты в гипоксический инкубатор при температуре 37 °C. Оставшиеся клетки заморозить в питательной среде, содержащей 10% ДМСО.
    Примечание: Как правило, для образцов тканей размером примерно 10-20 мм мы высеваем от 1/3 до 1/10 клеточной суспензии в чашку диаметром 6 см с 3 мл питательной среды, а остальные клетки криоконсервируют в 2-4 флаконах, в зависимости от выхода клеток.
  9. Покройте планшеты, добавив экстракт матрицы базальной мембраны в ледяной PBS в соотношении 1:100 и инкубируйте планшеты при комнатной температуре в трясущемся инкубаторе в течение 2 ч. Откажитесь от PBS перед добавлением питательной среды PDGC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие пассажи и культивирование клеток с использованием планшетов с экстрактным покрытием на основе базальной мембраны.
  10. Через 2 дня перенесите культивируемые клетки в планшеты с базальной мембраной, покрытые экстрактом, чтобы обеспечить адгезию и рост клеток.

5. Культивирование и пассаж клеток

  1. После того, как клетки прилипнут к культуральным планшетам, удалите неадгезивные клетки и заменяйте или дополняйте питательную среду каждые 2-3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Адгезионная способность варьируется в зависимости от ячейки. Даже в присутствии экстракта базальной мембраны небольшая фракция клеток может оставаться неадгезивной, например, BNI7-11, для которого требуется непрерывное культивирование суспензии. Кроме того, некоторые клетки демонстрируют полуадгезивный паттерн роста, например, BNI20. Поэтому тщательное наблюдение за клеточным статусом имеет важное значение. Для неадгезивных клеток может отмечаться увеличение взвешенных клеток. Если клеточные агрегаты выглядят как темные, похожие на вату структуры и не показывают значительных изменений с течением времени, они, как правило, неспособны к долгосрочному расширению.
  2. Когда клетки достигнут слияния, добавьте раствор для диссоциации клеток, чтобы отделить клетки. Завершите диссоциацию с помощью 3x PBS и центрифуги при 250 × г в течение 3 минут. Проведите клетки в соотношении от 1:2 до 1:4. Оставшиеся клетки заморозить в питательной среде, содержащей 10% ДМСО.
  3. Продолжайте пассирование в течение как минимум 10-20 поколений, чтобы создать стабильную клеточную линию.
    1. Документируйте морфологию клеток с помощью изображений во время каждого пассажа и записывайте номера пассажей. Четко обозначьте первоначальное замораживание клеток подробной информацией (например, номерами проходов).
    2. Как только клеточная линия стабилизируется, соберите 2-3 пробирки клеточных гранул (300 000-1 000 000 клеток/пробирку) и храните при температуре -80 °C.

6. Последующие экспериментальные операции

  1. Для образцов с фиксированным PFA после ночной фиксации образцы обезвоживаются с помощью градуированной серии растворов этанола путем последовательного погружения в 60% этанол, 70% этанол, 80% этанол, 90% этанол, 95% этанол и две замены 100% этанола, каждая в течение 40 мин. Затем процедите образцы в двух заменах ксилола, каждая в течение 40 минут, а затем инфильтрируйте их двумя заменами парафинового раствора, каждая в течение 40 минут. Наконец, обезвоженные и инфильтрированные образцы помещают в парафиновые блоки для последующего срезания и окрашивания15.
  2. Для гранул PBMC, опухолевой ткани или образцов опухолевых клеток, хранящихся при температуре -80 °C, извлекайте ДНК и РНК для различных омиксных исследований, включая полногеномное секвенирование, экзомного секвенирование, объемное секвенирование РНК и секвенирование РНК отдельных клеток по мере необходимости.
  3. Используйте стабильные клеточные линии PDGC для создания модели ксенотрансплантата мыши, высокопроизводительного скрининга лекарств, исследования механизмов и других связанных с этим экспериментов.
    1. Чтобы создать внутричерепную ортотопическую модель ксенотрансплантата PDGC, диссоциируйте и подсчитайте клетки, затем ресуспендируйте их в смеси экстракта базальной мембраны и ледяного PBS в соотношении 1:1 до конечной концентрации 100 000 клеток/мкл. Введите 5 мкл клеточной суспензии стереотаксически в левое полосатое тело 6-8-недельных мышей с иммунодефицитом с помощью микрошприца и стандартного стереотаксического инструмента. Установите координаты инъекции относительно брегмы следующим образом: +0,5 мм передне-задний (AP), -1,9 мм медиально-латеральный (ML) и -3,6 мм дорсально-вентральный (DV).
    2. Получение ПДГК, экспрессирующих люциферазу, и создание внутричерепных ксенотрансплантатов для биолюминесцентной визуализации роста опухоли.
      1. Упакуйте репортерный ген люциферазы-tdTomato в лентивирусные частицы, затем инфицируйте PDGC упакованным лентивирусом для установления стабильной экспрессии16.
      2. После инфицирования отсортируйте tdTomato-положительные клетки с помощью проточной цитометрии для получения стабильной популяции клеток, экспрессирующих люциферазу.
      3. Перед визуализацией введите D-люциферин внутрибрюшинно в дозе 10 мкл/г массы тела с использованием раствора D-люциферина 15 мг/мл. Обезболите мышей изофлураном и подождите 10 минут после введения D-люциферина. Поместите мышей в систему биолюминесцентной визуализации. Установите автоматический режим экспозиции во время съемки17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 представлен полный обзор рабочего процесса протокола. Образцы пациента включают периферическую кровь и ткань ядра опухоли. Образцы крови подвергаются центрифугированию для удаления плазмы с последующим проведением двух раундов лизиса ACK для получения PBMC, которые служат в качестве контроля для анализа секвенирования. Образцы опухолей промываются PBS для удаления сгустков крови и некротических участков перед обработкой на мелкие фрагменты. Множественные фрагменты ткани криоконс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гетерогенность ГБМ создает значительные проблемы для лечения. Обычные клеточные линии GBM часто развивают однородный генетический фон и теряют характеристики опухоли пациента после продолжительного культивирования в сывороткосодержащей среде, что ограничивает их трансляционную ценность. Оптимизация условий культивирования GBM и стандартизация рабочих процессов обработки образцов пациентов имеют важное значение для максимального использования ограниченных клинических ресурсов в исследован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (#2022YFA1103900 до J.C.), Лабораторией Чанпин и Инновационным фондом медицинских наук CAMS (CIFMS) (#2024-I2M-3-022 to J.C.). Дополнительные средства для Джей Си поступили от Китайского института исследований мозга. Рисунок 1 был создан в https://BioRender.com году.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
70 μ m клеточный фильтрFalcon352350
Accutase cell connection solutionBioLegend423201
хлорид аммонияAladdin60-92-4
Anti-Sox2 антителоMerckmilliporeAB5603
Antifade Mounting Medium with DAPIBeyotimeP0131
Anti-Nestin антителоNOVUSNB100-1604
B27 без витаминного супплеметаGibco12587010
BD FACSAria Fusion Flow CytometerBD Biosciences/
Чашка для клеточных культурNEST705001
D-люциферин, соль калияInvitrogenL2916
DMEM/F12GibcoC11330500BT
DMSOSinopharm30072418
EDTABBI Life SciencesA600107-0500
глюкозаSangon BiotechA50991-0500
GlutaMAXGibco35050-061заменитель глютамина
Гематоксилин-эозин окрашивание Набор для окрашиванияSolarbioG1120
HEPESBeyotimeST090
Human bFGFOrigeneTP750002
человеческий EGFновопротеинC029-500μ g
HypoThermosol FRSBiolife Solutions101104гипотермическая консервационная среда
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10
IVIS Lumina XR III PerkinElmer/биолюминесцентная система визуализации
MatrigelCorning356231экстракт матрицы базальной мембраны
МикрошприцHamilton80300
N2 ДобавкаGibco17502048
Nunclon Sphera 6-Well Plate ThermoScientific174932пластины со сверхнизким уровнем прикрепления
ПараформальдегидSangon BiotechA500684-0500
PBS буферSolarbioP1010-100*2L Пенициллин
/стрептомицинSolarbioP8420/S8290
Бикарбонат калияSangon BiotechA501195-0500
RWD тканевый диссоциаторRWD Life ScienceDSC-410
Стандартный стереотаксический приборRWD Life Science68801
Пробирка для обработки образцов тканейRWD Life ScienceSCT-100
β-меркаптоэтанолSigmaM3148-100mL

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  2. Louis, D. N., et al. The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  3. Miller, K. D., et al. Brain and other central nervous system tumor statistics, 2021. CA Cancer J Clin. 71 (5), 381-406 (2021).
  4. Ostrom, Q. T., Cote, D. J., Ascha, M., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. Adult glioma incidence and survival by race or ethnicity in the United States from 2000 to 2014. JAMA Oncol. 4 (9), 1254-1262 (2018).
  5. Horbinski, C., Berger, T., Packer, R. J., Wen, P. Y. Clinical implications of the 2021 edition of the WHO classification of central nervous system tumours. Nat Rev Neurol. 18 (9), 515-529 (2022).
  6. Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
  7. Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosom Cancer. 39 (1), 29-36 (2004).
  8. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  9. Yabo, Y. A., Niclou, S. P., Golebiewska, A. Cancer cell heterogeneity and plasticity: A paradigm shift in glioblastoma. Neuro-Oncol. 24 (5), 669-682 (2021).
  10. Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849.e21 (2019).
  11. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  12. Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  13. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
  14. Wu, M., et al. Multi-omics and pharmacological characterization of patient-derived glioma cell lines. Nat Commun. 15 (1), 6740(2024).
  15. Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Sci Rep. 10 (1), 12639(2020).
  16. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), e1499(2009).
  17. Sun, A., et al. Firefly luciferase-based dynamic bioluminescence imaging: A noninvasive technique to assess tumor angiogenesis. Neurosurgery. 66 (4), 751-757 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи