Методическая статья

Анализ обогащения 13С витамина А в биологических образцах методами газовой хроматографии-горения-изотопного соотношения масс-спектрометрия

493 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68571

⸱

14 ноября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье описан анализ образцов сыворотки, грудного молока и печени на 13С-обогащение ретинола и ретиниловых эфиров для индикаторных применений. Высокоэффективная жидкостная хроматография используется для очистки и количественного определения концентраций ретинола, а газовая хроматография-горение-изотопное отношение масс-спектрометрия (GC-C-IRMS) используется для анализа очищенных экстрактов.

Аннотация

Витамин А имеет решающее значение для здоровья, но оценка его статуса является сложной задачей. Витамин А, циркулирующий в крови, контролируется гомеостатически и часто не отражает дефицит или избыток витамина А. Использование 13С-витамина А позволяет отслеживать и количественно оценивать общие запасы витамина А в организме и получать дополнительную информацию о фармакокинетике и метаболизме. В данном протоколе описывается экстракция, очистка и определение обогащения 13С-изотопами витамина А в образцах сыворотки, грудного молока и тканей с помощью масс-спектрометрии газовой хроматографии-горения-изотопного отношения (GC-C-IRMS). Анализ с использованием GC-C-IRMS позволяет получить чувствительные и точные значения обогащения, особенно для образцов с обогащением 13C, близким к естественному уровню распространенности. Это обеспечивает гибкость в дизайне исследований для использования меньших доз индикаторов и более долгосрочной фармакокинетической выборки. Вкратце, на 0,4 – 1 мл сыворотки добавляют этанол для осаждения белков, С-23 β-апо-каротинол добавляют в качестве внутреннего стандарта, а для извлечения ретиноидов используют гексан. Экстракт затем ресуспендируют в метаноле и очищают с помощью ВЭЖХ. Затем фракцию ретинола ресуспендируют в гексане и вводят в систему GC-C-IRMS. Атом % (At%) рассчитывается непосредственно по отношению к углекислому газу, который калибруется по стандарту сахарозы с помощью элементного анализатора. Другие типы тканей, которые были проанализированы с помощью GC-C-IRMS, включают грудное молоко и печень после омыления. Методы твердофазной экстракции могут быть использованы для помощи в очистке этих или других сложных матриц. Кроме того, к IRMS может быть подключен элементный анализатор для анализа образцов пищевых продуктов на общее содержание 13C.

Введение

Витамин А (ВА) является важным микроэлементом, необходимым для зрения, иммунной функции, клеточной дифференцировки и метаболической регуляции. Оптимизация статуса ВА остается глобальной проблемой здравоохранения, поскольку дефицит или избыток может ухудшить результаты для здоровья. Точная оценка статуса ВА имеет решающее значение для клинических или популяционных исследований, определяющих соответствующие вмешательства. Тем не менее, концентрация ретинола в сыворотке сама по себе является плохим биомаркером и диагностическим инструментом, поскольку она гомеостатически регулируется в широком диапазоне общих запасов организма (TBS) и подвержена влиянию воспаления и дефицита других питательных веществ.

Изотопно меченные индикаторы кардинально изменили исследования VA, позволив количественно оценить TBS с помощью теста на разведение изотопов ретинола (RID) 3,4,5. Для RID вводят индикатор VA, обогащенный либо 13С, либо 2Н, который уравновешивается с запасами организма, а с помощью МС измеряют отношение ретинола к следованию (TTR) в сыворотке крови (или плазме). Уравнение разбавления изотопов применяется с конкретными допущениями, связанными с метаболизмом VA, для расчета TBS 5,6.

Для определения TTR ретинола сыворотки крови можно использовать многочисленные комбинации хроматографии и МС (например, ГХ-МС, ЖХ-МС, ЖХ-МС/МС). Аналитическая точность имеет решающее значение для точных оценок RID, поскольку TBS обратно пропорциональны TTR. ЖХ-МС/МС хорошо подходит для приложений с высокой пропускной способностью при использовании сильно меченых индикаторов и относительно высоких дозах индикаторов. Типичные методы ЖХ-МС/МС сообщают об относительных стандартных отклонениях ретинола (РСД) в 3-6% для внутрианалитического анализа и <8% для межаналитического анализа7, но имеются ограниченные данные о точности и прецизионности TTR. Напротив, масс-спектрометрия газовой хроматографии-горения-изотопного отношения (GCCIRMS) обеспечивает исключительную точность обогащения 13C-ретинолом с типичным содержанием изотопов 13C/12C ~0,02-0,05 8,9. Это позволяет точно определять концентрации индикаторов в образцах с низким уровнем обогащения. Использование IRMS для приложений RID позволяет получать адекватный аналитический сигнал с использованием меньшей массы индикатора и меньшего количества помеченных атомов в индикаторе, что снижает затраты, связанные с дозами индикатора.

В данной рукописи представлен анализ 13С-ретинола из крови, грудного молока и тканей с использованием ГХ-С-ИРМС. В зависимости от тестируемого биологического образца анализ 13-меченогоС-меченного ретинола с использованием GC-C-IRMS начинается с одного из нескольких потенциальных методов экстракции для выделения неполярных соединений, которые включают меченый ретинол. Для образцов сыворотки это включает в себя жидкостно-жидкую экстракцию путем добавления этанола и гексана и сбора фракции гексана. При тестировании грудного молока образцы сначала омыляют гидроксидом калия, а затем проводят аналогичную жидкостно-жидкую экстракцию сыворотки. Эти образцы грудного молока также очищаются с помощью картриджей для экстракции в твердой фазе, чтобы уменьшить количество других оставшихся липидов. При экстракции из ткани (например, печени) образец измельчают с безводным сульфатом натрия для удаления воды, экстрагируют метиленхлоридом и фильтруют в мерную колбу или колбу с круглым дном для ротационного выпаривания. Аликвоту сушат, ресуспендируют в этаноле, омыляют и экстрагируют тем же методом, что и грудное молоко. Эти неполярные растворы из каждого образца высушиваются в азоте и восстанавливаются в метаноле для очистки и количественного определения с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Чувствительность IRMS позволяет определять обогащение в образцах с низким уровнем обогащения, таких как фармакокинетические образцы для долгосрочного математического моделирования или образцы внепеченочных тканей для точного отслеживания метаболизма VA. Для оценки статуса ВА до и после вмешательства было предложено однодозовое парное тестированиеRID, чтобы определить эффективность у теоретических субъектов, что может быть многообещающим подходом в случае валидации на людях. IRMS способна обнаруживать индикаторы VA, близкие к значениям естественного обогащения, что обеспечивает длительные окна наблюдения и гибкость в протоколах отбора проб.

Было показано, что грудное молоко является менее инвазивным альтернативным подходом к отбору проб для оценки статуса ВА1. Ретинол грудного молока может быть использован в качестве источника образца для теста RID, и он показал сильную корреляцию со значениями RID, полученными из сыворотки крови, у женщин в Замбии с низким уровнем запасов VA11. Для образцов тканей и грудного молока методы твердофазной экстракции могут помочь в очистке этих образцов в сложных матрицах. IRMS также используется для различения пищевых источников ВА и определения относительного вклада в рацион питания с использованием изменений в естественном содержании 13C ретинола 9,12,13 в сыворотке крови. Элементный анализатор также может использоваться с IRMS для анализа образцов пищевых продуктов на общее содержание 13C и сравнения его с обогащением VA.

При использовании меток 13C крайне важно понимать исходное обогащение ретинолом 13C из-за встречающегося в природе 13C (~1,1% от общего углерода), которое может варьироваться в зависимости от источников VA, потребляемых как отдельными людьми, так и населением. Поэтому для достижения наилучшей точности на индивидуальном уровне рекомендуется сдавать исходный образец крови. Для оценки популяции популяционная оценка может быть сгенерирована с использованием случайно выбранной подгруппы или отдельных особей из одной и той же популяционной группы14.

Протокол

1. Экстракция ретинола из биологических образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры обработки и экстракции образцов выполняются под желтым или ультрафиолетовым фильтром света для минимизации деградации.

  1. Экстракция из сыворотки крови
    1. Пипетируйте 1 мл сыворотки (или столько, сколько доступно) в стеклянную пробирку размером 13 x 100 мм (или аналогичного размера). Запишите объем использованной сыворотки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать пипетку прямого вытеснения.
    2. Добавьте в 1,5 раза больше объема этанола 200 proof.
    3. Добавьте 25 мкл внутреннего стандарта, такого как C-23 β-апо-каротинол (синтезирован из полностью транс-ретинала, ABS = 0,9)9. Укупорьте образец и перемешайте вихрем в течение 15 с.
    4. Добавьте 1 мл гексана, перемешайте вихрем в течение 15 секунд и центрифугируйте в течение 2 минут (~1 300 × г) при комнатной температуре.
    5. С помощью пипетки Пастера осторожно нанесите верхний слой гексана в новую стеклянную пробирку (12 x 75 мм или 13 x 100 мм).
    6. Повторите шаги 1.1.4 и 1.1.5 2 раза, объединив три экстракта гексана во второй пробирке. Поместите собранный экстракт гексана под слабую струю азота до полного высыхания.
    7. Добавьте 100 μл метанола в высушенный образец и немедленно укупорьте его. Взбейте раствор вверх и вниз по стенкам пробирки, а затем перемешайте образец вихревым способом в течение 15 с.
    8. Поместите образцы в морозильную камеру при температуре -80 °C не менее чем на 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут храниться при температуре -80 °C до следующего дня.
  2. Экстракция образцов грудного молока
    1. Полностью разморозьте образцы молока и аккуратно переверните несколько раз, чтобы обеспечить однородность образцов. В стеклянную центрифугу объемом 10 мл отмерьте 0,5-1,5 мл (стандартные 1,0 мл) аликвоты молока и запишите использованный объем.
    2. Добавьте в 1,5 раза больше объема 200-градусного этанола (содержащего 0,1% бутилированного гидрокситолуола (w:v)), перемешайте с вихрем в течение 15 секунд.
    3. Добавьте 25 мкл внутреннего стандарта, такого как С-23 β-апо-каротинол (синтезирован из полностью транс-ретинала, АБС = 0,9)15. Закройте образец крышкой и перемешайте по вихрю.
    4. Добавьте в 0,8 раза больше объема образца молока 50:50 гидроксида калия в воду (приготовленную в виде w:v, например, 50 г KOH, растворенного в 50 мл воды), перемешайте вихрем в течение 15 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: KOH:вода должна быть приготовлена в пластиковых контейнерах (например, из полиэтилена высокой плотности).
    5. Омылите образцы в течение 1 часа на водяной бане при температуре 45 °C и быстро перемешивайте с помощью вихря каждые 15 минут.
    6. Добавьте холодную деионизированную воду или воду обратного осмоса в том же объеме, что и исходный объем молока.
    7. Добавьте 1 мл гексана, перемешайте вихрем в течение 15 секунд и центрифугируйте в течение 2 минут (~1 300 × г) при комнатной температуре.
    8. С помощью пипетки Пастера осторожно нанесите верхний слой гексана на новую стеклянную пробирку (12 x 75 мм или 13 x 100 мм).
    9. Повторите шаги 1.2.7 и 1.2.8 еще дважды, скапливая гексан во второй пробирке.
    10. Отберите каждый образец с помощью твердофазной экстракции (SPE); Начните с подключения необходимых картриджей SPE (PE 500 мг/3 мл -NH2) к вакуумному коллектору.
    11. Кондиционируйте каждый картридж, пропуская 3 x 2 мл гексана через каждый картридж, не допуская, чтобы уровень растворителя опускался ниже верхней части упаковочного материала. Соберите гексан в стеклянную пробирку размером 16 x 75 мм и утилизируйте ее соответствующим образом.
    12. Загрузите образцы в картриджи и протяните с помощью вакуума до тех пор, пока растворитель не станет чуть выше уровня упаковочного материала. Промойте каждый картридж 3 x 2 мл гексана таким же образом, как в шаге 1.2.11. Утилизируйте отработанный растворитель и замените стеклянные сборные пробирки на новые пробирки того же размера, на которых указан идентификатор образца.
    13. Промойте ретинол насквозь с 3 х 2 мл метиленхлорида, собирая эту фракцию.
    14. Высушите элюат под азотом и восстановите в 100 мкл метанола (марки MS). Перемешайте образец с помощью вихря и перемешайте растворитель по всем сторонам пробирки. Центрифуга для 20-30 с.
    15. Поместите образцы в морозильную камеру при температуре -80 °C не менее чем на 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут храниться при температуре -80 °C до следующего дня.
  3. Экстракция образцов печени
    1. В стеклянную воронку диаметром 8 см сложите и положите фильтровальную бумагу ватман #1 диаметром 15 см в форме конуса. Поместите под воронку мерную колбу объемом 50 мл.
    2. Разморозьте ткань и взвесьте 0,5 г, или столько образца, сколько доступно. Запишите вес используемой ткани.
    3. Переложите образцы в ступку с пестиком и измельчите примерно с 5 г сульфата натрия.
    4. Добавьте 250 мкл внутреннего стандарта, такого как C-2315.
      Примечание: Этерифицированные формы витамина А (т.е. ретинилацетат, ретинилбутират) не следует использовать, поскольку образец в конечном итоге будет омылен, что сделает стандарт неотличимым от эндогенного ретинола.
    5. В вытяжной шкаф насыпьте 10-15 мл метиленхлорида в ступку с измельченным образцом печени и аккуратно перемешайте с помощью пестика.
    6. Насыпьте метиленхлорид через фильтровальную бумагу в мерную колбу.
    7. Повторите шаги 1.3.5 и 1.3.6 еще дважды, следя за тем, чтобы общий растворитель в мерной колбе оставался ниже линии.
    8. С помощью пастеровской пипетки смойте оставшееся содержимое ступки в воронку с метиленхлоридом. Продолжайте добавлять метиленхлорид в воронку с помощью пастеровской пипетки до тех пор, пока растворитель в мерной колбе не достигнет линии. Закройте мерную колбу крышкой, и, закрепив крышку на месте, несколько раз переверните колбу.
    9. Налейте примерно 10 мл экстракта метиленхлорида в колбу Эрленмейера объемом 25 мл. Перелейте 5 мл раствора в стеклянную центрифужную пробирку объемом 10 мл с завинчивающейся крышкой. Высушите образец под слабой струей газообразного азота.
    10. Восстановите образец в 2 мл этанола + 0,1% бутилированного гидрокситолуола и вортекса для смешивания образца.
    11. Добавьте 0,8 мл гидроксида калия 50:50 (w:v) в воду и перемешайте вихревым способом в течение 15 с.
    12. Омылите образцы в течение 1 часа на водяной бане при температуре 45 °C и быстро перемешивайте с помощью вихря каждые 15 минут.
    13. Добавьте 0,1 мл холодной деионизированной или обратноосмосной воды.
    14. Добавьте 1 мл гексана, перемешайте вихрем в течение 15 с и центрифугируйте в течение 2 минут (~1 300 × г).
    15. С помощью пипетки Пастера осторожно нанесите верхний слой гексана на новую стеклянную пробирку (12 x 75 мм или 13 x 100 мм).
    16. Повторите шаги 1.3.14 и 1.3.15 еще дважды, скапливая гексан во второй пробирке.
    17. Высушите объединенный гексан в азоте и восстановите в 100 мкл метанола (марки MS). Перемешайте образец с помощью вихря и перемешайте растворитель по всем сторонам пробирки. Центрифугируйте в течение 20-30 с и поместите образцы в морозильную камеру при температуре -80 °C не менее чем на 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут храниться при температуре -80 °C до следующего дня.

2. Очистка и количественное определение образцов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

  1. Подготовьте систему ВЭЖХ 1 с колонкой C18 (5 мкм, 4,6 x 250 мм) и детектором УФ-ВИД с длиной волны 325 нм.
  2. Приготовьте подвижную фазу 92:8 ацетонитрил:вода, отмерив объемы ацетонитрила и воды отдельно, а затем влив воду в ацетонитрил. Вакуумная фильтрация смешанного раствора для удаления растворенного газа.
  3. Включите систему ВЭЖХ 1, при необходимости выполните продувку ВЭЖХ растворителем, затем установите расход на уровне 1 мл/мин в течение не менее 15 минут для полного выравнивания системы.
  4. Внедрение стандартов в систему ВЭЖХ.
    1. Для количественного определения концентраций ретинола введите 25 мкл внутреннего стандартного раствора C-23 и запишите результат 3 раза для сравнения с образцами.
    2. Введите стандарт ретинола, чтобы определить точное время удержания в системе, используемой для сбора фракций и количественного определения ретинола.
  5. Подготовьте систему ВЭЖХ 2 (компоненты такие же, как и в системе 1). При использовании одной системы ВЭЖХ на обоих этапах замените колонку, используемую для первичной очистки, на вторую идентичную колонку, чтобы свести к минимуму потенциальный перенос соединений из образцов.
  6. В системе 2 вакуумную фильтрацию метанола, продувку подвижной фазы ВЭЖХ, а затем прокачку со скоростью 0,7 мл/мин в течение 20 минут для выравнивания.
  7. Вынимайте образцы по одному из морозильной камеры при температуре -80 °C и центрифугируйте при температуре 1 300 × г в течение 30 с при комнатной температуре.
  8. Введите весь образец в ВЭЖХ, избегая гранулированного материала. Начните запись при количественном определении ретинола.
  9. Соберите пик ретинола в небольшую стеклянную пробирку (12 x 75 мм или 13 x 100 мм) по мере прохождения растворителя через детектор. Соберите среднюю часть пика для достижения максимальной чистоты, обычно значения поглощения более 0,1 единицы поглощения (Рисунок 1), которые можно регулировать в зависимости от концентрации ретинола в образце. Подождите, пока пик C-23 станет размытым, и прекратите запись.
  10. Высушите пробу под слабой струей азота.
  11. Добавьте 100 μл метанола (класса MS) в высушенный образец и немедленно укупорьте. Перемешайте раствор вверх и вниз по стенкам пробирки, затем перемешайте образец с помощью вихря в течение 15 с. Поместите образцы в морозильную камеру при температуре -80 °C не менее чем на 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут храниться при температуре -80 °C до следующего дня.
  12. Извлекайте образцы по одному из морозильной камеры при температуре -80 °C. Центрифуга при 1 300 × г в течение 30 с.
  13. Введите полный образец в систему ВЭЖХ 2, избегая гранулированного материала.
  14. По мере того, как пик ретинола размывается, соберите растворитель, когда он проходит через детектор, в небольшой стеклянный флакон (<1 мл) с коническим дном и осторожно вставьте флакон с образцом в пробирку размером 12 x 75 мм.
  15. Включите вакуумный концентратор и дайте конденсатору остыть в течение 20 минут.
  16. Поместите образцы в сбалансированный строй в карусель, установите настройку нагрева на ноль, а вакуум на 05,1, закройте крышку и нажмите кнопку запуска.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сушки образцов обычно требуется 10-20 минут. Для газового хроматографа важно, чтобы из образцов был удален весь метанол.
  17. После высыхания переложите флакон с ВЭЖХ в янтарный флакон объемом 4 мл с завинчивающейся крышкой и восстановите образец с помощью 4-7 мкл гексана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это 7 мкл, но оно уменьшается, когда в образце определяется низкая концентрация во время очистки. Образцы печени могут быть гораздо более концентрированными, поэтому восстанавливаются в большем объеме. Стремитесь к концентрации от 75 нг/мкл до 400 нг/мкл.
  18. Введите 1-5 мкл в GC-C-IRMS для получения адекватного сигнала, исходя из концентрации образца, необходимой для введения примерно 75 нг ретинола.

3. Анализ образца с помощью GC-C-IRMS

  1. Приготовьте ГХ с колонной (100% диметилполисилоксан, неполярный, 15 м, внутренний диаметр 0,25 мм, пленка 0,25 мкм) и расходом гелия 1,2 мл/мин.
  2. Выполните проверку системы, чтобы убедиться в отсутствии утечек и правильной фокусировке источника IRMS на массах 44, 45 и 46.
    Вводите 2 мкл стандартного ретинола с концентрацией 75 нг/мкл 13C-обогащенного каждый день в качестве первой инъекции, чтобы определить время удержания и проверить производительность системы.
  3. В программном обеспечении для сбора данных загрузите метод прибора, введите имя образца и нажмите кнопку «Запустить образец». Система GC-C-IRMS выполнит процедуру предварительной настройки системы. Как только на передней панели газовой хроматографии загорится зеленый индикатор «Готово к впрыску », введите заданный объем образца в инжектор PTV с программируемой температурой, извлеките шприц и нажмите кнопку «Пуск ».
  4. Управляйте форсункой PTV в режиме PTV Splitless, при этом защитная колонна расположена в верхней части вставки форсунки для имитации впрыска в колонку. Установите программу форсунки так, чтобы она начиналась с начальной температуры 50 °C, держалась в течение 1,05 мин, увеличивалась до 200 °C со скоростью 14,5 °C/с, держалась при 200 °C в течение 1 мин, переходила к 300 °C при 14,5 °C/с, затем удерживала для продувки инжектора в течение 4 мин с разделенным потоком гелия 50 мл/мин, прежде чем вернуться к 50 °C для следующего впрыска.
  5. Запрограммируйте температуру духовки GC на начальную температуру 50 °C, подержите в течение 1 минуты, увеличьте температуру от 30 °C/мин до 150 °C, затем от 15 °C/мин до 265 °C, затем до 295 °C при 40 °C/мин, затем подержите 2,50 минуты до охлаждения до 50 °C для следующего впрыска.
  6. Убедитесь, что каждая хроматограмма начинается с трех импульсов CO2 (чистота 99,999%), откалиброванных по сахарозе (IAEA-CH-6). Доступ к нему осуществляется в программном обеспечении для сбора данных.
  7. После каждой инъекции проверяйте каждую хроматограмму, чтобы убедиться в наличии пика ретинола и в том, что интеграция является правильной. Используйте программное обеспечение для автоматической интеграции пиков ретинола в максимально возможной степени, чтобы свести к минимуму потенциальное смещение от ручной интеграции. Используйте стандартные настройки определения начального и конечного уклона 20 мВ/с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пиковая амплитуда 200 мВ или ниже слишком мала для точного измерения отношения 13C.
  8. Экспорт данных хроматограммы в программу для работы с электронными таблицами. Включите следующие основные категории данных: имя образца, пиковое время удержания, пиковая амплитуда при массе 45 и AT%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспортируемые данные могут быть указаны с помощью определенного метода экспорта. Значение δ полезно для простоты интерпретации, но не обязательно для расчетов.

4. Расчет общих запасов витамина А в организме и концентраций в печени

  1. Уравнения разбавления изотопов ретинола.
    Примечание: Предпочтительное уравнение изотопного баланса и соответствующие обозначения, используемые некоторыми исследователями, основаны на рекомендациях Международного союза теоретической и прикладной химии16. Отметим, что некоторые исследовательские группы используют нотацию, которая пытается сохранить историческое использование факторов, используемых в уравнениях RID. Мы также отмечаем, что факторы и вспомогательная литература могут различаться в зависимости от того, применимы ли они непосредственно к расчетам концентраций ТБС или ЖК печени, в зависимости от дизайна исследования, экспериментальной модели и аналитических результатов.
    1. Определение TTR ретинола в сыворотке крови с использованием изотопного содержания 13°CCO2 после сгорания в соответствии со следующим уравнением:
       figure-protocol-1    
      Где F — изотопная распространенность (также известная как доля изотопного количества, сокращенно «x») дозы индикатора (Fa), ретинола сыворотки на исходном уровне (Fb) и ретинола сыворотки после дозирования и смешивания с пулом организма (Fc). Используемые периоды смешивания обычно составляют около 14-21 дня для людей, но могут быть короче или дольше в зависимости от конкретного дизайна исследования.
    2. Используйте уравнения RID для расчета VA TBS в соответствии со следующим базовым уравнением.
      figure-protocol-2
      Где
      figure-protocol-3
      Факторы, используемые для абсорбции и хранения, включают: 1) накопление дозы в момент уравновешивания (поглощение дозы), обычно оцениваемое в пределах от 75% до 90% для здоровых людей. Оценка может быть снижена при наличии воспаления. ii) Удержание дозы; Константа: e-kt; k = ln(2)/период полувыведения ретинола; от 32 до 136 дней для детей; 140 дней для взрослых); t = дней с момента приема (обычно 14-21 день); Секционирование сыворотки/печени: TTRserum / TTRliver; 0,65-0,9 при поступлении ВА в период смешивания; 0,9-0,1 при использовании низкой дозы индикатора, контролируемом приеме ВА и отборе проб натощак.
      figure-protocol-4
    3. Рассчитайте концентрации ВА в печени с дополнительными допущениями для массы печени и доли ВА TBS в печени.
      figure-protocol-5
      Где
      figure-protocol-6
      Отношение печени к массе тела обычно оценивается как возрастная константа: младенцы: 4-4,2%; дети: 3%; взрослые: 2,4%; Фракция ТБС в печени варьируется в зависимости от уровня витамина А. Ранее использовавшиеся оценки представляют собой маргинальный или низкий статус VA: 0,5; адекватный статус ВА: 0,8-0,9.

Результаты

Пример хроматограммы образца сыворотки, контролируемой с длиной волны 325 нм, приведен в разделе 2 протокола (рис. 1). В зависимости от конкретной системы и используемой колонки, типичное время удержания ретинола составляет 4-6 мин и 6-8 мин для внутреннего стандарта. Зеленой заштрихованной областью показан целевой диапазон сбора для фракции ретинола для минимизации примесей. Эффективность экстракции ретинола из сыворотки обычно составляет ≥ 85%, в то время как омыленное грудное молоко и образцы тканей, как правило, имеют более низкую эффективность, в среднем ~70-80%. Незначительные количества цис-изомеров ретинола могут наблюдаться незадолго до или после основного пика полностью транс во время очистки ВЭЖХ. В образце, представленном на рисунке 1 , не наблюдалось заметного цис-изомера, но его можно увидеть на дополнительном рисунке 1 в ссылке17. Часто дополнительный изомер отделяется во время второй очистки ВЭЖХ (не показано) или во время разделения ГХ (Рисунок 2).

Примеры хроматограмм GC-C-IRMS для стандартного, сывороточного образца и бланка приведены в разделе протокола 3 (рис. 2)9. Каждый образец включает эталонные пикиCO2 с обогащением 13C, откалиброванные по стандарту сахарозы МАГАТЭ (IAEA-CH-6).

Экспериментальная точность IRMS (CV%) для изотопного содержания 13C/общего C для: 1) эталонного CO2 составила 0,012 для стабильности и 0,031 для линейности (n = 10 каждый); 2) стандарт ретинола составил 0,036 для междневной стабильности и 0,022 для внутридневной линейности (n = 4 каждая); и 3) экспериментальная составила 0,073 ± 0,061 в исходных и восьми группах диетического лечения у песчанок (n = 46 в 9 группах)9.

Ниже приведен пример того, как полученные данные GC-C-IRMS в сыворотке крови используются для расчета концентраций TBS и ЖК в печени, определенных через 14 дней после введения дозы с использованием уравнения RID для метода 4:

Характеристика участников исследования:

Возраст:4 года
Масса тела:16,0 кг
Fa (2 атома углерода с маркировкой плюс естественное распространение):0.11
Фб:0.010757
ФК:0.011057
Применяемая доза индикатора:1,0 μмоль
Время с момента приема:14 дней
Период полураспада VA:32 дня
Поглощение:0.8
Соотношение TTR в сыворотке/печени (диета не контролируется):0.9
Фракция TBS в печени:0.8

Вычисление:

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0,0110568 - 0,010757) / (0,11 - 0,0110568) = 0,0030300213
1/TTR = 1 / 0,0030300213 = 330,03

Удержание дозы = e-kt с периодом полувыведения 32 дня и временем отбора проб 14 дней
k = ln(2)/36 = 0,693147181 / 36 = 0,021660849
т = 14
e-kt = e-0,02166 x 14 = 0,738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330,03 x 0,8 x 0,738413073 × 0,9 = 175 μмоль

Для расчета концентраций ЖК печени:
Масса печени (г) = 1 000 × масса тела (кг) × 3% (оценка для детей)
Масса печени = 1 000 x 16,0 x 0,03 = 480 г
figure-results-2
Концентрация VA в печени = (175 / 480) x 0,8 = 0,29 мкмоль/г

figure-results-3
Рисунок 1: Хроматограмма ВЭЖХ образца сыворотки крови человека. Система ВЭЖХ 1 с изократической подвижной фазой 90:10 MeOH:H2O и детектированием на длине волны 325 нм. Пик ретинола собирается для значений поглощения более ~0,1 (зеленая затененная область). Внутренний стандарт C-23 β-апо каротинол используется для количественного определения концентрации ретинола в сыворотке крови (при желании) на этом этапе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 2: Хроматограммы GC-C-IRMS, демонстрирующие определение ретинола 13 C/12 C. Хроматограмма GC-C-IRMS для (А) стандартного ретинола, (В) ретинола, очищенного из сыворотки, и (С) холостого инъекционного метода, адаптированного из Gannon et al.9. Три следа предназначены для массы 44 (соответствует 12C16O2), 45 (соответствует 13C16O2 или 12C16O17O) и 46 (соответствует в первую очередь 12C16O18O, которая используется для коррекции массы 45 на вклад 17O). Три широких пика до 200 с являются эталонными пикамиCO2 , откалиброванными по эталонному материалу сахарозы 13C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Описанные методы измерения обогащения ретинола 13С с помощью GC-C-IRMS могут предоставить ценные данные для оценки диетических вмешательств, моделирования кинетики витамина А, клинических исследований или популяционных исследований с использованием РИД для улучшения оценки статуса ВА22.

В этом испытании ретинол, очищенный из биологического образца, пропускают через колонку GC гелием исследовательского качества (чистота >99,99999%) с температурным градиентом, отделяя его от оставшихся примесей в образце. Ретинол сжигается с образованием CO2 и воды, после чего вода удаляется. CO2 переносится в IRMS, где измеряются массы 44, 45 и 46, а δ и AT% определяются относительно эталонного газа CO2 , который дополнительно калибруется по стандарту сахарозы (IAEA-CH-6).

При подготовке ретинола для инъекций экстрагированный ретинол должен иметь максимальную чистоту, чтобы достичь воспроизводимых изотопных соотношений и максимально продлить срок службы аналитической платформы между тщательными очистками. Растворители, используемые для экстракции, должны иметь наивысшую доступную степень чистоты, которая обычно является классом MS. Вся стеклянная посуда, такая как пробирки для экстракции, пипетки Пастера и флаконы для инъекций ВЭЖХ, должна быть новой, поскольку ее трудно должным образом очистить для анализа РС. Важно использовать стеклянные трубки и пипетки, а не пластик, чтобы свести к минимуму пластификаторы в экстрактах, которые накапливаются на ГХ и колоннах сгорания.

В этот рабочий процесс анализа образцов могут быть внесены изменения в зависимости от конкретного плана исследования и источника выборки. Например, одна система ВЭЖХ, вероятно, может быть оптимизирована для очистки ретинола. По нашему опыту, для этого потребовалась бы вода в подвижной фазе и либо градиент подвижной фазы, либо увеличенное время сушки образца перед впрыском в GC-C-IRMS. Мы обнаружили, что использование двух систем ВЭЖХ с короткими изократическими методами уравновешивает аналитические требования при одновременном получении четких сигналов на GC-C-IRMS (рис. 2). Использование ЖХ-МС/МС может обеспечить более рациональный аналитический рабочий процесс для проб МПОГ7. Тем не менее, чувствительность GC-C-IRMS имеет явные преимущества, заключающиеся в возможности использования более низких доз и изотопных мечений, количественном определении индикаторов в более длительные моменты времени и анализе образцов с низким обогащением образцами.

К ограничениям этого метода относятся необходимость использования нескольких приборов, квалифицированной технической обработки и ограничения по пропускной способности из-за более длительного времени подготовки образцов. Время, необходимое для подготовки каждого образца, может быть уменьшено за счет внедрения ВЭЖХ с возможностью автоматического сбора фракций, поскольку на этапах очистки ВЭЖХ используются изократические методы, что приводит к постоянному времени удержания аналита. Метод может быть оптимизирован для использования только одной очистки ВЭЖХ. Мы используем две параллельные системы для повышения производительности и облегчения сушки образца перед восстановлением в гексане и впрыском в GC-C-IRMS.

В то время как GC-C-IRMS чрезвычайно чувствителен для определения изотопных отношений, для адекватного сигнала ретинола требуется большая общая масса образца ретинола. Требования к образцам зависят как от количества образца, так и от концентрации образца VA. Как правило, 75 нг ретинола нацелены на сильный пик, что позволяет варьировать перенос ГХ и эффективность сгорания. На практике, при оптимальных условиях эксплуатации, мы получали адекватный сигнал с образцами, в результате чего инъекции GC-C-IRMS достигали 25 нг. Это соответствует образцу сыворотки с меньшим объемом (~0,4 мл), низкой концентрацией ретинола (~0,5 мкмоль/л) и незначительными потерями в процедурах экстракции и очистки. При аналитической разработке метода RID основным усовершенствованием стал переход на инжектор PTV. Низкая начальная температура предотвращает слишком быстрое расширение гексана, несущего образец, что позволяет моделировать впрыскивание образцов в колонку. Введение непосредственно в колонку максимизирует сигнал ретинола с недостатком в виде несколько худшей формы пика и более постоянного обслуживания.

Грудное молоко было предложено в качестве заменителя образцов сыворотки в тесте RID. Это было подтверждено на кормящих женщинах в Замбии, у которых в основном наблюдался низкий уровень ВА11. Его еще предстоит подтвердить у женщин с более высоким потреблением предварительно сформированной ДЖ, как в странах с высоким уровнем дохода или у населения, потребляющего несколько источников ДЖ, включая диетическое питание, обогащение продуктов питания и добавки.

Оценка ВА грудного молока имеет ряд преимуществ перед другими биохимическими показателями статуса ВА. Сбор грудного молока часто проще, чем крови, потому что флеботомисты не нужны, а сбор грудного молока обычно считается менее инвазивнымдля испытуемых. Использование обычных образцов грудного молока удобно и требует всего 5 мл молока. Кроме того, образцы не нужно обрабатывать немедленно, что сокращает время обработки образцов, особенно в полевых условиях. Тем не менее, нормализация сбора проб для образцов полного грудного молока имеет решающее значение, поскольку концентрации жира и ретинола в заднем молоке выше, чем в предмолоке, а концентрации молочного жира и ретинола, как правило, варьируются в зависимости от времени суток и интервала с момента последнего кормления 1,24. Для случайных образцов концентрация ретинола лучше всего выражается на г молочного жира. Молочный жир нужно определить в идеале сразу после сбора с помощью метода крематокрита25. Образцы должны быть защищены от света. Аликвоты (обычно от 1 до 5 мл) для анализа ВЭЖХ должны быть подготовлены во время сбора, поскольку молоко не является однородным после замораживания и размораживания.

Существует два основных обстоятельства, при которых измерение 13-С-обогащения ВА в печени может быть возможным и представлять интерес. Наиболее распространенной ситуацией является использование ретинола, меченного 13С, в исследованиях на животных при заборе печени. Рассчитанные ТБС ВА будут сравниваться с концентрацией ВА в печени, определенной с помощью ВЭЖХ/УПЛХ, но обогащение 13С запасов печени также полезно для определения того, как индикатор распределяется в циркуляции относительно долгосрочных запасов. Кроме того, в некоторых уникальных обстоятельствах можно получить образцы биопсии печени от людей, которые дали согласие, а также приняли меченую дозу витамина А 26,27. Эти образцы также полезны для валидации и тестирования смешивания 13С-ретинола. Обработка образца печени начинается с измельчения измеренного образца с безводным сульфатом натрия для улавливания воды и разрушения тканей. Затем его экстрагируют с помощью 50 мл метиленхлорида через фильтровальную бумагу. Фракцию сушат под азотом и восстанавливают в этаноле с добавлением 0,1% бутилированного гидрокситолуола в качестве консерванта. Образец омыляется и извлекается по той же процедуре, что и для грудного молока.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа финансировалась NIH-R01 DC019357 и Проектом координированных исследований МАГАТЭ E43035.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Эталонный материал 13C, прослеживаемый по шкале VPDB-LSVEC (сахароза)Международное агентство по атомной энергииIAEA-CH-6 Название Национального института стандартов и технологий: RM 8542
Ацетонитрил (класс ВЭЖХ)Fischer ScientificUN1648
Этанол (чистый 200 proof, безводный, и ge; 99.5%)Сигма459836
Стеклянные пипетки ПастераЛюбой
Стеклянные пробиркиЛюбой
Гелий (исследовательская благодат, (>99,9995% чистота)Любой
ГексаныСигма178918
Метанол (степень магистратуры)VWRMSPP-A-456
Ступка с пестелем, керамикаЛюбой
Пипетка с положительным смещением 3-25 и микро; LГилсонFD10002
Пипетка с положительным смещением 10-100 и микро; LГилсонFD10004
Пипетка с положительным смещением 50-250 & micro; LГилсонFD10005
Пипетка с положительным смещением 100-1000 и микро; LГилсонFD10006
Едкое калиFisher ScientificUN1813
Качественная фильтрующая бумага #1 150 ммВатман1001-150
Сепаративные воронкиЛюбой
Сульфат натрия, безводныйFischer ScientificS415-212
Объёмные колбы (50 мл)Любой

Ссылки

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND)-vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Gannon, B. M., et al. Selected laboratory-based biomarkers for assessing vitamin A deficiency in at-risk individuals. Cochrane Database Syst Rev. 5 (5), CD013742(2025).
  3. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  4. Lietz, G., et al. Current capabilities and limitations of stable isotope techniques and applied mathematical equations in determining whole-body vitamin A status. Food Nutr Bull. 37 (2 Suppl), S87-S103 (2016).
  5. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among equations used for retinol isotope dilution in the assessment of total body stores and total liver reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  6. Bausch, J., Rietz, P. Method for the assessment of vitamin A liver stores. Acta Vitaminol Enzymol. 31 (1-5), 99-112 (1977).
  7. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of β-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Green, M. H., Green, J. B. Use of the paired retinol isotope dilution test, but with a single isotope dose, to assess the impact of a vitamin A intervention on vitamin A stores in theoretical children with low stores. J Nutr. 154 (10), 3151-3156 (2024).
  11. Kaliwile, C., et al. Breast milk-derived retinol is a potential surrogate for serum in the 13C-retinol isotope dilution test in Zambian lactating women with vitamin A deficient and adequate status. J Nutr. 151 (1), 255-263 (2021).
  12. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med (Maywood). 234 (2), 140-147 (2009).
  13. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med (Maywood). 242 (15), 1508-1514 (2017).
  14. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in six diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  15. Tanumihardjo, S. A., Howe, J. A. Twice the amount of α-carotene isolated from carrots is as effective as β-carotene in maintaining the vitamin A status of Mongolian gerbils. J Nutr. 135 (11), 2622-2626 (2005).
  16. Coplen, T. B. Guidelines and recommended terms for expression of stable-isotope-ratio and gas-ratio measurement results. Rapid Commun Mass Spectrom. 25 (17), 2538-2560 (2011).
  17. Tanumihardjo, S. A., et al. Synthesis of 13C2-retinyl acetate and dose preparation for retinol isotope dilution tests. J Vis Exp. (222), e68535(2025).
  18. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  19. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  20. Lopez-Teros, V., et al. The "super-child" approach is applied to estimate retinol kinetics and vitamin A total body stores in Mexican preschoolers. J Nutr. 150 (6), 1644-1651 (2020).
  21. Green, M. H., et al. Use of population-based compartmental modeling and retinol isotope dilution to study vitamin A kinetics and total body stores among Ghanaian women of reproductive age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  22. Engle-Stone, R., et al. Filipino children with high usual vitamin A intakes and exposure to multiple sources of vitamin A have elevated total body stores of vitamin A but do not show clear evidence of vitamin A toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  23. Stoltzfus, R. J., Underwood, B. A. Breast-milk vitamin A as an indicator of the vitamin A status of women and infants. Bull World Health Organ. 73 (5), 703-711 (1995).
  24. Ruel, M. T., Dewey, K. G., Martinez, C., Flores, R., Brown, K. H. Validation of single daytime samples of human milk to estimate the 24-hour concentration of lipids in urban Guatemalan mothers. Am J Clin Nutr. 65 (2), 439-444 (1997).
  25. Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
  26. Furr, H. C., Clifford, A. J., Bergen, H. R. 3rd, Jones, A. D., Anderson, D. P., Olson, J. A. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  27. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).

Перепечатки и разрешения

Теги

A13C A

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.