Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

На месте Обнаружение метаболически активных клеток в тканях гепатоцеллюлярной карциномы с помощью криосекционной визуализации на основе МТТ

325 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68575

⸱

31 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, First Hospital of Quanzhou Affiliated to Fujian Medical University, 2Medical School, Huaqiao University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем простой протокол для обнаружения метаболически активных клеток в тканях гепатоцеллюлярной карциномы с помощью криосекционной визуализации на основе МТТ. Этот метод также может быть использован для обнаружения активных клеток in situ в других тканях или органах.

Аннотация

Новые данные, в том числе предыдущие исследования, указывают на субпопуляцию клеток в тканях гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), которые демонстрируют превосходную метаболическую активность и стрессоустойчивость. Эти клетки являются ключевыми факторами прогрессирования опухоли и резистентности к терапии. Тем не менее, существующие методы обнаружения жизнеспособных клеток in situ часто нарушают целостность тканей, изменяют клеточную жизнеспособность или являются технически сложными. В этом исследовании представлен новый, простой, неразрушающий подход к обнаружению in situ метаболически активных клеток в тканях ГЦК путем митохондриально-зависимого восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) до нерастворимых кристаллов формазана. За счет оптимизации размера фрагмента ткани (1 × 1 × 0,2 см3), условий культивирования (20% FBS, 1 мг/мл МТТ и 3-часовая инкубация с прерывистым закручиванием) и параметров криосекции (толщина 20 мкм, фиксация PFA 4% и компенсирование DAPI) в течение 5 ч было достигнуто пространственное картирование жизнеспособных клеток ГЦК. Этот экономичный протокол не требует специализированного оборудования и поддерживает тканевую архитектуру, обеспечивая пространственную идентификацию высокожизнеспособных и стрессоустойчивых клеточных кластеров в поверхностных областях. Ограничения включают прогрессирующую потерю жизнеспособности более чем на 6 ч и смещение кристаллов во время секционирования, которые могут быть смягчены с помощью добавок FBS и контролируемой заморозки. Этот метод обеспечивает практическую платформу для выделения одиночных клеток устойчивых к терапии субпопуляций, продвигая исследования микроокружения ГЦК.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), третья по значимости причина смертности от рака во всем мире, характеризуется высокой гетерогенностью и частотой рецидивов1. Эта пространственная и временная гетерогенность делает определенные клеточные популяции в опухолевых тканях более активными, чем другие, в метаболизме, пролиферации, прогрессировании, стрессоустойчивости и лекарственной устойчивости. Обнаружение in situ жизнеспособных клеток в тканях ГЦК имеет глубокое клиническое и биологическое значение, поскольку эти клетки включают в себя пролиферирующие субклоны, резистентные к терапии популяции и клетки, инициирующие метастазирование. Такие жизнеспособные клетки могут служить критическими факторами рецидива опухоли, уклонения от иммунитета и терапевтической неудачи2.

Тем не менее, современные технологии пространственного профилирования (например, пространственная транскриптомика) требуют специализированного оборудования и связаны с высокими затратами, в то время как традиционный объемный анализ часто упускает из виду пространственную гетерогенность жизнеспособных клеток и их динамическое взаимодействие со стромальнымикомпонентами. Например, остаточные жизнеспособные клетки ГЦК после резекции демонстрируют отчетливые метаболические профили, которые не могут быть точно воспроизведены в диссоциированных клеточных системах4. Таким образом, развитие технологий обнаружения с пространственным разрешением является обязательным условием для разгадки функциональных перекрестных помех между жизнеспособными опухолевыми клетками и их микроокружением, что в конечном итоге дает информацию для прецизионных терапевтических стратегий. Несмотря на то, что наши группы использовали традиционные методы, такие как проточная цитометрия или иммуногистохимия (ИГХ), для обнаружения жизнеспособных клеток при ГЦК, они требуют диссоциации или фиксации тканей, тем самым теряя пространственный контекст и затрудняя анализ межклеточных взаимодействий 5,6. Таким образом, разработка неразрушающих технологий с высоким разрешением для обнаружения жизнеспособных клеток in situ имеет решающее значение для выяснения механизмов резистентности к ГЦК и руководства прецизионной терапией.

Для быстрого обнаружения и отображения жизнеспособных клеток в тканях ГЦК in situ без деструктивного лечения был разработан простой метод культивирования тканей на основе 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ). Вкратце, свежие тонкие ткани ГЦК (приблизительно 1 × 1 × 0,2 см3) сначала культивировали в среде DMEM в течение 3 ч, содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и MTT (1 мг/мл). Затем, после фиксации 4% параформальдегида (PFA) и DAPI-содержащего монтажа, замороженные предметные стекла тканей с ОКТ (толщиной 20 мкм) подвергали микроскопическому наблюдению под ярким или ультрафиолетовым светом. Жизнеспособные клетки будут иметь фиолетовую, пурпурно-красную или пурпурно-черную окраску. Используя этот протокол, мы успешно обнаружили жизнеспособные клетки в тканях ГЦК в течение 5 ч. Между тем, этот метод сохраняет 3D-микроархитектуру, совместим с последующим мультиомическим анализом, прост, а также экономит время и деньги. Однако этот метод имеет определенные ограничения. Многоступенчатые процессы промывки, секционирования и культивирования могут вызывать структурную деформацию и апоптоз в тканях, особенно в образцах с высоким содержанием метаболических веществ, таких как ткань ГЦК в данном исследовании. Кроме того, увеличенная толщина срезов криосекции ухудшает четкость и плоскостность микроскопических наблюдений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрены Комитетом по этике Первой аффилированной больницы Цюаньчжоу (No 100). FJMU IACUC2021257). Ткани ГЦК были удалены хирургическим путем и собраны в Первой больнице Цюаньчжоу, входящей в состав Фуцзяньского медицинского университета, с информированного согласия пациентов. Этот эксперимент требует стандартных мер защиты, включая ношение лабораторного халата, одноразовой маски и перчаток.

1. Подготовка тканей

  1. Поставьте на лед стерильную чашку Петри длиной 9 см. Добавьте 30 мл ледяного фосфатного буферного раствора (PBS).
  2. Немедленно перенесите хирургически резецированную ткань человека с ГЦК в PBS.
  3. Аккуратно поворачивайте посуду в течение 5 секунд, чтобы удалить загрязнения крови. Асасируйте PBS с помощью стерильной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите три раза.
  4. Переложите салфетку на крышку чашки Петри.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Салфетки легко прилипают к несмоченной крышке чашки Петри для лучшего последующего использования.
  5. Обрежьте ткань примерно на 1 × 1 × 0,2 см3 фрагмента с помощью стерильного хирургического лезвия (No 11).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длина и ширина фрагментов могут быть изменены, но глубина должна быть меньше 0,2 см.
  6. Верните фрагменты в свежую чашку диаметром 9 см, наполненную 30 мл ледяного PBS.
  7. Аккуратно поворачивайте посуду в течение 5 секунд, чтобы удалить загрязнения крови. Асасируйте PBS с помощью стерильной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаг 1.7 три раза. Один фрагмент ткани, сваренный в PBS (95 °C, 10 мин), устанавливали в качестве отрицательного контроля. Выполняйте все действия в стерильных условиях.

2. Культура тканей

  1. Добавьте 1,8 мл полной питательной среды DMEM (предварительно подогретой до 37 °С), содержащей глюкозу (конечная концентрация = 4,5 г/л) и L-глютамин (конечная концентрация = 2 мМ), в каждую лунку 6-луночного планшета. Затем добавьте 0,6 мл FBS (конечная концентрация = 20% v/v) и 0,6 мл запаса MTT (конечная концентрация = 1 мг/мл) в каждую лунку 6-луночного планшета.
  2. Перенесите фрагменты ткани в лунки с помощью стерильных щипцов.
  3. Поместите планшет на 6 лунок в инкубатор. Инкубировать в течение 3 ч при 37 °C с 5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно поворачивайте тарелку в течение 3 секунд каждые 30 минут. Инкубация может быть прекращена, как только поверхность фрагментов ткани станет фиолетовой или пурпурно-черной.

3. Терминация и фиксация

  1. Аспирируйте среду МТТ. Промойте фрагменты тканей ледяным физиологическим раствором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите пять раз.
  2. Добавьте 2 мл 4% нейтрально буферизованного формалина (NBF) в каждую лунку 6-луночного планшета.
  3. Поставьте тарелку в холодильник при температуре 4 °C на 1 час.

4. Криосекция

  1. Аккуратно промокните осколки на чистой впитывающей бумаге.
  2. Поместите ткань в криомолд, наполненный ОКТ-соединением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань полностью покрыта составом ОКТ.
  3. Заморозьте салфетку в низкотемпературном холодильнике при температуре -80 °C в течение 20 минут.
  4. Установите замороженный блок на патрон криостата при температуре -20 °C.
  5. Разрежьте срезы 100 мкм при температуре -20 °C до тех пор, пока поверхность ткани не обнажится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность ткани имеет фиолетовую окраску.
  6. Соберите срезы размером 20 мкм с помощью предметных стекол с клейким покрытием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы ткани должны иметь оттенок фиолетового, пурпурно-красного или пурпурно-черного.
  7. Зафиксируйте ломтики в 4% параформальдегиде (PFA) при комнатной температуре на 2 минуты.
  8. Аккуратно промойте горки PBS в течение 1 минуты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите три раза.

5. Монтаж

  1. Нанесите 1 каплю DAPI-содержащей (конечная концентрация: 1 мкг/мл) монтажной среды.
  2. Накройте крышкой.
  3. Заклейте края лаком для ногтей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предметные стекла с запечатанными краями можно хранить при температуре 4 °C в темноте, если микроскопия не будет выполнена немедленно.

6. Микроскопия

  1. Визуализируйте фиолетовые, пурпурно-красные или пурпурно-темные отложения формазана (жизнеспособные клетки) при увеличении 20× в светлом поле с помощью светлопольной микроскопии.
  2. Обнаружение синих DAPI (ядер) под ультрафиолетовым излучением с помощью флуоресцентной микроскопии.
  3. Объедините светлопольные и флуоресцентные каналы для пространственной корреляции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется программное обеспечение NIS Element F (версия 4.00.06).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании были успешно обнаружены метаболически активные клетки в ткани ГЦК без нарушения архитектуры ткани. Во-первых, светлопольные изображения (рис. 1A) показали, что поверхность ткани демонстрирует плотное клеточное покрытие и многослойное укладывание клеток по стеклу, что подтверждает сохранение архитектурной целостности ткани ГЦК на протяжении всей культивирования и обработки. Примечательно, что кластеры клеток в поверхностных областях демонстрировали отчетливые пурпурно-крас...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Современные методологии обнаружения жизнеспособных клеток in situ по-прежнему сталкиваются с многогранными ограничениями. ИГХ и иммунофлюоресценция (ИФ), которые широко используются для идентификации маркеров пролиферации или белков, связанных с апоптозом, страдают от нарушения целостности мембраны, вызванного фиксацией формальдегида7. Кроме того, проникновение антител в толстые срезы тканей является неоптимальным8. Флуоресцентные ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Это исследование финансировалось Научно-техническим бюро города Сямынь (No 3502Z20227197), Фондом стартапов для научных исследований Фуцзяньского медицинского университета (2021QH1240). Мы благодарим Сяньин Чжана, Цзинцзин Чжоу и Шаоцуна Вэна (Университет Хуацяо) за их техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
-80 и градус; Морозильник C (вертикальный)Термо Фишер СайентификTSX60086V
Чистая стенда (вертикальный ламинарный поток)AIRTECHSW-CJ-1FD
CO2 инкубатор (165 л)Термо Фишер СайентификHeracell VIOS 160i (например, 51030400 / 51033559)
Coverslip (24 и более раз; 50 мм, #1.5)ЦИТОГЛАС (Ситотест)0341-3610
Культурная чашка Петри (90 мм)ГНЕЗДО752001 (пример)
Монтажная среда с DAPIBeyotimeP0131 (5 мл/25 мл)
DMEM (высокий уровень глюкозы, с пируватом)Invitrogen (Gibco)11995-065
FBS (Квалифицированный, американское происхождение)Invitrogen (Gibco)A3160501
Флуоресцентный микроскопNikonСерия ECLIPSE Ti2
Замораживание микротома (криостат)LeicaCM1950
Микроскопические стекли (обычные, 25 раз; 75 мм)ЦИТОГЛАС (Ситотест)0317-0001
Реагент MTT (порошок)BeyotimeST316
Лак для ногтей (прозрачный)Beyotime—
NBF (нейтральный буферизованный формалин)Beyotime—
Соединение ОКТСАКУРА (Сакура Финетек)4583
Оптический микроскоп (вертикальный)NikonСерия ECLIPSE Ci (например, Ci-L)
PBS (500 мл)BeyotimeC0221A
PFA, 4% в PBS (фиксативное)BeyotimeP0099
Кончик пипетки (1 мл, низкое крепление)КИРГЕНKG1313-L
Кончик пипетки (200 и микро; L)Аксиген (Corning)T-200-Y (опт) / T-200-Y-R-S (с креплениями, стерильные)
Пипеттор (одноканальный)Термо Фишер СайентификFinnpipette F2 (котка, специфичная для диапазона#)
СкальпельHYSTICМодель варьируется (например, ссылка поставщика 100022208326)
Выщипывать пинцетомHYSTICМодель варьируется

Ссылки

  1. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  2. Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  3. Calderaro, J., Couchy, G., Imbeaud, S. Histological subtypes of hepatocellular carcinoma are related to gene mutations and molecular tumour classification. J Hepatol. 67 (4), 727-738 (2017).
  4. Finn, R. S., Qin, S., Ikeda, M. Atezolizumab plus Bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 384 (20), 1894-1905 (2020).
  5. Lin, C. C., Zhou, J. P., Liu, Y. P. The silencing of Pokemon attenuates the proliferation of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo by inhibiting the PI3K/Akt pathway. PLoS One. 7 (12), e51916(2012).
  6. He, J. The lactate receptor HCAR1 drives the recruitment of immunosuppressive PMN-MDSCs in colorectal cancer. Nat Immunol. 26 (3), 391-403 (2025).
  7. Zhou, H. G., Guo, M. Y., Li, J. Y. Hypoxia-triggered self-assembly of ultrasmall iron oxide nanoparticles to amplify the imaging signal of a tumor. J Am Chem Soc. 143 (4), 1846-1853 (2021).
  8. Baker, A. M., Huang, W. N., Wang, X. M. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nat Commun. 8 (1), 1998(2017).
  9. Morrison, J. K. Single-cell transcriptomics reveals conserved cell identities and fibrogenic phenotypes in zebrafish and human liver. Hepatol Commun. 6 (7), 1711-1724 (2022).
  10. Qi, L., Liang, J. Y., Li, Z. W. Deep learning-derived spatial organization features on histology images predicts prognosis in colorectal liver metastasis patients after hepatectomy. iScience. 26 (10), 107702(2023).
  11. Aizarani, N., Saviano, A. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  12. Tasdogan, A., Faubert, B., Ramesh, V. Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential. Nature. 577 (7788), 115-120 (2020).
  13. Guo, D. Z. Single-cell tumor heterogeneity landscape of hepatocellular carcinoma: Unraveling the pro-metastatic subtype and its interaction loop with fibroblasts. Mol Cancer. 23 (1), 157(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MTT
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.