Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сверхэкспрессия и очистка токсичной нуклеазы из кишечной палочки

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68577

⸱

29 августа 2025 г.

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, College of Charleston

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье описана методика сверхэкспрессии рекомбинантного Nsp15, токсичной нуклеазы, в системе экспрессии C41(DE3) с последующей очисткой меченого белка с помощью аффинной и эксклюзионной хроматографии. Эти протоколы могут быть адаптированы для других сложных токсичных белков.

Аннотация

Escherichia coli широко используется в качестве системы экспрессии для производства рекомбинантных белков. Тем не менее, некоторые типы рекомбинантных белков, такие как нуклеазы, могут быть затруднены для сверхэкспрессии рекомбинантно в E. coli из-за их ферментативной активности на клеточной ДНК или РНК. Такое токсическое воздействие может привести к замедлению роста и плохому выходу белка. Одним из таких примеров является эндорибонуклеаза Nsp15 из коронавирусов: выходы гамма-коронавируса дикого типа (WT) Nsp15 значительно ниже, чем каталитически неактивного Nsp15. Чтобы решить эту проблему, мы использовали клетки C41 (DE3) и закваску одной колонии в тот же день, чтобы помочь снизить токсичность. Рекомбинантный Nsp15, содержащий N-концевую 6xHis-метку, сверхэкспрессировали и очищали с помощью аффинной хроматографии на основе кобальта с последующей эксклюзионной хроматографией (SEC). Полученные в результате выходы очищенного белка достаточны для биохимических анализов и структурных исследований методом криоэлектронной микроскопии. Этот подход доказал свою эффективность в смягчении токсических эффектов и достижении удовлетворительных выходов белка для дальнейшего исследовательского анализа.

Введение

Escherichia coli (E. coli) — бактерия, широко используемая для производства рекомбинантных белков. Многочисленные мутантные штаммы, включая BL21(DE3) и его производные, были разработаны для экспрессии белков-мишеней1. Этот процесс, как правило, управляется кодируемой бактериофагом Т7 РНК-полимеразой и индуцируется изопропил-�-D1-тиопалактопиранизидом (IPTG), аналогом лактозы, который активирует лак-оперон путем высвобождения лак-репрессора 1,2,3. Поскольку он не поддается гидролизу, обеспечивается непрерывная экспрессия мРНК и более высокая продукция белка3.

В то время как этот тип системы удобен и последователен для многих белков, некоторые типы рекомбинантных белков вызывают токсичность E. coli, что приводит к плохому выходу белка. Токсичность от присутствия рекомбинантного белка, негативно влияющая на бактерии, может быть вызвана утечкой экспрессии до индукции или стрессом для бактерий при индукции 3,4. Результатом является снижение скорости роста и жизнеспособности бактерий5. Подавление негерметичной экспрессии может играть важную роль в успешной экспрессии токсичных белков. Экспрессирующие штаммы E. coli с pLysS плазмидами (т.е. BL21(DE3)pLysS, C41(DE3)pLysS и т.д.) подавляют негерметичную экспрессию путем экспрессии лизоцима T7, который ингибирует Т7-полимеразу до индукции 6,7. Другие штаммы, такие как штаммы C41(DE3) и C43(DE3), содержат мутации, которые снижают активность Т7-полимеразы за счет снижения уровня ее мРНК и удаляют протеазы lon и ompT 1,4,8,9,10. Подавление утечки экспрессии или снижение скорости производства рекомбинантных белков (через регуляцию Т7-полимеразы или снижение температуры) способствует увеличению выхода токсичных белков 1,9.

Нуклеазы часто являются токсичными и трудно экспрессируемыми белками при использовании системы экспрессии E. coli из-за их ферментативной активности по отношению к клеточной ДНК или РНК1. Например, эндорибонуклеаза Nsp15, обнаруженная в коронавирусах и других нидовирусах, токсична для бактерий, что приводит к более медленному темпу роста и низкому выходу 11,12,13,14,15,16,17. Из-за своей каталитической роли, расщепляющей 3' уридинов в вирусной РНК, Nsp15, как полагают, действует как на свою собственную, так и на клеточную мРНК при рекомбинантной экспрессии, что приводит к нарушению регуляции метаболизма и экспрессии рекомбинантных белков11,14. Для Nsp15 олигомеризация необходима для ферментативной активности. Предыдущие исследования бета-коронавируса (такого как SARS и SARS-CoV-2) Nsp15 показали, что фермент в основном олигомеризуется в гомогексам в растворе, при этом мономерная форма неактивна 16,18,19,20. При мутации только в виде мономеров наблюдалось значительное увеличение выхода14. Кроме того, при мутации одного из каталитических остатков в каталитической триаде в аланин наблюдалась улучшенная экспрессия в тех же условиях, что и у WT, что еще раз подтверждает, что токсичность Nsp15 для E. coli обусловлена его нуклеазной активностью 13,16,17. В этом протоколе мы показываем разницу в выходе между гамма-коронавирусом WT (вирусом инфекционного бронхита) Nsp15 и каталитически мертвой версией, полученной путем мутации одного из каталитических остатков гистидина (H223A).

Здесь мы описываем пошаговую методологию сверхэкспрессии рекомбинантного Nsp15 в системе экспрессии C41(DE3) с последующей очисткой белка с помощью аффинной и эксклюзионной хроматографии. Для выделения белка используется N-концевая 6-кратная His-метка с иммобилизованной металлической хроматографией (IMAC) на основе кобальта. Дальнейшую очистку проводят с помощью SEC для разделения Nsp15 по олигомерному состоянию и выделения активных гексамерных веществ. Этот подход предлагает метод сверхэкспрессии и очистки токсичных нуклеаз для биохимических и структурных исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка к буферу и реагентам

  1. Реагенты сверхэкспрессии
    1. Приготовьте 1 л среды 2xTY, смешав 16 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта, 5 г хлорида натрия (NaCl) и 900 мл деионизированной воды в колбе объемом 2 л. Автоклавируйте колбу не менее 30 минут в жидком цикле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки требуется не менее 2 л среды 2xTY.
    2. Подготовьте соответствующий запас антибиотиков для плазмиды. Для Nsp15-pET-14b введите 15 мл 100 мг/мл ампициллина, растворив 1,5 г ампициллина с деионизированной водой в конической трубке объемом 15 мл. Храните запасы антибиотиков при температуре -20 °C до тех пор, пока они не понадобятся.
    3. Приготовьте 250 мл агаровой среды Lysogeny Broth (LB), смешав в стеклянной бутылке объемом 500 мл 2,5 г триптона, 1,25 г дрожжевого экстракта, 2,5 г NaCl, 3,75 г агарозы и 250 мл деионизированной воды. Стерилизуйте раствор путем автоклавирования в течение не менее 30 минут в жидкостном цикле и охладите до тех пор, пока он не станет теплым на ощупь.
    4. Приготовьте планшеты с агаром LB с добавлением ампициллина, переложив 25 мл теплой среды агара LB в стерилизованную колбу Эрленмейера объемом 250 мл (25 мл на каждую готовящуюся пластину). Добавьте 25 мкл 100 мг/мл ампициллина на каждые 25 мл среды и перемешайте, чтобы объединить содержимое. С помощью серологической пипетки добавьте 25 мл медиасмеси в стерильную пластиковую чашку Петри; Избегайте появления пузырей.
      1. Чтобы предотвратить загрязнение, протрите лабораторный стол 20% этанолом и зажгите горелку Бунзена для поддержания стерильности при заливке тарелок.
      2. Дайте пластинам остыть, прежде чем хранить их при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
    5. Приготовьте 15 мл 1 М IPTG, растворив 3,574 г IPTG с деионизированной водой в конической пробирке объемом 15 мл. Хранить при температуре -20 °C до необходимости. Избегайте повторных циклов замораживания/размораживания, разбавляя аликвоты на три 5 мл аликвот.
  2. Реагенты для очистки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты должны быть подготовлены не менее чем за один день до очистки
    1. Приготовьте 250 мл буфера для лизиса (50 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 5% глицерина, 5 мМ имидазола) и храните при 4 °C.
    2. Приготовьте 15 мл элюирующего буфера (50 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 5% глицерина, 250 мМ имидазола) и храните при 4 °C до тех пор, пока не понадобится.
    3. Приготовьте 250 мл буфера для расщепления (50 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5% глицерина) и храните при температуре 4 °C до тех пор, пока не понадобится.
    4. Приготовьте 1 л буфера SEC (20 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl, 5 мМ MnCl2) и отфильтруйте через фильтр PES 0,22 мкм с помощью вакуумной фильтрации. Хранить при температуре 4 °C с FPLC.
    5. Приготовьте 15 мл 1 М 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторида гидрохлорида (AEBSF) путем растворения 3,595 г AEBSF с деионизированной водой в конической пробирке объемом 15 мл. Внесите 1 мл аликвот в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и храните при температуре -20 °C до тех пор, пока не понадобится.
    6. Необязательно: Приготовьте мастер-смесь буфера с долецилсульфатом натрия (SDS) для загрузки геля путем разведения 200 μL исходного раствора (250 мМ Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,1% бромфенолового синего, 40% глицерина, 100 мМ DTT) в 400 μл деионизированной воды.
    7. Подготовьте пробирки с гелевыми образцами для отслеживания очистки. Перелейте 30 мкл 1x загрузочного буфера в каждую пробирку.
    8. Приготовьте 1 л 10x Трис-глицина бегового буфера, растворив 30 г основания Триса, 144 г глицина и 20 г SDS в 1000 мл деионизированной воды. Для раствора 1x разбавьте 100 мл раствора 10x в 900 мл деионизированной воды в бутылке объемом 1 л. Храните оба реагента при комнатной температуре до дальнейшего использования.

2. Сверхэкспрессия Nsp15

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты и материалы должны содержаться как можно стерильнее, чтобы предотвратить риск заражения.

  1. Преобразование
    1. Удалите клетки C41(DE3) E. coli с температуры -80 °C для оттаивания в течение 10 минут на льду. Пипеткой введите 1 мкл плазмидной ДНК в пробирку, содержащую клетки C41. Дайте ему инкубироваться, сидя на льду в течение 30 минут.
      Примечание: Хотя концентрации плазмид могут варьироваться, для описанных здесь данных было добавлено 10-20 нг ДНК на одну трансформацию. Коммерческий протокол для клеток C41(DE3) рекомендует 10-50 нг ДНК на одну трансформацию. Этот протокол применим к любой плазмиде, использующей промоторную систему Т7; однако в данном случае ранее опубликованная плазмида pET14b, кодирующая кодон-оптимизированный Nsp15, с сайтом TEV, следующим за N-концевой 6xHis-меткой и сайтом расщепления тромбина, была модифицирована путем замены SARS-CoV-2 Nsp15 на последовательность IBV Nsp15 (GENBANK: WIL95322.1, 5989-6324)19.
    2. Поместите трубку в термоблок при температуре 42 °C на 45 с, чтобы вызвать тепловой шок у клеток и поглощения плазмид. Инкубируйте трубку на льду в течение 2 минут.
    3. Пипетка нанесет 200 мкл восстановительной среды (SOC или другой насыщенной среды) в пробирку, содержащую клетки C41(DE3) и плазмиды. Встряхивайте при 210 об/мин в течение 1 часа при 37 °C.
    4. Извлеките агаровые тарелки LB, дополненные ампициллином, с температуры 4 °C и поместите в невстряхивающий инкубатор, установленный при температуре 37 °C.
    5. Пипетка бактерий на агаровой пластине. С помощью стерильного разбрасывателя разложите ячейки на агаровой пластине. Поместите планшет в невстряхивающий инкубатор, установленный на 37 °C для выращивания в течение 14-16 часов.

3. Рост

  1. Сбор одиночной колонии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для инокуляции клеток в фазе логарифмического роста использовали закваски с одной колонией в тот же день, а не культуру на ночь. При ночных культурах клетки, как правило, находятся в неподвижной или мертвой фазе, особенно при работе с токсичными белками. Кроме того, при более длительном времени культивирования загрязнители или мутанты могут вытеснить токсичные нуклеазы.
    1. Используйте одну стерилизованную колбу Эрленмейера объемом 50 мл на каждый л культуры плюс 2-3 дополнительные закваски. Пометьте одну из колб звездочкой для проверки оптической плотности (OD). Внешний диаметр, собранный из этой колбы, будет представлять весь рост, если нет визуальной разницы между колбами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было обнаружено, что колбы Эрленмейера обеспечивают лучшую аэрацию, чем стартовые пробирки объемом 15 мл.
    2. Создайте мастер-смесь из 2xTY и соответствующих антибиотиков, используя объем 10 мл x N заквасок. Для роста объемом 4 л внесите 6 стартовых культур. Основная смесь будет состоять из 60 мкл ампициллина (размороженного при -20 °C) и 60 мл 2xTY (разбавления 1:1000). Перемешайте и добавьте по 10 мл в каждый Эрленмейер.
    3. Извлеките трансформированную пластину из инкубатора. Отдерните от пластины одну изолированную колонию с помощью стерильной зубочистки или наконечника пипетки. Переложите зубочистку с колонией в колбу с фильтрующим материалом. Повторяйте до тех пор, пока в каждой колбе не будет зубочистки.
    4. Поместите инокулированные стартовые колбы в встряхивающий инкубатор при температуре 210 об/мин, 37 °C. Дайте стартовым колбам вырасти в течение ~5-7 часов.
  2. Инокуляция культуры
    1. Через 5 ч проверьте внешний диаметр колбы с длиной волны 600 нм (наружный диаметр600) колбы, отмеченной звездой, с помощью микрокюветы и спектрометра. Извлеките и переложите 1 мл культуры из колбы в микрокювету. Периодически повторяйте измерения до тех пор, пока наружный диаметр600 не достигнет 0,8-1,0.
    2. За 30 минут до 1 часа до инокуляции (когда наружный диаметр600 достигает 0,4) нагрейте колбы 2 л 2xTY до 37 °C. Теплые среды сокращают время задержки после инокуляции закваской.
    3. Разморозьте запас ампициллина в концентрации 100 мг/мл при температуре от -20 °C. Как только будет достигнут целевой OD600 , приготовьте четыре колбы объемом 2 л с 1 л среды 2xTY, добавив 1 мл 100 мг/мл ампициллина (разведение 1:1000).
    4. Для прививки высыпаем содержимое одной закваски в одну колбу объемом 2 л. Повторяйте до тех пор, пока не будет введена каждая колба объемом 2 л. Не высыпайте зубочистку в колбу для более легкого времени заготовки ячеек.
    5. Поместите инокулированные колбы объемом 2 л в встряхивающий инкубатор при 210 об/мин, 37 °C на 3 ч перед проверкой первого наружного диаметра600.
  3. Индукционная индукция с помощью IPTG
    1. Проверьте внешний диаметр600 , удалив 1 мл среды из колбы с помощью серологической пипетки. Повторяйте до тех пор, пока наружный диаметр600 не достигнет 0,8-1,0.
    2. Как только будет достигнут целевой OD600 , добавьте 1 мл 1 М IPTG для получения конечной концентрации 1 мМ (оттаивая при температуре от -20 °C), чтобы вызвать гиперэкспрессию.
    3. Перенесите колбы объемом 2 л в встряхивающий инкубатор при 210 об/мин, 16 °C для ночного индукционного введения (14-16 ч).
      Примечание: Более низкая температура замедляет рост клеток E. coli , снижая токсичность за счет замедления производства белка и нуклеазной активности.
  4. Урожай
    1. Извлеките наведенные колбы из встряхивающего инкубатора и разлейте содержимое в отдельные бутылки центрифуги объемом 1 л. Сбалансируйте бутылки с помощью деионизированной воды. Вращайте ячейки при 4500 x g в течение 10 минут при 4 °C.
    2. Удалите надосадочную жидкость и переложите гранулу в коническую пробирку объемом 50 мл с помощью шпателя. Соедините гранулы в одну коническую трубку. Хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

4. Очистка Nsp15

ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы и пробирки следует держать на льду. Все этапы центрифугирования следует проводить при температуре 4 °C. В следующем протоколе предполагается наличие белка, меченного His.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО: После каждого этапа можно взять образцы геля, чтобы следить за ходом очистки.

  1. Лизис клеток и осветление лизатов
    1. Ресуспендируйте бактериальную гранулу, добавив 2 мл лизисного буфера на каждые 1,2 г гранулы. Добавляйте 100 мкл 1 М AEBSF на каждые 10 мл буфера для лизиса в качестве ингибитора протеазы. При использовании комбинированной гранулы объемом от 4 л добавьте 100 мкл ДНКазы I для получения конечной концентрации 200 ЕД.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна таблетка коктейля ингибитора протеазы без ЭДТА на л может быть заменена в качестве ингибитора протеазы.
    2. Кратковременно перемешайте содержимое пробирки в течение 30 секунд, чтобы гранула и буфер смешались. Переложите вихревую гранулу в измельчитель тканей Dounce. Рассыпчатым пестиком гомогенизируйте содержимое (~10 ударов).
    3. Переложите гомогенизированный образец в металлический стакан для ультразвуковой обработки.
      1. Чтобы получить максимальное количество пробы, промойте пробирку, содержащую исходную гранулу, 5 мл буфера для лизиса и кратковременно перебейте пробирку. Вылейте содержимое в гомогенизатор Dounce, нанесите ~5 ударов, а затем переложите на стакан с ультразвуком.
    4. В металлический стакан добавьте 75 μL Triton X-100 для помощи в лизисе мембраны и солюбилизации. Поместите металлический стакан в ледяную баню, чтобы образец оставался холодным во время ультразвуковой обработки.
    5. Поместите ультразвуковой щуп в металлический стакан и обрабатывайте образец ультразвуком в течение 6 мин и 30 с с импульсами каждые 2 с и усилением на уровне 70%.
      ВНИМАНИЕ: Используйте средства защиты органов слуха, если ультразвуковой щуп не закрыт в корпусе.
    6. С помощью серологической пипетки перенесите лизат в центрифужную пробирку. В ту же пробирку добавьте 1 М AEBSF в разведении 1:100 в качестве свежего ингибитора протеазы. Осветите лизат центрифугированием при температуре 26,915 x g в течение 50 мин.
  2. Аффинная хроматография методом гравитационной фильтрации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кобальтовая смола значительно снижает количество неспецифических металлических связующих веществ по сравнению с никелевой смолой21.
    1. Во время ультразвуковой обработки получите 2 мл суспензии кобальтовой смолы и ресуспендируйте 25 мл буфера для лизиса в новой конической пробирке. Центрифугируйте ресуспендированную смолу в течение 5 минут при давлении 500 x g. После центрифугирования слейте надосадочную жидкость, стараясь не потерять смолу.
    2. Повторите с двумя отдельными промывками буфером для лизиса объемом 25 мл с последующим центрифугированием. Не сливайте надосадочную жидкость от последней стирки до готовности к пакетному связыванию. Когда все будет готово, вылейте буфер для лизиса из последней промывки смолы и повторно суспендируйте смолу 10 мл свежего буфера для лизиса (10 мл буфера на 1 мл смолы).
    3. Добавьте растворимую фракцию в пробирку и дайте 6-кратному белку, помеченному His, связаться со смолой на коромысле в течение 45 минут при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если объем связующего пакета превышает 50 мл, выполните этот шаг в стакане объемом 250 мл с мешалкой на очень медленной скорости при 4 °C. Перенесите всю смолу в стакан при выполнении этого шага с использованием буфера для лизиса.
    4. После пакетного связывания содержимое высыпать в колонну гравитационной фильтрации и собрать поток в колбу Эрленмейера объемом 125 мл. Содержимое колбы должно состоять из любого белка, который не связывается со смолой; Его помеченный Nsp15 будет связан со смолой. Используя отдельную колбу для сбора, промойте смолу 8 x 25 мл буфера в общей сложности не менее 200 мл (~5x от исходного объема) с помощью серологической пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Медленно добавляйте буфер вниз по стене колонны, а не прямо посередине, чтобы не повредить слой смолы, что может привести к неэффективной или неравномерной промывке.
  3. Элюирование белка
    1. Разбавьте меченный His-мечом Nsp15 в три элюирования с помощью элюирующего буфера. Элютионы 1 и 2 представляют собой элюции объемом 2 мл, а элюция 3 представляет собой элюцию объемом 1 мл.
    2. Проведите «быстрый и грязный» анализ по Брэдфорду, разбавив реагент Брэдфорда в воде в соотношении 1:1. Перелейте по 10 мкл каждого элюирования в пробирки и переверните для перемешивания. Раствор должен стать синим в присутствии белка. Оцените изменение цвета, чтобы определить, как сочетать элюции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если элюции 1 и 2 сильные, а элюция 3 слабая, объедините элюции 1 и 2 и продолжайте. Если все слабые, соедините все три трубки.
  4. Концентрация белка и расщепление метки
    1. Перенесите объединенный элюирующий образец в концентратор MWCO с температурой 30 кД (или подходящего размера для интересующего белка). Сконцентрируйте белок до ≤2 мл центрифугированием при 3 000 x g в течение 10 минут. Переложите концентрированный образец в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Доведите итоговый объем образца до 2 мл с помощью буфера для спайности, если это необходимо.
    2. Подготовьте одноразовую колонну для обессоливания (например, колонну ПД-10) в соответствии с указаниями производителя. Добавьте образец объемом 2 мл в столбец. Поместите колонку в чистую коническую пробирку объемом 50 мл и разбавьте центрифугированием при давлении 1000 x g в течение 2 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе быстро удаляется имидазол, который препятствует расщеплению тромбина, избегая при этом агрегации, вызванной концентрацией, при использовании концентраторов MWCO для буферного обмена.
    3. В элюат добавьте β-Ме и CaCl2 до конечной концентрации 2 мМ каждый. Добавьте 50 мкл бульона тромбина 1 ед/мкл. После того как все компоненты будут добавлены, поместите пробирку на шейкер вертикально и дайте реакции инкубироваться при комнатной температуре в течение 4 ч при легком встряхивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ночное расщепление при 4 °C может работать для некоторых белков; Улучшенный выход Nsp15 наблюдался при 4-часовом расщеплении при RT по сравнению с ночным расщеплением при 4 °C.
    4. Восстановите равновесие гравитационной фильтрационной колонны в буфере для расщепления (3 раза промойте буфером для расщепления 25 мл). Убедитесь, что запорный кран закрыт, и добавьте 5 мл буфера для спайне, чтобы предотвратить высыхание смолы. Хранить колонку при температуре 4 °C в течение периода спайности.
  5. Отделение расщепленного белка от расщепленного His-tag и разрозненного белка
    1. С помощью серологической пипетки осторожно нанесите реакцию расщепления непосредственно на смолу и соберите элюат в коническую пробирку объемом 15 мл.
    2. Промойте смолу 2 мл буфера для спайности и соберите в ту же пробирку объемом 15 мл. Повторите в общей сложности два мытья. По окончании добавьте AEBSF в пробирку, чтобы погасить тромбин и получить конечную концентрацию 10 мМ.
    3. Перенесите образец повторного прохода в новый концентратор MWCO с усилием 30 кД. Сконцентрируйте белок до ≤500 мкл путем центрифугирования при 3 000 x g в течение 10 минут. Переложите концентрированный образец в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл.
  6. Эксклюзионная хроматография
    1. Запустите аналитическую колонку для увеличения S200 (или другую подходящую колонку для определения размера интересующего белка) в соответствии со спецификациями производителя. Уравновесьте в буфере SEC и установите размер фракции FPLC равным 500 μL.
    2. Перенесите выбранные пробирки фракции с пиков в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и добавьте 2,5 мкл 1 М DTT (конечная концентрация 5 мМ) в каждую фракцию, чтобы снизить содержание очищенного Nsp15.
    3. Измерьте значения A280 для каждой дроби с помощью наноспектрофотометра. Перед сбором измерений очистите прибор буфером SEC. Храните очищенные образцы Nsp15 при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
  7. Дополнительно: Проверка очистки
    1. Нагрейте пробирки с гелевыми образцами на термоблоке при температуре 95 °C в течение 10 минут. Коротко центрифугируйте пробирки после нагрева, чтобы раскрутить конденсат. Загрузите образцы в гель/с Mini-Protean TGX 4-20% без пятен и работайте при напряжении 300 В в течение 17 минут. Сделайте изображение геля, чтобы проверить чистоту.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Из-за токсичности Nsp15 в качестве нуклеазы, обычно требовалось ~7 ч для того, чтобы закваски достигли OD600 0,8-1,0. После инокулирования обычно требовалось ~3-5 ч для того же оптимального наружного диаметра600 0,8-1,0 для индукции. В этом случае время удвоения оказалось ~1 ч. Когда был экспрессирован мёртвый мутант Nsp15, удвоение клеток E. coli оказалось нормальным (~20 мин), что является еще одним доказательством того, что активность нуклеазы ответственна за токсичность (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представили подробный протокол, который приводит к успешной сверхэкспрессии токсичной нуклеазы в E. coli и ее очистке с помощью аффинной и размерной эксклюзионной хроматографии. Применение 10 мл заквасок с одной колонией в тот же день вместо ночных заквасок увеличило постоянство времени роста и выхода белка при выращивании. Мы решили использовать клетки C41(DE3), которые содержат мутации, снижающие активность Т7-полимеразы, чтобы помочь справиться с токсичностью рекомбинантны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не сообщают о конфликте интересов.

Благодарности

Эта работа была профинансирована за счет стартового финансирования Школы естественных и экологических наук Колледжа Чарльстона, Колледжа Чарльстона Летние исследования и творческие исследования бакалавриата с грантом факультета и субпремии SC INBRE DRP от P20GM103499.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 & микро; m PES, Стерилизация, Низкое связывание белка, Система фильтрации, 1 лКорнинг431098
Ингибитор сериновой протеазы AEBSFГолдбио30827-99-7
Агар, бактериологическийАмрескоДж637
Ä Система очистки KTA goЦитива29383015
Концентратор Amicon Ultra 15 мл, 30 кДа MWCOМногородностьUFC903024
Ампициллин натрияГолдбиоА-301-25
Колбы для встряхивания с перегородкамиNalgene Ф0527
Настольная центрифугаEppendorf 5920Р
Биофотометр плюсЭппендорфЕ-ВР6132
Тромбин крупного рогатого скотаБиоФарм91-030
Брэдфордский краситель реактивБостон БиоПродуктыБФА-200
Бромфенол синийСигма-Олдрич114931
Хлорид кальцияСигма-ОлдричС4901
Цифровая сухая ваннаБио Рад1660562
Одноразовые разбрасыватели, Г-образныеПартнеры MedSupply62-1014-1
ДитиотреитолГолдбио27565-41-9
DNaseI из поджелудочной железы крупного рогатого скотаСигма-ОлдричД4527
Измельчитель салфеток для душа, 40 млУитон357546
Колонки для хромагтографии с экономическими колонкамиБио-Рад737-1532
Эндуро минимикс нутационный миксерЛабнетС0600
ЭтанолСигма-Олдрич459844
Excella E25R Inc / Встряхиватель для рефЭппендорфНБ-Э25Р
FastPette V2ЛабнетП2000
Ротор с фиксированным углом наклона Fiberlite F10-4x1000 LEXThermo Fisher Scientific096-041075
Ротор Fiberlite F21-8x50y с фиксированным углом наклонаThermo Fisher Scientific096-084275
Gel Doc EZ ImagerБио-Рад1708270
ГлицеринСигма-АльрихГ5516
ГлицинБио-Рад161-0718
ХЕПЕССигма-ОлдричН3375
Мешалка с подогревомВВР12365-346
Соляная кислотаВВРBDH3028
ИмидазолГолдбиоИ-902-25
Изопропил-ß-D-тиогалактиозид (IPTG)Голдбио12481С25
Lemo21(DE3) компетентные клетки E. coliБиолаборатории Новой АнглииК2528Дж
Тетрагидрат хлорида марганца(II)Сигма-ОлдричМ3634
Микроцентрифужные пробирки, 0,5 млВВР87003-290
Микроцентрифужные пробирки, 1,7 млПартнеры MedSupply15-1151
Микроцентрифужные пробирки, 2 млАксигенMCT-200-C
Ячейка для вертикального электрофореза Mini-PROTEAN tetraБио-Рад10025025
Мини-протеановые гели с трис-глицином, 4-20%Био-Рад4568094
MyFuge mini centrfugeПартнеры MedSupplyС1008-Б
Сверхскоростная центрифуга Nalgene 1 лThermo Fisher Scientific3141-1006
Центрифужная трубка Nalgene Oak RidgeThermo Fisher Scientific31139-0050
НанофотометрИмплементировать3769
Нетрясающийся инкубаторЛабнетI 5110 
Сверхэкспресс C41(DE3) химически компетентные элементыБиопоисковые технологии60442-1
Сверхэкспресс C41(DE3) химически компетентные элементыСигма-ОлдричCMC0017Прекращено; Альтернативой являются клетки Biosearch C41(DE3) или клетки NEB Lemo21
Чашки ПетриПартнеры MedSupply62-1077-3
Плазмиды (остов pET-14b)ГенераторИндивидуальный заказ
Пластиковые микрокюветыНаучный центр Фишера14955127
Универсальный блок питания PowerPacБио-Рад1645070
Прецизионная скользящая иглаБектон Диксон305198
Прецизионность плюс стандарты белкаБио-Рад1610363
Среда для восстановления сцеживания Сигма-ОлдричCMR0001K
S-4x1000 Ротор с качающимся ковшомЭппендорфЭП-С4С1
Серологическая пипетка, 10 млФаклон357551
Серологическая пипетка, 25 млФаклон35725
Серологическая пипетка, 5 млФаклон35743
Серологическая пипетка, 50 млPr1maПР-Серо-50
Хлорид натрияСигма-ОлдричС9888
Додецилсульфат натрияСигма-ОлдричЛ3771
Гидроксид натрияСигма-Олдрич567530
Звуковой дисмембраторНаучный центр ФишераФБ505
Центрифуга Sorvall Lynx 4000Thermo Fisher Scientific75006580
Колонка Spephadex G-25 M PD-10Цитива17085101
ß-МеркаптоэтанолМногородность444203
Стакан Griffin из нержавеющей сталиПолярная посуда13977-010-ЭА
Стерильные пробирки Falcon, 15 млСокол352097
Стерильные пробирки Falcon, 50 млСокол352098
Колонна Superdex 200 10/300 GLЦитива28990944
Шприцы, 1 млAir-Tite А1
Шприцы, 3 млБектон Диксон309657
Металлическая аффинная смола TALONТакара635503
ЗубочисткиУлица творчестваPAC3690-01
База TrisГолдбиоТ-400-1
Тритон Х-100MP Biomedicals807423
ТриптонResearch Products InternationalТ60065
ВорнадоРеперБВ101-Г
Дрожжевой экстрактResearch Products InternationalУ20025

Ссылки

  1. Francis, D. M., Page, R. Strategies to optimize protein expression in E. coli. Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).
  2. Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).
  3. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).
  4. Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
  5. Kato, Y. Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production. Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).
  6. Dubendorf, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  7. Studier, F. W. Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).
  8. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  9. Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields. Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).
  10. James, J., et al. Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance. Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).
  11. Shi, Y., et al. A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11. J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).
  12. Nedialkova, D. D., et al. Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease. J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).
  13. Zhao, J., et al. Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation. J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).
  14. Joseph, J. S., et al. Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch. J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).
  15. Xie, Y., et al. Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence. Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).
  16. Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation. J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).
  17. Xu, X., et al. New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15. J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).
  18. Bhardwaj, K., et al. Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15. J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).
  19. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 12 (1), 636(2021).
  20. Kim, Y., et al. Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2. Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).
  21. Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle. Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).
  22. Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease. Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).
  23. Andersen, K. R., Leksa, N. C., Schwartz, T. U. Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification. Proteins. 81 (11), 1857-1861 (2013).
  24. Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools. Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).
  25. Godoy, A. S., et al. Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).
  26. Otter, C. J., et al. SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).
  27. Wang, X., Zhu, B. SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).
  28. Zheng, A., et al. Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer. J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).
  29. Huang, T., et al. Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation. J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).
  30. Zhang, L., et al. Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).
  31. Jernigan, R. J., et al. Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser. Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).
  32. Ricagno, S., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus. Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).
  33. Canal, B., et al. Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease. Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).
  34. Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor. J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).
  35. De Marco, A. Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Оверэкспрессия белкааффинная хроматографияэксклюзионная хроматографияочистка Nsp15экспрессия рекомбинантного белкакриоэлектронная микроскопияанализ расщепления РНКудаление His-метки
Сверхэкспрессия и очистка токсичной нуклеазы из кишечной палочки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.