Методическая статья

Извлечение гистонов из клинических образцов для эпигенетического профилирования с помощью масс-спектрометрии

DOI:

10.3791/68584

⸱

21 ноября 2025 г.

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обеспечивает эффективное извлечение гистонов из различных клинических образцов для последующего анализа посттрансляционной модификации с помощью LC-MS/MS. Обеспечивая надёжное обнаружение ключевых модификаций гистонов, он служит ценным инструментом для комплексного эпигенетического профилирования в крупных клинических когортах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обширные экспериментальные данные подтверждают роль эпигенетических механизмов в начале, прогрессировании и рецидиве рака. Среди них варианты гистонов и их посттрансляционные модификации (ПТМ) регулируют организацию и динамику хроматина, а также доступность генома, тем самым влияя на ключевые процессы на основе ДНК, такие как транскрипция, репликация и восстановление повреждений ДНК с помощью так называемого гистонного кода. Нарушения паттернов гистонного ПТМ часто наблюдаются при раках, при этом некоторые маркеры служат диагностическими и прогностическими биомаркерами. Таким образом, новые методологии, позволяющие беспристрастное и всестороннее профилирование PTM гистонов в клинических образцах, имеют высокую ценность для характеристики эпигенетического ландшафта опухолей. Здесь мы представляем протокол эффективного извлечения гистонов из клинических образцов, включая быстрое замораживание, замороженное с оптимальной температурой резки (OCT) и биопсии с фиксированным парафином (FFPE). Этот подход даёт гистонные белки достаточного количества и качества для последующего анализа снизу вверх с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS). Этот рабочий процесс позволяет надёжно выявлять и количественно оценивать ключевые модификации гистонов, особенно ацетилирование и метилирование лизина, на первичных образцах опухоли, обеспечивая дополнительный молекулярный слой для характеристики рака.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ядре эукариотических клеток гистоны собираются с ДНК, формируя нуклеосомы — фундаментальные структурные единицы хроматина. Каждая нуклеосома состоит примерно из 146 бп ДНК, обёрнутых вокруг октамера, состоящего из двух копий основных гистонов H2A и H2B, а также двух димера гистонов H3 и H4. Кроме того, присутствует линкерный гистон H1, который способствует организации хроматина высшего порядка, связывая как нуклеосому, так и линкерную ДНК между нуклеосомами1. Гистоны украшены широким спектром посттрансляционных модификаций (PTM), которые в основном присутствуют на их N-концевых хвостах. К этим модификациям относятся метилирование, различные типы ацилирования (ацетилирование, пропионилирование, бутирилирование и др.), фосфорилирование, SUMOилирование, убиквитилирование, ADP-рибозилирование и кротонилирование, среди которых наиболее характерны метилирование лизина и аргинина, а также лизин-ацетилирование. Конкретные типы, расположения и комбинации модификаций гистонов создают так называемый гистонический код. Этот код состоит из различных посттрансляционных модификаций (PTM) на N-конечных хвостах гистонов, которые добавляются и удаляются специфическими ферментами, модифицирующими гистоны. Эти модификации затем распознаются эффекторными белками, приводя к изменениям в структуре хроматина, таким как уплотнение или деконденсация, что в конечном итоге влияет на ряд биологических процессов, включая восстановление, репликацию повреждений ДНК и особенно транскрипциюгенов 3,4.

Метилирование ДНК и гистонные ПТМ являются одними из наиболее изученных эпигенетических признаковрака 3. Недавние экспериментальные данные показали изменения уровней различных гистонных ПТМ у нескольких типов рака. В частности, потеря H4K20me3 и H4K16ac была признаком рака, поскольку их уровень был снижен практически во всех опухолях по сравнению с нормальнымитканями 4. Наша группа определила потерю H3K14ac как потенциальную признак рака, количественно измерив его уменьшение при нескольких видах рака по сравнению с обычными аналогами с помощью масс-спектрометрических (РС)методов 5. Кроме того, многочисленные исследования подчеркнули прогностическую ценность гистонных ПТМ, показав, что изменения их глобальных уровней, в основном измеряемые иммуногистохимией в биопсиях пациентов, коррелируют с прогрессированием рака, гистологической градацией и терапевтическимответом 6,7,8. Поэтому анализ гистонного ПТМ в образцах рака важен для выявления новых диагностических и прогностических биомаркеров, а также потенциальных мишеней так называемых эпи-препаратов8.

Очень распространённые методы анализа гистоновых ПТМ в клеточных линиях и клинических образцах основаны на методах на основе антител, таких как иммуноблотация, иммуногистохимия и ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA)9. Однако методы на основе антител страдают от различных ограничений, включая перекрёстную реактивность или, наоборот, маскировкуэпитопов 10. Перекрёстная реактивность возникает, когда антитела связываются с непреднамерёнными мишенями с похожими эпитопами, что приводит к потенциальным ложноположительным результатам, тогда как эпитопная маскировка подразумевает пропущенное обнаружение конкретного эпитопа (гистонного ПТМ или варианта, в данном случае) из-за наличия других модификаций на соседних остатках. Кроме того, количество ткани, необходимое для анализа модификации гистонов с использованием антител, часто велико, поскольку одновременно можно обнаружить лишь ограниченное количество ПТМ, поэтому для мультиплексированных анализов необходимо обработать несколько срезовткани 11. Масс-спектрометрия (РС) стала основным методом для профилирования гистонных ПТМ и вариантов, преодолевая ограничения подходов на основеантител 5,8. МС основывается на обнаружении разницы в массе (Δm, дельта-масса) между теоретическими и экспериментально измеряемыми массами пептидов и белков. Он беспристрастен, комплексен и количественен, так как позволяет идентифицировать и количественно оценивать ПТМ и их варианты без необходимости априорного знания их участка. Это делает рассеянный склероз особенно ценным для чувствительного и точного анализа изменений гистонового ПТМ при раке и других патологическихсостояниях 8.

Здесь мы описываем оптимизированный протокол экстракции гистонов из клинических образцов, в сочетании с профилированием гистонных ПТМ на основе РС, далее называемым рабочим процессом эпи-протеомики. Биопсии пациентов в основном хранятся в виде образцов свежего заморожения (FF), образцов с оптимальной температурой резки (OCT) и образцов с фиксированным парафином (FFPE)12. В то время как свежие биопсии мгновенно замораживаются в жидком азоте или предварительно охлажденном изопентане без добавления какого-либо сохраняющего среды13, биопсии, замороженные с помощью ОКТ, содержат водорастворимую криопротекторную среду, состоящая главным образом из поливинилспирта и полиэтиленгликоля, что облегчает разрезаниетканей 14. Образцы FFPE, напротив, закреплённые в формалине и встроенные в парафин, представляют собой наиболее распространённый способ хранения клинических образцов, поскольку их можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких лет, избегая дорогостоящего обслуживания при низких или ультранизкихтемпературах 15. Поскольку биопсии с быстрой замораживанием не содержат добавок для быстрой заморозки, можно напрямую обрабатывать для экстракции гистонов, тогда как биопсии с OCT и FFPE требуют начальных этапов удаления среды с фиксацией. Образцы FFPE также требуют обширного декросслинкинга белков и получения антигенов.

Этот протокол описывает подробные методы извлечения гистонов из свежезамороженных клинических образцов, встроенных в OCT и FFPE, обеспечивая достаточное количество и качество для дальнейшего анализа РС с учётом специфических сложностей, связанных с каждым типом сохранения образцов (шаг 1). Гистоны, очищенные из клинических образцов, отделяются с помощью протеинового геля электрофореза в условиях денатурирования (SDS-PAGE), затем следуют этап дериватизации и ферментативно перевариваются для получения пептидов подходящей длины (4-15 аминокислот) для масс-спектрометрического анализа снизувверх 16 (шаг 2). Более конкретно, гистоны расщепляются с помощью стратегии, похожей на ArgC, при которой трипсин, обычно разрезающий на C-конце немодифицированных лизинов (K) и аргининов (R), индуцируется резать только на C-конце аргининов из-за предыдущего химического ацилирования немодифицированных и монометилированных лизинов с помощью пропионного ангидрида (PRO). Далее, похожие на Arg-C, переваренные гистонные пептиды ацилируются в N-концевых хвостах с добавлением фенилизоцианата (PIC). Дальнейшая дериватизация увеличивает гидрофобность пептидов и позволяет лучше разделять короткие гистонные пептиды с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии обратной фазы (RP-HPLC), улучшая идентификацию и количественную оценку изобарных пептидоформ17,18 (шаг 3). В целом, описанные здесь методы подчёркивают силу профилирования гистонов на основе рассеянного склероза в исследованиях эпигенетики рака.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Свежезамороженные и OCT-замороженные биопсии тканей были получены по информированному согласию пациентов, проходящих операцию в Европейском институте онкологии (Милан), а биопсии FFPE — у пациентов, проходящих операцию в Неврологическом институте Карло Беста (Милан). Это исследование было одобрено Этическим комитетом Европейского института онкологии (Study UID 2550) и Институтом неврологии Карло Беста (Study CET 39/24).

1. Экстракция гистонов из тканей, полученных пациентом (рисунок 1A)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа гистонов из представительных популяций опухолевых клеток и снижения изменчивости между выборками рекомендуется использовать клинические биопсии с клеточностью опухоли не менее 50%, без некротических участков и/или с обширной иммунной инфильтрацией.

  1. Обогащение гистонов из свежих замороженных тканей (предполагаемая продолжительность: 60 мин)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны выполняться на льду.
    1. Разморозить ткань на льду и вырезать кусок примерно 20–30 мг, обычно соответствующий примерно 2мм 3 ткани.
    2. Переместите образец в пробирку объёмом 1,5 мл и измельчите ткань на мелкие кусочки с помощью ножниц (Таблица материалов).
    3. Добавьте 1 мл буфера изоляции ядер (Таблица 1), свежепополненного ингибиторами протеаз, перечисленными в Таблице материалов. Хорошо перемешайте потом.
    4. Перенесите образец в гомогенизатор Dounce (таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии крупных кусочков ткани используйте наконечник p1000 (при разрезании кончика ножницами), чтобы лучше собрать образец.
    5. Унифицируйте ткань, используя сначала LOOSE, а затем TIGHT Thle (таблицу материалов), пока части ткани не станут невидимыми для невооружённого глаза.
    6. Отфильтруйте гомогенизированный образец через 100-мкм клеточное сито (Таблица материалов) для удаления тканевых мусоров.
    7. Энергично поднимайте и опускайте с помощью p200, чтобы растворить плазматическую мембрану и перенести образец в новую пробирку объёмом 1,5 мл.
    8. Гранулируйте ядра клеток центрифугой при 2300 x g в течение 15 минут при 4 °C с помощью настольной центрифуги (Таблица материалов).
    9. Сбросить супернатант и снова суспензировать ядерные гранулы в 50-100 мкл буфера для изоляции ядер, дополненный 0,1% SDS для растворения ядерной мембраны (Таблица материалов).
    10. Добавьте 250 U бензоназы нуклеазы для переваривания нуклеиновых кислот, хорошо перемешайте и инкубируем в течение 2 минут при 37°C (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец всё ещё вязкий, соникация также может выполняться в водяной бане (настройка: 10 мин 30 секунд включённо/30 секунд выключено; мощность: высокая; температура: 4 °C). После этого этапа образцы можно хранить при -20 °C.
  2. Обогащение гистонов из образцов ОКТ (предполагаемая продолжительность: 90 мин)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для четырёх/пяти срезов ОКТ толщиной 10 мкм, соответствующих 20-60 мг ткани. Однако количество срезов ткани зависит от типа клинической биопсии и общей площади ткани. Учитывая дефицит клинических образцов, можно провести удаление из меньшего количества исходной ткани, хотя это может привести к снижению обнаружения изменений гистонов.
    1. Поместите четыре-пять срезов ткани толщиной 10 мкм, соответствующих примерно 20-60 мг ткани, в трубку длиной 1,5 мл.
    2. Промыйте секции с 1 мл ледяного раствора 70% EtOH (Таблица 1) в течение 2 минут на вращающемся колесе (Таблица материалов) при 4 °C.
    3. Центрифуга при 16 000 x g в течение 2 минут при 4 °C в настольной центрифугах.
    4. Повторяйте шаги 1.2.2 и 1.2.3 всего 3 раза.
    5. Регидратировать образцы в 1 мл двойной дистиллированной воды (ddH 2O) с вращением (таблица материалов) в течение 2 минут при 4 °C.
    6. Центрифугу при 16 000 x g в течение 2 минут при 4 °C в настольной центрифуге (Таблица материалов).
    7. Повторите шаги 1.2.5 и 1.2.6 дважды с помощью 1x PBS (Таблица материалов).
    8. Переходите к шагу 1.1.2 протокола обогащения из свежих замороженных образцов.
  3. Извлечение гистонов из образцов FFPE (предполагаемая продолжительность: 8 ч)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол был разработан для четырёх срезов FFPE толщиной 10 мкм, соответствующих примерно 20-60 мг ткани. Для большинства MS-анализов модификаций гистонов это количество является избыточным и представляет собой безопасную отправную точку, когда материал не ограничивается. Однако также можно использовать меньше исходного материала, что особенно актуально с учётом часто небольшого количества ткани при анализе клинических образцов. Использование меньшего количества исходного материала, хотя и возможно, обычно снижает количественную устойчивость для модификаций гистонов с низким содержанием (например, H3K27ac или мультиметилированные пептиды H3K27/K36), и этот эффект может варьироваться в зависимости от типа ткани, а также от образца к образцу. Тем не менее, наша лаборатория ранее показала, что профилирование гистонов PTM на основе РС можно успешно проводить из лазерных микрорассеченых тканей образцов FFPE при раке молочной железы, соответствующих минимум 1000 клеткам18.
    1. Поместите четыре среза FFPE толщиной 10 мкм, соответствующие примерно 20-60 мг ткани, в трубку объёмом 1,5 мл.
    2. Добавьте 1 мл растворяющего парафина в образец и вихрь (таблица материалов) на максимальной скорости в течение 30 секунд, пока парафин полностью не растворится.
      ВНИМАНИЕ: Растворяющиеся реагенты на основе парафина являются мутагенными, канцерогенными и воспламеняющимися веществами, поэтому их необходимо использовать под химическим капюшоном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворение парафина достигается, когда кусочки парафина больше не видны невооружённым глазом, а растворитель парафина имеет беловатый, однородный цвет.
    3. Центрифугу 16 000 x g на 3 минуты на RT в настольной центрифуге и сбросьте супернатант. Чтобы избежать нежелательной аспирации образца во время удаления супернатантов, вакуумный насос/пипетки можно закрыть меньшим наконечником (например, наконечниками p200, p10).
    4. Повторите шаги 1.3.2 и 1.3.3 ещё три раза (всего 4 раза), чтобы обеспечить полное удаление парафина. В качестве альтернативы взвесьте полностью депарафинированный образец, чтобы получить индикативный показатель объёма обработанной ткани.
    5. Добавьте 1 мл раствора 95% EtOH (Таблица 1) и уведите вихрь на максимальной скорости в течение 30 секунд, чтобы обеспечить полное суспензирование тканей.
    6. Центрифугу 16 000 x g на 3 минуты на RT в настольной центрифуге и сбросьте супернатант. В качестве альтернативы взвесьте обезвоженный образец, чтобы получить индикативную меру количества обработанной сухой ткани.
    7. Повторите шаги 1.3.5 и 1.3.6 с EtOH 70%, 50% и 20% (Таблица 1) иddH 20для восстановления гидратации образца.
    8. Добавьте 200 мкл буфера экстракции (Таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть крупные кусочки ткани, разрежьте их на меньшие кусочки ножницами. В зависимости от количества ткани можно добавить меньший или больший объем буфера для экстракции для обеспечения правильного лизисирования образца. Для особенно небольших гранул, перевзвешенных в объеме буфера экстракции менее 100 мкл, соникация может выполняться с помощью устройства соникации (таблица материалов) (30 с включённо/30 с выключенная мощность: высокая, 10 циклов).
    9. Гомогенизация тканей в буфере экстракции с помощью звуковой обработки с помощью цифрового сонификатора (Таблица материалов) с микронаконечником диаметром 3 мм (>15 циклов, 5 секунд вкл/2 минуты выключения, питание: 15-30%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно считать правильно гомогенизированными, если в растворе не видно видимых частиц ткани, а буфер экстракции имеет равномерный, немутный цвет. Храните образцы на RT во время циклов соникации. Лёд может вызывать осадки SDS в буфере экстракции, тем самым нарушая гомогенизацию тканей. Правильная соникация крайне важна для полного лизиса тканей и извлечения белка. Разместите микронаконечник на нужной высоте в пробирке (он не должен касаться дна пробирки, выделяя пластиковые частицы, и не должен находиться на границе буфера для экстракции воздуха, образуя пену и пузырьки).
    10. После гомогенизации инкубировать образцы при 95 °C в течение 45 минут в термомиксере. Каждые 15 минут открывайте крышку тюбиков, чтобы формальдегид испарился.
    11. Инкубировать образцы при 65 °C в течение 4 часов в термомиксере. Открывайте крышку каждые 20-60 минут, чтобы формальдегид испарился.
    12. Центрифугу 16 000 x g на 1 минуту на RT в настольной центрифуге и перенесите супернатант в новую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент образцы можно хранить при -20 °C.

Таблица 1: Состав буфера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

2. Разрешение гистонов через SDS-PAGE и внутригельное переваривание

  1. SDS-PAGE (Рисунок 1B; предполагаемая продолжительность: 2 часа)
    1. Для оценки чистоты гистонов и их количества загрузите 1/10 экстрактов гистонов на гель полиакриламида 17% (SDS-PAGE; Таблица 1) а также известные количества рекомбинантных гистонов, как показано на рисунке 1B.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо загрузки 1/10 экстрактов гистонов можно загрузить 15-50 мкг белков, измеряемых анализами, устойчивыми к высоким концентрациям детергентов, например, анализ белков на бицинхониновую кислоту(BCA) 19 . Однако обратите внимание, что обогащение гистонов по общим белкам может значительно различаться между свежезамороженными, замороженными образцами OCT и FFPE, и количественное определение количества гистонов можно основываться только на основе SDS-PAGE. 1, 0,5 и 0,25 мкг рекомбинантного гистона H3.1 (Таблица материалов) можно загрузить в качестве ориентира для более точной количественной оценки количества гистонов.
    2. Смешайте образцы с буфером нагрузки литийдодецилсульфата (LDS) или с эквивалентными буферами для SDS-PAGE (например, буфер Laemmli) с добавлением дитиотрейтола (DTT; Таблица материалов) при конечной концентрации 10 мМ.
    3. Денатурация пробы при 95°C в течение 5 минут в термомиксере.
    4. После разделения белков на SDS-PAGE окрашивайте гель с помощью краски Coomassie (Таблица материалов).
    5. Оценка выхода гистонов с помощью визуальной или программной поддержки20 гистоновых полос в клинических образцах по сравнению с рекомбинантным гистоном H3, загруженным в известных количествах.
  2. Переваривание гистонов в гелях (Рисунок 2; предполагаемая продолжительность: 2 дня)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для MS-анализа гистонных ПТМ используется расщепление, аналогичное ArgC, поскольку стандартное расщепление трипсинов приводит к чрезмерно коротким содержаниям пептидов из-за высокой частоты аминокислот лизина и аргинина в их последовательности, что затрудняет обнаружение пептидов LC-MS и идентификацию PTM. Химически модифицируя лизины, триптическое расщепление в этих местах предотвращается, что приводит к расщеплению только на C-конце аргининов, образуя более длинные пептиды (4–15 аминокислот), содержащие модифицированные лизины внутри последовательности; в целом этот протокол облегчает обнаружение и измерение модифицированных гистон-пептидов при РС и подробно описан во многих публикациях8,17,21.
    ОПЦИОНАЛЬНО: Внутренний стандарт (например, толстые маркированные спайк-ин, синтетически маркированные пептиды22) может смешиваться с образцами гистонов в соотношении 1:1 для более точного количественного определения пептида в MS (Рисунок 2B).
    1. Загрузите образец гистона 3-5 мкг на гель полиакриламида 17%, основываясь на оценочной количественной оценке гистонов, выполненной на шаге 2.1.5 (рисунок 2B).
    2. После SDS-PAGE визуализируйте белки, окрашивая гель окрашиванием Coomassie.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить загрязнение, которое может мешать анализу LC-MS/MS, рекомендуется выполнять следующие шаги в условиях без кератина, например, в выделенной вытяжке, поскольку кератин является сильным загрязнителем РС.
    3. Акцизные гелевые полосы соответствуют молекулярной массе белков гистонов ядра (гелевая полоса от 10 до 18 кДа, с учётом следующей молекулярной массы для каждого ядра гистонов: H3 около 17 кДа, H2A-H2B около 14 кДа, H4 около 11 кДа) с использованием скальпеля (Таблица материалов) и разрезанные полосы кусочками примерно 1 мм3 каждая.
    4. С помощью скальпеля переложите детали геля в трубку объёмом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы полностью покрыть гелевые частицы, можно увеличить объёмы, указанные ниже, сохраняя реагентную стехиометрию.
    5. Окрашивайте детали геля, добавив раствор 50% ацетонитрила (ACN) вddH 2O (Таблица 1). Поставьте в термомиксер, установленный на 1400 об/мин на 10 минут RT, а затем сбросьте супернатант.
    6. Повторяйте шаг 2.2.5, пока детали геля полностью не окрашиваются.
    7. Обезвоживайте гелевые частицы, добавив 100% ACN (Таблица материалов). Инкубируйте с смешиванием на 1400 об/мин в течение 10 минут RT, а затем выбросьте супернатант.
    8. Повторяйте шаг 2.2.7, пока детали геля не станут белыми и твёрдыми, а значит, полностью обезвоженными.
    9. Сушите гелевые детали в течение 5 минут на RT в вакуумной центрифуге (таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гистоны бедны цистеином (только два цистеина обнаружены в гистоне H3 в позициях 96 и 110 (UniprotKB ID P68431), а в гистоне H2B в позиции 154 обнаружен только один цистеин (UniprotKB ID B4DR52)). Кроме того, эти цистеины присутствуют в пептидах, которые не обнаруживаются при расщеплении, подобном ArgC, при рассеянном склерозе снизу вверх, поэтому химические аддукты тиоловойгруппы 23 не являются артефактом при анализе гистонов при РС, и в описанном протоколе не выполняются этапы восстановления и алкилирования цистеина.
    10. Добавьте в каждую трубку 15 мкл раствора пропионанангидрида (PRO) и 26 мкл 1 м аммония бикарбоната (AmBic) (Таблица материалов) и инкубировать образцы в термомиксере, установленном на 350 об/мин в течение 10 минут при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ангидриды, растворённые в реактивном буфере, склонны испаряться, не готовьте мастер-смесь PRO и AmBic, а добавляйте их по отдельности в каждый образец, чтобы поддерживать правильную концентрацию PRO в каждой пробирке.
    11. Полностью покрывая гелевые частицы, добавив 1 M AmBic (рекомендуемый объём: 80 мкл) и инкубирайте образцы с смешиванием при 1400 об/мин в течение 4 часов при 37°C в термомиксере. После этого удалите всю жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1 M AmBic добавляется для поддержания базового pH, идеально подходящего для катализа пропионилирования немодифицированных и монометилированных лизинов с помощью PRO.
    12. Промывайте три раза сddH 2O, инкубируя образцы между ними на RT в течение 10 минут, смешивая в термомиксере при 1400 об/мин. После каждого стирки сливайте жидкость.
    13. Добавьте 50% ACN и инкубируете в термомиксере при 1400 об/мин в течение 15 минут при RT. После этого сбросьте жидкость.
    14. Полностью обезвоживайте детали геля, добавив 100% ACN, и инкубируйте при 1400 об/мин в течение 15 минут при RT в термомиксере. После этого сбросьте жидкость.
    15. Повторяйте шаг 2.2.14, пока гелевые кусочки не станут белыми и сухими.
    16. Сухие детали геля 5 минут при RT в вакуумной центрифуга.
    17. Добавьте к каждому образцу 4 мкл раствора трипсина (Таблица 1) и 20 мкл буфера Digest (Таблица 1) и инкубировать 10 минут на льду, чтобы трипсин впитывался в кусочки геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инкубация — проводимая с использованием концентрированного раствора трипсина и буфера для пищеварения (50 мМ амБика вddH 2O, что создаёт базовый pH, идеальный для расщепления трипсина) — позволяет ферменту поглощаться гелем до его активации при 37 °C.
    18. Когда концентрированный трипсин полностью впитается, тщательно покройте кусочки геля дополнительным буфером для пищеварения (индикативный объём: 80 мкл) и инкубируем при 37 °C ночью в термомиксере.
    19. Чтобы извлечь переваренные пептиды из кусочков геля, добавьте 100 мкл 100% ACN и инкубировать при 1400 об/мин в течение 20 минут при RT в термомиксере.
    20. Соберите супернатант и перенесите его в новую трубку на 1,5 мл.
    21. Добавьте 80 мкл 100% ACN в гелевые изделия и инкубируете при 1400 об/мин в течение 10 минут RT в термомиксере.
    22. Собирайте супернатант и объединяйте его с тем, что собраны на шаге 2.2.20, затем концентрируйте пептиды в вакуумной центрифуге с объёмом от 1 до 5 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование вакуумной центрифуги позволяет испарять органический растворитель (ACN). Однако на этом этапе не рекомендуется полностью сушить образец, так как это может негативно повлиять на следующий этап дериватизации. Если образец высохнет, подвесьте его в водеddH 20и соник в водяной бане в течение 5 минут.
    23. ДобавьтеddH 20к каждому образцу до итогового объёма 15 мкл, затем добавьте 2 мкл 1 м бикарбоната триэтиламмония (таблица материалов) и 3 мкл раствора фенилизоцианата (PIC) (Таблица 1) и инкубировать при 350 об/мин в течение 90 минут при 37 °C в термомиксере.
      ВНИМАНИЕ: ПИК — мутагенный и канцерогенный, поэтому рекомендуется использовать его под химическим капюшоном. Поскольку PIC обладает высокой реакционной реакцией и летучей кислотой, рекомендуется избегать приготовления мастер-смеси бикарбоната триэтиламмония и PIC, но рекомендуется добавлять каждый реагент отдельно, чтобы обеспечить точную концентрацию PIC.
    24. В каждую пробирку добавляют 8 мкл 1% трифторуксусной кислоты (TFA; Таблица материалов) чтобы остановить дериватизацию с помощью PIC.
    25. Разведите каждый образец 100 мкл буфера A (Таблица 1) и загрузите их на насадки стадии C18 (подготовленные, как описанов статье 24 , или приобретены у разных поставщиков).
    26. Вращите образцы при температуре 2100 x g в течение 10 минут при 4 °C в центрифуге с вращающимся ротором, чтобы пептиды гистонов связались с смолой C18.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить на наконечниках Stage при 4 °C в течение нескольких месяцев.
    27. Добавьте 30 мкл буфера элюции (Таблица 1) к наконечникам C18 Stage Tips и поместите наконечники в новую трубку объемом 1,5 мл. Отбирайте образцы при 1000 x g в течение 10 минут в настольной центрифуге при 4 °C для элюции гистон-пептидов.
    28. Концентрируйте образцы до объёма от 1 до 3 мкл с помощью вакуумного центрифуги, затем добавьте 1% TFA, чтобы получить итоговый объём 6 мкл.
    29. Загрузите 5 мкл пептидного раствора в микропластину с 96 лунками для анализа MS (Таблица материалов) и запечатайте её герметическим матом (Таблица материалов).

3. ВЭЖХ-МС/МС и анализ данных (Рисунок 3)

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные параметры подходят для жидкостной хроматографии ESAY-nLC 1200, соединённой через колонку EASY Spray с масс-спектрометром Q Exactive Plus Orbitrap (таблица материалов), но также могут использоваться аналогичные или эквивалентные приборы с временными параметрами.

  1. HPLC-MS/MS (предполагаемая продолжительность: 90 мин на образец)
    1. Ввести 3 мкл из 5 мкл гистон-пептидов шага 2.2.29 (примерно 0,25–0,8 мкг по количественной оценке гистонов SDS-PAGE) на наноколонку C18 (таблица материалов) при постоянном потоке 500 нл/мин в буфере A.
    2. Примените 55-минутный линейный градиент с буфером B 10%-45% при расходе 250 нл/мин для разделения пептидов.
    3. Получите данные MS/MS в режиме, зависящем от данных (DDA), чтобы автоматически переключаться между MS1 и MS2 с помощью специализированных программных пакетов (Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для приобретения и общих параметров см. Таблицу 2.
  2. Анализ данных RAW MS
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе количественная оценка гистонных PTM проводится с помощью EpiProfile — открытого скрипта (https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family), удобного для использования и подходящего для стандартных анализов, как описанные для метилирования и ацетилирования лизина H3 и H4. Однако EpiProfile может быть адаптирован для проведения анализа менее стандартных модификаций и различных протоколов подготовки образцов более опытными пользователями. Обратите внимание, что для работы EpiProfile требуется лицензия MATLAB для работыс 25 годами.
    1. Проанализировать полученные RAW данные с помощью программного обеспечения EpiProfile 2.0 (версия PRO-PIC)25 (Таблица материалов) и количественно оценить гистон-пептиды, выбрав варианты histone_normal при проведении анализа без маркировки и histone_SILAC при использовании SUPER-SILAC spike-in. Поставьте ndebug = 0.
    2. Для каждого гистонного пептида (например, H3_3-8) вычислите относительную численность (%RA) каждой модифицированной пептидоформы (например, H3_3-8 unmod, me1, me2, me3), деля её извлеченную ионную хроматограмму (XIC), вычисленную EpiProfile, на сумму всех XIC, вычисленных для этого пептида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию XIC, вычисленные с помощью EpiProfile, могут быть проверены путём проверки спектров MS и ручной количественной оценки гистоновых пептидов с использованием выделенной компаньоны спектров, описанной в18,26.
    3. Для каждой пептидоформы вычислите соотношение лёгкого к тяжёлому (L/H), деля %RA каждого нативного легкого пептида на %RA соответствующего тяжелого пептида, полученного из смеси SUPER-SILAC, введённого в каждый образец.
    4. Преобразуем коэффициенты L/H в логарифмическую шкалу. Чтобы подчеркнуть значительные различия в количестве пептидоформ по образцам, можно провести статистический анализ, а соотношения L/H во всех образцах можно визуально представить в виде тепловых карт и диаграмм рассеяния, как на рисунке 4.

Таблица 2: Список настроек приобретения и общих настроек, используемых для LC-MS/MS в системе, используемой в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы проводили экстракцию гистонов из свежих и ОКТ образцов рака молочной железы, а также из образцов менингиомы FFPE согласно вышеуказанному протоколу. Как показано на рисунке 1A, для замороженных образцов мы удаляли OCT, когда он присутствовал, и гомогенизировали образцы в буфере изоляции ядер с мягким детергентом (0,1% тритона шаг 1,1), что позволило выделить ядра. Далее мы извлекли гистоны с добавлением 0,1% SDS; вместо этого для образцов FFPE мы депарафин...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь метод обеспечивает простой и надёжный рабочий процесс для эффективного выделения гистонов из клинических образцов, хранящихся в виде свежих замороженных, замороженных OCT и FFPE-биопсий для профилирования их модифицационных ландшафтов с помощью MS-анализа. Последующий протокол подготовки образцов с помощью разделения SDS-PAGE и раствора в гелях PRO-PIC с трипсином обеспечивает эффективное удаление детергентов, солей и других загрязнителей MS33, а т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим хирургов и клиницистов из Европейского института онкологии и Института неврологии Карло Беста за проведение биопсий тканей FF, OCT и FFPE. Благодарим Роберту Ноберини за научные и методологические обсуждения при подготовке рукописи и за наше финансирование: PRIN2022 (CUPG53D23001530006), AIRC (номер гранта IG-2023-28767) и Fondazione IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>химикаты
Histolemon RS для гистологииКарло Эрба4549122,5 L
Ацетонитрил (ACN)Карло Эрба4123411L
Аммоний бикарбонат (AmBic)Сигма ОлдричA6141500 г
Персульфат аммония (APS)WDR1.012.010.500500 г
Ингибитор протеазы апротининаSigma Aldrich A11535 мг
Бензоназная нуклеазаМеркE101425 KU
Бисакриламид 30% 37,5 мAppliChemAPA362610001 L
Буфер A 0,1 % муравьиной кислоты в ddH2OТермо Фишер Сайентифик10229884500 mL 
Буфер B 0,1 % муравьиной кислоты /80% ацетонитрила в ddH2OТермо Фишер Сайентифик15431423500 мл
Смола C18Мерк66883-UДиаметр 47 мм
Coomassie Instant BlueAbcamAB1192111 L
Дитиотрейтол (DTT) WDR441496P25 г
ЭтанолКарло Эрба4146082,5 L
Leupeptin  Ингибитор протеазыSigma-Aldrich L85115 мг
N,N,N′,N′-Тетраметилэтилендиамин (TEMED)Сигма Олдрич1.107.320100100 мл
NuPAGE LDS сэмпл-буферИнвитрогенNP00074x
PBS — фосфатно-буферный физиологический раствор  MicroGemTL1006500 мл
Фенил изоцианат (PIC)Сигма Олдрич185353100 г
Ингибитор протеазы фенилсульфонилфторида (ПМСФ)Sigma Aldrich P76261 г
Пропионный ангидрид (PRO)Сигма Олдрич24031150 г
Рекомбинантный гистон H3.1 ЧеловекNew England BiolabsM25031 и микро; g/µ L
Трипсин секвенирующего классаPromegaV5113100 мкг
Ингибитор гистондеацетлиазы натрия бутирата (NaBut)МеркB58875 г
Додецилсульфат натрия (SDS)Сигма ОлдричL3771100 г
Бикарбонат триэтиламмонияСигма ОлдричT7408100 мл
Трифторуксусная кислота (TFA)Термо Фишер Сайентифик289041x10 мл
Tris-HClСигма ОлдричT3253100 г
Моющее средство Triton X-100Sigma-Aldrich X100RS5 г
<сильные>наборы/ оборудование/программное обеспечение
96-ячественная микропластинаКорнингPCR-96-FS-CНепирогенные, без рназы/дназы
РавновесиеМужик19024
Настольная центрифугаЛаборатория биофуги ХареусПико, 23396
Устройство Bioruptor SonicationДиагеноды
Цифровой сонификатор Branson 250Эмерсон
Клеточное сито 100 и микро; mСокол352360
Концентратор плюсЭппендорф5305000509
Dounce Homogenizer (например, g  Данс, Уитон...)Даунс, Уитон1 мл Молол для салфеток
EASY-nLC 1200 Жидкостная хроматографияТермо Фишер Сайентифик
Колонка EASY-Spray HPLC C18Термо Фишер СайентификES9022 и микро; m, 100  Å, 75 µ м x 25 см
Скрипт EpiProfile2.0https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
Фиджийское программное обеспечениеhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
Поисковая система MaxQuanthttps://maxquant.net/maxquant/
Пестель А (свободный)Даунс, Уитон
Пестель B (плотный)Даунс, Уитон
Система Q Exactive Plus Orbitrap LC-MS/MSТермо Фишер Сайентифик
Вращающееся колесоТермо Фишер Сайентифик11496548
СкальпельКиато13010
НожницыТермо Фишер Сайентифик15207266
Герметический матКорнингAM-96-PCR-RDСовместимый с автоматизацией
Центрифуга ротора с отворотомБекман КоултерAllegra X-15R
Компактный термомиксерЭппендорф5350
ВихрьPBIВибромикс
Программное обеспечение XcaliburТермо Фишер СайентификOPTON-30965

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  2. Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  3. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: From laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 28(2024).
  4. Fraga, M. F., et al. Loss of acetylation at lys16 and trimethylation at lys20 of histone h4 is a common hallmark of human cancer. Nat Genet. 37 (4), 391-400 (2005).
  5. Noberini, R., et al. Profiling of epigenetic features in clinical samples reveals novel widespread changes in cancer. Cancers (Basel). 11 (5), 723(2019).
  6. Khan, S. A., Reddy, D., Gupta, S. Global histone post-translational modifications and cancer: Biomarkers for diagnosis, prognosis and treatment. World J Biol Chem. 6 (4), 333-345 (2015).
  7. Liu, R., et al. Post-translational modifications of histones: Mechanisms, biological functions, and therapeutic targets. MedComm (2020). 4 (3), e292(2023).
  8. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: Applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  9. Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: Emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
  10. Voskuil, J. L. The challenges with the validation of research antibodies. F1000Res. 6, 161(2017).
  11. Rothbart, S. B., et al. An interactive database for the assessment of histone antibody specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  12. Gastman, B., et al. Defining best practices for tissue procurement in immuno-oncology clinical trials: Consensus statement from the society for immunotherapy of cancer surgery committee. J Immunother Cancer. 8 (2), e001583(2020).
  13. Steu, S., et al. A procedure for tissue freezing and processing applicable to both intra-operative frozen section diagnosis and tissue banking in surgical pathology. Virchows Arch. 452 (3), 305-312 (2008).
  14. Snijders, M. L. H., et al. Cryo-gel embedding compound for renal biopsy biobanking. Scientific Reports. 9, 15250(2019).
  15. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods Mol Biol. 1897, 253-268 (2019).
  16. Dupree, E. J., et al. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14(2020).
  17. Restellini, C., et al. Alternative digestion approaches improve histone modification mapping by mass spectrometry in clinical samples. Proteomics Clin Appl. 13 (1), e1700166(2019).
  18. Noberini, R., et al. Spatial epi-proteomics enabled by histone post-translational modification analysis from low-abundance clinical samples. Clin Epigenetics. 13 (1), 145(2021).
  19. Olson, B. Assays for determination of protein concentration. Curr Protoc Pharmacol. 73, A 3A 1-A 3A 32 (2016).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Daled, S., et al. Histone sample preparation for bottom-up mass spectrometry: A roadmap to informed decisions. Proteomes. 9 (2), 17(2021).
  22. Kim, H. J., Ha, S., Lee, H. Y., Lee, K. J. Rosics: Chemistry and proteomics of cysteine modifications in redox biology. Mass Spectrom Rev. 34 (2), 184-208 (2015).
  23. Lindemann, C., et al. Strategies in relative and absolute quantitative mass spectrometry based proteomics. Biol Chem. 398 (5-6), 687-699 (2017).
  24. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using stagetips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  25. Yuan, Z. F., et al. Epiprofile 2.0: A computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  26. Noberini, R., Bonaldi, T. A super-silac strategy for the accurate and multiplexed profiling of histone posttranslational modifications. Meth Enzymol. 586, 311-332 (2017).
  27. Valikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A systematic evaluation of normalization methods in quantitative label-free proteomics. Brief Bioinform. 19 (1), 1-11 (2018).
  28. Noberini, R., Longhi, E., Bonaldi, T. A super-silac approach for profiling histone posttranslational modifications. Methods Mol Biol. 2603, 87-102 (2023).
  29. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (4), 933-938 (2007).
  30. Manea, M., Mezo, G., Hudecz, F., Przybylski, M. Mass spectrometric identification of the trypsin cleavage pathway in lysyl-proline containing oligotuftsin peptides. J Pept Sci. 13 (4), 227-236 (2007).
  31. Davies, V., et al. Rapid development of improved data-dependent acquisition strategies. Anal Chem. 93 (14), 5676-5683 (2021).
  32. Herwig-Carl, M. C., et al. Mass spectrometry-based profiling of histone post-translational modifications in uveal melanoma tissues, human melanocytes, and uveal melanoma cell lines - a pilot study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (2), 27(2024).
  33. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  34. Vai, A., et al. Improved mass spectrometry-based methods reveal abundant propionylation and tissue-specific histone propionylation profiles. Mol Cell Proteomics. 23 (7), 100799(2024).
  35. Chen, J., et al. In-gel nhs-propionate derivatization for histone post-translational modifications analysis in arabidopsis thaliana. Anal Chim Acta. 886, 107-113 (2015).
  36. Nshanian, M., et al. Short-chain fatty acid metabolites propionate and butyrate are unique epigenetic regulatory elements linking diet, metabolism and gene expression. Nat Metab. 7 (1), 196-211 (2025).
  37. Joseph, F. M., Young, N. L. Histone variant-specific post-translational modifications. Semin Cell Dev Biol. 135, 73-84 (2023).
  38. Amatori, S., Tavolaro, S., Gambardella, S., Fanelli, M. The dark side of histones: Genomic organization and role of oncohistones in cancer. Clin Epigenetics. 13 (1), 71(2021).
  39. Mohammad, F., Helin, K. Oncohistones: Drivers of pediatric cancers. Genes Dev. 31 (23-24), 2313-2324 (2017).
  40. Louis, D. N., et al. The 2021 who classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  41. Deshmukh, S., Ptack, A., Krug, B., Jabado, N. Oncohistones: A roadmap to stalled development. FEBS J. 289 (5), 1315-1328 (2022).
  42. Lopes, M., Lund, P. J., Garcia, B. A. Optimized and robust workflow for quantifying the canonical histone ubiquitination marks h2ak119ub and h2bk120ub by lc-ms/ms. J Proteome Res. 23 (12), 5405-5420 (2024).
  43. Turriziani, B., et al. On-beads digestion in conjunction with data-dependent mass spectrometry: A shortcut to quantitative and dynamic interaction proteomics. Biology (Basel). 3 (2), 320-332 (2014).
  44. Hamza, G. M., et al. Affi-bams: A robust targeted proteomics microarray platform to measure histone post-translational modifications. Int J Mol Sci. 24 (12), 10060(2023).
  45. Nel, A. J., Garnett, S., Blackburn, J. M., Soares, N. C. Comparative reevaluation of fasp and enhanced fasp methods by lc-ms/ms. J Proteome Res. 14 (3), 1637-1642 (2015).
  46. Ledvinova, D., et al. Filter-aided sample preparation procedure for mass spectrometric analysis of plant histones. Front Plant Sci. 9, 1373(2018).
  47. Picard, G., et al. Psaq standards for accurate ms-based quantification of proteins: From the concept to biomedical applications. J Mass Spectrom. 47 (10), 1353-1363 (2012).
  48. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The maxquant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  49. Zhang, C., Liu, Y. Retrieving quantitative information of histone ptms by mass spectrometry. Methods Enzymol. 586, 165-191 (2017).
  50. Thomas, S. P., Haws, S. A., Borth, L. E., Denu, J. M. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: Best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  51. Bauden, M., Kristl, T., Andersson, R., Marko-Varga, G., Ansari, D. Characterization of histone-related chemical modifications in formalin-fixed paraffin-embedded and fresh-frozen human pancreatic cancer xenografts using lc-ms/ms. Lab Invest. 97 (3), 279-288 (2017).
  52. Noberini, R., Uggetti, A., Pruneri, G., Minucci, S., Bonaldi, T. Pathology tissue-quantitative mass spectrometry analysis to profile histone post-translational modification patterns in patient samples. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 866-877 (2016).
  53. Sugii, N., Matsuda, M., Tsurubuchi, T., Ishikawa, E. Hemorrhagic complications after brain tumor biopsy: Risk-reduction strategies based on safer biopsy targets and techniques. World Neurosurg. 176, e254-e264 (2023).
  54. Govaert, E., et al. Extracting histones for the specific purpose of label-free ms. Proteomics. 16 (23), 2937-2944 (2016).
  55. An, Y. A., Scherer, P. E. Mouse adipose tissue protein extraction. Bio Protoc. 10 (11), e3631(2020).
  56. Vantaggiato, L., et al. Protein extraction methods suitable for muscle tissue proteomic analysis. Proteomes. 12 (4), 27(2024).
  57. Noberini, R., et al. Extensive and systematic rewiring of histone post-translational modifications in cancer model systems. Nucl Acids Res. 46 (8), 3817-3832 (2018).
  58. Chatzikyriakou, P., et al. A comprehensive characterisation of phaeochromocytoma and paraganglioma tumours through histone protein profiling, DNA methylation and transcriptomic analysis genome wide. Clin Epigenetics. 15 (1), 196(2023).
  59. Noberini, R., et al. Pat-h-ms coupled with laser microdissection to study histone post-translational modifications in selected cell populations from pathology samples. Clin Epigenetics. 9, 69(2017).
  60. Henikoff, S., et al. RNA polymerase II at histone genes predicts outcome in human cancer. Science. 387 (6735), 737-743 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FFPE

Похожие статьи