Использование инструментов оптогенетики LEXY и LINuS и автоматизированного анализа изображений для количественной оценки динамики нуклеоцитоплазматического транспорта в живых клетках

Краткое содержание

Этот протокол описывает, как эффективно настраивать и выполнять автоматизированный анализ данных визуализации живых клеток, полученных в результате отслеживания нуклеоцитоплазматического транспорта с помощью оптогенетических инструментов.

Аннотация

Нуклеоцитоплазматический транспорт (НКТ) необходим для поддержания клеточного гомеостаза, а его нарушение связано с различными заболеваниями, включая нейродегенеративные расстройства и боковой амиотрофический склероз. Это подчеркивает необходимость разработки инструментов для мониторинга и количественной оценки НКТ. Среди этих инструментов быстрые и обратимые оптогенетические зонды, LEXY (светоиндуцируемая ядерная экспортная система) и LINuS (светоиндуцируемый сигнал ядерной локализации), позволяют измерять динамику NCT в живых клетках.

В оригинальных публикациях описывается ручная сегментация и количественная оценка сигнала флуоресцентного зонда в ядре и цитозоле при трансфекции конструкций LEXY и LINuS при визуализации живых клеток. Однако как трансфекция, так и ручная сегментация ограничивают количество клеток, которые могут быть проанализированы, и подвержены неточности из-за потенциальных ошибок, зависящих от пользователя. В то время как высокая скорость и обратимость, обеспечиваемые оптогенетикой, должны, в принципе, обеспечивать высокую чувствительность при обнаружении изменений в динамике NCT, это зависит от параметров получения и анализа достаточного количества клеток.

Поэтому мы создали лентивирусные векторы, экспрессирующие LEXY и LINuS для создания стабильных клеточных линий, протестировали маркеры визуализации в реальном времени и контрольные условия, а также внедрили полуавтоматический конвейер анализа изображений, который позволяет анализировать сотни клеток. Этот метод анализа использует программное обеспечение с открытым доступом FIJI, доступен для новичков в биоинформатике и не требует продвинутых компьютерных настроек. В этой статье мы приводим пошаговый протокол настройки LEXY в качестве примера этих оптогенетических инструментов для мониторинга ядерного экспорта, от подготовки образцов до получения изображений живых клеток и автоматизированного анализа, а также демонстрируем, как адаптировать протокол к другим условиям, контролю или моделям в любой лаборатории. Все плазмиды и клеточные линии, используемые в этом протоколе, будут доступны научному сообществу, что еще больше повысит доступность метода.

Введение

Важность нуклеоцитоплазматического транспорта (НКТ) для регуляции ключевых клеточных путей и поддержания клеточного гомеостаза была хорошо изучена в последние годы¹. В результате было создано несколько инструментов для изучения динамики NCT ^2,3,4. Среди этих инструментов оптогенетические зонды LINuS⁵ и LEXY⁶, опубликованные соответственно в 2014 и 2016 годах, обеспечивают эффективный способ мониторинга NCT в живых клетках. Эти инструменты, разработанные для отслеживания индуцируемого экспорта (LEXY) или импорта (LINuS) флуоресцентного репортера, индуцируются воздействием синего света и обратимы.

Вкратце, эти два небольших зонда используют свойства домена LOV2 белка фототропина-1 растения Avena sativa⁷. В отсутствие синего света спираль Jα из домена LOV2 фотоклетка встраивается в ядро белка. Поскольку спираль Jα может реагировать на световой стимул, освещение синим светом вызывает конформационное изменение и последующее отстыковку спирали Jα от домена LOV2. Авторы LEXY и LINuS использовали эту светочувствительность для слияния сигнала ядерной локализации (NLS) или сигнала ядерного экспорта (NES) с спиралью Jα для LINuS и LEXY соответственно (рис. 1). Полученный инструмент представляет собой зонд, который перемещается в ядро (LINuS) или цитозоль (LEXY) при освещении синим светом.

Для отслеживания зондов с помощью флуоресцентной визуализации в конструкции также был добавлен флуоресцентный репортер mCherry. Наконец, в систему были добавлены слабые NES (для LINuS) или NLS (для LEXY), чтобы гарантировать, что зонды не находятся в своей окончательной локализации до освещения синим светом, что помешало бы наблюдению транслокации LEXY или LINuS между ядром и цитозолем.

Рисунок 1: Представление зондов LEXY и LINuS. Оба зонда состоят из белка mCherry, слитого со светочувствительным доменом LOV2. Разница между этими двумя инструментами заключается в последовательности сигнализации, скрытой Jα-спиралью: NES для LEXY и NLS для LINuS. Оба зонда также обладают слабой последовательностью сигналов для управления их начальной локализацией: слабая NLS для LEXY и слабая NES для LINuS. Таким образом, активация систем с помощью подсветки синим светом вызывает либо их экспорт для LEXY, либо импорт для LINuS, что позволяет пользователям контролировать экспорт или импорт ядерных материалов. Сокращения: LEXY = светоиндуцируемая система ядерного экспорта; LINuS = светоиндуцируемый сигнал ядерной локализации; NLS = сигнал ядерной локализации; NES = сигнал ядерного экспорта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Локализация флуоресценции mCherry сообщает о шаттле зондов LEXY и LINuS между ядрами и цитозолем, и, следовательно, может быть прослежена при визуализации живых клеток, что позволяет пользователям контролировать NCT. В дополнение к использованию в качестве простых зондов, LEXY и LINuS также могут быть спроектированы для контроля локализации и изучения представляющих интерес белков in vitro 5,6,8,9 или in vivo ^10,11.

Метод количественной оценки, предложенный в публикациях LEXY и LINuS, показывает относительную ядерную интенсивность зондов. Предлагаемый анализ выполняется вручную и основан на измерении области интереса (ROI) в ядре и цитозоле. Хотя этот метод дает хорошее представление сигнала зонда во времени, он очень долгий и утомительный, особенно при повторении экспериментов и условий. Важно отметить, что этому методу также не хватает точности, поскольку представлена лишь небольшая часть спроектированного отсека.

Здесь мы предлагаем новый протокол для количественного определения флуоресцентных сигналов LEXY и LINuS. Мы внедрили автоматизированные методики, которые облегчают анализ и обеспечивают большую точность. Это облегчит процесс для новых пользователей этих инструментов и поможет увеличить пропускную способность. Наш протокол количественной оценки использует только один интерфейс, плагин с открытым исходным кодом TrackMate¹² от FIJI. В частности, для повышения надежности количественного определения мы использовали совместимый с визуализацией в реальном времени дальний красный маркер ДНК для выполнения сегментации всего ядра с помощью StarDist¹³, обученной сверточной нейронной сети, в сочетании с отслеживанием и измерением флуоресцентного сигнала зонда с помощью TrackMate¹².

Полученные данные затем могут быть легко экспортированы в предоставленную и готовую к использованию электронную таблицу (Дополнительная таблица S1) для получения относительной ядерной интенсивности каждого идентифицированного ядра. В этом протоколе также объясняется, как объединить полученные значения в график путем подгонки полученной кривой временного хода к моноэкспоненциальной модели, как в Ю и Митчисоне¹⁴ , и как рассчитать скорость переноса для различных тестируемых условий. С помощью этого протокола и предоставленной электронной таблицы для анализа пользователи смогут легко количественно оценить данные визуализации живых клеток, даже с ограниченными навыками биоинформатики.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже описан протокол мониторинга экспорта ядерных материалов с помощью зонда LEXY. Подробная информация о настройках, которые необходимо настроить для LINuS, представлена в разделе 5.

1. Культура клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура, описанная в данном разделе, должна выполняться в капюшоне для культуры тканей. Описанные ниже шаги были оптимизированы для^{15-клеточной} линии фибробластов мышей NIH/3T3 с использованием DMEM (или DMEM, не содержащего фенола красного, при наличии показаний) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина в качестве среды (см. Таблицу материалов). Тем не менее, пользователи могут адаптировать процедуру для других типов клеток. Протокол подходит для трансфицированных клеток или стабильных клеточных линий. Тем не менее, мы рекомендуем создавать стабильные клеточные линии, как упоминалось в разделе обсуждения.

1. Приготовьте покрывающий раствор с 23 мкг/мл коллагена и 2 мкг/мл фибронектина в стерильном 1x PBS. Добавьте 800 мкл раствора для нанесения покрытия в каждую чашку для визуализации под действием (см. Таблицу материалов) и выдержите в инкубаторе 90 минут.
2. Промойте смесь для покрытия стерильным 1x PBS и засейте 60 000 клеток на чашках для визуализации в реальном времени в среде для получения на следующий день.
3. При необходимости трансфектируйте клетки плазмидой LEXY в соответствии с методом трансфекции, который лучше всего подходит для используемого типа клеток. Чтобы следовать этому протоколу, выполните котрансфекцию зонда с пустым вектором для повышения эффективности в соотношении 1:5 для вектора LEXY:empty. Защитите клетки от света в темном ящике или с помощью алюминиевой фольги и дайте им вырасти в течение суток.
4. Перед получением окрасьте клетки дальним красным маркером ДНК, совместимым с визуализацией живых клеток, в среду, свободную от фенола, и убедитесь, что они полностью защищены от света до момента приобретения.
   Примечание: В нашем случае мы используем SiR-ДНК¹⁶ в концентрации 1 мкМ, инкубированную в течение не менее 1 ч перед получением.
5. Для контроля экспорта используют ядерный ингибитор экспорта лептомицин B¹⁷ в концентрации 0,5 нМ (слабое ингибирование экспорта) и 1 нМ (сильное ингибирование экспорта), применяемые к клеткам за 1 ч до ингибирования.

2. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть получены с помощью конфокального микроскопа, совместимого с живым изображением, который имеет возможность создавать шаблон выбранных снимков и пульсирующее лазерное излучение с длиной волны 458 нм. Наша визуализация проводилась в темноте в камере с температурой 37 °C (с 5%_CO2) конфокального микроскопа с резонансным сканированием. Установка оптимизирована с помощью объектива 20x, что позволяет одновременно визуализировать несколько клеток в одном поле зрения. Последовательность визуализации состоит из трех фаз, как показано на рисунке 2.

1. Стабильная фаза
   1. Выполняйте один сбор сигналов mCherry (LEXY, лазер 561 нм) и дальнего красного (SiR-DNA, лазер 633 нм) каждые 15 с и повторяйте его 10 раз, общей продолжительностью 150 с. Следите за тем, чтобы на этом этапе не наблюдалось ни отбеливания, ни транслокации LEXY в цитозоль.
      ВНИМАНИЕ: Освещение системы синим светом на этом этапе активирует LEXY, что немедленно вызовет его экспорт в цитозоль.
2. Фаза освещения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта фаза состоит из трех шагов, повторяющихся 15 раз.
   1. Осуществлять пульсирующее освещение синим светом (лазер с длиной волны 458 нм), с импульсами 36 мс, повторяющимися 150 раз, общей продолжительностью ~5 с.
   2. Выполните один сбор флуоресцентных сигналов mCherry (LEXY, лазер 561 нм) и дальнего красного (SiR-DNA, лазер 633 нм).
   3. Пауза на 15 с.
3. Фаза восстановления
   1. Выполняйте один сбор сигналов mCherry (LEXY, лазер 561 нм) и дальнего красного (SiR-DNA, лазер 633 нм) каждые 15 с, повторите 25 раз, общей продолжительностью 375 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным и может быть отменен, если пользователи хотят наблюдать только за экспортом зонда, а не за восстановлением.

Рисунок 2: Конфигурация трех фаз LEXY. Для мониторинга экспорта ядерных материалов с помощью LEXY в программном обеспечении микроскопа необходимо настроить три фазы. В верхней части указана конфигурация, используемая для получения изображений живых клеток LEXY. Эта конфигурация состоит из стабильной фазы, обеспечивающей стабильность сигнала в ядре, фазы освещения, вызывающей транслокацию LEXY из ядра в цитозоль, и фазы восстановления, позволяющей наблюдать за возвращением LEXY в ядро. В нижней части рисунка указаны ожидаемые результаты при визуализации живых клеток. Красным цветом mCherry обозначена локализация LEXY. Серым цветом SiR-ДНК окрашивает ядра клеток. Масштабные линейки = 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Анализ для LEXY

ПРИМЕЧАНИЕ: Весь анализ сегментации и отслеживания выполнен с использованием FIJI с TrackMate¹², плагином с открытым исходным кодом для Фиджи (требуемая версия подробно описана в Таблице материалов).

1. Установите FIJI, а затем загрузите плагины StarDist¹³ и TrackMate. Чтобы установить плагины, перейдите в раздел Справка | Обновление ... | Управляйте сайтами обновлений и отметьте CSBDeep, StarDist и Trackmate-StarDist, затем нажмите «Применить изменения». Перезапустите Фиджи.
2. В то время как некоторые микроскопы могут воспринимать каждую фазу регистрации (Stable-Illumination-Recovery) вместе, другие (например, референсный конфокальный микроскоп) сохраняют их отдельно. Таким образом, дополнительным шагом, при использовании этой конфигурации, является объединение фаз вместе: откройте изображения трех последовательностей, запустите функцию конкатенации для компиляции трех фаз замедленной съемки в один файл: нажмите на Изображение | Стеки | Инструменты | Конкатенация....
3. Выберите стабильную фазу как Image1, фазу освещения как Image2, а фазу восстановления как Image3. Полученное изображение представляет собой единое изображение для покадровой съемки трех фаз, в которых объединены каналы mCherry (канал 1) и SiR-ДНК (канал 2).
4. Сохраните полученное изображение для последующего шага сегментации и сохраните его: перейдите в Файл | Сохранить как | Тифф....
5. Разделите только канал mCherry для следующих анализов: перейти к Изображение | Цвет | Разделите каналы и сохраните их: перейдите в Файл | Сохранить как | Тифф....
6. Чтобы проверить возможное обесцвечивание во время сбора, выполните команду Построить профиль по оси Z на канале mCherry: перейдите в раздел Изображение | Стеки | Построение графика профиля оси Z. На сгенерированной таблице нажмите на Данные | Скопируйте ^1-й набор данных и вставьте его в готовую к использованию электронную таблицу, поставляемую с этим протоколом (дополнительная таблица S1), под ячейкой профиля оси Z.
7. Нарисуйте круглую область интереса (ROI) среднего размера ядра и сохраните ее: перейдите в раздел Анализ | Инструменты | Менеджер по окупаемости инвестиций.... Добавьте ROI и сохраните его: перейдите в раздел «Еще» | Спасать...
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один и тот же ROI должен использоваться для измерения фона для всех анализируемых условий.
8. Поместите сохраненный ROI в область без ячеек в течение всего таймлапса и измерьте среднюю интенсивность в пределах этого ROI с помощью функции интерфейса ROI. Во-первых, убедитесь, что среднее значение серого отмечено галочкой, нажав « Анализировать» | Установите мерки. Затем нажмите «Еще» | Мультимерность. Отметьте галочкой «Измерить все 50 ломтиков и один сырой ломтик» и нажмите « ОК».
9. Скопируйте и вставьте все значения, отображаемые в предоставленной таблице (Дополнительная таблица S1), под ячейкой «ROI Background».
10. На Фиджи закройте изображение только с каналом mCherry и выберите ранее сохраненное изображение с объединенными каналами mCherry и SiR-DNA.
11. Откройте плагин TrackMate: перейдите в раздел Плагины | Отслеживание | TrackMate.
12. Проверьте правильность количества временных точек (от 0 до 49 , если были соблюдены предложенные этапы) и нажмите « Далее».
13. Выберите детектор StarDist и нажмите « Далее».
14. Выберите канал 2 (SiR-ДНК) для сегментации ядер и нажмите « Далее». Подождите несколько секунд, пока процесс сегментации не завершится. Визуально проверьте, соответствует ли полученная сегментация границе ядер и нажмите на кнопку Next (рисунок 3). В случае неточной сегментации обратите внимание на соответствующий идентификатор ядра (SpotID), чтобы исключить его из дальнейшего анализа на шаге 3.26.
15. Оставьте параметры по умолчанию и нажмите «Далее » в окне настройки начального порога . В этом окне указывается количество сегментированных пятен (ядер) среди 50 временных точек.
16. Установка фильтров на споты: создание и установка фильтров:
    1. Создайте два фильтра со средней интенсивностью ch1 в качестве параметра для удаления ядер со слишком интенсивным или слишком слабым сигналом, которые могут исказить результаты анализа: один фильтр для выбора значений выше заданного порога, а другой — для выбора значений ниже порога. Определите значение, при котором будет удаляться только очень слабый или насыщенный сигнал.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эти фильтры могут не понадобиться, если используются стабильные клеточные линии. Обратите внимание на эти значения, так как их необходимо повторно применить для всех условий.
    2. Создайте два фильтра Area для удаления нежелательных объектов (мусора, умирающих или делящихся клеток) из анализов: один фильтр для выбора значений выше заданного порога, а другой — для выбора значений ниже порога. Нажмите на кнопку «Далее».
       ПРИМЕЧАНИЕ: Повторно примените эти значения для всех условий.
17. Выберите трекер: выберите Simple LAP tracker и нажмите « Далее».
18. Выберите параметры для отслеживания. Отрегулируйте Максимальное расстояние связывания (здесь, 30 μм) - максимальное расстояние, на которое будет разрешено связывать объекты между кадрами. Используйте Максимальное расстояние закрытия зазора (здесь, 15 мкм) и Максимальный зазор между кадрами закрытия зазора (здесь 3), чтобы определить, сколько пятен одного трека можно пропустить, не исключая этот же трек. Нажмите кнопку «Далее » (рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти предложенные параметры были оптимизированы для нашей установки и клеточной модели с использованием метода проб и ошибок и, возможно, потребуется корректировка экспериментально.
    Максимальное расстояние между связями необходимо регулировать, чтобы предотвратить неправильное отслеживание от одного ядра к другому, особенно если клетки сильно перемещаются.
19. После расчетов нажимаем на Next и устанавливаем фильтры на треки. Чтобы выбрать только те ядра, которые отслеживались в течение всего временного цикла (50 временных точек с предложенной последовательностью), выберите наибольшее количество точек на треке (наведите курсор на более 49 для предложенной последовательности). Нажмите на кнопку «Далее».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это облегчит анализ, но возможно только в том случае, если было отслежено достаточное количество ядер за весь период времени, если нет: см. обсуждение.
20. Параметры отображения: отметьте галочкой Отображать названия точек , чтобы иметь возможность повторить каждое ядро в дальнейших анализах. Настройте отображаемые функции в соответствии с предпочтениями пользователя.
21. В нижней части страницы нажмите на Треки | Экспортируйте в CSV , чтобы сохранить таблицу со всеми измерениями. Закройте таблицу и нажмите « Далее».
22. При необходимости построите график объектов трека с T (временем) в качестве оси X и Средней интенсивностью ch1 для оси Y. Нажмите на Особенности графика. Закройте график и нажмите «Далее».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст пользователям представление об общей тенденции экспорта. На этом этапе она не нормализуется по фону и начальной интенсивности.
23. Нажмите « Захватить наложение как действие» и «Выполнить» | Хорошо. Сгенерированное изображение будет использоваться для идентификации количественных ядер. Сохранить: перейти в Файл | Сохранить как | Тифф....
24. В файл электронной таблицы импортируйте файл CSV, полученный с помощью TrackMate: На вкладке « Данные » в группе «Получить и преобразовать данные » нажмите «Из текста/CSV» и «Импорт».
25. Выделите все четыре следующих столбца, нажав на соответствующую букву, скопируйте и вставьте их в верхнюю часть предоставленной таблицы (Дополнительная таблица S1), столбцы от A до D, с фоном: Идентификатор пятна (B), Идентификатор трека (C), Кадр (I), Средняя интенсивность ch1 (M).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что начало вставленных мер начинается со строки 6 Дополнительной таблицы S1. Если это не так, измерения могут быть смещены с одной или нескольких ячеек и, следовательно, быть неверными. Обратитесь к таблице Дополнительной таблицы S2 , чтобы получить пример ожидаемого распоряжения.
26. Сначала отсортируйте результаты в алфавитном порядке по TrackID (отдельное ядро), нажав на стрелку в ячейке B5 , и Frame (временная точка), нажав на стрелку в ячейке C5.
27. Чтобы удалить фоновый шум, вычтите значения, полученные на шаге 3.8, из каждого значения, полученного в параметре Средняя интенсивность ch1 (предварительно рассчитано в прилагаемой таблице, см. Дополнительную таблицу S1).
28. Чтобы нормализовать сигнал LEXY, вычислим среднюю интенсивность флуоресцентного сигнала mCherry в стабильной фазе (кадры с 0 по 9). Затем разделите все полученные результаты в Средней интенсивности ch1 на среднюю интенсивность стабильной фазы (предварительно рассчитанную в прилагаемой таблице, см. Дополнительную таблицу S1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полученное число является средней интенсивностью ядерной флуоресценции LEXY. Все показатели уже отображаются по ядрам из столбца L и могут быть отображены в виде графика.

Рисунок 3: Анализ TrackMate с использованием FIJI. Вверху схематическое изображение анализов TrackMate, внизу изображения, полученные в результате анализов на Фиджи. На первом изображении слева серым цветом показано окрашивание несегментированной SiR-ДНК, маркера ядра. Вторая панель представляет собой автоматическую сегментацию, выполненную с помощью канала SiR-ДНК компанией Stardist. Ядра окрашиваются в соответствии с интенсивностью канала mCherry, чтобы облегчить визуализацию и заключительный этап. На третьей панели показаны треки, полученные путем отслеживания окрашивания SiR-ДНК во временных точках всей последовательности визуализации живых клеток. На последней панели справа красным цветом показан флуоресцентный сигнал LEXY в области, определенной сегментацией, которая будет измеряться для каждой временной точки. Масштабная линейка = 50 μм Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Транспортный тариф, статистика и цифры

1. Постройте график относительной интенсивности ядерного излучения.
   1. Откройте GraphPadPrism и создайте лист: нажмите на Ввести или импортировать данные в новую таблицу, а в опциях выберите затраченное время для X и максимальное количество сегментированных ядер для повторения значений в параллельных подстолбцах для Y. Нажмите на кнопку Создать и вставьте полученные данные в таблицу.
   2. Для значений X (время), если параметры приобретений были сохранены в соответствии с предложенными, скопируйте и вставьте столбец в разделе «время» в предоставленную таблицу. В противном случае отрегулируйте значения в соответствии с используемыми параметрами.
   3. Чтобы построить график относительной интенсивности ядерного излучения, перейдите в раздел Графики. Выберите XY в качестве семейства графов и Точки и соединительная линия с полосами погрешностей в качестве типа графика.
   4. В разделе «График » выберите «Среднее», «Ошибка» и «SEM» и нажмите « ОК », чтобы просмотреть графики. Измените масштабы и визуальные эффекты в соответствии с выбранными параметрами.
2. Подгонка относительной интенсивности ядерного излучения к моноэкспоненциальной модели.
   1. В разделе «Таблица данных » нажмите на «Новая таблица данных».
      1. Выберите Введите значения X как X и Enter, постройте одно значение Y для каждой точки как Y и нажмите Создать.
      2. В столбце X укажите время в десятичных дробях только для стабильной фазы и фазы освещения; Если предложенные параметры приобретений были сохранены, скопируйте и вставьте столбец под «десятичным временем» в предоставленную таблицу, Дополнительная таблица S1.
      3. Вставьте в таблицу значения, полученные в виде относительной ядерной интенсивности , только для стабильной фазы и фазы освещения.
      4. В разделе Результаты выберите следующий анализ: Анализ XY | Экспоненциальный | Нелинейная регрессия (Аппроксимация кривой) и нажмите OK.
      5. В параметрах в качестве Модели выбираем Plateau с последующим распадом одной фазы, а в параметрах ограничения выбираем константу, равную 2,25 как X0 (время начала освещения), константу, равную 1, как Y0 (относительная интенсивность ядер в начале освещения), константу, равную 0 для Plateau (значения, к которым должна склоняться относительная интенсивность ядер), и укажите, что K (норма экспорта) должна быть больше 0. Остальные параметры оставьте по умолчанию. Нажмите на OK.
      6. В разделе «Результаты » в строке K указаны все скорости экспорта для ядер тестируемого состояния.
      7. При необходимости повторите шаги с 4.2.1 по 4.2.1.5 для других условий.
3. Создайте график скорости экспорта.
   1. Создайте новую таблицу: выберите значения Enter X как X и Enter, постройте одно значение Y для каждой точки как Y и нажмите кнопку Create.
   2. Для каждого условия (в столбцах) вставьте и транспонируйте значения K, полученные на предыдущем шаге.
   3. Чтобы создать график скорости экспорта, перейдите в раздел Графики, выберите столбец как семейство графиков, а в разделе Коробка и скрипка выберите тип графика График для скрипки, с помощью графика График для скрипки. Показать все точки в виде графика. Нажмите OK, чтобы увидеть график. При необходимости настройте способ представления данных.
   4. Чтобы провести статистический тест для коэффициента экспорта, выполните двусторонний t-критерий Уэлча, как описано в Yoo and Mitchison¹⁴, выполнив следующие действия:
      1. В таблице, содержащей показатели экспорта всех условий, нажмите на кнопку Анализ | Сравнение групп | T-тест (и непараметрические тесты), выберите условия для тестирования и нажмите OK. Tick Unpaired, Yes use parametric test, а Unpaired t test with Welch's correction. Не предполагайте равные SD и нажмите OK.
   5. Следите за результатами анализа в таблице раздела Результаты и при необходимости составляйте отчет на графике скорости экспорта.

5. Адаптации для LINuS

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный выше протокол может быть легко адаптирован для мониторинга импорта ядерных материалов с помощью LINuS путем внесения следующих изменений.

1. Культура клеток
   1. Вместо лептомицина В на стадии 1.5 используют импортазол¹⁸ в качестве ядерного ингибитора в концентрации 10 мкМ в течение 1 ч перед получением.
2. Отображение
   1. Чтобы получить оптимальный импорт системы, замените 150 повторений импульсов освещения по 36 мс лазером с длиной волны 458 нм на шаге 2.2.1 на 250 повторений общей продолжительностью ~9 с.
      Примечание: Время последовательности может зависеть от типа ячейки, и параметры для обоих зондов могут нуждаться в корректировке для того, чтобы быть оптимальными, поскольку системы зависят от распознавания NLS и NES, которые специфичны для типа клеток^19,20.
3. Тарифы, статистика и цифры на транспорт
   1. Вместо того, чтобы подгонять кривую к плато с последующим затуханием одной фазы на шаге 4.2.1.5, выберите плато с последующим анализом одной фазовой ассоциации .
   2. Ограничьте X0 равным 2,25, Y0 равным 1, а K (скорость импорта в случае LINuS) больше 0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы LINuS с помощью TrackMate идентичны анализам LEXY. Относительная интенсивность ядра по-прежнему является измеряемым и анализируемым значением, но вместо того, чтобы наблюдать снижение из-за экспорта зонда, следует наблюдать обогащение флуоресцентного сигнала в ядре после освещения синим светом.

Результаты

Вышеупомянутый протокол должен позволить пользователям визуализировать локализацию и транслокацию зонда во время сбора данных при визуализации живых клеток. Пример ожидаемых изображений, полученных для визуализации ядерного экспорта с помощью LEXY, показан на рисунке 4. Быстрое снижение сигнала от ядра и обогащение цитозоля должно наблюдаться после пары раундов свечения синим светом. После остановки циклов подсветки можно заметить постепенное восстановление сигнала датчика. Для управления системой лептомицин В, ингибитор экспорта, подтверждает, что изменение экспорта может быть визуализировано с помощью анализов, поскольку он предотвращает экспорт LEXY при освещении синим светом (рис. 4).

Рисунок 4: Визуализация сигнала LEXY во времени. Захват репрезентативных временных точек фаз стабильности, освещенности и восстановления, полученных с помощью визуализации живых клеток. Состояние метанола представляет собой контрольное условие. При пульсирующем освещении синим светом красного цвета флуоресцентный сигнал mCherry, сообщающий о местоположении LEXY, перемещается из ядра в цитозоль. После остановки подсветки сигнал восстанавливается в ядре. Лечение ингибитором экспорта лептомицином В в концентрации 1 нМ или 0,5 нМ показывает отсутствие или снижение экспорта препарата LEXY при блокировании экспорта. Масштабная линейка = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Что касается анализов, то в то время как значения кривой относительной ядерной интенсивности во время стабильной фазы должны составлять около 1, после активации синим светом они должны медленно снижаться до достижения плато в конце фазы освещения (рис. 5А). Если снижение происходит слишком быстро или слишком медленно, параметры сбора данных могут быть оптимизированы (см. обсуждение). Лечение лептомицином B в достаточных концентрациях также может подтвердить, что анализы и методика достаточно чувствительны, чтобы показать, что ядерный экспорт полностью заблокирован, при этом относительные значения ядерной интенсивности стабильны на уровне около 1 в течение всего эксперимента. Промежуточные концентрации лептомицина В, однако, должны демонстрировать умеренный ядерный экспорт (рис. 5А). Эти визуальные наблюдения должны быть количественно подтверждены с учетом нормы экспорта (рис. 5В).

Рисунок 5: Ожидаемая относительная ядерная интенсивность LEXY и скорость переноса. (A) График представляет относительную ядерную интенсивность флуоресцентного сигнала LEXY во времени, нормализованную до средней интенсивности стабильной фазы mCherry. Относительная ядерная интенсивность метанола (контрольного, красного) снижается вдвое после освещения, в отличие от клеток, обработанных экспортным ингибитором лептомицином В, в концентрации 0,5 нМ (светло-голубой) или 1 нМ (темно-синий). (B) Скорость экспорта условий контроля и лептомицина В, полученная путем подгонки кривой к моноэкспоненциальной модели. Значения, полученные при блокировании экспорта лептомицином В, значительно ниже контрольного условия. N = 18 клеток для метанола (красный), 19 клеток для лептомицина B 0,5 нМ (светло-голубой) и 15 клеток для лептомицина B 1 нМ (темно-синий). Значения P рассчитывали с помощью двустороннего t-критерия Уэлча. : P < 1×10⁻⁴, ****: P < 1×10⁻⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительная таблица S1: Таблица с предопределенными расчетами. Эта таблица предоставлена для облегчения анализа. Значения интенсивности, полученные с помощью TrackMate, можно напрямую скопировать и вставить в электронную таблицу для получения нормализованных относительных значений интенсивности ядерного излучения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S2: Пример ожидаемых результатов для контрольного условия анализа LEXY. В таблице приведен пример полученных значений для контрольного условия стабильной клеточной линии LEXY. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Как упоминается в протоколе, создание стабильных клеточных линий значительно повышает качество анализов. Во-первых, наличие 100% клеток, экспрессирующих зонды, увеличивает количество отслеживаемых и анализируемых ядер, что повышает надежность анализов. Во-вторых, он снижает гибель клеток, вызванную сверхэкспрессией зондов и токсичностью используемых реагентов для трансфекции. И, наконец, это снижает сильную гетерогенность флуоресцентных сигналов среди клеток. Этот параметр имеет важное значение, так как насыщенный сигнал не позволит должным образом обнаружить изменение интенсивности после освещения. Тот же вывод справедлив и для слабых сигналов, которые могут обесцвечиваться или не позволять количественно оценить различия. Поэтому мы рекомендуем сначала протестировать зонды методом трансфекции, чтобы убедиться в их правильной работе, настроить параметры сбора, а затем быстро создать стабильные клеточные линии. Мы создали лентивирусные векторы для зондов LEXY и LINuS, которые доступны для совместного использования по запросу, а также для стабильных линий NIH/3T3 LEXY или LINuS, созданных с помощью этих лентивирусов.

Если зонды трансфицированы или ячейки разрежены, предлагаемые параметры, скорее всего, уменьшат количество обнаруженных треков, и анализ будет менее надежным. В этом случае пользователи могут быть более снисходительными к пропущенным в треке пятнам, уменьшив фильтр Количество спотов в треках (мы рекомендуем оставить не менее 45 из 50 спотов). Внимание: если этот фильтр уменьшен, предоставленный файл Excel (Дополнительная таблица S1) должен быть скорректирован вручную: действительно, значения, вставленные из импортированного CSV, не будут учитывать пробелы. Пользователю нужно найти, где находятся недостающие места с номером TrackID и соотнести их с номером ядра, что обычно занимает несколько раундов копирования-вставки.

Критически важным параметром, гарантирующим успех эксперимента, является содержание клеток в темноте. Поскольку зонды реагируют на синий свет, пользователи должны обеспечить транспортировку клеток в темноте в течение не менее 30 минут перед их получением. Достаточно небольшой закрытой коробки или использования алюминия для покрытия тарелки. Точно так же необходимо быть очень осторожным и использовать только свет mCherry для поиска клеток в микроскопе, так как освещение синим светом активирует клетки. Если возможное освещение происходит под микроскопом, поищите другое удаленное поле для съемки. Построение профиля оси Z на шаге 3.6 поможет узнать, подвергались ли ячейки воздействию освещения, уменьшается ли кривая, а не является ли она плато.

Последовательность визуализации состоит из трех этапов. Во-первых, стабильная фаза, чтобы оценить потенциальное обесцвечивание, а также убедиться, что локализация LEXY стабильна без активации (1). Во-вторых, фаза активации, состоящая из циклов пульсирующего излучения синим светом, индуцирует транслокацию LEXY из ядра в цитозоль (2). Наконец, необязательная фаза восстановления, при которой сигнал постепенно возвращается к своему первоначальному положению в ядре (3).

Последовательность, описываемая для получения данных, может быть специфичной для типа клеток^19,20. Для первого эксперимента пользователь должен протестировать и изменить мощность лазера и тайминги, чтобы увидеть, как система постепенно перемещается между ядром и цитозолем. Важно отметить, что слишком сильная мощность лазера, такая как слишком короткая пауза, может помешать нахождению прогрессирующей транслокации, но вместо этого произойдет резкое падение/обогащение (в зависимости от используемого зонда) интенсивности mCherry после освещения.

Если оптимизация последовательности не решает проблему, вполне вероятно, что NES и/или NLS не подходят для используемого типа ячейки. Пользователи могут обратиться к статье⁸ метода LINuS для проектирования и модификации пробников. Пользователи также могут ознакомиться с этой статьей для получения изображений LINuS с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.

Сегментация ядер является критическим этапом анализа. Для визуализации живых клеток зондов следует использовать устойчивый и надежный ядерный маркер. Поскольку освещение синим светом активирует транслокацию зонда, а зонды контролируются флуоресцентным белком mCherry, этот маркер должен быть виден в дальнем красном спектре или вблизи. В нашем случае мы используем SiR-ДНК, которая окрашивает клетки в течение от 1 до ~24 часов инкубации, но использование SPY-DNA 650 также является вариантом (см. Таблицу материалов для ссылок).

Наконец, если сегментация с помощью StarDist в сочетании с отфильтрованным отслеживанием TrackMate доказывает свою эффективность, важно отметить, что пользователь всегда должен визуально проверять результаты сегментации и количественной оценки. Делящаяся или умирающая клетка может быть включена в количественную оценку, в то время как она не должна быть включена. Чтобы снизить риски анализа таких событий, предоставленный лист Excel присваивает относительную интенсивность ядерного излучения цветовым кодом (синий = низкие значения, красный = высокие значения). Изучая цвета перед построением графика значений в GraphPad Prism, пользователь должен заметить любые необычные значения. Например, относительная ядерная интенсивность LEXY должна варьироваться от высокой (красный — сильное количество зонда в ядрах) во время стабильной фазы до низкой (синий — уменьшенное количество зонда в ядрах) в конце фазы освещения, прежде чем вернуться к высоким значениям (красный) на фазе восстановления (как показано в дополнительной таблице S2).

Данный протокол имеет различные преимущества по сравнению с ранее предложенными методами ^5,6. Полуавтоматический конвейер облегчает анализ нуклеоцитоплазматического транспорта LEXY и LINuS и обеспечивает большую точность, чем ранее предложенное ручное количественное определение ^5,6. Использование нашего протокола позволит новичкам в этой области выполнять эффективные анализы, а также предоставит новый инструмент для опытных пользователей, которым потребуется всего один интерфейс с открытым доступом для выполнения полуавтоматического анализа нуклеоцитоплазматического транспорта.

Этот метод может быть использован не только для изучения глобальной скорости нуклеоцитоплазматического транспорта в клеточных линиях NIH3T3. Действительно, с помощью нескольких шагов оптимизации его можно адаптировать для изучения скорости транспортировки зонда в различных типах клеток или у живых животных⁸. Кроме того, путем слияния белка, представляющего интерес для LEXY или LINuS, также можно изучить скорость его транспортировки или последующие эффекты его световой транслокации в ядро или из него. Например, с помощью LEXY можно изолировать белок в цитоплазме, а с помощью LINuS 5,6,21,22,23 можно принудительно локализовать его в ядре. Наконец, описанные анализы также могут быть расширены для большего числа приложений, чем LEXY и LINuS, для отслеживания любого сигнала, который перемещается между субклеточными компартментами, которые могут быть сегментированы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Коллаген	Сигма-Олдрич	08-115
Конфокальный микроскоп	LEICA	СП8
DMEM	Gibco	31966021
Превосходить	Майкрософт
ФБС	Сигма-Олдрич	Ф7524
Фибронектин	Сигма-Олдрич	Ф1141
Программное обеспечение FIJI	ФИДЖИ		ImageJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322
Фтороблюды	Датчер	ФД3510-100	Альтернатива: Attofluor камера (Invitrogen #A7816)
ГрафПад Призма 10.4.1	ГрафПад Софтвер, Инк.
Импортазол	Сигма-Олдрич	SML0341
Лептомицин В	Сигма-Олдрич	Л2913
Плазмида LEXY	Адджен	72655	пДН122
Плазмида LINuS	Адджен	61347	пDN77
Карандашлин-стрептомицин	Gibco	15140-122
Фенол-красный, свободный от фенола DMEM	Gibco	21063-029
SiR-ДНК	Спирохром	СК007	Альтернатива: SPY-DNA650 (Спирохром #SC501)
Плагин Stardist 2D	СтарДист		StarDist_0.3.0
Плагин TrackMate	ТрекМат		TrackMate-7.14.0