Методическая статья

Методология исследования обучаемости и памяти у ювенильных крыс с использованием анестезии севофлураном для оценки экспрессии p-CREB и c-fos гиппокампа

DOI:

10.3791/68591

⸱

19 сентября 2025 г.

 ,  , 
1Department of Anesthesiology and SICU, Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании изучается, как севофлуран ухудшает сохранение памяти и снижает экспрессию p-CREB и c-fos в нейронах гиппокампа через путь NMDAR/p-CREB/c-fos у молодых крыс. Результаты показывают, что севофлуран вызывает дефицит кратковременной памяти и снижает маркеры синаптической пластичности, при этом эффекты обратимы через 3 дня, независимо от частоты приема.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение когнитивных нарушений во время развития мозга сталкивается с трудностями из-за динамического характера нейроразвития, методологических ограничений и контекстуальных барьеров. В этом исследовании изучался комплексный методологический подход к изучению когнитивных нарушений в развивающемся мозге, вызванных севофлураном, основанный на памяти и экспрессии p-CREB и c-fos в нейронах гиппокампа через сигнальный путь NMDAR/p-CREB/c-fos у молодых крыс. Шестьдесят четыре 21-дневных самца крыс в возрасте SD (масса тела <80 г) были разделены на пять групп: нормальные (n=8), 60% O2 (n=16), фиктивные тренировки (n=8), однократные дозы севофлурана (n=16) и многодозовые севофлураны (n=16). Две группы севофлурана были разделены на жертвы через 1 день (группы sev1a и sev1b) и 30 дней (группы sev30a и sev30b) после тренировки (n=8/подгруппа); Все остальные крысы были умерщвлены через 1 ч после тренировки. Тест Y-лабиринта использовался для оценки обучения и удержания памяти. С помощью иммуногистохимии определяли количество p-CREB- и c-fos-положительных нейронов в образцах гиппокампа. По сравнению с группой 60% O2 (сохранение памяти 86,33% ± 17,52%), память крыс в группах sev1a и sev1b показала достоверное снижение (sev1a: 44,29% ± 11,26%; sev1b: 62,42% ± 7,27%; все P<0,05), в то время как группы sev1b и sev30b не показали значимых различий (sev30a: 84,41% ± 14,15%; sev30b: 85,21% ± 11,61%; все P>0,05). По сравнению с группой с 60% содержаниемO2 (c-fos: 92,83 ± 7,88; p-CREB: 72,22 ± 8,89), экспрессия p-CREB и c-fos в нейронах гиппокампа снизилась в группе sev1a (c-fos: 23,13 ± 3,28; p-CREB: 22,88 ± 5,18) и группе sev30 (c-fos: 23,22 ± 3,13; p-CREB: 25,58 ± 2,26) (все P<0,05), в то время как группы sev30a и sev30b не показали существенных различий (все P>0,05). Севофлуран оказывает кратковременное отрицательное стимулирующее действие на способность молодых крыс поддерживать память без влияния в зависимости от частоты приема. Севофлуран снижает экспрессию p-CREB и c-fos в нейронах гиппокампа молодых крыс.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение когнитивных нарушений во время развития мозга сталкивается со значительными трудностями из-за динамического характера нейроразвития, методологических ограничений и контекстуальных барьеров. Развитие мозга включает в себя быстрые, нелинейные изменения, затрудняющие выявление нарушений во время критических окон 1,2. В условиях ограниченных ресурсов такие барьеры, как грамотность лиц, осуществляющих уход, языковое разнообразие и ограниченный доступ к специализированным инструментам (например, МРТ), препятствуют раннему скринингу1. Индивидуальная вариабельность созревания мозга затрудняет дифференциацию патологических отклонений от типичного развития 2,3. Такие состояния, как синдром Дауна, демонстрируют измененное развитие коры головного мозга, но небольшие размеры выборки и скудные гистологические данные ограничивают механистическое понимание4. Расстройства развития нервной системы (например, РАС, СДВГ) часто сочетаются с тревогой или депрессией, искажая когнитивные оценки5. Серьезные коммуникативные дефициты в некоторых группах населения ограничивают использование стандартизированных тестов6. Эти особенности приводят к нескольким проблемам с дизайном исследований. Действительно, в большинстве исследований используется дизайн поперечных сечений, в котором не удается смоделировать индивидуальные изменения с течением времени. Существует чрезмерная зависимость от западного, образованного населения (выборки «WEIRD»)7. Исследования синдрома Дауна страдают от небольших посмертных образцов мозга и неадекватного контроля соответствующего возраста4. Инструменты экологической мгновенной оценки изо всех сил пытаются учесть контекстуальные переменные, влияющие на повседневную когнитивную деятельность5.

Наиболее важными функциями в животном и человеческом мозге являются обучение и память, которые занимают центральное место в развитии человека и жизнив целом. Мозг младенцев находится на стадии развития и уязвим к внешним факторам, таким как лекарства и анестезия 9,10. Повреждение функции памяти младенцев, вызванное анестетиками, является важной темой клинических исследований и может даже задержать оптимальное лечение педиатрических пациентов из-за невозможности проведения анестезии. Когнитивные дисфункции, связанные с анестезией (или послеоперационная когнитивная дисфункция, POCD), могут иметь долгосрочные последствия для младенцев12. Ингаляция севофлурана может влиять на функции памяти у младенцев13,14, но традиционная анестезиология считает, что повреждение мозга у младенцев в основном вызвано гипоксией мозга во время анестезии, особенно при общей анестезии10. Таким образом, до тех пор, пока в головном мозге нет краткосрочной или долгосрочной гипоксии, риск повреждения центральной нервной системы у младенцевдолжен быть снижен. Тем не менее, понимание POCD остается неоптимальным. Младенцам, нуждающимся в хирургическом вмешательстве, потребуется анестезия, и лучшее знание задействованных путей может помочь разработать стратегии анестезии, которые сведут к минимуму риск развития POCD.

Исследование с участием пожилых людей, перенесших некардиологические операции, показало, что почти 25% пациентов испытывали ПОКД в течение 1 недели после операции, и эта доля снизилась до уровня ниже 10% через 3 месяца, в то время как контрольная группа показала показатели ПОКД 3,4% и 2,8%15. Исследование также показало, что большинство случаев ПОКД были обратимыми, и только у небольшого числа пациентов наблюдалась длительная или постоянная ПОКД15. В центральной нервной системе глутамат является наиболее распространенной возбуждающей аминокислотой16. N-метил-D-аспартатный рецептор (NMDAR) имеет решающее значение для индукции и поддержания долгосрочного потенцирования (LTP) и долгосрочной депрессии (LTD)17. Исследования на мышах показали, что возбуждающая синаптическая пластичность напрямую влияет на развитие функций мозга18, при этом особенно важны активация NMDAR и приток кальция19,20. Повышенная активность NMDAR имеет значительные последствия для индукции синаптического роста и пластичности19,20. Следовательно, более высокая степень блокады NMDAR антагонистами NMDAR (например, севофлураном) должна приводить к снижению способностей к обучению и памяти21. В то время как влияние севофлурана на обучение и память в мозге взрослого человека не было установлено22,23, севофлуран обычно используется для анестезии в педиатрических операциях14. Будучи неконкурентным антагонистом NMDAR, севофлуран может существенно влиять на функции обучения и памяти мозга 11,13,14,23,24. Тем не менее, помимо NMDAR, в обучении и памяти участвуют и другие пути и белки, а механизмы регуляции памяти с участием белка, связывающего элемент с фосфорилированным цАМФ (p-CREB) и непосредственными ранними генами c-fo, становятся все более ясными 25,26,27, но все еще требуют лучшего понимания для оптимального проведения анестезии у младенцев и детей.

Основываясь на этих теоретических рамках, в настоящем исследовании был изучен комплексный методологический подход, который может быть использован для изучения когнитивных нарушений в развивающемся мозге, вызванных севофлураном, на основе памяти и экспрессии p-CREB и c-fos в нейронах гиппокампа через сигнальный путь NMDAR/p-CREB/c-fos у молодых крыс. Результаты могут помочь улучшить наше понимание POCD и ухудшения памяти после общей анестезии. В этом исследовании использовались 21-дневные крысы, потому что они только что были отлучены от груди и имели очень однородную массу тела и физиологическое состояние, соответствующее раннему подростковому возрасту у людей. Благодаря их повышенной нейропластичности и уязвимости в этот критический период развития, они могут эффективно моделировать когнитивные нарушения, вызванные хирургическим вмешательством или анестезией на незрелом мозге 28,29. Это делает их особенно подходящими для изучения нейрокогнитивных рисков, связанных с детской хирургией, и изучения потенциальных стратегий вмешательства. Y-образный лабиринт является широко используемым методом оценки обученияи памяти. Иммуногистохимия обычно используется для изучения нейронов и различных белков нейронов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы в этом исследовании были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике больницы Синьхуа Медицинской школы Шанхайского университета Цзяотун (одобрение No. XHEC-C-2016-023-2).

1. Экспериментальный обзор животных и группировка

  1. Получить 64 крыс-самца в возрасте 21 дня (масса тела до 80 г).
  2. Разделите крыс на пять групп: нормальная группа (n = 8), группа 60% O2 (n = 16), тренировочная группа Шама (n = 8), группа однократной дозы севофлурана (n = 16) и группа многодозового севофлурана (n = 16) (см. таблицу 1).
  3. Содержание крыс в помещении для животных при температуре 20-24 °C с влажностью 50%-60% и естественным освещением.
  4. Обеспечьте достаточное количество пищи и воды.
  5. Убедитесь, что все протоколы проверены и одобрены Комитетом по этике.
  6. Подготовьте ингаляционную камеру (см. дополнительный рисунок S1, подробно описанный в разделе 2.1).
  7. Нормальная группа
    1. Подвергните крыс воздействию воздуха на 60% в течение 2 часов (подробно описано в разделе 2.2).
    2. Проведите тестирование Y-образного лабиринта через 1 день после контакта (подробно описано в разделе 4).
    3. Соберите ткани после поведенческого тестирования (подробно описано в разделе 5).
  8. 60% О2 группа
    1. Подвергните крыс воздействию воздуха на 60% в течение 2 часов (подробно описано в разделе 2.2).
    2. Проведите тестирование Y-образного лабиринта через 30 дней после контакта (подробно описано в разделе 4).
    3. Соберите ткани после поведенческого тестирования (подробно описано в разделе 5).
  9. Бутафорская учебная группа
    1. Подвергните крыс воздействию воздуха на 60% в течение 2 часов (подробно описано в разделе 2.2).
    2. Проведите тестирование Y-образного лабиринта через 1 день после воздействия без структурированной тренировки (освещение и расположение зон шока менялись случайным образом), используемого для контроля влияния света и электрических стимулов на обучение и память (подробно описано в разделе 4).
    3. Соберите ткани после поведенческого тестирования (подробно описано в разделе 5).
  10. Группа севофлурана однократной дозы (группа sev1a)
    1. Подвергайте крыс воздействию 60% воздуха + 3% севофлурана в течение 2 ч (подробно описано в разделе 2.2).
    2. Проведите тестирование Y-образного лабиринта через 1 день после контакта (подробно описано в разделе 4).
    3. Соберите ткани после поведенческого тестирования (подробно описано в разделе 5).
  11. Группа севофлурана однократного приема (группа sev30a)
    1. Подвергайте крыс воздействию 60% воздуха + 3% севофлурана в течение 2 ч (подробно описано в разделе 2.2).
    2. Проведите тестирование Y-образного лабиринта через 30 дней после контакта (подробно описано в разделе 4).
    3. Соберите ткани после поведенческого тестирования (подробно описано в разделе 5).
  12. Группа севофлурана при повторном приеме (группа sev1b)
    1. Подвергайте крыс воздействию 60% воздуха + 3% севофлурана в течение 2 ч в день, в течение 7 дней подряд (подробно описано в разделе 2.2).
    2. Проведите тестирование Y-образного лабиринта через 1 день после контакта (подробно описано в разделе 4).
    3. Соберите ткани после поведенческого тестирования (подробно описано в разделе 5).
  13. Группа севофлурана с повторными дозами (группа sev30b)
    1. Подвергайте крыс воздействию 60% воздуха + 3% севофлурана в течение 2 ч в день, в течение 7 дней подряд (подробно описано в разделе 2.2).
    2. Проведите тестирование Y-образного лабиринта через 30 дней после контакта (подробно описано в разделе 4).
    3. Соберите ткани после поведенческого тестирования (подробно описано в разделе 5).

2. Ингаляции с севофлураном

  1. Подготовка камеры (см. дополнительный рисунок S1)
    1. Соедините отверстие слева от коробки с 60% O2/40% N2.
    2. Подключите подачу кислорода к вапорайзеру севофлурана.
    3. Подсоедините отверстие справа от коробки к газоанализатору наркозного аппарата.
    4. Подсоедините отверстие в верхней части камеры к газоотводу.
    5. Поместите известь ниже сетки на дно камеры и добавьте вату.
    6. Поместите установку в вытяжной шкаф.
    7. Подложите под камеру грелку.
  2. Ингаляция
    1. Включите подачу кислорода и испаритель севофлурана.
    2. Отрегулируйте расход кислорода до 2 л/мин.
    3. Когда концентрация севофлурана достигнет 3,0%, поддерживайте подачу в течение 30 мин для стабилизации атмосферы в камере.
    4. Поместите крысу на хлопчатобумажную сторону камеры.
    5. Держите крысу там в соответствии с группировкой (см. шаг 1.2).
    6. Контролируйте цвет кожи, частоту дыхания, частоту сердечных сокращений и пульсоксиметрию.
    7. Уберите крысу.
    8. Дайте крысе проснуться естественным путем.
    9. Верните крысу в клетку.

3. Экспериментальные реактивы и приборы

  1. Подготовка реагентов
    1. Приготовьте 250 мл коммерчески доступного севофлурана для введения анестезии.
    2. Приготовьте рабочий раствор антитела p-CREB, разбавив исходное антитело в соотношении 1:350.
    3. Приготовьте рабочий раствор антитела c-fos путем разведения исходного антитела в соотношении 1:200.
    4. Соберите набор для иммуногистохимического окрашивания.
    5. Приготовьте 4% параформальдегид.
      1. Растворите 40 г растворимого параформальдегида (PFA) в стеклянной емкости с 500 мл воды высокой чистоты, непрерывно нагревайте и перемешивайте с помощью магнитов до 60-65 °C до образования молочной суспензии.
      2. Добавляйте капли 1,0 моль/л NaOH до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (pH = 7,0).
      3. Добавьте примерно 500 мл PBS и тщательно перемешайте на ледяной бане или бане с холодной водой.
      4. Еще раз проверьте pH, отфильтруйте и сделайте объем до 1000 мл.
      5. Хранить при температуре 4 °C для дальнейшего использования.
  2. Настройка оборудования
    1. Расположите Y-образный лабиринт в области поведенческого тестирования (см. дополнительный рисунок S2).
    2. Откалибруйте микроскоп с помощью встроенной системы визуализации для гистологического анализа.
  3. Установите микротом со свежими лезвиями для разрезания ткани.
  4. Запрограммируйте машину для обезвоживания в соответствии со стандартным протоколом обработки тканей.
  5. Подготовьте окрашивательную машину с помощью ванн для последовательного окрашивания в соответствии с инструкциями производителя машины.
  6. Настройте перфузионный аппарат.
    1. Используйте две пластиковые бутылки с солевым раствором, слейте физиологический раствор из нижнего отверстия и наполните их PBS и 4% фиксатором параформальдегида.
    2. Повесьте флаконы, соедините их с инфузионными наборами и прикрепите трехсторонний запорный кран к толстому игольчатому концу инфузионного набора.

4. Y-образный лабиринт и тестирование обучения/памяти

  1. Соберите Y-Maze
    1. Установите Y-образный лабиринт с тремя прямоугольными рукавами, обозначенными I, II и III, соединенными треугольным соединением (см. дополнительный рисунок S2).
    2. Поместите электрическую сетку с шагом 1 см на дно лабиринта.
    3. Прикрепите к стенам лабиринта тонкие медные полоски толщиной 2 см для имитации опасных участков и установите сигнальные лампы.
  2. Определение опасных и безопасных зон
    1. Электризуйте зоны I, II и III с напряжением 16 000 В/м для обозначения опасных зон (сигнальная лампочка загорается при электризации).
    2. Отметьте неэлектрифицированные регионы красным светом, чтобы обозначить безопасные зоны.
    3. Определите место соединения рук как небезопасную зону, где крыса может получить удар электрическим током.
  3. Порядок обучения
    1. В начале эксперимента рассматривайте зону, где находится крыса, как безопасную зону.
    2. Через 2-4 минуты подайте электричество в безопасную зону, поощряя крысу двигаться к безопасной зоне.
    3. Если крыса переместится из безопасной зоны в опасную зону, она вернется в безопасную зону под ударом током, проявляя пассивную реакцию избегания.
  4. Развитие активной реакции избегания
    1. После нескольких тренировок включите свет в безопасной зоне, не применяя электрошок.
    2. Наблюдайте за движением крысы к освещенной безопасной зоне, формируя условный рефлекс различения света и темноты (активная реакция избегания).
  5. Разместите Y-образный лабиринт в тускло освещенном и тихом месте, чтобы свести к минимуму внешние отвлекающие факторы.
  6. Проводите обучение ежедневно с 9:00 до 11:00 и с 14:00 до 16:00.
  7. Позвольте крысам свободно перемещаться по лабиринту в течение 5 минут до начала эксперимента, чтобы помочь им адаптироваться к среде лабиринта.
  8. Настройка параметров стимула
    1. Отрегулируйте напряжение стимула (16 000 В/м) во время тестирования, чтобы убедиться, что крысы убегут в течение 10 секунд после поражения электрическим током.
    2. Не выключайте сигнальную лампочку безопасной зоны в течение 15 секунд, затем выключите ее.
    3. Начинайте следующий раунд экспериментов с ударом через 45 секунд.
  9. Последовательность сигнальных ламп и правильный отклик
    1. Установите последовательность включения сигнальной лампы как I → II → III → I, в цикле.
    2. Определите правильную реакцию как побег крысы из стартовой зоны непосредственно в освещенную безопасную зону в течение 10 секунд после получения удара током.
  10. Предположим, что крыса достигла стандарта обучения, если она делает правильную реакцию убегания в 8 из 10 последовательных попыток.
  11. Записывайте любой побег в руку без света как неправильную реакцию.
  12. Многократные тренинги и тесты
    1. Проведите несколько сеансов обучения и тестирования для оценки обучения и памяти.
    2. Записывайте количество правильных и неправильных ответов в течение фиксированного числа попыток.
    3. Измените начальную область, чтобы увеличить сложность задачи.
  13. Оценивайте удержание памяти через определенные промежутки времени (например, через 24 или 48 часов после тренировки), чтобы оценить способность крыс сохранять память.

5. Иммуногистохимия

  1. Обезболивание крыс
    1. Введите внутрибрюшинную инъекцию 10% хлоралгидрата (0,4 мл/100 г) через 1 ч после тренировки для обезболивания крыс. Утилизируйте раствор хлоралгидрата в соответствии с местными нормами.
    2. Выполнить торакотомию для полного обнажения сердца31.
  2. Перфузируйте крыс под наркозом физиологическим раствором
    1. Введите иглу, содержащую PBS, в левый желудочек в направлении аорты, закрепите иглу гемостатическими щипцами и немедленно разрежьте правую ушную раковину мыши, чтобы выпустить венозную кровь.
    2. Быстро вводите PBS до тех пор, пока стоки не станут прозрачными, а печень и легкие не станут белыми.
    3. Затем следует быстрая, а затем медленная инфузия 500 мл 10% раствора формалина до тех пор, пока тело животного не станет жестким, достигая фиксации формалина.
    4. Утилизировать раствор формалина следует в соответствии с местными нормами.
  3. Удаление мозга
    1. Быстро вскройте череп32.
    2. Удалите весь мозг, аккуратно приподняв его над черепом и разрезав кровеносные сосуды и спинной мозг у основания, не повреждая полушария (как показано на дополнительном рисунке S3).
  4. Рассекаем гиппокамп
    1. Рассекаем двусторонний гиппокамп.
      1. В затылочном отверстии мыши разрежьте ножницами весь мозг.
      2. Осторожно вставьте ножницы по диагонали в большое затылочное отверстие, чтобы разрезать теменную кость.
      3. Подденьте обе стороны теменной кости с помощью кровоостанавливающих щипцов.
      4. С помощью ножниц перережьте зрительный нерв с одной стороны и прощупайте вниз к основанию черепа.
    2. Поместите гиппокамп в 10% раствор формалина на 12 ч.
    3. Погрузите образец в формалин, содержащий градиент сахарозы (10%, 20%, 30%).
    4. Держите в течение ночи при температуре 4°C, пока ткань образца не опустится на дно.
  5. Закладка и разрез образца
    1. Погрузите образец в парафин. Утилизировать раствор формалина следует в соответствии с местными нормами.
    2. Разрез закладного образца до 4 мкм.
  6. Депарафинизируйте и регидратируйте срезы
    1. Замочите срезы в 50 мл ксилола три раза для депарафинизации, каждый раз на 15 минут.
    2. Последовательно погрузить в 50 мл 100%, 90%, 70% и 50% этанола на 10 мин каждый.
    3. Промойте три раза 50 мл 0,01 мМ PBS в течение 3 мин каждый.
  7. Забор антигена
    1. Поместите срезы в 50 мл цитратного буфера (PBS, pH 6,0).
    2. Нагрейте секции в скороварке из нержавеющей стали до 120 °C. Поместите секции на решетку, полностью погрузив в буфер. Укупорьте плиту, нагрейте и выдержите под высоким давлением 3 минуты.
    3. Снимите плиту с огня и дайте ей естественным образом остыть при комнатной температуре, прежде чем открывать крышку.
    4. Промойте срезы в PBS (pH 7,2) в течение 2 минут, повторив 3 раза.
    5. Внесите примерно 100-200 мкл 3%H2O2 , чтобы покрыть сектгион на предметном стекле, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5-10 минут для устранения активности эндогенной пероксидазы.
    6. Смойте PBS в течение 2 мин, 3 раза.
  8. Первичная инкубация антител
    1. Добавьте 200 мкл первичных антител (разведенных 1:150 в 0,01 моль/л PBS) в срезы.
    2. Выдерживать в течение ночи при температуре 4°C.
  9. Вторичная инкубация антител
    1. Промойте срезы в PBS в течение 3 мин, 3 раза.
    2. Инкубируйте секции с примерно 100-200 мкл полимерного помощника, чтобы покрыть секцию на предметном стекле, и инкубируйте при 37 °C в течение 20 минут.
    3. Промойте срезы в 0,1 моль/л PBS в течение 2 мин, 3 раза.
    4. Добавьте примерно 100-200 μл полипероксидазы-анти-мыши/кролика IgG и инкубируйте при 37°C в течение 20 минут.
    5. Промойте срезы в PBS в течение 3 мин, 3 раза.
  10. Разработка цвета
    1. Добавьте примерно 100-200 мкл раствора диаминобензидина (DAB) (достаточно, чтобы покрыть разрез на предметном стекле) для проявления цвета.
    2. Дайте ему отреагировать примерно на 3 минуты.
  11. Противозаправка и монтаж
    1. Выполните противодействие, добавив примерно 100-200 мкл гематоксилина по каплям, чтобы полностью покрыть участок на каждом предметном стекле.
  12. Обезвоживаем и монтируем секции
    1. Обезвоживайте срезы в 50 мл 50%, 70%, 90% и 100% этанола в течение 10 мин каждый, а затем 50 мл ксилола в течение 10 мин.
    2. Очистите и смонтируйте секции с помощью стандартных процедур.
  13. Микроскопическое исследование
    1. Подсчитать количество p-CREB- и c-fos-положительных нейронов в гиппокампе каждой группы33,34.
    2. Рассмотрите срезы под микроскопом при 400-кратном увеличении.
    3. Запишите среднее количество положительных нейронов в каждом срезе, основываясь на подсчете трех участков на животное без перекрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные были собраны в компьютерной таблице. Все анализы проводились с использованием статистического программного обеспечения. Результаты были представлены в виде среднего ± стандартной погрешности среднего (SEM) и проанализированы с использованием одностороннего ANOVA с апостериорными тестами SNK-q и Dunnett T335. Критерий SNK-q обычно используется для поисковых исследований и подходит для попарных сравнений между несколькими выборочными средними. Он не опирается на заранее определенные гипотезы, что делает его идеальным для сравнения всех групповых средних36. Тест Даннетта T3 обычно используется для подтверждающих исследований с заранее определенными гипотезами. Он подходит для сравнения нескольких групп лечения с контрольной группой или для сравнения средств с особой профессиональной значимостью 35,37. Когда P-значение теста ANOVA составляло ≤ 0,05, были проведены попарные апостериорные тесты, чтобы определить, какие группы значительно отличаются от других. Двусторонние P-значения < 0,05 считались статистически значимыми.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя данные этого исследования в качестве иллюстративных примеров, мы продемонстрировали типы результатов, которые могут быть получены с помощью этой методологической основы, включая репрезентативные изображения иммуноокрашивания, а также поведенческие и молекулярные данные из различных групп. Акцент делается на представлении типичных или ожидаемых результатов, полученных с помощью этого подхода, а не на интерпретации их биологического значения.

Результаты тестов на обучение и пам...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании изучалось, как севофлуран влияет на память и модулирует экспрессию p-CREB и c-fos в нейронах гиппокампа через сигнальный путь NMDAR/p-CREB/c-fos у молодых крыс. Полученные результаты свидетельствуют о том, что севофлуран оказывал кратковременное (через 1 ч после тренировки, а не через 3 дня) негативное стимулирующее действие на способность к поддержанию памяти у молодых крыс, без влияния в зависимости от частоты приема (однократная доза или семь доз в течение 7 дней)....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы сообщают, что нет никаких конкурирующих интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Е Цзян и Гохуэй Ли разработали дизайн кабинета. Е Цзян и Лай Цзян собрали и проанализировали данные и подготовили рукопись. Е Цзян и Гохуэй Ли отредактировали рукопись. Все авторы рассмотрели и одобрили окончательный вариант рукописи для представления. Эта работа поддержана грантами Гохуэй Ли из Шанхайской программы Пуцзян (грант No 23PJD057).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>подопытные животные
Спрэг-Доули (SD) КрысыCharles River Laboratories (Пекин, Китай)Н/Д21 день, кобель
Стандартный крысиный чауKeao Xieli Feed (Пекин, Китай)Н/ДСтандартный рацион лабораторных животных
<сильно>Химикаты и реагенты
ХлоралгидратХимический реагент Sinopharm (Шанхай, Китай)80113818Анестетик для терминальной перфузии
Цитратный буфер (10x)ZSGB-BIO (Пекин, Китай)ЗЛИ-9064Раствор для извлечения антигена, pH 6,0
Этанол (100%)Химический реагент Sinopharm (Шанхай, Китай)100092683Обезвоживающее средство для гистологии
Раствор для окрашивания гематоксилиномBaso Diagnostics Inc. (Чжухай, Китай)БА-4041Противопятно для ИГХ
Перекись водорода (H2O2)Химический реагент Sinopharm (Шанхай, Китай)100112183% раствор для блокирования эндогенной пероксидазы
Нейтральный бальзаминSolarbio (Пекин, Китай)Г8590Монтажный носитель для слайдов
Азот (N<суб>2)Shanghai Medical Gas Co. (Шанхай, Китай)Н/ДВысокая чистота, для газовой смеси
Кислород (O2)Shanghai Medical Gas Co. (Шанхай, Китай)Н/ДМедицинский сорт, для газовой смеси
ПарафинLeica Biosystems (Нусслох, Германия)39601006Среда для встраивания тканей
Параформальдегид (PFA)Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)158127Фиксатор для перфузии и фиксации тканей
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Gibco (Уолтем, штат Массачусетс, США)7001104410x стоковый раствор, pH 7,4
СевофлуранAbbVie Inc. (Северный Чикаго, Иллинойс, США)Н/ДИнгаляционное обезболивающее средство
Содовая известьW. R. Grace and Co. (Колумбия, штат Мэриленд, США)22-01-0010CO2 абсорбент для ингаляционной камеры
Гидроксид натрия (NaOH)Химический реагент Sinopharm (Шанхай, Китай)10019818Используется для регулировки pH раствора PFA
СахарозаSangon Biotech (Шанхай, Китай)A502693Используется для криозащиты тканей головного мозга
КсилолХимический реагент Sinopharm (Шанхай, Китай)10023418Клиринговый агент для гистологии
<сильно>антитела и наборы
Антитела к c-FosAbcam (Кембридж, Великобритания)АБ190289Кролик против мыши, первичное антитело
DAB Chromogen KitZSGB-BIO (Пекин, Китай)ЗЛИ-9018Подложка для разработки цвета HRP
Антитела к p-CREB (Ser133)Технология клеточной сигнализации (Данверс, Массачусетс, США)9198Кролик против мыши, первичное антитело
Набор для обнаружения полимерной HRPZSGB-BIO (Пекин, Китай)ПВ-9000Вторичные антитела и система обнаружения ИГХ
<сильный>Оборудование
Аппарат для анестезииRWD Life Science (Шэньчжэнь, Китай)Р500Для контролируемой подачи газовой смеси
Автоматизированный тканевый процессорLeica Biosystems (Нусслох, Германия)ASP6025Для автоматического обезвоживания и очистки
Криостат/МикротомLeica Biosystems (Нусслох, Германия)КМ1950Для среза замороженной/внедренной мозговой ткани
Система микроскопаOlympus (Токио, Япония)БХ53Для визуализации предметных стекол ИГХ
Перфузионный насосLong Precision Pump Co. (Баодин, Китай)БТ100-2ДжПеристальтический насос для транскардиальной перфузии
Севофлуран ВапорайзерRWD Life Science (Шэньчжэнь, Китай)Р510ПСДля точного контроля концентрации севофлурана
Аппарат Y-образного лабиринтаMed Associates Inc. (Сент-Олбанс, Вермонт, США)MED-VFC-S-YС электрической сетью и освещением для активного предотвращения
Software
ГрафПад ПризмаПрограммное обеспечение GraphPad (Сан-Диего, Калифорния, США)Версия 9Статистический анализ и визуализация данных
ИзображениеJНациональные институты здравоохранения (Бетесда, штат Мэриленд, США)Версия 1.53Программное обеспечение для анализа изображений для подсчета клеток
Майкрософт ExcelКорпорация Microsoft (Редмонд, штат Вашингтон, США)Офис 365Программное обеспечение для работы с электронными таблицами для компиляции данных

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hadders-Algra, M. The developing brain: challenges and opportunities to promote school readiness in young children at risk of neurodevelopmental disorders in low- and middle-income countries. Front Pediatr. 10, 989518(2022).
  2. Pfeifer, J. H., Allen, N. B., Byrne, M. L., Mills, K. L. Modeling developmental change: contemporary approaches to key methodological challenges in developmental neuroimaging. Dev Cogn Neurosci. 33, 1-4 (2018).
  3. Pezzoli, P., et al. Challenges and solutions to the measurement of neurocognitive mechanisms in developmental settings. Biol Psychiatry Cogn Neurosci Neuroimaging. 8 (8), 815-821 (2023).
  4. Risgaard, K. A., Sorci, I. A., Mohan, S., Bhattacharyya, A. Meta-analysis of Down syndrome cortical development reveals underdeveloped state of the science. Front Cell Neurosci. 16, 915272(2022).
  5. Caporusso, E., et al. Current limitations in technology-based cognitive assessment for severe mental illnesses: a focus on feasibility, reliability, and ecological validity. Front Behav Neurosci. 19, 1543005(2025).
  6. Kasari, C., Brady, N., Lord, C., Tager-Flusberg, H. Assessing the minimally verbal school-aged child with autism spectrum disorder. Autism Res. 6 (6), 479-493 (2013).
  7. Hilton, M. T. Methodological challenges faced by researchers studying early neurodevelopmental outcomes in majority settings. Cambridge J Human Behav. 1 (2), 106-114 (2023).
  8. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20 (11), 1434-1447 (2017).
  9. Lee, J. H., Zhang, J., Wei, L., Yu, S. P. Neurodevelopmental implications of the general anesthesia in neonate and infants. Exp Neurol. 272, 50-60 (2015).
  10. Keunen, K., Sperna Weiland, N. H., de Bakker, B. S., de Vries, L. S., Stevens, M. F. Impact of surgery and anesthesia during early brain development: a perfect storm. Paediatr Anaesth. 32 (6), 697-705 (2022).
  11. McCann, M. E., et al. Neurodevelopmental outcome at 5 years of age after general anaesthesia or awake-regional anaesthesia in infancy (GAS): an international, multicentre, randomised, controlled equivalence trial. Lancet. 393 (10172), 664-677 (2019).
  12. Han, F. F., et al. Predictors and occurrence of postoperative cognitive dysfunction in children undergoing noncardiac surgery: a prospective cohort study. iBrain. 9 (2), 148-156 (2023).
  13. Chung, W., et al. Sevoflurane exposure during the neonatal period induces long-term memory impairment but not autism-like behaviors. Paediatr Anaesth. 25 (10), 1033-1045 (2015).
  14. Apai, C., Shah, R., Tran, K., Pandya Shah, S. Anesthesia and the developing brain: a review of sevoflurane-induced neurotoxicity in pediatric populations. Clin Ther. 43 (4), 762-778 (2021).
  15. Arefayne, N. R., Berhe, Y. W., van Zundert, A. A. Incidence and factors related to prolonged postoperative cognitive decline (POCD) in elderly patients following surgery and anaesthesia: a systematic review. J Multidiscip Healthc. 16, 3405-3413 (2023).
  16. Malik, A. R., Willnow, T. E. Excitatory amino acid transporters in physiology and disorders of the central nervous system. Int J Mol Sci. 20 (22), 5671(2019).
  17. Albarracin, S. L., Baldeon, M. E., Sangronis, E., Petruschina, A. C., Reyes, F. G. R. L-glutamate: a key amino acid for sensory and metabolic functions. Arch Latinoam Nutr. 66 (2), 101-112 (2016).
  18. Vyklicky, V., et al. function, and pharmacology of NMDA receptor channels. Physiol Res. 63 (Suppl 1), S191-S203 (2014).
  19. Zorumski, C. F., Izumi, Y. NMDA receptors and metaplasticity: mechanisms and possible roles in neuropsychiatric disorders. Neurosci Biobehav Rev. 36 (3), 989-1000 (2012).
  20. Lau, C. G., et al. Regulation of NMDA receptor Ca2+ signalling and synaptic plasticity. Biochem Soc Trans. 37 (Pt 6), 1369-1374 (2009).
  21. Bye, C. M., McDonald, R. J. A specific role of hippocampal NMDA receptors and Arc protein in rapid encoding of novel environmental representations and a more general long-term consolidation function. Front Behav Neurosci. 13 (8), (2019).
  22. Callaway, J. K., Jones, N. C., Royse, A. G., Royse, C. F. Sevoflurane anesthesia does not impair acquisition learning or memory in the Morris water maze in young adult and aged rats. Anesthesiology. 117 (5), 1091-1101 (2012).
  23. Li, R., et al. Sevoflurane exposure in the developing brain induces hyperactivity, anxiety-free, and enhancement of memory consolidation in mice. Front Aging Neurosci. 14, 934230(2022).
  24. Yuan, I., Xu, T., Kurth, C. D. Using electroencephalography (EEG) to guide propofol and sevoflurane dosing in pediatric anesthesia. Anesthesiol Clin. 38 (3), 709-725 (2020).
  25. Schinelli, S., et al. Stimulation of endothelin B receptors in astrocytes induces cAMP response element-binding protein phosphorylation and c-Fos expression via multiple mitogen-activated protein kinase signaling pathways. J Neurosci. 21 (22), 8842-8853 (2001).
  26. Florian, C., Mons, N., Roullet, P. CREB antisense oligodeoxynucleotide administration into the dorsal hippocampal CA3 region impairs long- but not short-term spatial memory in mice. Learn Mem. 13 (4), 465-472 (2006).
  27. Cabrera, O. H., Useinovic, N., Jevtovic-Todorovic, V. Neonatal anesthesia and dysregulation of the epigenome. Biol Reprod. 105 (3), 720-734 (2021).
  28. Arellano, J. I., Duque, A., Rakic, P. A coming-of-age story: adult neurogenesis or adolescent neurogenesis in rodents. Front Neurosci. 18, 1383728(2024).
  29. Borsini, A., Giacobbe, J., Mandal, G., Boldrini, M. Acute and long-term effects of adolescence stress exposure on rodent adult hippocampal neurogenesis, cognition, and behaviour. Mol Psychiatry. 28 (10), 4124-4137 (2023).
  30. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The Y-maze for assessment of spatial working and reference memory in mice. Methods Mol Biol. 1916, 105-111 (2019).
  31. Ordodi, V. L., Paunescu, V., Mic, F. A. Optimal access to the rat heart by transverse bilateral thoracotomy with double ligature of the internal thoracic arteries. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 44-46 (2008).
  32. Aboghazleh, R., et al. Rodent brain extraction and dissection: a comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
  33. Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue: a review. Diagn Pathol. 9, 221(2014).
  34. Diem, K., et al. Image analysis for accurately counting CD4+ and CD8+ T cells in human tissue. J Virol Methods. 222, 117-121 (2015).
  35. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean J Anesthesiol. 71 (5), 353-360 (2018).
  36. Shaffer, J. P. Controlling the false discovery rate with constraints: the Newman-Keuls test revisited. Biom J. 49 (1), 136-143 (2007).
  37. Liu, W. Some results on step-up tests for comparing treatments with a control in unbalanced one-way layouts. Biometrics. 53 (4), 1508-1512 (1997).
  38. Steven, A., et al. What turns CREB on? And off? And why does it matter. Cell Mol Life Sci. 77 (20), 4049-4067 (2020).
  39. Naqvi, S., Martin, K. J., Arthur, J. S. CREB phosphorylation at Ser133 regulates transcription via distinct mechanisms downstream of cAMP and MAPK signalling. Biochem J. 458 (3), 469-479 (2014).
  40. Brosnan, R. J., Thiesen, R. Increased NMDA receptor inhibition at an increased sevoflurane MAC. BMC Anesthesiol. 12, 9(2012).
  41. Wang, H., Peng, R. Y. Basic roles of key molecules connected with NMDAR signaling pathway on regulating learning and memory and synaptic plasticity. Mil Med Res. 3 (1), 26(2016).
  42. Chen, B. S., Roche, K. W. Regulation of NMDA receptors by phosphorylation. Neuropharmacology. 53 (3), 362-368 (2007).
  43. Brightwell, J. J., Smith, C. A., Neve, R. L., Colombo, P. J. Transfection of mutant CREB in the striatum, but not the hippocampus, impairs long-term memory for response learning. Neurobiol Learn Mem. 89 (1), 27-35 (2008).
  44. Colombo, P. J., Brightwell, J. J., Countryman, R. A. Cognitive strategy-specific increases in phosphorylated cAMP response element-binding protein and c-Fos in the hippocampus and dorsal striatum. J Neurosci. 23 (8), 3547-3554 (2003).
  45. Kida, S. A functional role for CREB as a positive regulator of memory formation and LTP. Exp Neurobiol. 21 (4), 136-140 (2012).
  46. Liu, Z., et al. Long-term sevoflurane exposure resulted in temporary rather than lasting cognitive impairment in Drosophila. Behav Brain Res. 442, 114327(2023).
  47. Wei, W., et al. Biomechanical effect of proximal multifidus injury on adjacent segments during posterior lumbar interbody fusion: a finite element study. BMC Musculoskelet Disord. 24 (1), 521(2023).
  48. Giza, C. C., Maria, N. S., Hovda, D. A. N-methyl-D-aspartate receptor subunit changes after traumatic injury to the developing brain. J Neurotrauma. 23 (6), 950-961 (2006).
  49. Jia, M., et al. Role of histone acetylation in long-term neurobehavioral effects of neonatal exposure to sevoflurane in rats. Neurobiol Dis. 91, 209-220 (2016).
  50. Tang, X., et al. Resveratrol mitigates sevoflurane-induced neurotoxicity by the SIRT1-dependent regulation of BDNF expression in developing mice. Oxid Med Cell Longev. 2020, 9018624(2020).
  51. Gao, H., et al. Effects of intravenous anesthetics on the phosphorylation of cAMP response element-binding protein in hippocampal slices of adult mice. Mol Med Rep. 18 (1), 627-633 (2018).
  52. Allen, T. A., Fortin, N. J. The evolution of episodic memory. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (Suppl 2), 10379-10386 (2013).
  53. Bucci, D. J., Robinson, S. Toward a conceptualization of retrohippocampal contributions to learning and memory. Neurobiol Learn Mem. 116, 197-207 (2014).
  54. Cherubini, E., Miles, R. The CA3 region of the hippocampus: how is it? what is it for? how does it do it. Front Cell Neurosci. 9, 19(2015).
  55. Lehr, A. B., et al. Ca2+ beyond social memory: evidence for a fundamental role in hippocampal information processing. Neurosci Biobehav Rev. 126, 398-412 (2021).
  56. Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
  57. Benke, T. A., Luthi, A., Isaac, J. T., Collingridge, G. L. Modulation of AMPA receptor unitary conductance by synaptic activity. Nature. 393 (6687), 793-797 (1998).
  58. Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105 (3), 331-343 (2001).
  59. Benke, T. A., et al. Mathematical modelling of non-stationary fluctuation analysis for studying channel properties of synaptic AMPA receptors. J Physiol. 537 (Pt 2), 407-420 (2001).
  60. Poncer, J. C., Esteban, J. A., Malinow, R. Multiple mechanisms for the potentiation of AMPA receptor-mediated transmission by alpha-Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Neurosci. 22 (11), 4406-4411 (2002).
  61. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR J. 55 (2), 310-332 (2014).
  62. Macheda, T., Snider, H. C., Watson, J. B., Roberts, K. N., Bachstetter, A. D. An active avoidance behavioral paradigm for use in a mild closed head model of traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 343, 108831(2020).
  63. Shang, M., et al. Moderate white light exposure enhanced spatial memory retrieval by activating a central amygdala-involved circuit in mice. Commun Biol. 6 (1), 414(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Sevoflurane AnesthesiaJuvenile RatsLearning And MemoryHippocampal Neuronsp CREB Expressionc fos ExpressionY Maze TestImmunohistochemistryNMDAR SignalingCognitive Impairment

Похожие статьи