Методическая статья

Экспансионная микроскопия: высокоразрешающая флуоресцентная визуализация с использованием обычного микроскопа

DOI:

10.3791/68595

⸱

19 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Bordeaux, CNRS, MFP, iMet UMR 5234, 2Université Claude Bernard Lyon 1, MeLiS-UCBL-CNRS UMR 5284-INSERM U1314, 3University of Bordeaux, CNRS, MFP, ProParaCyto UMR 5234

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем подробный протокол, сочетающий методы криофиксации и экспансионной микроскопии (Cryo-ExM), позволяющий проводить высококачественную визуализацию с сохранением структуры, адаптированной к различным биологическим образцам. Биологические образцы замораживаются, помещаются в разбухаемый полимер, денатурируются, расширяются и иммуномаркированы, что позволяет осуществлять сверхразрешающую визуализацию с помощью стандартных световых микроскопов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспансионная микроскопия (ExM) — это инновационный метод сверхразрешающей флуоресцентной микроскопии, которая физически увеличивает биологические образцы, позволяя проводить визуализацию за пределами дифракционного предела с помощью традиционных систем, таких как конфокальные микроскопы. Встраивая образцы в разбухающуюся гидрогельную матрицу, ExM позволяет изотропному расширению образца, повышая пространственное разрешение без необходимости специального оборудования для наноскопии. Продвинутые варианты, такие как ультраструктурная экспансионная микроскопия (U-ExM), сохраняют тонкие клеточные детали, включая органеллы и макромолекулярные сборки.

Наблюдение определённых клеточных структур или органелл существенно зависит от метода фиксации, применяемого к образцу, в частности с помощью химических сшивателей на основе альдегида и белкового осадки холодным метанолом. В последнее время интеграция криофиксации — золотого стандарта фиксации — с методом U-ExM позволила проводить наномасштабные наблюдения широкого спектра биологических образцов — от культивированных клеток млекопитающих до целых организмов — в их близко-родном виде. Экспансионная микроскопия — мощный инструмент для изучения биологических структур на разных масштабах — от изолированных органелл до целых тканей. В сочетании с криофиксацией она даёт беспрецедентные знания о клеточной архитектуре и динамических процессах, минимизируя артефакты, связанные с традиционными методами фиксации. Эти разработки позиционируют ExM как универсальную платформу для высокоразрешающей, почти родной биологической визуализации.

В настоящем исследовании изложен подробный протокол криофиксации в сочетании с расширенной микроскопией образцов различных источников. Этот протокол выделяет ключевые этапы, включая фиксацию образца, формирование, расширение полимера, иммунокрашивку и визуализацию, предоставляя необходимые рекомендации для внедрения этого метода в любой лаборатории.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопия играет ключевую роль в биологических исследованиях, позволяя визуализировать ультраструктуру и организацию живых систем на беспрецедентных масштабах — от целых организмов до отдельных молекул. Область микроскопии включает две отдельные системы: электронную микроскопию (ЭМ) — высокорешительную, но с ограниченной возможностью для специфического маркировки, и световую микроскопию, позволяющую точно и специфически визуализировать субклеточную структуру, но с ограниченным разрешением из-за предела дифракционного значения света. Хотя сверхразрешающая флуоресцентная микроскопия (SRM) стала мощным методом субдифракционной флуоресцентной визуализации клеток, визуализация ультраструктурных деталей макромолекулярных сборок, таких как целые организмы, остаётсясложной задачей 1. Кроме того, методы SRM, достигающие разрешения от 10 до 120 нм, зависят от современных микроскопов и алгоритмов реконструкции изображений и требуют экспертизы и специализированных микроскопов, что ограничивает их доступ для многих биологических лабораторий. Появляющийся метод сверхразрешения — расширяющая микроскопия (ExM) — преодолел эти ограничения. Разработанная в лаборатории Эдварда С. Бойдена десять лет назад, ExM — это инновационная фотонная микроскопическая технология, ныне считающаяся сверхразрешающей микроскопией, позволяющей проводить визуализацию без использования специализированныхмикроскопов 2. Вместо использования сложных технологий визуализации, ExM предполагает встраивание биологических образцов в разбухаемый полимер, который изотропно расширяется. Это физическое расширение увеличивает размер образцы в четыре раза и более, повышая разрешение и позволяя наблюдать с помощью обычных световых микроскопов. Изначально разработанные в срезах мозга, протоколы ExM эволюционировали для улучшения разрешения и упрощения процедур. Эта техника была успешно адаптирована для различных биологических образцов, включая эукариотические клетки, одноклеточные организмы, паразитов, ткани и целые организмы, демонстрируя своюуниверсальность 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15.

В настоящее время существуют два основных класса протоколов:до-расширение 2,16 и пост-расширение17,18, которые относятся к моменту окрашивания биологического образца — либо до, либо после процедуры расширения. В этой статье будет акцент конкретно на протоколе после расширения, при котором иммуномаркировка выполняется после денатурации и расширения образца.

В этом протоколе биологические образцы крио- или химически фиксируются и инкубируются химическими агентами, что позволяет белку закрепляться на будущем полимере. Образцы затем помещаются в набухающий полимер, состоящий из акриламида/бис-акриламида (широко используемого в электрофорезных гелях) и акрилата натрия (способствующего расширению). Добавление воды запускает расширение геля, увеличивая расстояние между белками пропорционально расширению геля. Интересующие белки затем маркируются непосредственно внутри геля с помощью специфических антител (рисунок 1).

Все вышеупомянутые методы визуализации, включая электронную микроскопию, фотонную микроскопию, микроскопию сверхразрешения и ExM, требуют фиксации биологического образца. Фиксация на основе альдегида создаёт перекрёстное сцепление между белками, поддерживая клеточную организацию во время обработки, необходимой для фотонной или электронной микроскопии. Однако фиксация также может привести к артефактам и морфологическим изменениям в клетке, которые могут быть тонкими в классической световой микроскопии, но становятся всё более заметными с развитием SRM, заставляя учёных пересмотреть последствия методовфиксации 19. Один из способов обойти артефакты, связанные с фиксацией, — использовать живую микроскопию, которая позволяет динамично визуализировать клеточные структуры в их близком к родном состоянии. Однако живая микроскопия имеет ряд недостатков, в частности необходимость экспрессии трансгенов, которая может влиять на физиологию клеток и изменять поведение белков по сравнению с эндогенными аналогами. Кроме того, живая микроскопия обычно обеспечивает более низкое разрешение, чем фиксированная, и ограниченное количество вариантов маркировки, так как флуоресцентные метки должны быть нетоксичными и стабильными в живых условиях, что ограничивает количество доступных маркеров. Область электронной микроскопии, благодаря высокому разрешению, значительно способствовала разработке оптимальных методов фиксации субклеточных или макромолекулярных структур при сохранении их естественного состояния. Десятилетия назад криофиксация была разработана лабораториями Дюбоше, Фрэнка и Хендерсона, включая быструю фиксацию клетки в стекловидной воде и демонстрируя, что это единственный способ сохранения нативнойультраструктуры 20,21. В то время как очищенные молекулы можно наблюдать непосредственно в стекловидном льду с помощью криоэлектронной микроскопии, клетки необходимо вложить в смолу и разделить перед наблюдением. Для дальнейшей стабилизации образцов в максимально естественном состоянии образцы подвергаются замороженной замещению. В этом процессе, когда молекулы льда возвращаются в жидкое состояние, они мгновенно заменяются ацетоном, который имеет более высокий коэффициент диффузии, чем вода. Во время удаления воды интересующие молекулы могут агрегироваться и коллапсировать, подобно тому, что происходит при фиксации химического сшивания. Для ограничения этой агрегации замерзание проводится при низких температурах, уменьшая агрегацию за счёт увеличения внутриклеточнойвязкости 22. Этот контролируемый подход ограничивает образование крупных агрегатов и сохраняет клеточную ультраструктуру ближе к её естественному состоянию.

В 2022 году растущие доказательства того, что химическая фиксация вводит артефакты, в сочетании с достижениями в экспансионной микроскопии, побудили лабораторию Guichard/Hamel разработать метод, интегрирующий криофиксацию с экспансионной микроскопией, известный как 'Cryo-ExM'23. Этот подход использует сильные стороны обеих методов, сохраняя биологические структуры с минимальными искажениями. Образцы крио-замораживаются с помощью заморозки под высоким давлением или ручного погружения, что требует специализированного оборудования, обычно используемого в лабораториях электронной микроскопии или в керновых лабораториях.

В этой статье изложен пошаговый протокол для проведения криофиксации с последующей экспансионной микроскопией и представлены репрезентативные результаты двух экспериментальных моделей: культивируемых человеком клеток и одноклеточного паразита Trypanosoma brucei, вызывающего сонную болезнь. Мы подчеркнум улучшения, которые предлагает криофиксация по сравнению с традиционными методами фиксации, и выделим наиболее распространённые подводные камни и артефакты фиксации, связанные с этой техникой.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов. Этот протокол адаптирован с незначительными изменениями для наблюдения различных клеточных процессов в различных биологических образцах (включаядрожжи 24,25, Toxoplasma gondii26, близкорственные виды животных27, зелёныеводоросли 28,29, микробных эукариотов30, а также образцымышей 23 ичеловеческие образцы 23,31,32,33 ). Изменения для адаптации протокола к этим разным образцам не упоминаются в этой статье, так как их можно получить из оригинальных публикаций. Здесь клетки RPE1 и Trypanosoma brucei используются как прокси для клеток млекопитающих и паразитов. Этот протокол акцентирует внимание на этапах фиксации и расширения биологических образцов; Поэтому информация о культуре выборки не представлена в этой статье.

1. Подготовка бульонного раствора

  1. Полилизиновый раствор
    1. Ресуспензировать поли-L или поли-D-лизингидробромид (таблица материалов) в воде для получения стандартного раствора полилизина при концентрации 1 мг/мл. Храните этот раствор при -20 °C и дополнительно разбавляйте его в воде с концентрацией 0,2 мг/мл для покрытия покрытий (Таблица 1, Таблица материалов).
  2. Анкерное решение
    1. Приготовьте свежий раствор акриламида/формальдегида (под химическим капюшоном), смешивая 38 мкл формальдегида (36,5%–38%; Таблица материалов) и 50 мкл акриламида (40%, Таблица материалов) в 912 мкл PBS для получения 1 мл раствора.
  3. Раствор гелирования без APS (инициатор)
    1. Приготовьте смесь, добавив 500 мкл 38% акрилата натрия (19% финала), 250 мкл 40% акриламида (10% финала), 50 мкл 2% бисакриламида (0,1% финала), 50 мкл TEMED (0,5% финала) и 100 мкл 10x PBS (1x финал). Аликвот по объёму, подходящим для максимум 2 гелей (80-90 мкл), и храните при -20 °C не менее 12 часов перед использованием (см. таблицу 1 для долгосрочного сохранения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что объём, указанный для приготовления смеси раствора гелирования, рассчитывается для получения конечного объёма 1 мл, но фактический объём раствора составляет 950 мкл, так как APS, что составляет 1/20 от общего объёма каждого, добавляется экспромторанно. Первоначальное время хранения раствора длягелирования 17 было увеличено после того, как мы обнаружили, что его можно сохранять до 1 месяца при -20 °C без ущерба для плотности геля или эффективности расширения.
  4. TEMED и APS
    1. APS 10% в/в: разбавьте порошок APS в воде, аликвотируйте и храните при -20 °C.
    2. TEMED 10% v/v: разбавьте TEMED в воде, аликвот и храните при -20 °C.
  5. Акрилат натрия (SA) 38%
    1. Приготовьте 38% SA из очищенного SA (AK scientific или Sigma; Таблица материалов)
      1. Суспензировать 38 г акрилата натрия в 100 мл воды при постоянном помешивании (важно). Постепенно добавляйте SA, чтобы избежать заполнителей, и перемешивайте ночью при 4 °C для полного восстановления. Убедитесь, что раствор полупрозрачный, бесцветный или слегка жёлтый. Аликвот и хранить при 4 °C до 1 года.
    2. Приготовьте 38% SA из акриловой кислоты (Sigma; Таблица материалов)
      1. Подготовьте 90 мл акрилата натрия 38%, нейтрализируя акриловую кислоту с NaOH под химическим капюшоном.
      2. Смешайте 29 мл воды с 25 мл акриловой кислоты во время помешивания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: С этого этапа реакция должна проводиться на льду с постоянным контролем pH и температуры, так как реакция экзотермична.
      3. Добавляйте 10 Н NaOH капель за каплей с помощью пипета Pasteur.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что температура не превышает 25 °C (если превышает, прекратите добавление NaOH и дождитесь, пока температура остынет).
      4. Продолжайте нейтрализацию до уровня pH 7-8 и перемешивайте 1 час на льду.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если pH внезапно поднялся выше 10, добавьте акриловую кислоту, пока pH не снизится до 7-8.
      5. Храните раствор в закрытом контейнере на ночь. Если раствор уже осажен, центрифугуйте при 1000 × г в течение 10 минут. Соберите супернатант, аликвот, и храните их при -20 °C.
  6. Решение для денатурации
    1. TrisBase 1 M: разбавьте 121,14 г TrisBase в 1 л воды, скорректируйте pH с HCl до 9 и храните в RT.
    2. Буфер для денатурации: смешать 200 мМ натрия додецилсульфата (SDS), 200 мМ NaCl, 50 мМ TrisBase в воде. Для раствора объёмом 200 мл добавьте 10 мл Tris-BASE 1 M (pH 9) в 124,9 мл ddH2O, добавьте 57,1 мл SDS (20%/700 мМ) и 8 мл NaCl (5 млн бульон) при перемешивании. Магазин в RT (Таблица 1).

2. Процедура криофиксации и расширения

  1. Подготовка образца и криофиксация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для образцов, выращиваемых или загруженных на 12-мм накладных склейках. Пожалуйста, пересмотрите объём решения для другой поддержки.
    1. Подготовка образца
      1. Выращивать образец в условиях, адаптированных к биологическому образцу, либо непосредственно на 12-мм коверслипах (клетках, прилипких к млекопитающим), либо в суспензии (T. brucei).
      2. Загрузите образец на заранее покрытый полилизином (T. brucei) следующим образом: кратко инкубировать 12 мм коверсли в полилизине (0,2 мг/мл) в течение 1 часа при 37 °C, быстро промыть и высушить на воздухе.
      3. Центрифугуйте паразитов при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре (RT). Повторная суспензия в PBS, дополненная 10% культурной среды, и загрузите на укрывающие слипы за 5-10 минут до криофиксации.
    2. Настройка погружения (рисунок 2A-C)
      ВНИМАНИЕ: Работайте под химическим капюшоном в перчатках и лабораторном халате при манипуляции с ацетоном. Используйте лабораторный халат и очки при работе с жидким азотом и жидким этаном.
      1. Под химической вытяжкой заполните 5 мл трубок (1 капель/трубку) 1 мл сверхсухого ацетона с помощью шприца и игли, чтобы избежать загрязнения воздуха.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего сохранения биологической мембраны необходимо добавить параформальдегид (PFA)/глутаральдегида (GA) (0,1/0,02 %). Адаптируйте трубку под диаметр защитного механизма (накладки > 12 мм не помещаются в трубки объёмом 5 мл).
      2. Заморозьте трубки в жидком азоте с помощью пластиковой или металлической стойки, устойчивой к холодным температурам, чтобы они оставались вертикально.
      3. Заполните половину полистиролового ящика (стенки толщиной 30 см x 30 см) сухим льдом.
      4. Заполните дьюар типа Vitrobot жидким азотом, пока он не прекратит испарение, и подождите 10-15 минут стабилизации температуры. Использование паука необходимо для облегчения охлаждения системы (рисунок 2B, звездочка). Если потребуется, добавьте добавку.
      5. Снимите паука и заполните металлическую камеру жидким этаном.
      6. Подождите 10 минут, пока этан не уравновесится.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости наполняйте систему погружения жидким этаном во время эксперимента (паук больше не используйте). Переход от газообразного к жидкому этану сложен. Использование соответствующего давления критически важно для образования жидкого этана. Высокое давление предотвращает образование жидкости при постоянном переполнении газа в металлической камере, тогда как низкое давление образует твёрдый этан внутри металлической камеры и наполняющей трубки. Избегание образования льда крайне важно для эксперимента. Поддержание наконечника на границе жидкости и воздуха помогает предотвратить образование твёрдого этана.
    3. Погружение (рисунок 2A–C)
      ВНИМАНИЕ: Используйте лабораторный халат и очки при работе с жидким азотом и жидким этаном.
      1. Возьмите 12-мм защитный шлейф с тонким пинцетом.
      2. Впитывайте лишний материал с помощью бумаги.
      3. Держите защитное кольцо на полпути пинцетом с помощью зажимного кольца, адаптированного к крио-вантузу.
      4. Положите пинцет, удерживающий укрытие, в держатель крио-вантуза. Промокните остатки материала бумагой Whatman.
      5. Активируйте крио-плунжер, чтобы погрузить коверслип в этановый раствор в металлической камере.
      6. Быстро переложите накладку в трубку с замороженным ацетоном (1 коверслип/трубка).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте один и тот же пинцет для сбора образцов и для погружения, чтобы избежать загрязнения культурной средой. Будьте особенно осторожны, если используете защитные слои > 12 мм (чехлы диаметром 15 или 18 мм подходят к носителю, но их может быть сложнее погрузить). На этом этапе после погружения можно погрузить накладку в жидкий азот, чтобы облегчить перенос в Эппендорф, сохраняя образец замороженным. Поскольку ацетон замерзает при -96 °C, для замораживания необходимо размещать замороженные ацетоны на замороженный ацетон.
    4. Заморозка и регидратация
      ВНИМАНИЕ: Работайте под капотом при манипуляции образцами во время замерзания. Повышение температуры создаёт давление внутри трубки, что может вызвать взрыв трубки.
      1. Инкубировать трубки в сухом льде с углом наклона (примерно 45°).
      2. Перемешивать ночью на орбитальном шейкере. Поставьте закрытую коробку на шейкер при температуре 4 °C или RT, чтобы температура поднялась с -180 °C до -80 °C.
      3. Удалите большую часть сухого льда из коробки (просто оставьте несколько на дне), спустите давление в трубки, быстро открывая и закрывая их, и продолжайте перемешивать 45 минут на орбитальном шейкере, чтобы температура продолжала подниматься от -80 °C до -20 °C.
      4. Перенесите покрытия на 12-ядровую пластину (или любую удобную ёмкость), содержащую предварительно охлаждённый чистый этанол (100%). Инкубировать в течение 5 минут и постепенно регидратировать следующим образом: EtOH 100% (5 мин) - EtOH 95% (3 мин) - EtOH 95% (3 мин) - EtOH 70% (3 мин) - EtOH 50% (3 мин) - EtOH 25% (3 мин) - H20 100%.
      5. Перенесите накладки на PBS и ориентируйте их под микроскопом (царапая поверхность наконечником), чтобы все были направлены вверх.
        ПРИМЕЧАНИЕ: EtOH 100% и 95% хранятся при -20 °C, EtOH 70% и EtOH 50% при 4 °C, а EtOH 25% и ddH2°O при RT для дальнейшего повышения температуры до RT. Для маркировки мембран необходимо добавить PFA/GA (0,1%/0,02%) в растворах ацетона и регидратации, за исключениемddH 2O.
  2. Расширение
    1. Белоковое закрепление
      1. Приготовьте свежий раствор 1,4% формальдегида/2% акриламида (FA/AA) в PBS 1 раз.
      2. Поместите крышки в пластину 4/12, заполненную 0,5/1 мл AA/FA.
      3. Инкубировать 3-5 часов при 37 °C без перемешивания.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид связывает свободные аминные группы белков с акриламидом. Избыток акриламида помогает ограничить перекрёстное сцепление белков, обычно индуцируемое формальдегидом, и закрепляет белки на будущем полимере расширения. В зависимости от биологического образца может потребоваться удлинение пошагового удлинения белка на ночь. В любом случае, более длительная инкубация не повлияет на ни один из следующих шагов. Заполните свободные колодцы водой или поместите их в влажную камеру, чтобы избежать испарения.
    2. Желирование
      1. Размораживание, APS (10%) и раствор для гелирования (акрилат натрия 19%, акриламид 10%, бисакриламид 0,1%, TEMED 0,5% разбавленный в 10x PBS) на льду за 10 минут до гелирования.
      2. Подготовьте влажную камеру с тонким слоем влажной ткани и парапленки, затем храните при 4 °C в течение 10 минут.
      3. Поставьте влажную камеру на лёд.
      4. Вынимите коверслики из раствора для закрепления белка и удалите лишний раствор с помощью папиросной бумаги (2 раза подряд).
      5. Добавьте APS (конечная концентрация 0,5%) в раствор гелирования, создайте вихрь в течение 2-3 секунд и заполните 2 капли по 35 мкл на парапленку влажной камеры.
      6. Покройте каждую каплю накрытием, чтобы клетки были обращены к раствору гелирования.
      7. Инкубировать на льду в течение 5 минут, чтобы гель проник.
      8. Инкубировать при 37 °C в течение 30-60 минут.
    3. Денатурация
      1. Пробуйте гель биопсийным инструментом (диаметром 0,4 см, рисунок 2D) и перемешайте в течение 10-15 минут в пластине на 6 лунок с 1 мл денатурационного буфера, пока гели не отсоединятся от накладок.
      2. Переместите гель в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл, заполненную свежим буфером для денатурации.
      3. Инкубировать 1 час 30 минут при 95 °C.
      4. Переведите гель вddH 2O на 10 минут и повторите 3 раза, чтобы правильно промыть буфер денатурации.
      5. Измерьте гель миллиметровой бумагой или суппортом для оценки коэффициента расширения геля.
      6. Перенесите гель в PBS для иммунного окрашивания.
      7. В качестве альтернативы храните гели в PBS-азиде 0,02% при 4 °C в течение короткого времени (Таблица 1) или при -20°C для длительного хранения (Таблица 1). Для длительного хранения гели необходимо инкубировать в нескольких ваннах воды: раствор глицерина 50% на 2-3 часа под перемешиванием и помещать при -20 °C в достаточном объёме раствора, который необходимо адаптировать под размер геля.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Гель можно сохранять целым, если это предпочтительно (рисунок 2D, E) (шаг 2.2.3.1). В одну трубку можно собрать до 5 пуансов (эквивалент целого геля) (шаг 2.2.3.2). Температура и время денатурации должны соблюдаться (шаг 2.2.3.3). Высокая температура может спровоцировать открытие трубки, что приводит к испарению буфера и/или выбросу геля. Обязательно используйте трубки с сейф-замком или закрывайте их. Промывка геля после денатурации должна проводиться в дистиллированной воде, так как PBS вызовет осадки SDS, что влияет на эффективность промывки. Этот шаг вызовет небольшое расширение геля, что не повлияет на следующие шаги протокола (шаг 2.2.3.4). Глицерин можно разбавлять в PBS, чтобы сэкономить место при крупных гелях. Для пробивания 0,4 мм гели лучше хранить в 12-луночной пластине, заполненной 3 мл воды — глицерина.

3. Иммунное окрашивание и окончательное расширение

  1. Поменяйте ванну PBS на ещё 15 минут инкубации.
  2. Разрежьте весь гель на 4 равных части.
  3. Переместить детали геля/пуансовы в адаптированный носитель (рисунок 2D, E) и инкубировать с первичными антителами, разбавлёнными в PBS-BSA 2% в течение 3 часов до ночи с перемешиванием (см. таблицу 2 и таблицу 3 для подробных условий).
  4. Гели для промывания 3 раза с PBS+Tween 0,1% на 10 минут RT с перемешиванием.
  5. Инкубировать гель во вторичные антитела и Hoechst в PBS-BSA 2% в течение 3 часов до ночи с перемещением (см. таблицу 2 и таблицу 3 для подробного состояния).
  6. Гель для стирки 3 раза с PBS+Tween 0,1% на 10 минут RT с перемешиванием.
  7. Опционально: выполните пан-маркировку всего протеома, инкубировав гель с NHS-эфиром (см. таблицу 2 для подробностей) в PBS в течение 1 часа 30 секунд при RT под перемешиванием, затем промывайте 3 раза в PBS+Tween 0,1% в течение 10 минут.
  8. Перенесите гель на адаптированный носитель и приступите к расширению геля путём инкубации в дистиллированной воде (ddH 2O).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация и тип моющего средства (Tween, Triton-X100, Saponin), используемых для промывания антител, можно адаптировать для биологических образцов. Многократная замена воды крайне важна для устранения следов соли, которые препятствуют полноценному расширению.

4. Монтаж и визуализация

  1. Покрытие коверслипов поли-лизином (см. раздел 1.1), покрывая их примерно 200 мкл полилизина, инкубирайте 1 час при RT и промывайте 3 раза вдлH 20для удаления избыточного полилизина. Дайте покрытию высохнуть и храните их при 4°C до использования.
  2. С помощью флуоресцентного микроскопа наместите расширенные гели на непокрытые накладки в камеру визуализации, чтобы проверить ориентацию образцов.
  3. После ориентации сушите гели на бумаге без ворса, чтобы удалить лишнюю воду, и закрепить на покрытые полилизиновым покрытием (см. шаг 1.1 для протокола).
  4. Наблюдайте образцы с помощью инвертированного микроскопа.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье представлены результаты сочетания криофиксации с экспансионной микроскопией на двух различных типах образцов: культивированных млекопитающих и паразитах T. brucei . Оба образца были либо криофиксированы, либо химически фиксированы в 4% PFA до расширения и иммунного окрашивания. Обратите внимание, что другие химические фиксации могут быть более подходящими для конкретных органелл (например, метанол или глутаральдегид), и что для сравнения с криофиксацией для простоты был выбран только PFA — распространённая химическая фиксация.

Человеческие RPE1 (эпителиальные клетки пигмента сетчатки) были окрашены на αβ-тубулин, ATP5a и Hoechst для визуализации микротрубочек, митохондрий и ядер соответственно. Кроме того, гели инкубировали флуоресцентным NHS-эфиром перед расширением — красителем, реагирующем со свободными аминогруппами, окрашивая весь клеточный протеом. Мы могли наблюдать несколько преимуществ криофиксации по сравнению с химической фиксацией, как ужебыло показано 23. Самой заметной особенностью было то, что криофиксация идеально сохраняла митохондриальную сеть, видимую как с помощью NHS-эфира, так и специфических антител против субъединицы альфа синтазы АТФ (АТФ5а) (рисунок 3A,B). Кроме того, поскольку ATP5a локализован во внутренней митохондриальной мембране, мы могли бы разрешить митохондриальные кристы с помощью криофиксации (см. рисунок 3B). Наоборот, фиксация PFA не позволила сохранить митохондриальную сеть, и поэтому митохондриальные кристы не были видны в таком состоянии (см. рисунок 3C). Мы также окрашивали микротрубочки в обоих условиях и показали, что криофиксация лучше сохраняет динамические микротрубочки, такие как цитоплазматические или астральные микротрубочки (рисунок 3B-E). Однако стабильные микротрубочки, такие как у центриолей и ресничок — немембранозных органелл, состоящих из 9-кратных микротрубочков, триплетов/дублетов, сохранялись одинаково, если не лучше в клетках, фиксированных с PFA, по сравнению с криофиксированными клетками (рисунок 3B',C'). Важно отметить, что криофиксация, сохраняющая целостность клеточных белков, может быть менее применима к очень плотным структурам, таким как центриоли/реснички. Это наблюдение также проводилось на жёстких структурах, таких как ядерные поры, где химическая фиксация вызывает вымывание цитоплазматических белков, что позволяет лучше наблюдать структуры ядерныхпор 23,32. Наконец, мы можем показать, что криофиксация также обходит эффект перекрёстного сшивания химической фиксации, который негативно влияет на способность расширения, как показано на митотических шпинделях, которые в крио-фиксированном состоянии были почти в 2 раза более расширены по сравнению с PFA (рисунок 3D,E).

Клетки Trypanosoma brucei были окрашены дляTDH 34 (рисунок 4A-D) для визуализации уникальной митохондрии и дляBiP 35 (рисунок 4E,F) для выделения эндоплазматической сетки. Кроме того, гели окрашивались флуоресцентным NHS-эфиром. Как наблюдалось на человеческих клетках, криофиксация в сочетании с расширением лучше сохраняет общую клеточную архитектуру (рисунок 4B,E), особенно эти две мембранные структуры, по сравнению с фиксацией PFA (рисунок 4C,D,F). Цитоскелет микротрубочки у T. brucei более жёсткий и стабильный, чем у человеческих клеток; следовательно, значимой разницы между PFA и криофиксацией не наблюдалось. Кроме того, ограничение разрешения метода U-ExM мешает нам различать отдельные микротрубочки (не показано).

В целом криофиксация решает ограничения классической химической фиксации, такие как сохранение мембранных органелл (митохондрии, эндоплазматический ретикул) и динамические цитоскелетные элементы (цитоплазматические или астральные микротрубочки). Кроме того, поскольку криофиксация не создаёт перекрёстной связи между белками, она полностью сохраняет способность к расширению, особенно на жёстких и плотных структурах.

Контроль качества криофиксации и расширения крайне важен для сохранения клеточной ультраструктуры биологических образцов. Ряд ошибок может привести к плохой фиксации и создавать артефакты в биологических образцах. Здесь мы выделяем наиболее распространённые недостатки криофиксации и последствия плохой фиксации. Самым очевидным артефактом, возникающим при криофиксации, является появление трещин внутри биологического образца (рисунок 5A), которые также часто встречаются в криоэлектронной микроскопии. Хотя эти трещины не изменяют внутреннюю ультраструктуру органелл, как показано на рисунке 5A (вставка) для митохондрий и микротрубочек, это может привести к неправильной интерпретации биологической значимости этих трещин и требует осторожного рассмотрения. Нет особой связи между проблемами манипуляций и внешним видом/объёмом этих трещин.

Одной из особенностей, указывающих на плохую фиксацию, является появление «пузырькообразных структур» внутри цитоплазмы клетки, указывающих на наличие ледяных кристаллов. Эти структуры особенно заметны при окрашивании NHS-эфиром (рисунок 5B). Обычно они сопровождаются ограниченным сохранением цитоскелетных элементов, таких как волнистые микротрубочки (рисунок 5B), и очень слабой сохранностью мембранных органелл (митохондрии на рисунке 5B). Эти особенности сопровождаются серьёзными проблемами фиксации, которые могут быть вызваны (i) неправильным объёмом и/или температурой этана (шаги 2.2.4-2.2.6 из протокола), (ii) непостепенным нагревом биологического образца (шаги 2.3 и 2.4 протокола) и (iii) наличием примесей в растворе заморозки (шаг 2.2.1 из протокола). Репрезентативные изображения растворов акрилата натрия, подчеркивающие ожидаемый аспект использования 38% натрия акрилата (бесцветный и полупрозрачный [1]) или слегка желтый и полупрозрачный [2]), либо непригодный для расширения (жёлтый/оранжевый и мутный [3]), показаны на рисунке 5C.

figure-results-1
Рисунок 1 Рабочий процесс Cryo-ExM. (A) Живые клетки (человеческие клетки или T. brucei) криофиксируются путём погружения в жидкий этан при -180 °C и инкубации в замороженном ацетоне на сухом льду. Заморозка осуществляется за счёт постоянного и медленного повышения температуры с -180 °C до -80 °C путём инкубации на сухом льду, что вызывает жидкость ацетона (-96 °C), а затем инкубация без сухого льда с -80 °C до -20 °C. Регидратация осуществляется последовательно ванной этанола, смешанной с полумесячной концентрацией дистиллированной воды с постоянным повышением температуры с -20 °C до комнатной температуры. (B) Затем регидратированные образцы расширяются следующим образом: образцы инкубируются в смеси акриламида: формальдегида (AA/FA) при 37 °C, что позволяет белкам закрепляться на разбухающем полимере, состоящем из акриламида, бисакриламида и акрилата натрия (AA/BIS/SA), последний придаёт гелю свойство расширения. Образцы инкубируются в NaCl/SDS при 95 °C для дестабилизации взаимодействия белков и мягкой денатурации. Этот этап необходим для изотропного расширения. Образцы затем окрашивают с помощью обычных первичных и вторичных антител, а затем расширяют в дистиллированной воде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Настройка крио-погружения и расширения. (A) Крио-плунжер в вооружённом положении (верхняя панель) и вниз (нижняя панель). Стрелка указывает кнопку НАЖАТИЯ для активации погружения. (B) Крио-погружающая установка, готовая к погружению, показывающая уровень жидкого азота (N2), подходящий для криофиксации, указанный по высоте пены вокруг дьюара (красная стрелка). Съёмный паук обозначен звёздочками. (C) Иллюстрация ключевых шагов крио-погружения, удерживая коверслип (верхний левый угол), положение накладных слоёв в жидком этане Дьюар (внизу слева) и сборной трубки для замяжения заморозки (справа). (D) Иллюстрация метода «гель-пробивания» для иммунного окрашивания на человеческих образцах. Полимеризированный гель на покрытиях (1) нарезают с помощью специального биопсийного пунша (P), образуя гелевый пунш диаметром 0,4 см (2), который можно окрашивать в кремниевую пластину (правые панели) для уменьшения количества антител. (E) Иллюстрация метода «гелевой резки» для иммунокрашивки в образцах человека и T. brucei . Полимеризированные и денатурированные гели (1) разрезаются на 4 равных части (2), что позволяет их инкубировать в 12-луночной пластине с антителами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Сравнение криофиксации и фиксации PFA в человеческих клетках. (A) Изображение вращающегося диска крио-фиксированных и расширенных клеток RPE1, окрашенных на αβ-тубулины (циан), митохондриальные субъединицы АТФ-синтазы 5a (ATP5a, жёлтый) и NHS-эфир (красный/серый), демонстрируя отличную сохраненность как мембранных органелл, так и элементов цитоскелета, включая центриоли и реснички (наконечник стрелки). Шкала: 10 мкм. (B, C) Вращающееся изображение диска крио-фиксированной (B) и PFA-фиксированной (C) клетки RPE1, окрашенной для αβ-трубочков (циан), митохондриального ATP5a (жёлтый) и Hoechst (пурпурный), с акцентом на первичный реснички (стрелки, B', C') и митохондрии (B", C"). Если крио- и PFA-фиксация одинаково сохраняет центриолии и первичные реснички, криофиксация значительно превосходит PFA по сохранению структуры митохондрий (B", C" — красные стрелки указывают на митохондриальные кресты, видимые только в крио-фиксированных условиях). Полосы масштаба: 1, 1 и 2,5 мкм соответственно. (D,E) Образ вращающегося диска крио-фиксированной (D) и PFA-фиксированной (E) митотической клетки RPE1, окрашенной на αβ-трубочки в жёлтый/серый), митохондриальный ATP5a (магента) и Hoechst (BOP синий), показывает, что криофиксация позволяет лучше расширять митотическое веретено (красные наконечники стрелок) и сохранять лучшие микротрубочки митотического веретена (красные стрелки). Измерения длины митотического веретена: 12 мкм и 7 мкм для криофиксации и фиксации PFA соответственно. Шкалы: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4. Сравнение криофиксации и фиксации PFA у Trypanosoma brucei. (A, B) Конфокальные изображения крио-фиксированных и расширенных проциклических клеток T. brucei , окрашенных на митохондриальную треонинодегидрогеназу (TDH, жёлтый) и NHS-эфир (красный/серый), демонстрируя отличное сохранение уникальной митохондрии и общую структуру клетки. Полосы чешуи: 5 мкм (C, D) Конфокальное изображение PFA-фиксированных и расширенных проциклических клеток T. brucei , окрашенных на TDH (жёлтый) и NHS-эфир (красный/серый). Сравнивая сохранение структуры митохондрий и сеть, криофиксация превосходит PFA-фиксацию. Полосы масштаба: 5 мкм (E, F) Конфокальные изображения крио-фиксированных (E) и PFA-фиксированных (F) и расширенных проциклических клеток T. brucei , окрашенных на эндоплазматический ретикулум маркера BiP и NHS-эфира (серый), показывающие, что криофиксация позволяет лучше расширять и сохранять эндоплазматический сетка. Масштабные полосы: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигурки.

figure-results-5
Рисунок 5. Проблемы с криофиксацией. (A,B) Образы вращающихся дисков крио-фиксированного и расширенного RPE1, окрашенных на αβ-трубочки (циан), субъединицу митохондриальной АТФ-синтазы 5a (ATP5a, жёлтый) и NHS-эфир (красный), демонстрирующие классические эффекты криофиксации: трещины (A, стрелки) и пузырьки (B, стрелка). Хотя трещины не влияют на ультраструктуры органелл (A), наличие пузырьков в цитоплазме (B) указывает на плохую фиксацию и значительно влияет на сохранение субклеточных органелл (митохондрий и микротрубочки, вставки). Шкала: 5 мкм и 2 мкм (всадки). (C) Изображение, показывающее различные растворы акрилата натрия, подчёркивающее ожидаемый аспект использования 38% натрия акрилата (бесцветный и полупрозрачный (1) или слегка жёлтый и полупрозрачный (2), или непригодный для расширения (жёлтый/оранжевый и мутный (3)). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Условия хранения раствора Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Список антител. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Иммунные окрашивающие состояния Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем подробный протокол, интегрирующий криофиксацию с экспансионной микроскопией (Cryo-ExM), предлагая надёжный подход к визуализации субклеточных компартментов при избегании артефактов, часто связанных с химической фиксацией, таких как структурные искажения и потеря антигена. Сохраняя клеточную архитектуру в почти родном состоянии, Cryo-ExM устраняет необходимость в обширной оптимизации фиксации, что позволяет более точно локализовать белки.

Хотя протокол в целом прост, несколько важных шагов требуют особого внимания для успешных результатов. Этап крио-погружения особенно чувствительн, так как требует как специфических материалов (см. Таблицу материалов), так и определённой ловкости, особенно при работе с жидкой этановой наполнением, что может быть подводным каменем. Предварительные знания по методам криофиксации являются преимуществами; рекомендуем проконсультироваться со специалистом по крио-ЭМ или менеджером центра электронной микроскопии при первом применении этого метода. На этапе расширения важно строго соблюдать условия денатурации, так как отклонения могут снизить как сохранение образца, так и эффективность расширения. Наконец, поддержание правильных условий хранения всех реагентов (см. Таблицу 1) имеет решающее значение для обеспечения воспроизводимости и стабильного качества изображения со временем.

В этой статье выделяются несколько ключевых преимуществ протокола Cryo-ExM. В частности, криофиксация минимизирует потерю растворимых белков, что является распространённым ограничением традиционных методов фиксации, и лучше сохраняет целостность мембраны, тем самым повышая точность клеточной визуализации. Главным преимуществом этой техники является её совместимость со стандартными широкополыми и конфокальными микроскопами. В отличие от многих других методов сверхразрешения, требующих специализированного и часто дорогого оборудования, ExM можно реализовать с помощью обычных флуоресцентных микроскопов. Ещё одним значительным преимуществом ExM является его универсальность. Метод успешно применялся к широкому спектру биологических образцов — от отдельных клеток до сложных тканей — что демонстрирует её широкое применение в различных областях исследований. В этой статье особо подчеркивается совместимость этого протокола с двумя совершенно разными модельными системами: T. brucei и человеческими клетками, но следует отметить, что более крупный или более сложный образец потребует фиксации при замерзании под высоким давлением, так как ручное погружение недостаточно для сохранения всегообразца 24,25,30. Экспансионная микроскопия произвела революцию в визуализации наномасштабных клеточных структур, которые ранее было трудно или невозможно разрешить, что позволило добиться прорывов в таких областях, как клеточная биология, биология развития инейронаука 36. В частности, этот метод стал преобразующим в паразитологии — области, где традиционная световая микроскопия часто уступает. Для многих паразитов ультраструктурная экспансионная микроскопия (U-ExM) стала настоящим прорывом, позволяя с беспрецедентной чёткостью снимать сложные органеллы, такие как апикопласт, коноидные и цитоскелетныеэлементы с беспрецедентной чёткостью 6,37,38. Эти достижения демонстрируют силу U-ExM в выявлении ранее недоступных структурных деталей, открывая новые пути для открытий в клеточной биологии, нейронауке и биологии паразитов, а также способствуя поиску потенциальных терапевтических целей. Кроме того, ExM остаётся совместимым с широко используемыми иммунофлуоресцентными антителами, что облегчает его интеграцию в существующие рабочие процессы. В большинстве случаев антитела, рутинно используемые для флуоресцентной микроскопии или вестерн-блоттинга, эффективно действуют на расширенных образцах, устраняя необходимость в специализированных реагентах. Такая доступность делает Cryo-ExM привлекательным вариантом для многих биологических исследовательских лабораторий, предлагая высококачественную визуализацию без затрат и сложности, обычно присущих передовым системам визуализации.

Несмотря на преимущества, у ExM есть определённые ограничения. Основным недостатком является значительное потребление антител, что может быть дорого или проблематично, особенно для домашних антител, доступных в ограниченных количествах. Вот почему мы предлагаем такую стратегию протокола для уменьшения объёма антител, используемых для иммунокрашивки (рисунок 2D,E). Процесс расширения также увеличивает толщину образца, что может повлиять на возможность визуализации более глубоких структур из-за ограничений рабочего расстояния стандартных микроскопских объективов. Это ограничение может быть особенно сложным при изучении более крупных и толстых образцов, где более глубокие области могут быть неэффективно собраны с помощью обычных микроскопов. Кроме того, расширение тканей иногда вызывает механические искажения, требующие тщательной проверки и коррекции для обеспечения точных пространственных представлений. Наконец, классический ExM строго зависит от фиксации образца, которая может варьироваться в зависимости от биологических образцов или субклеточной структуры для наблюдения. В то время как центриоли и реснички достаточно стабильны для расширения без предварительной фиксации, клеточные органеллы требуют различных видов химической фиксации (ПФА, метанол, глутаральдегид), что может создавать артефакты и препятствовать совместному наблюдению нескольких клеточных структур. Наконец, поскольку ExM совместим с различными сверхразрешающими методами визуализации, такими как микроскопия структурированного освещения (SIM)39, микроскопия с истощением с выбросами (STED)40, прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM)41 и, более недавно, микроскопия с лёгкимилистами 42, описанный в этом исследовании подход предоставляет универсальный инструмент для высокоточного изучения клеточных структур. Недавнее исследование сочетало криофиксацию с итеративной экспансионноймикроскопией 32, что ещё больше расширяло границы разрешения и максимально сохраняло естественное состояние клетки благодаря криофиксации.

Позволяя этим передовым методам визуализации захватывать клетки в их родном состоянии, Cryo-ExM открывает путь для будущих исследований сложных клеточных процессов с беспрецедентной ясностью. Этот подход также открывает новые возможности для корреляционной световой и электронной микроскопии (CLEM), что ещё больше расширяет её потенциал для мультимодальной визуализации.

В заключение, ExM представляет собой мощный инструмент для сверхразрешающей визуализации с широкой применимостью к различным биологическим образцам. Совместимость со стандартными микроскопами, универсальность типов образцов и относительно простое внедрение делают его привлекательным выбором для многих лабораторий. С дальнейшим развитием технологии мы ожидаем дальнейших улучшений в разрешении, использовании антител и обработке образцов, что усилит её возможности и сделает её ещё более доступной для широкого спектра биологических применений. Cryo-ExM, в частности, является многообещающим достижением, предоставляющим возможность изучать клеточные структуры с исключительной детализацией при сохранении их собственной целостности, в конечном итоге расширяя границы современной микроскопии.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что конфликт интересов не существует

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим Дженнифер Вииллард за критические советы и чтение рукописи. Мы признаём вклад SFR Santé Lyon-Est (UAR3453 CNRS, US7 Inserm, UCBL) — CIQLE (член LyMIC) в получении изображений клеток RPE1. Благодарим Монику Фернандес Монреаль из BIC за доступ к вантузу и этану, а также к Центру визуализации Бордо — сервисному подразделению CNRS-INSERM и Университету Бордо, входящему в национальную инфраструктурную компанию France BioImaging, за получение изображений T. brucei . Эта работа была поддержана CNRS (T.brucei) и INSERM (человеческие клетки) и финансирована следующими учреждениями: Agence National de la Recherche (ANR-20-CE91-0003, ANR-19-CE17-0014 до M.B.), LabEx ParaFrap (ANR-11-LABX-0024) и Fondation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC-AP2024, M.L). P.H поддерживался финансированием ANR-OIL (ANR24-CE15-2171-01 до L.R.), L.K поддерживался ANR-BBDIV (ANR-22-CE13-0014 до B.D.)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Металлический держатель трубки объемом 5 млДоминик ДатшерQB-E5Шаг заморозки замещения
Ручной крио-плунжер 620RHOSThttps://rhost-em.com/Шаг криофиксации
Ацетон 99,8% AcroSealAcros OrganicsКот. No 67-64-1 Шаг заморозки замещения
Акриламид 40% (AA)Сигма-ОлдричA4058Процедура расширения  (якорь)
Акриловая кислота Сигма-Олдрич8.00181 Процедура расширения (полимер)
Персульфат аммония (APS)Термо Фишер17874Процедура расширения (полимер)
Биопсионный ударДоминик ДатшерПУК-40Необходим для резки геля перед денатурацией 
BSAСигма-ОлдричP1379Иммунокрашивание 
Ячейная камера АттофторИнвитрогенA7816Камера для визуализации адаптирована к 24-мм накладным скользям для съёмки
Камера ячейкиСлужба по натуре10900Камера для визуализации адаптирована для 18-мм накладных ссылок для съёмки
Накладки 12 мм Доминик Датшер100040Выращивание клеток / прикрепление T.brucei
Покрытие 24 мм Доминик Датшер900547Визуализация  
Покрытие 18 ммVWR631-0153Визуализация  
Этан газ Линде Газ88888DEТребуется для криофиксации
Формальдегид 36.5– 38% (FA)Сигма-Олдрич  F8775Процедура расширения  (якорь)
Глутаральдегид 25% (GA)Сигма-Олдрич  G5882Шаг заморозки замещения
Glycerol Euromedex EU3550Длительное хранение геля 
Жидкий азот  Линде Газ2200975Требуется для криофиксации (охлаждения системы)
Микротрубочный прозрачный замок 5 мл&bbsp;Доминик Датшер390932AТребуется для заморозки
Needle 18GДоминик Датшер050123BНужно было собрать ацетон
N,N-метилбисакриламид 2% (BIS)Сигма-ОлдричM1533, SIGMAПроцедура расширения (полимер)
Параформальдегид 16% (PFA)EMSКот. No 15710Шаг заморозки замещения
Поли-D-лизинСигма-ОлдричP1024Покрытие покрытий для образцов / визуализации 
Поли-L-лизинСигма-ОлдричP1274Покрытие покрытий для образцов / визуализации 
Редуктор давления Линде ГазCPLH0SJ-LIN224Редуисер давления, позволяющий этана-диструбацию (криофиксация)
Seringe Terumo 10 mlДоминик Датшер50132Нужно было собрать ацетон
Набор силиконового эластомераДау4001834Набор для подготовки пластин с силионной скважиной (иммунное окрашивание) 
Акрилат натрия 97-99% (SA)Сигма-Олдрич408220Процедура расширения (полимер)
AK ScientificR624Процедура расширения (полимер)
Додецилсульфат натрияEuromedexEU0660Процедура расширения (денатурация)
Тетраметилэтилендиамин (TEMED)Термо Фишер17919Процедура расширения (полимер)
Трубки Thermo Scientific8060-0060Трубки для этановой диструбации (криофиксация)
Tween-20Euromedex1005-7Иммунокрашивание 
Пинцет Dumont n° 5 FineScienceTools11255-20Манипуляции с обложками 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacquemet, G., et al. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. J Cell Sci. 133 (11), jcs240713(2020).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging: expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Laporte, M. H., et al. Time-series reconstruction of the molecular architecture of human centriole assembly. Cell. 187 (9), 2158-2174 (2024).
  4. Steib, E., et al. WDR90 is a centriolar microtubule wall protein important for centriole architecture integrity. Elife. 9, e57205(2020).
  5. Le Borgne, P., et al. The evolutionary conserved proteins CEP90, FOPNL, and OFD1 recruit centriolar distal appendage proteins to initiate their assembly. PLoS Biol. 20 (9), e3001782(2022).
  6. Bertiaux, E., et al. Expansion microscopy provides new insights into the cytoskeleton of malaria parasites including the conservation of a conoid. PLoS Biol. 19 (3), e3001020(2021).
  7. Liffner, B., et al. Atlas of Plasmodium falciparum intraerythrocytic development using expansion microscopy. Elife. 12, RP88088(2023).
  8. Amodeo, S., et al. Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei. J Cell Sci. 134 (5), jcs254300(2021).
  9. Corrales, R. M., et al. Tubulin detyrosination shapes Leishmania cytoskeletal architecture and virulence. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (3), e2415296122(2025).
  10. Brunet, M., et al. Drosophila Alms1 proteins regulate centriolar cartwheel assembly by enabling Plk4-Ana2 amplification loop. EMBO J. 44 (8), 2396(2025).
  11. Langner, E., et al. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of mouse and human kidneys for analysis of subcellular structures. Cytoskeleton (Hoboken). 81 (11), 618-638 (2024).
  12. Mercey, O., et al. The connecting cilium inner scaffold provides a structural foundation that protects against retinal degeneration. PLoS Biol. 20 (6), e3001649(2022).
  13. Steib, E., et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Rep Methods. 2 (10), 100311(2022).
  14. Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
  15. Yu, C. J., Orozco Cosio, D. M., Boyden, E. S. ExCel: super-resolution imaging of C. elegans with expansion microscopy. Methods Mol Biol. 2468, 141-203 (2022).
  16. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
  17. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  18. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nat Biotechnol. 34 (9), 973-981 (2016).
  19. Schnell, U., et al. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  20. Dubochet, J. Cryo-EM-the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  21. Neuhaus, E. M., et al. Ethane-freezing/methanol-fixation of cell monolayers: a procedure for improved preservation of structure and antigenicity for light and electron microscopies. J Struct Biol. 121 (3), 326-342 (1998).
  22. Kellenberger, E. The potential of cryofixation and freeze substitution: observations and theoretical considerations. J Microsc. 161 (Pt 2), 183-203 (1991).
  23. Laporte, M. H., et al. Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM). Nat Methods. 19 (2), 216-222 (2022).
  24. Hinterndorfer, K., et al. Ultrastructure expansion microscopy reveals the cellular architecture of budding and fission yeast. J Cell Sci. 135 (24), jcs260240(2022).
  25. Mikus, F., Dey, G. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Mol Biol. 2862, 47-59 (2025).
  26. Ben Chaabene, R., et al. Toxoplasma gondii rhoptry discharge factor 3 is essential for invasion and microtubule-associated vesicle biogenesis. PLoS Biol. 22 (8), e3002745(2024).
  27. Shah, H., et al. Life-cycle-coupled evolution of mitosis in close relatives of animals. Nature. 630 (8015), 116-122 (2024).
  28. Klena, N., et al. An in-depth guide to the ultrastructural expansion microscopy (U-ExM) of Chlamydomonas reinhardtii. Bio Protoc. 13 (17), e4792(2023).
  29. van den Hoek, H., et al. In situ architecture of the ciliary base reveals the stepwise assembly of intraflagellar transport trains. Science. 377 (6605), 543-548 (2022).
  30. Mikus, F., et al. Charting the landscape of cytoskeletal diversity in microbial eukaryotes. bioRxiv. , (2024).
  31. Petrich, A., et al. Expanding insights: harnessing expansion microscopy for super-resolution analysis of HIV-1-cell interactions. Viruses. 16 (10), 1610(2024).
  32. Louvel, V., et al. iU-ExM: nanoscopy of organelles and tissues with iterative ultrastructure expansion microscopy. Nat Commun. 14 (1), 7893(2023).
  33. Lemaître, F., et al. Unveiling the molecular architecture of T cells and immune synapses with cryo-expansion microscopy. bioRxiv. , (2025).
  34. Millierioux, Y., et al. De novo biosynthesis of sterols and fatty acids in the Trypanosoma brucei procyclic form: carbon source preferences and metabolic flux redistributions. PLoS Pathog. 14 (5), e1007116(2018).
  35. Bangs, J. D., et al. Molecular cloning and cellular localization of a BiP homologue in Trypanosoma brucei: divergent ER retention signals in a lower eukaryote. J Cell Sci. 105 (Pt 4), 1101-1113 (1993).
  36. Dolgin, E. 'Expansion microscopy' turns ten: how a tissue-swelling method brought super-resolution imaging to the masses. Nature. 637 (8046), 752-754 (2025).
  37. Tosetti, N., et al. Essential function of the alveolin network in the subpellicular microtubules and conoid assembly in Toxoplasma gondii. Elife. 9, e56635(2020).
  38. Gorilak, P., et al. Expansion microscopy facilitates quantitative super-resolution studies of cytoskeletal structures in kinetoplastid parasites. Open Biol. 11 (9), 210131(2021).
  39. Halpern, A. R., et al. Hybrid structured illumination expansion microscopy reveals microbial cytoskeleton organization. ACS Nano. 11 (12), 12677-12686 (2017).
  40. Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
  41. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  42. Daetwyler, S., Fiolka, R. P. Light-sheets and smart microscopy, an exciting future is dawning. Commun Biol. 6 (1), 502(2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Super Resolution ImagingCryo FixationFluorescence MicroscopyHydrogel EmbeddingConfocal MicroscopyUltrastructure Expansion MicroscopySample FixationImmunostaining ProtocolCellular Architecture

Похожие статьи