Методическая статья

Лактилом на основе масс-спектрометрии и подтверждение лактилированных белков

263 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68597

⸱

24 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke (CRCHUS), 3Institut de Recherche sur le Cancer de l'Université de Sherbrooke (IRCUS)

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод использования клеточных линий плоскоклеточных карциномы пищевода в качестве примера анализа лактилирования белков. Процесс включает анализ лактилирования белков из клеточной культуры до подтверждения кандидатов, включая масс-спектрометрию на основе лактилирования и подтверждение с помощью иммунопреципитаци.

Аннотация

Впервые выявленная в 2019 году, лактилирование — новая посттрансляционная модификация (ПТМ) на остатках лизина с тех пор показала интерес в различных патологиях и физиологических контекстах. Она содержит два изомера (L- и D-лактилирование) и известна тем, что изменяет формирование комплексов, локализацию клеток или стабильность белков-мишень. Этот протокол описывает метод анализа лактилирования из клеточной культуры для подтверждения потенциальных лактилированных мишеней, используя в качестве примера клеточную линию плоскоклеточных карциномы ТЭ11. Следующий протокол предоставит подробную информацию о идентификации лактилированных белков с помощью L-лактиллизин-специфической иммунопреципитации (IP) пептидов для масс-спектрометрического анализа (MS): (1) экстракция белка, (2) восстановление, алкилирование и расщепление белков, (3) очистка белков и концентрация пептидов, (4) IP с использованием шариков KL-LA и (5) концентрация пептидов KL-LA. После этих этапов будет проведен анализ исходных данных MS для выявления лактилированных участков, а также подтверждение этих предполагаемых лактилированных белков IP. С помощью этого метода можно определить диапазон от 100 до 500 пептидов, а также подтвердить интересующие лактилированные белки. В заключение, изучение лактилированных белков имеет потенциал для расширения нашего понимания клеточной сигнализации, вызванной ПТМ, как в нормальных, так и в болезненных условиях.

Введение

Лактилирование — это посттрансляционная модификация (ПТМ) на остатках лизина с использованием метаболитов, полученных в результате гликолиза. L-лактил-КоА и лактоилглутатион являются субстратами L-лактилирования (K L-LA) и D-лактилирования (KD-LA), соответственно 1,2. L-лактилирование — это ферментативный процесс, включающий ферменты, такие как ацетилтрансфераза 3,4. Напротив, D-лактилирование — это неферментный процесс, происходящий нуклеофильным замещением между лактоилглутатионом и остаткомлизина 5. В качестве динамического процесса деацетилазы, такие как HDAC1-3, были использованы как стирателилактилирования 6. С момента открытия в 2019году 3 он представляет интерес в различных патологиях и физиологическихконтекстах 2. Этот ПТМ впервые был выявлен на гистонах при наблюдении смещения массы 72,021 Да с помощью анализа высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и тандемной масс-спектрометрии (MS/MS) 3. С тех пор лактилирование было обнаружено и на других белках, кроме гистонов, и показано, что оно влияет на функциональное разнообразие, локализацию или стабильность модифицированных белков в зависимости отконтекста 7,8,9,10.

Учитывая, что ПТМ часто бывают в низкомсодержании 11 и являются частью динамического и переходногопроцесса 12, требуется обогащение исследуемого ПТМ с помощью иммунопреципитации (ИП). Далее МС часто используется для описания протеома, связанного с ПТМ, на переваренных пептидах, таких как фосфорпротеом или профилирование убиквитинации11. Как и в случае с другими ПТМ, лактиломными или обогащённо-лактилированными пептидами, протеомика на основе МС является золотым стандартом для выявления новых мест лактилирования.

Этот протокол описывает идентификацию пептидов, обогащённых KL-LA с помощью протеомики на основе РС, после чего следует подтверждение лактилированных белков с помощью иммунопреципитаци. Используя в качестве примера клеточные линии плоскоклеточной карциномы пищевода (ESCC), мы описываем протокол для извлечения лактилированных белков для идентификации лактилированных мишень на основе РС и их последующего подтверждения с помощью IP.

Протокол

Поскольку ПТМ являются динамичным и временным процессом, важно заранее определить оптимальный общий уровень лактилирования с помощью проточной цитометрии или вестерн-блоттинга с антителоманти-K L-LA . Например, конфлигенция 70%-80% предпочтительна в клетках ESCC для экспериментов с лактиломом и IP, так как общий уровень лактилирования достигает максимального уровня. Используемые реагенты и оборудование перечислены в таблице материалов.

1. Культура клеток

  1. Выращивайте клетки в чашках Петри диаметром 100 мм до достижения необходимого слияния, как уже было сказано.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выращивайте достаточно клеток для получения от 0,5 до 1 мг белка для лактиломов или более 2 мг для IP.
  2. Промывайте клетки 5 мл предварительно охлаждённого 1x физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS).
  3. Добавьте 500 мкл предварительно охлаждённого PBS и собирайте клетки с помощью скребка. Перенесите в микротрубку с низким уровнем связывания объёмом 1 мл.
  4. Центрифугные ячейки при 2000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) и сбросьте прозрачный супернатант. Клеточные гранулы можно хранить при -80 °C.

2. Лактилом

ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте перчатки, чтобы предотвратить загрязнение образцов. Всегда используйте фильтрованные наконечники, микротрубки с низким уровнем связывания и воду класса MS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Биологические репликации (3-5 по нашему опыту) всегда следует выполнять, чтобы гарантировать воспроизводимость выявленных модификаций.

  1. Экстракция белка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте на льду.
    1. Подготовьте буфер лизиса лактилома (Таблица 1) и храните при 4 °C перед использованием. Добавьте ингибиторы протеазы непосредственно перед использованием.
    2. Извлекать белки с использованием нужного объема буфера лизиса.
    3. Соникат на льду — 12 циклов импульса 5 с + 5 секунд с отрывом при интенсивности 20%-25%.
    4. Центрифугировать при 16 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Перенести прозрачный супернатант с белками в новую микротрубку с низким связанием.
    5. Количественно оценивайте белки с помощью набора для бицинхониновой кислоты (BCA) согласно рекомендации производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Набор BCA совместим с максимальным содержанием мочевины 3 М. Поэтому образцы необходимо разбавлять соответствующим образом.
    6. Перенесите 500 мкг на 1 мг белков в новые микротрубки с низким уровнем связывания. Используйте одинаковое количество белка для каждого образца. Дополните объём всех образцов буфером лизиса лактилома до того же конечного объёма.
  2. Восстановление, алкилирование и ферментативное пищеварение
    1. Добавьте дитиотрейтол до конечной концентрации 5 мм. Инкубировать при 95 °C в течение 2 минут.
    2. Инкубировать 30 минут на RT.
    3. Добавьте хлороацетамид к конечной концентрации 7,5 мм. Инкубировать в RT 20 минут в темноте.
    4. Добавьте в три раза больше объёма образца (с шага 2.1.6) 1 M (NH 4)2CO3 , чтобы уменьшить мочевина с 8 M до 2 M.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если общий объём превышает ёмкость микротрубок, разделите их на две микротрубки.
    5. Добавьте 1 мкг трипсина класса MS на 100 мкг белков. Инкубировать за ночь при 30 °C. Приступить к очистке образца.
  3. Очистка и концентрация пептидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работа в RT.
    1. Подкислите образец, добавив трифторуксусную кислоту (TFA) в итоговую концентрацию 0,2%.
    2. Приготовьте следующие растворы в свежей воде MS-класса: 0,1% TFA, 1% муравьиной кислоты (FA) и 1% FA/50% ацетонитрила.
    3. Используйте колонки C18 по 100 мг для очистки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы использовать этот столбец, используйте два наконечника пипетки: загрузите колонку одним и отрежьте кончик другого, чтобы выбросить жидкость из колонны. Убедитесь, что колонка остаётся постоянно влажной. Используйте по одной колонке на образец.
    4. Зарядьте колонку 1 мл 100% ацетонитрила, раствором для увлажнения, и выбросьте его. Повторите дважды.
    5. Уравновесьте колонку, заряжая 1 мл TFA 0,1%, и выбрасывайте его. Повторите дважды.
    6. Зарядьте колонку 1 мл кислотного образца. Проведите 10 циклов заряда/выброса образца. Повторите, если остался образец.
    7. Промыйте колонку, заряжая 1 мл TFA 0,1%, и выбросьте его. Повторите дважды.
    8. Для элюции проводите 10 циклов заряда/выброса с использованием 750 мкл 1% FA/50% ацетонитрила. Собирайте в новую микротрубку с низким уровнем связывания. Повторяйте с добавлением дополнительно 750 мкл 1%/50% ацетонитрила, в общей сложности 1,5 мл очищенных пептидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите микротрубку сбоку, а не на крышке, чтобы избежать загрязнения образцов при проколе отверстий в крышке.
    9. Проколите от 1 до 3 отверстий в крышке микротрубок иглой для испарения.
    10. С помощью вакуумного концентратора концентрируйте образцы при 60 °C на столькое, сколько требуется (для образцов в конечном объёме 1,5 мл это может занять не менее 4 часа). Затем проводите иммунопреципитацию пептидов.
  4. Иммунопреципитация с помощью шариков KL-LA
    1. Подготовьте буфер для мойки и IP-буфер лактилома (Таблица 2).
    2. На льду добавьте 200 мкл IP-буфера к концентрированным пептидам, тщательно перемешайте вверх и вниз до растворения. Некоторые осадки всё ещё видны.
    3. Центрифугуйте при 12 000 г в течение 10 минут при 4 °C, чтобы удалить осадки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования образец можно дозать в качестве контрольного шага, например, с помощью спектрофотометра для количественной оценки концентрации пептида на 205 нм.
    4. Промывайте шарики, сопряжённые с агарозойK L-LA, три раза с 200 мкл ледяной жидкости 1x PBS, центрифугировав при 2000 x г в течение 1 минуты при 4 °C и удаляя прозрачный верхний слой после каждой мойки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 мг белка в начале этого протокола используйте 20 мкл бусин, конъюгированных с агарозой KL-LA , ранее аликотированных в пробирках с низким уровнем связывания объемом 0,5 мл для удобства использования.
    5. Переместите прозрачный супернатант с восстановленными пептидами в микротрубку объемом 0,5 мл с предварительно промытыми шариками. Запечатайте трубки парафиновой пленкой, чтобы избежать утечки.
    6. Инкубировать на ночь с мягким вращением от конца до конца при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги 2.4.7–2.4.12 выполняются при 4 °C.
    7. Гранулируйте шарики центрифугой при 2000 x g в течение 1 минуты. Сбросьте прозрачный супернатант.
    8. Добавьте 200 мкл лактиломного IP-буфера и промывайте 15 секунд, инвертируя трубку. Центрифугуйте при 2000 х г на 30 секунд и уберите прозрачный супернатант.
    9. Повторите шаг 2.4.8 один раз.
    10. Добавьте 200 мкл буфера для стирки и стирайте 15 секунд, переворачивая трубку. Центрифугуйте при 2000 x g на 30 секунд и сберите прозрачный супернатант.
    11. Повторите шаг 2.4.10 дважды.
    12. Добавьте 200 мкл воды MS-класса и промывайте 30 секунд, переворачивая трубку. Центрифугуйте при 2000 x g на 1 минуту и сбросьте прозрачный супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшиеся этапы протокола лактилома выполняются на РТ.
    13. Элюировать связанные пептиды с помощью 100 мкл буфера элюции (0,1% свежеприготовленного TFA) в течение 1 минуты с мягким вращением от конца до конца на RT. Центрифугой при 2 000 x g в течение 2 минут.
    14. Повторите шаг 2.4.13 ещё два раза и объедините элюты. Приступите к очистке образцов.
  5. Концентрация и очистка пептидов KL-LA
    1. Приготовьте следующие растворы в пресной воде класса MS: 0,1% TFA, 1% FA и 1% FA/50% ацетонитрила.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Непосредственно перед началом очистки приготовьте нужное количество раствора в микротрубках объёмом 1,5 мл (шаг 2,5,3: 300 мкл 100% ацетонитрила, шаг 2,5,4: 300 мкл 0,1% TFA, шаг 2,5,6: 300 мкл 0,1% TFA и шаг 2,5,7: 300 мкл 1% FA/50 %).
    2. Используйте насадки C18 с 100 мкл для очистки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники C18 объёмом 100 мкл используются так же, как и традиционные наконечники пипеток. Держите большой палец напряжённым и никогда не отпускайте поршень между шагами, чтобы колонка оставалась влажной и не допускала попадания воздуха.
    3. Аспирируйте 100 мкл 100% ацетонитрила, увлажняющего раствора, и аккуратно разливайте, не выбрасывая всю жидкость. Повторите дважды.
    4. Уравновесьте колонку, аспирируя 100 мкл с 0,1% TFA, и аккуратно раздавайте. Повторите дважды.
    5. Зарядьте колонку 100 мкл образца пептидовK L-LA . Проведите 10 циклов заряда/выброса в новой микротрубке с низким связыванием. Повторите, если остался образец.
    6. Промыйте колонку, аспирировав 100 мкл 0,1% TFA, и выдайте его. Повторите дважды.
    7. Проведите 10 циклов заряда/выброса для размывания, используя 100 мкл 1% FA/50% ацетонитрила в новой низкосвязывающей микротрубке. Повторите дважды и комбинируйте элуаты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пептиды, связывающиеся с кончиком C18, могут помешать наконечнику аспирировать по 100 мкл за раз. Повторяйте этот шаг, пока в микротрубке не останется жидкость (300 мкл) на шаге 2.5.7.
    8. Проколите от 1 до 3 отверстий в крышке микротрубок иглой для испарения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите микротрубки по бокам пробирки, а не на крышке, чтобы избежать загрязнения образцов при проколе отверстий.
    9. С помощью вакуумного концентратора концентрируйте образцы при 60 °C на столько, сколько требуется для испарения жидкости (при общем объёме 300 мкл это может занять не менее 2 часа).
    10. Суспензировать концентрированные пептиды в 30 мкл 1% FA.
    11. Следуя рекомендациям вашей масс-спектрометрической платформы, количественно измеряйте пептиды с помощью спектрофотометра на 205 нм, чтобы определить их концентрацию.
    12. Переложите в стеклянный флакон и держите при 4 °C до анализа РС.

3. Анализ магистратуры и биоинформатика

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы были проанализированы в Центре протеомики Университета Шербрука с использованием масс-спектрометра (MS) (работающего в режиме Data-зависимого сбора с параллельным накоплением-последовательной фрагментацией (DDA-PASEF).

  1. Масс-спектрометрия
    1. Для каждого образца вводите 375 нг пептидов в систему высокопроизводительной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
    2. Загружать пептиды на уловительную колонку с постоянным расходом 4 мкл/мин.
    3. Разделить пептиды на аналитической колонке C18 с помощью градиента 5%-37% ацетонитрила на 2 часа при расходе 400 нл/мин.
    4. Выполняйте электрораспыляющую ионизацию со следующими настройками: капиллярное напряжение: 1500 В, сухой газ: 3,0 л/мин, сухая температура: 180 °C, давление TIMS-in: 2,6 мБар.
    5. Получите масс-спектры в диапазоне 100-1700 м/ж с помощью режима DDA auto-MS/MS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прибор настроен на обнаружение состояний заряда от 0 до 5+. Используется конфигурация двойной спектрометрии пойманной ионной мобильности (TIMS) с временем нарастания 100 мс и 10 параллельными сканированием последовательной накопления (PASEF) за цикл захвата, что обеспечивает рабочий цикл 1,17 с. Динамическое исключение установлено на 0,4 мин.
    6. Провести фрагментацию с помощью энергии, вызванной столкновением диссоциации (CID), линейно увеличенной от 20 до 59 эВ в диапазоне ионной подвижности 0,6–1,6 Вс/см².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Целевая интенсивность установлена на уровне 20 000 с порогом интенсивности 2 500. Стандартный полигон фильтра применяется для приоритизации прекурсоров вдоль диагональной линии для +2, +3 и +4 заряженных пептидов в плоскости m/z-ионной мобильности.
  2. Предварительная обработка данных: анализ MaxQuant
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются с помощью программного обеспечения MaxQuant v.2.6.713 для идентификации лактилированных пептидов.
    1. В правом верхнем углу нажмите на вкладку «Конфигурация » и проверьте, добавлена ли модификация лактилирования.
    2. Если нет, используйте базу данных Unimod.org14. Войдите как гость и найдите лактилирование (accession #2114).
    3. Нажмите кнопку «Добавить ». В разделе «Имя» запишите «Лактилирование» (K), введите композицию в виде Unimod, нажав кнопку «Изменить ».
    4. Проверьте полученную моноизотопную массу. Нажмите на OK.
    5. В левом верхнем углу экрана, синим цветом, нажмите кнопку «Сохранить изменения ».
    6. В левом верхнем разделе нажмите на «Исходные данные». Загрузите файлы с исходными данными и автоматически наименуйте их с помощью кнопки «Нет дробей ».
    7. Установите количество потоков в левом нижнем углу в зависимости от количества доступных ядер на компьютере.
    8. Во вкладке «Группа, специфичная группа», нажмите на «Модификации » синим цветом.
    9. Добавьте Lactylation to Variable модификации, нажав кнопку стрелки для добавления в квадрат справа.
    10. Нажмите на Quantification без меток. Введите LFQ и измените тип нормализации на none.
    11. Нажмите на «Пищеварение». Убедитесь, что трипсин/P добавлен в квадрат справа.
    12. Увеличьте максимальное количество пропущенных расщеплений до 4 , так как лактилирование может повлиять на пищеварение трипсина.
    13. Нажмите на «Инструмент». Измените допуск пептидов основного поиска на 20, учитывая, что лактилирование — не распространённый ПТМ.
    14. В левом верхнем углу нажмите на глобальные параметры. Добавьте файл Fasta, ранее скачанный с Uniprot или Ensembl, для соответствующего вида.
    15. Нажмите на правило идентификатора и Тест , чтобы убедиться, что файл Fasta можно правильно прочитать.
    16. Нажмите на «Квантификация белка » синим цветом. Добавьте «Лактилирование» в квадрат справа.
    17. Нажмите на «Идентификация» синим цветом. Измените FDR на 0.05. Убедитесь, что проверены вторые пептиды и совпадение между пробегами.
    18. Нажмите на Quantification без этикетки синим цветом. Отметьте пункты iBAQ и Top3.
    19. В правом верхнем углу нажмите на Performance.
    20. В нижнем разделе нажмите «Начать синим».
  3. Идентификация лактилированных белков
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце запуска MaxQuant будет получено несколько выходных файлов, таких как:
    • Лактилирование (K)Сайты: первичный интересующий файл — содержит специфическую информацию о лактилированных лизиновых остатках в точной пептидной последовательности (выявлен белок, локализация лактилирования по последовательности, интенсивность, уровень доверия).
    • Параметры лактилирования: содержит всю информацию о настройках и порогах, используемых при анализе MaxQuant.
    • Пептиды лактилирования: идентифицированные пептиды модифицированные и немодифицированные.
    • Группы лактилирования белков: выявленные группы белков и их связь с обнаруженной лактилацией.
    Использование этих файлов зависит от конкретного вопроса исследования. Следующий шаг описывает, как определить лактилированный участок.
    1. Откройте файл Lactylation (K)Sites в Excel.
    2. Дублировать вкладку внизу Lactylation (K)Sites , чтобы сохранить исходные данные.
    3. Отсортируйте от A до Z — обратные и потенциальные столбцы загрязнения. Если в некоторых строках есть значение, удалите эти строки.
    4. В этой новой вкладке сохраняйте только необходимые столбцы, такие как: (1) Белок:UniProt 14 Первичный номер акцексионирования, (2) Позиции внутри белков: прогнозируемое положение лактилирования, важно подтвердить как описано позже, (3) Названия белков, (4) Имена генов, (5) Количество лактилирования (K обнаружено на соответствующем пептиде), (6) Лактилирование (K) Вероятности (вероятность 1 в положении лактилирования), (7) Интенсивность (Сумма всех индивидуальных интенсивностей соответствующего пептида).
    5. Заполните все недостающие значения, такие как имена белков или имена генов.
    6. В столбце ''Белки'' храните только первый номер акцесса. Полученная таблица представляет все обнаруженные лактилированные пептиды вместе с наиболее вероятным белком, в котором этот пептид может находиться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку лактилирование не является распространённым ПТМ, ожидается, что от 100 до 500 пептидов будут идентифицированы как лактилируемые. Поскольку обнаруженные пептиды различаются от одного реплицирования к другому, возможно установить порог не менее обнаруженного в двух биологических репликах.
    7. Для подтверждения положения модифицированного остатка используйте инструмент выравнивания, такой как BLAST изNIH 15 или Align из UniProt16 с пептидной последовательностью в столбце ''Lactylation (K) Probabilities'' (стереть любую вероятность) и белковой последовательностью из базы данныхUniProt 17.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в одной белковой последовательности можно выявить несколько лактилированных участков, их можно одновременно выровнять. Это также поможет выявить дублирующиеся участки, которые могут находиться на разных пептидах, но находиться в одном и том же месте белковой последовательности.
    8. Анализ данных будет зависеть от конкретного исследовательского вопроса, но необходимо рассмотреть этапы нормализации, центрирования, масштабирования и преобразования логарифма перед проведением любого статистического анализа данных18.
    9. Для подтверждения лактилированных белков, выявленных анализом РС, приступайте к протоколу иммунопреципитации.

4. Иммунопреципитация (ИП)

  1. Экстракция белка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте на льду.
    1. Подготовьте IP-лизис/буфер для промывки (Таблица 3) и храните его при 4 °C перед использованием. Добавьте ингибиторы протеазы непосредственно перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки образца можно использовать клеточную гранулу, консервированную при -80 °C. Если вы работаете с новыми ячейками, следуйте шагам 4.1.2 и 4.1.3. В противном случае повторно суспензируйте ячеточную гранулу в том же объёме IP-буфера лизиса/промывки, как указано в шаге 4.1.2, и продолжайте с шагом 4.1.4.
    2. Добавьте 1 мл IP-лизиса/буфера для промывки и инкубируйте клетки при 4 °C в течение 10 минут.
    3. Берите клетки скребком и переносите лизис в микротрубку объёмом 1,5 мл.
    4. Инкубировать с плавным вращением от конца до конца в течение 30 минут при 4 °C.
    5. Центрифуга при 16 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
    6. Перенесите прозрачный супернатант в новую микротрубку объёмом 1,5 мл.
    7. Количественно измеряйте белок с помощью комплекта BCA согласно протоколу производителя.
  2. Предварительное очищение шариков и инкубация антител KL-LA
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте на льду. Для каждого экспериментального состояния подготовьте контрольную IP-трубку (IgG того же вида, что и антитело KL-LA ) и трубку для KL-LA IP.
    1. Перенесите 1 мг белка в новую микропробирку объёмом 1,5 мл. Завершите все образцы до того же конечного объёма с помощью IP-лизия/промывки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может выполняться с помощью магнитных или агарозных бусин. Для следующих этапов использовались магнитные шарики.
    2. Перенесите необходимый объём шариков в новую микротрубку объёмом 1,5 мл.
    3. Чтобы предварительно промыть шарики, намагничивайте шарики на 30 секунд или пока раствор не станет прозрачным. Сбросьте прозрачный супернатант. Промыйте шарики 3 раза с помощью 500 мкл IP-буфера для промывки. После каждой промывки сбрасывайте прозрачный супернатант. Добавляйте тот же объём IP-буфера, сколько и изначально взятые шарики.
    4. Инкубировать образцы белка с 10-15 мкл предварительно вымытых бусинок с плавным вращением от конца до конца в течение 20 минут при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 мг белка используйте 10-15 мкл магнитных шариков. Этот этап минимизирует связывание неспецифических белков с шариками во время протокола иммунопреципитации.
    5. Намагничивайте шарики на 30 секунд или пока раствор не станет прозрачным. Перенесите прозрачный супернатант в новую микротрубку объёмом 1,5 мл.
    6. Добавьте 1,5 мкл анти-KL-LAантитела в одну пробирку и соответствующее количество IgG в другую.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 мг белка в начале данного протокола используйте 1,5 мкг антител.
    7. Инкубировать образцы с мягким вращением от конца до конца ночью при 4 °C.
  3. KL-LA иммунопреципитация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте на льду.
    1. Подготовьте IP-лизис/буфер для промывки (Таблица 3) и храните его при 4 °C перед использованием. Добавьте ингибиторы протеазы непосредственно перед использованием.
    2. Предварительно промыйте бусины, как описано в шаге 4.2.3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 1 мг белка в начале этого протокола используйте 40 мкл магнитных шариков.
    3. Инкубировать образцы с 40 мкл заранее промытых магнитных шариков с плавным вращением от конца до конца в течение 4 часов при 4 °C.
    4. Намагничивайте шарики на 30 секунд или пока раствор не станет прозрачным. Соберите первый прозрачный супернатант. Промывайте шарики 3 раза с помощью 500 мкл IP-лизиса/буфера для промывки. После каждой мойки удаляйте прозрачный супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первый супернатант можно количественно измерить и использовать при западном блотинге (WB). Полезно оценить эффективность иммунопреципитации.
    5. Подвесьте бусины с помощью 20 мкл 2x Laemmli и 5% буфера β меркаптоэтанола.
    6. Инкубировать при 95 °C в течение 5 минут перед загрузкой на гель SDS-PAGE. В качестве альтернативы денатурированные образцы можно хранить при -20 °C в течение нескольких недель.
  4. Обнаружение WB
    1. Поставьте IP-лампы на магнитную подставку на 30 секунд, прежде чем взять образец и загрузить его на гель SDS-PAGE.
    2. Проведите анализ WB с использованием антитела к интересуемому белку и/илианти-K L-La антитела для подтверждения снижения лактилированного белка в 5% сывороточном альбумине (BSA). Вторичные антитела были разбавлены при 1:5000 при 5% BSA.
    3. Обнаружить диапазоны с помощью хемилюминесцентного обнаружения на основе HRP.

Результаты

В качестве примера, клеточная линия плоскоклеточной карциномы TE11 пищевода была культивирована до достижения слияния 80%. Следуя работе, показанной на рисунке 1 и анализе MaxQuant, описанному в этом протоколе, был определен лактилом. В этих клетках было выявлено 137 пептидов как потенциально лактилированные, представляющие собой 82 уникальных белка, так как на одном белке было выявлено несколько участков (рисунок 2A). Обратите внимание, что это не учитывает уникальные пептиды. Ожидается количество идентифицированных пептидов от 100 до 500 пептидов в этих экспериментах с плоскоклеточной карциномой пищевода.

Выявленные лактилированные белки связаны с несколькими биологическими процессами, такими как ремоделирование хроматина или сборка хроматина, которые уже были описаны в литературе как обогащённые лактилированными белками (рисунок 2B). Некоторые из первых выявленных лактилированных белков были гистонами, которые также встречаются в этих данных, например, гистон H1.2 (Таблица 4). Лактилирование можно было определить на нескольких различных остатках лизина одного белка. Например, на гистоне H1.2 были выявлены два участка лактилирования: лизины (K) 168 (вероятно) и 191. На первом пептиде (Таблица 4, строка 2) было отмечено, что остаток K168 имеет большую вероятность быть лактилированным с 0,733 на 1, тогда как вероятность K169 составляет всего 0,267. HNRNPA1 — хороший пример пептида, который потребуется выравнивать для определения правильного модифицированного остатка.

Для проверки лактилирования HNRNPA1 на основе результатов лактилома (Таблица 4) был проведён IP-анализ, направленный на эту посттрансляционную модификацию. Сначала для определения, какой тип шарика демонстрирует оптимальное взаимодействие сантителом K L-LA, были сравнены шарики G и шарики A/G. После проведения ИП с антителами кK L-LA и последующего результата WB противK L-LA наблюдалось заметное обогащение белков KL-LA по сравнению с входными показателями, как ожидалось, с обоими типами шариков (см. рисунок 3). Эти результаты демонстрируют эффективность и надёжность протокола в обогащении лактилированных белков. Заметных различий между обоими типами бусин, которые тестировались, не наблюдалось. Для проверки выявленных РС целей можно затем подтвердить конкретные IP. Например, была откалибрована лактилирование HNRNPA1, идентифицированное MS (Таблица 4). Специфическая полоса, соответствующая HNRNPA1, была обнаружена после KL-LA IP и HNRNPA1 WB, что указывает на то, что HNRNPA1 модифицируется лактилированием (рисунок 4). Хотя и G, и A/G шарики успешно иммунопреципитали целевой белок, более интенсивный сигнал HNRNPA1 наблюдается с помощью A/G шариков, что указывает на усиление аффинности или восстановления.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса лактиломного анализа. Сокращения: IP = иммунопреципитация; KL-LA = L-лактиллизин; LC-MS/MS = жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативные результаты для некоторых белков, полученных для лактилома клеток TE11. (A) Общее количество выявленных белков и пептидов. На одном белке можно определить несколько мест лактилирования. (B) Топ-5 биологических процессов, обогащённых для лактилированных белков в клетках TE11, полученных с помощью базы данных STRING. P-значение было скорректировано для многократных тестов с помощью Бенжамини-Хохберга. Число в каждой полосе отражает количество белков в сети, которые были идентифицированы как лактилированные из общего числа белков в данной генной онтологии (GO). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Иммунопреципитация KL-LA с использованием шариков G или A/G и обнаружение WB Pan-KL-LA в клетках TE11. ОбнаружениеPan-K L-LA служит важным контролем для подтверждения эффективности и специфичности иммунопреципитации этого PTM. Этот эксперимент гарантирует, что IP успешно обогащает белки, содержащие модификацию KL-LA . (*) указывает на тяжёлые и лёгкие цепи антител, как это явно видно в IP: IgG-линии (контрольный IP) (N = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Иммунопреципитация KL-LA с использованием шариков G или A/G и обнаружение HNRNPA1 с помощью WB. Обнаружение HNRNPA1 с помощью WB в специфических иммунопреципитациях KL-LA с использованием шариков G или A/G подтверждает его лактилирование в клетках TE11 (N = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой рисунка.

РешениеИтоговая концентрация
Мочевина8 м
Бикарбонат аммония1 М
HEPES20 мМ

Таблица 1: Буфер лизиса лактилома. Подготовка в воде класса MS и регулировка pH до 8.

Раствор — буфер для промывки с лактиломомИтоговая концентрация
NaCl100 мМ
EDTA1 мМ
Tris-HCl20 мМ
Добавьте для IP-буфера LactylomeИтоговая концентрация
NP-400.5%

Таблица 2: Лактиломный промывочный буфер и IP-буфер. Подготовка в воде MS-класса и регулировка pH до 8 для обоих растворов.

РешениеИтоговая концентрация
Хлорид натрия100 мМ
Фторид натрия50 мМ
Tris-HCl (pH 7.5)50 мМ
β-глицерофосфат40 мМ
EDTA (pH 8)5 мМ
Глицерин5%
Triton X-1001%
Добавьте свежими:
Коктейль с ингибитором протеазы 100X1X
PMSF1 мМ
Ортованадате0,2 мМ

Таблица 3: IP-лизис/буфер промывания. Он должен быть свободен от денатураторов, так как они могут дестабилизировать присутствие PTM на белках.

Положения внутри белковБелокНазвания белковГенные названияКоличество лактилирования (K)Вероятности лактилирования (K)Интенсивность
168P16403Гистон H1.2HIST1H1C1KPAAATVTK(0.733)K(0.267)1.98E+04
191P16403Гистон H1.2HIST1H1C1SAAK(1)AVKPK6.91E+04
51A8K2U0Белок, похожий на альфа-2-макроглобулин, 1A2ML11VCLDLSPGYSDVK(1)3.18E+04
5; 5; 5C9JMM0Гомолог белка Chromobox 3CBX31ASNK(1)TTLQK1.21E+05
10; 10; 10C9JMM0Гомолог белка Chromobox 3CBX31TTLQK(0.828)MGK(0.172)2.49E+05
112; 141O76095-2Белок JTBJTB2K(0.858)ALEK(0.18)VRK(0.962)1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245;
253; 169; 48; 100; 95; 93; 79;
23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73;
51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин A1HNRNPA11SSGPYGGGGQYFAK(1)PR6.13E+04

Таблица 4: Репрезентативные результаты по лактилированным пептидам, полученные для линии плоскоклеточных карциномы пищевода TE11. Эта таблица получена после анализа MaxQuant.

Обсуждение

Этот протокол описывает, как иммунопреципитация белков, модифицированных KL-LA, может использоваться при МС для обнаружения новых лактилированных белков и их мест лактилирования. Этот лактиломный протокол выполняется с использованием конъюгированных бусин, но может быть реализован с помощью антител KL-LA или даже антител кK D-LA , согласно исследованию. Если использовать антитела вместо сопряжённых бусин, выбор поликлонального антитела способствует формированию более плотных комплексов, так как они могут связываться с несколькими эпитопами; однако такой подход может привести к вариативности. Одним из преимуществ использования сопряжённых бусинок является то, что они предотвращают выщелачивание антителами — высвобождение из твёрдой опоры — что может загрязнить образцы РС. Это также более эффективно по времени, чем использование неконъюгированного антитела.

Кроме того, важно отметить, что количество идентифицированных пептидов в этом анализе может зависеть от множествафакторов. Во-первых, специфичность антител играет ключевую роль в обеспечении улавки правильного белка. Добавление этапа предварительного очищения с агарозными шариками может стать способом устранения неспецифических взаимодействий. С другой стороны, неизвестно, влияет ли лактилирование на пищеварение трипсина, так как оно расщепляет пептиды на C-конечной стороне остатка аргинина, но, что важнее всего, остаток лизина. Если это так, это может привести к снижению покрытия пептидами. Поэтому можно рассмотреть другие варианты протеаз. В этом протоколе параметр «Макс. пропущенные расщепления» увеличен с учётом этого ограничения. Наконец, следует учитывать подготовку и обращение образцов, например, использование перчаток для предотвращения загрязнения образцов кератином из кожи, или устойчивость модификации, поскольку оборот PTM — это динамический и иногда быстрыйпроцесс 6.

В отличие от более широкого подхода к РС, который привёл к низкому обнаружению ПТМ с низким содержанием, таким как лактилирование, идентификация обогащённых пептидовK L-LA с помощью протеомики на основе МС позволяет проводить детальный анализ сайтов ПТМ, например, выявление новых участков лактилирования и лактилированныхбелков 19. Western blot может дать информацию о общем паттерне лактилирования, присутствующей в клетках, но не может повлиять на белкоспецифическую лактилированность. Таким образом, IP является широко используемым подходом для подтверждения PTM 20, обнаруженного при РС. Тест на лигирование близости (PLA) — ещё один метод, который может быть использован для подтверждения лактилирования потенциальных целей, выявленныхпротеомикой 21. Этот метод также может указывать на локализацию модифицированных белков, но имеет более низкую специфичность. Использование подхода, специфического для лактилирования, подходит для широкого скрининга ПТМ, но может быть интересно провести белок-специфический ИС в зависимости от конкретного исследовательского вопроса.

При количественной оценке доли определённого лактилированного белка в общем экстракте белка одного ИП недостаточно. Хотя IP с использованием шариков KL-LA позволяет захватывать лактилированные белки, он не позволяет точно определить долю лактилирования, так как ограничивается обогащением целевых белков. Поэтому требуется масс-спектрометрия, обеспечивающая более детальный анализ, позволяющий точное количественное измерение лактилирования. Таким образом, проведение IP потенциально лактилированного белка с использованием антитела к этому белку, затем масс-спектрометрический анализ может определить процент лактилированных белков в общем образце белка, а выполнение IP является эффективным способом подтвердить лактилирование белков, выявленных РС как лактилированные.

В ИП с использованием неконъюгированных антител оптимизация соотношения шариков к антителам крайне важна для обеспечения оптимального захвата лактилированных белков. Действительно, баланс между этими двумя компонентами напрямую влияет на специфичность и эффективность ИП. Избыток антител может привести к неспецифическому связыванию, что увеличивает фоновый шум и снижает общую точность обнаружения. В отличие от этого, обратное может привести к неэффективному обогащению целевых белков, что приводит к ослаблению сигналов и снижению чувствительности. Эти технические аспекты критически важны для получения надёжных и точных результатов при изучении лактилированных белков.

В заключение, этот протокол можно использовать для мониторинга изменений в профилях лактилирования после дерегуляции гомеостаза, таких как рак 8,10, которые могут влиять на ответ, связанный с лекарствами. Идентификация биомаркеров даже может быть достигнута этим методом. Применяемая к нескольким клеточным линиям, типам тканей и даже биопсиям пациентов, эта методика обладает потенциалом для углубления понимания клеточной сигнализации, управляемой ПТМ, при заболеваниях или нормальных условиях.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Мы искренне благодарим всех членов лаборатории Жиру за научные обсуждения. Мы благодарны платформе протеомной и масс-спектрометрии от факультета медицины и медицинских наук Университета Шербрука за предоставленные услуги и рекомендации. VG поддерживается Советом по естественным наукам и инженерии Канады (RJPIN-2019-06185) и Канадским институтом исследований здоровья (178171). VG занимает должность Канадского исследовательского кресла уровня 2 по биологии стволовых клеток желудочно-кишечного тракта. MH является обладателем стипендий от Центра исследований воспаления и онкологии пищеварительной науки Университета Шербрука, Университета Шербрука — Фонда Сева, CRCHUS, программы TRaIning A New generation of Research в гастроэнтерологии и жизни (TRIANGLE), а также FRQ. FMB является стипендиатом FRQS Merit Research Scholar (366044). VG и FMB являются членами финансируемого FRQS «Centre de Recherche du CHUS».

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 мкл Zip Tip C18 Пирс87784
Acclaim PepMap100 C18Корпорация Dionex1649460,3 мм идентификатор x 5 мм
Ацетонитрил (класс MS)ФишерA955-4
Бикарбонат аммонияСигма-ОлдричA6141-500
Анти-HNRNPA1 моноклональные антителаNovus Biologicals NB100-672
Анти-L-лактиллизин (KL-La) моноклональное антителоPTM-BioPTM1401RM
Антимышиный IgG, антитела, связанные с HRPCST7076S
Антикроликовый IgG, антитела, связанные с HRPCST7074S
Azure 280БиосистемыAZI280-01
Комплект BCAТермо Фишер СайентификP123227
Сывороточный альбумин Бовина (BSA)Wisent800-095-EG
Captive Spray nanoESI источникBruker Daltonics
ХлорацетамидСигма-ОлдричC0267
Clarity Max Western ECL подложкаБио-Рад1705062
Дитиотрейтол (DTT)Термо Фишер СайентификR0861
Бусины Dynabeads Protein G для иммунопреципитацииТермо Фишер Сайентифик10004D
EDTAСигма-ОлдричE9884
Муравьиная кислота (FA; Степень магистра)Термо Фишер СайентификA117-50
ГлицеринFisher ScientificBP229-1
HEPES (1 год)Wisent330-050-EL
Гиперсеп C18 колонка 100 мгФишер60108-302
Агарозные бусины KL-LAPTM-BioPTM-1404
Laemmli 2X (SDS, бромофенол)Вайзент, Дж.Т. Бейкер800-100-CG, D293-01
Микротрубка с низким уровнем связывания 0,5 млСарштедт72.704.600
Микротрубка с низким уровнем связывания 1,5 млТермо Фишер СайентификP190410
Микротрубка объёмом 1,7 млAxygenMCT-175-C
Система NanoElute HPLCBruker DaltonicsРазмер частиц 1,9 мкм, 75 мкм I.D. x 25 см
Нормальное поликлональное антитело IgG у кроликовМиллипор Сигма12-370
PepSepBruker Daltonics1811112
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Wisent311-425-CL
PMSFТермо Фишер Сайентифик36978
Коктейль с ингибиторами протеазы (PIC)Сигма-ОлдричP8340-5
Магнитные частицы Sera-Mag SpeedBeads Белок A/GТермо Фишер Сайентифик09-981-920
Хлорид натрияСигма-ОлдричS9888-500
Фторид натрияСигма-ОлдричS1504
Ортованадат натрияСигма-ОлдричS6508
TimsTOF профессиональный масс-спектрометр  Bruker Daltonics
Трифторуксусная кислота (TFA)Термо Фишер СайентификA116-50
Tris-HClWisent600-125-IK
Triton X-100Сигма-ОлдричX100
Трипсин (степень магистратуры)Пирс90058
МочевинаТермо Фишер СайентификU15-500
Вакуум плюсЭппендорф22820168
Вода (класс MS)VWR10803-890A
&бета;-глицерофосфатСигма-ОлдричG5422
&бета;-меркаптоэтанолСигма-ОлдричM3148

Ссылки

  1. Li, H., Sun, L., Gao, P., Hu, H. Lactylation in cancer: Current understanding and challenges. Cancer Cell. 42 (11), 1803-1807 (2024).
  2. Lu, Z., et al. Lactylation: The emerging frontier in post-translational modification. Front Genet. 15, 1423213(2024).
  3. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  4. Niu, Z., et al. HBO1 catalyzes lysine lactylation and mediates histone H3K9la to regulate gene transcription. Nat. Commun. 15 (1), 3561(2024).
  5. Zhao, Q., et al. Non-enzymatic lysine D-lactylation induced by glyoxalase II substrate SLG dampens inflammatory immune responses. Cell Res. 35 (2), 97-116 (2025).
  6. Moreno-Yruela, C., et al. Class I histone deacetylases (HDAC1-3) are histone lysine delactylases. Sci Adv. 8 (3), eabi6696(2022).
  7. Yang, W., et al. Hypoxic in vitro culture reduces histone lactylation and impairs pre-implantation embryonic development in mice. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 57(2021).
  8. Yang, Z., et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat. Metab. 5 (1), 61-79 (2023).
  9. Zhang, N., et al. Protein lactylation critically regulates energy metabolism in the protozoan parasite Trypanosoma brucei. Front Cell Dev Biol. 9, 719720(2021).
  10. Yu, J., et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m(6)A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 22 (1), 85(2021).
  11. Kim, M. -S., Zhong, J., Pandley, A. Common errors in mass spectrometry-based analysis of post-translational modifications. Proteomics. 16 (5), 700-714 (2016).
  12. Conradi, C., Shiu, A. Dynamics of post-translational modification systems: Recent progress and future directions. Biophys J. 114 (3), 507-515 (2018).
  13. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  14. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
  15. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  16. Zaru, R., Orchard, S. UniProt Consortium. UniProt Tools: BLAST, Align, Peptide Search, and ID Mapping. Curr Protoc. 3 (3), e697(2023).
  17. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2025. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D609-D617 (2025).
  18. Sun, J., Xia, Y. Pretreating and normalizing metabolomics data for statistical analysis. Genes Dis. 11 (3), 100979(2023).
  19. Yang, Y., Qiao, L. Data-independent acquisition proteomics methods for analyzing post-translational modifications. Proteomics. 23 (7-8), e2200046(2023).
  20. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein post-translational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
  21. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. J Vis Exp. (185), e64294(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи