Этот протокол описывает систему фиксации ультразвукового преобразователя, специально разработанную для ультразвуковой стимуляции спинного мозга у бодрствующих мышей. В методе используется система фиксации, обеспечивающая точное позиционирование ультразвукового преобразователя и в то же время позволяющая испытуемым свободно двигаться без ущерба для точности стимуляции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Фиксация ультразвуковых преобразователей для нейромодуляции спинного мозга у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сфокусированный ультразвук (FUS) появился как инновационная неинвазивная технология нейромодуляции, демонстрирующая значительный потенциал для нервной регуляции спинного мозга. Тем не менее, достижение стабильной фиксации датчика вдоль позвоночного столба представляет собой значительные технические проблемы. Существующие методы иммобилизации часто требуют длительного обезболивания животных или демонстрируют недостаточную надежность адгезии. Эти критические ограничения подчеркивают настоятельную необходимость разработки новой парадигмы фиксации, обеспечивающей как операционную стабильность, так и физиологическую совместимость. Этот протокол представляет собой инновационную систему фиксации ультразвукового датчика для стимуляции спинного мозга у бодрствующих, свободно движущихся мышей. Создание надежного метода точного размещения ультразвукового датчика на позвоночном столбе является ключевым моментом в экспериментах по нейростимуляции. Этот метод объединяет три этапа: хирургическое обнажение тела позвонка Т13, прецизионное шлифование остистого отростка для создания плоского контактного интерфейса и надежное адгезивное соединение металлической основы и коллиматора с позвоночным столбом с использованием материала основы протеза и адгезивной смеси. Он обеспечивает естественное двигательное поведение за счет неограниченных движений и обеспечивает стабильное позиционирование с минимальными пространственными колебаниями между сеансами, облегчая исследование ультразвуковых вмешательств в спинной мозг на животных моделях в сознании. Это особенно актуально для исследований, требующих поведенческих оценок при восстановлении травм позвоночника, модуляции гемато-спинномозгового барьера и механизмов хронической боли. Решая важнейшую техническую проблему в исследованиях нейромодуляции у бодрствующих животных, этот протокол предлагает стабильный интерфейс преобразователь-спинальный мозг без ограничения движений, прокладывая путь к более точным и надежным экспериментальным результатам.
Введение
Спинной мозг является важнейшим узлом для интеграции информации между центральной и периферической нервной системами, что делает его ценным для клинических исследований в таких областях, как передача болевого сигнала, реконструкция моторных нейронных сетей и регуляция нейропластичности. Сфокусированный ультразвук (FUS), новая технология неинвазивной нейромодуляции, стал важным средством нервной регуляции спинного мозга. Благодаря своим физическим характеристикам проникновения в глубокие ткани, пространственному разрешению на миллиметровом уровне и контролируемым параметрам выхода энергии, его применение простирается от фундаментальных исследований нейромеханизмов до доклинических исследований трансляции различных патологических моделей спинного мозга.
Исследования показывают, что ФУС может регулировать нервные цепи спинного мозга двумя способами: либо ингибируя, либо активируя их с помощью термических и механических воздействий. Он также характеризуется своей временной обратимостью и безопасностью для тканей 1,2,3. При изучении моделей травм спинного мозга ФУС улучшил двигательные способности крыс, модулируя воспалительные реакции и способствуя восстановлению нейронов 4,5,6. Кроме того, было показано, что ФУС открывает гемато-спинной барьер и повышает эффективность местной доставки лекарств за счет эффекта кавитации, опосредованной микропузырьками 7,8. В области нейропатической боли Liao et al. подтвердили, что FUS эффективно облегчает проявления нейропатической боли у крыс, регулируя экспрессию KCC2 и ингибируя путь CaMKIV KCC2. Song et al. продемонстрировали, что низкоинтенсивная ЦФУС, применяемая в поясничном отделе спинного мозга, значительно снижает механическую аллодинию и подавляет активацию микроглии у крысы с хронической констрикционной травмой модели10. Достижение точной модуляции спинного мозга с помощью FUS зависит от пространственной стабильности системы доставки ультразвуковой энергии. Современные стратегии фиксации в основном делятся на две категории: 1) Метод жесткой фиксации: он обеспечивает точное позиционирование с помощью стереотаксической рамки, но требует непрерывной анестезии, которая подавляет нейронную активность испытуемых и влияет на достоверность поведенческих оценок 1,2,3,4,10 ; 2) Гибкий метод фиксации: позволяет проводить исследования на находящихся в сознании субъектах с использованием устройства с эластичным ремнем, но из-за большой подвижности позвоночника возникают ошибки смещения и отслоение датчика 6,8,9. Кроме того, геометрическая неоднородность пластинки позвоночного столба приводит к значительному затуханию ультразвуковой энергии, снижая эффективность нейронной модуляции 7,8.
В этом исследовании новаторски предложена схема фиксации имплантируемого сфокусированного ультразвукового преобразователя для исследования нейронной модуляции спинного мозга у находящихся в сознании, свободно двигающихся мышей. Этот протокол использует минимально инвазивный хирургический подход для интеграции металлической основы, коллиматора и позвоночного столба, поддерживает многократное ношение ультразвукового датчика, обеспечивает постоянство ультразвуковой мишени и поддерживает ослабление ультразвуковой энергии через пластинку в приемлемом диапазоне. Разработанная методология устраняет критические ограничения существующих подходов, тем самым позволяя проводить более надежные и воспроизводимые эксперименты по нейромодуляции спинного мозга у бодрствующих животных. Ключевые параметры включают разрез по средней линии 2,5 см в точке T13, фиксацию металлической основы из нержавеющей стали и объемное соотношение материала основы протеза и цианоакрилатного клея 3:1. К ограничениям относятся умеренная хирургическая травматичность и зависящая от оператора точность подготовки поверхности кости.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры на животных, описанные в настоящем исследовании, были одобрены Институциональным этическим комитетом по экспериментам на животных Шэньчжэньского института передовых технологий (номер сертификата: SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313). Во всех экспериментах использовались самцы мышей C57BL/6J (в возрасте 8 недель). Мыши на момент операции весили 18-22 г.
1. Индукция и поддержание анестезии (5 ± 1 мин)
- Предварительно зарядите наркозный контур на 5 минут.
- Установите индукционную камеру на подачу 4% изофлурана в медицинский воздух со скоростью потока 2 л/мин.
- Переходите на вентиляцию в лицевой маске после потери выпрямляющего рефлекса.
- Отрегулируйте испаритель так, чтобы концентрация составляла 1,5-2% изофлурана.
- Поддерживайте температуру тела мыши с помощью согревающего одеяла до 37 °C с целевым диапазоном 36-38 °C на протяжении всей анестезии.
- Применяют офтальмологическую мазь Террамицин.
2. Позиционирование (1 ± 1 мин)
- Используйте регулируемый стереотаксический адаптер для мыши.
- Положение мыши лежа с выравниванием позвоночника для поддержания физиологического искривления позвоночника.
- Закрепите головку мыши с помощью ушных вкладышей.
- Расположите конечности симметрично.
3. Подготовка операционного поля (1 ± 1 мин)
- С помощью электрической машинки для стрижки (зазор между лезвиями 0,1 мм) удалите волосы с места операции.
- Следите за тем, чтобы площадь депиляции составляла примерно 3 см × 1 см.
- Выполните три прохода стрижки в направлении, противоположном росту волос.
4. Разрез и подход (2 ± 1 мин)
- Протрите участок йодофором 3 раза (с интервалом 30 с).
- Пальпируйте последнее ребро (прикрепленное к позвонку Т13 у мышей) и используйте его в качестве
Главный ориентир. Сделайте разрез 2,5 см на уровне позвонка Т13 вдоль
дорсальная срединная линия с помощью скальпеля. - Последовательно рассекайте подкожную фасцию.
- Обнажите параспинальные мышцы через анатомические плоскости.
5. Параспинальная мышечная диссекция (5 ± 1 мин)
- Установите увеличение хирургического микроскопа в 5 раз для оптимальной визуализации параспинальных мышц и позвоночных структур.
- Выполните резкое рассечение параспинальных мышц с помощью микроножниц.
- Полностью рассекайте дорсальные и боковые параспинальные мышцы с сохранением вентральных мышечных слоев.
- Остановите кровотечение с помощью рассасывающейся кровоостанавливающей марли.
6. Монтаж металлического основания (1 ± 1 мин)
- Закрепите фиксирующий стержень (пластик) на стереотаксический адаптер.
- Установите изготовленное на заказ металлическое основание (нержавеющая сталь, 0,28 г) на дистальном конце стержня (Рисунок 1A).
- Расположите изготовленное на заказ металлическое основание двусторонне в спинномозговых поперечных отростках T13.
- Проверьте устойчивость муфты.
7. Подготовка костного интерфейса (2 ± 1 мин)
- Удалите остаточную мышечную ткань из пластинки и остистых отростков под операционным микроскопом.
- Добиться полного гемостаза можно с помощью компрессии стерильного ватного плеса.
- Создайте плоскую контактную поверхность с помощью прецизионного костного сверла с непрерывным орошением солевым раствором. Управляйте дрель со скоростью 5 000-10 000 об/мин, чтобы свести к минимуму выделение тепла. Во время бурения надевайте щиток для глаз и маску.
- Удалите костную пыль ватными палочками, смоченными в солевом растворе.
8. Герметизация системы фиксации (3 ± 1 мин)
- Смешайте материалы основы для зубных протезов и цианоакрилатный клей (клей 502) в соотношении 3:1. Надевайте нитриловые перчатки и защитные очки, чтобы предотвратить попадание кожи в глаза.
- Прикрепите ультразвуковой коллиматор (пластик, 0,6 г, рисунок 1Б) и металлическую основу к позвоночному столбу с помощью клеевой смеси (рисунок 1В).
- Дайте клеевой смеси застыть при контролируемых условиях окружающей среды (24 ± 1 °C, относительная влажность 40-60%). Сохраняйте статическое положение в течение 60 с до визуального подтверждения полного затвердевания (потеря блеска поверхности и образование жесткой границы).
- Отделите металлическую основу от пластикового фиксирующего стержня.
- Проверка стабильности фиксации: Приложите мягкое вращательное усилие к металлическому основанию в горизонтальной плоскости. Наблюдайте за соотношением коллиматор-позвонок при 5-кратном увеличении при любом смещении (допуск <0,1 мм). Если движение превышает допустимое значение, повторно нанесите клеевую смесь (шаг 8.2) и повторите отверждение (шаг 8.3).
9. Закрытие раны (1 ± 1 мин)
- Выровняйте края намотки, чтобы полностью герметизировать металлическую основу.
- Выполните прерванное наложение швов шелковыми нитями 4-0.
- Протрите разрез йодофором.
- Удалите остаточные остатки крови/костей в месте ламинарного воздействия коллиматора и упакуйте стерильной ватой для герметизации и гемостаза.
10. Послеоперационное ведение
- Терморегуляция: держите мышь на согревающем одеяле (37 °C) до полного восстановления способности передвигаться (обычно через 2-3 часа после анестезии).
- Послеоперационная антибиотикопрофилактика: Введение цефазолина натрия (50 мг/кг, растворенного в 0,9% физиологическом растворе до концентрации 50 мг/мл) путем подкожной инъекции в область дорсальной шеи сразу после операции.
- Соблюдайте гигиену раны. Очищайте рану ватным тампоном, смоченным в физрастворе, один раз в день в течение первых 3 дней и ежедневно осматривайте место операции на наличие признаков инфекции, расхождения или воспаления.
- Послеоперационная обезболивание: Вводите карпрофен (5 мг/кг, подкожно) каждые 12 ч в течение 3 дней после операции11.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1D показана система фиксации, имплантированная в живую мышь после восстановления.
11. Утилизация опасных отходов
- Собирайте костную пыль и загрязненные кровью материалы в герметичные пакеты с маркировкой «Биологическая опасность» для транспортировки в лицензированное учреждение по утилизации медицинских отходов.
- Поместите неотвержденный материал основы зубных протезов и остатки клея 502 в герметичные химически стойкие контейнеры с маркировкой «Химические отходы» и храните их в специально отверженном вентилируемом шкафу для утилизации в соответствии с протоколами обращения с химическими отходами.
- Выбросьте иглы, лезвия скальпеля и костяные сверла в устойчивые к проколам контейнеры с острыми предметами, помеченные этикетками «Biohazard».
12. Предупреждения по технике безопасности
- При работе с материалами основы зубных протезов избегайте прямого контакта с кожей, надевайте нитриловые перчатки и защитные очки, а также выполняйте смешивание и отверждение в хорошо вентилируемом вытяжном шкафу, чтобы свести к минимуму вдыхание летучих мономеров.
- Утилизируйте остаточный материал как химические отходы в соответствии с институциональными рекомендациями. Для цианоакрилатных адгезивов 502 предотвратить попадание на кожу или в глаза и немедленно промыть водой в течение 15 минут при контакте, обратившись за медицинской помощью. Используйте их в проветриваемых помещениях, храните в прохладных, сухих местах вдали от источников возгорания и избегайте контакта с хлопчатобумажными или шерстяными тканями.
- При использовании прецизионных дрелей закрепите наконечник, наденьте лицевой щиток и хирургическую маску, а также орошите место сверления солевым раствором для предотвращения термической травмы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Испытание в открытом поле
Испытание в открытом поле было разработано для оценки потенциальных изменений в поведении мышей после хирургического вмешательства (рис. 2A). Стандартная открытая полевая камера размером от 40 см × 40 см была использована для обеспечения достаточного пространства для активности мышей при сохранении относительно стабильных условий окружающей среды и минимизации внешнего вмешательства. Эксперимент состоял из двух фаз: до операции и через 7 дней пос...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом исследовании представлен новый протокол сопряжения позвонков, который способствует точной ультразвуковой нейромодуляции спинного мозга у бодрствующих, свободно ведущих себя мышей. В отличие от традиционных подходов к фиксации, эта методология преодолевает ограничения традиционных подходов к фиксации. В отличие от жестких стереотаксических каркасов, требующих непрерывной анестезии (которая подавляет нейронную активность и усложняет поведенческие оценки) и эл...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана проектом научно-исследовательского стартапа высокого уровня больницы Университета Гонконга в Шэньчжэне в рамках гранта HKUSZH202207003. Мы искренне благодарим всех сотрудников лаборатории за их помощь в оптимизации протокола и уходе за животными, а также Шэньчжэньский институт передовых технологий Китайской академии наук (SIAT) за их институциональную поддержку.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Индукционная камера для анестезии | Шэньчжэнь RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Цианоакрилатный клей (клей 502) | Пекинский химический завод | https://item.taobao.com/item.htm? detail_redpacket_pop=true& id=736 869038961& LTK2=1752156592779 MDBP47QQP4vyV57MQ156E& ns=1& priceTId=214780251752156543206 3926e1996& query=502%E8%83% B6%E6%B0%B4%20%E5%8C%97 %E4%BA%AC%E5%8C%96%E5% B7%A5%E5%8E%82& skuId=52584 34238219 | |
| Материалы основы зубных протезов | Нью Век Дентал | https://www.sncdental.com/product-item-11.html | |
| Фиксирующий стержень | Обычай | ||
| Изофлуран | Шэньчжэнь RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Металлическая основа | Обычай | ||
| Микроинструмент | Шэньчжэнь Цзунши Научные инструменты Ко., Лтд. | ||
| Прецизионное сверло | Шэньчжэнь RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Многоканальная система анестезии для мелких животных | Шэньчжэнь RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html | |
| Стереотаксический адаптер для мышей и молодняка крыс | Чанша Маюэ | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop<чел/> =true& id=651346369142& ltk2=1752 157416717wlsrozz5uroehtbq5ycim4 & ns=1& priceTId=214781ce1752157 3520498589e101a& query=%E8%84 %91%E7%AB%8B%E4%BD%93%E5%AE% 9A%E4%BD%8D%E4%BB%AA%20% E9%95%BF%E6%B2%99%E8%BF% 88%E8%B6%8A& skuId=4891677573 207& spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam=%7B%22aplus_abtest% 22%3A%22a478799868a3178d0dd 433b763909e16%22%7D& xxc= taobaoSearch | |
| Хирургический микроскоп | Шэньчжэнь Цзунши Научные инструменты Ко., Лтд. | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Хирургический шовный материал (пролен) | Ethicon (Johnson & Джонсон) | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop<чел/> =true& id=774292384846& ltk2= 1752157506907c0321finubb5 rpkub6av6n& ns=1& priceTId= 214781ce1752157493734800 4e101a& query=%E5%BC%B A%E7%94%9F%E7%BC%9D %E7%BA%BF& skuId=594224 1331046& spm=a21n57.1.hoverI | |
| Террамицин Офтальмологическая мазь | Компания Pfizer | https://theterramycin.com/terramycin-ophthalmic-ointment/ | |
| Ультразвуковой коллиматор | Обычай |
Ссылки
- Song, W., et al. Transspinal focused ultrasound suppresses spinal reflexes in healthy rats. Neuromodulation. 27 (4), 614-624 (2024).
- Tsehay, Y., et al. Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (7), 1992-2001 (2023).
- Kim, E., Kum, J., Kim, H. Trans-spinal focused ultrasound stimulation selectively modulates descending motor pathway. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 30, 314-320 (2022).
- Hong, Y. -R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Sci Rep. 12 (1), 3636(2022).
- Hwang, B. Y., et al. Ultrasound in traumatic spinal cord injury: A wide-open field. Neurosurgery. 89 (3), 372-382 (2021).
- Liao, Y. -H., et al. Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the l4-l5 sections of rats following spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 16, 882127(2022).
- Payne, A. H., et al. Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability. Neural Regen Res. 12 (12), 2045-2049 (2017).
- Fletcher, S. -M. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening. Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).
- Liao, Y. -H., Wang, B., Chen, M. -X., Liu, Y., Ao, L. -J. Lifu alleviates neuropathic pain by improvingthe kcc2 expression and inhibiting the camkiv-kcc2 pathway in the l4-l5 section of the spinal cord. Neural Plast. 2021, 6659668(2021).
- Song, W., Giannotti, A., Bekiaridou, A., Bloom, O., Zanos, S. Low intensity trans-spinal focused ultrasound reduces mechanical sensitivity and suppresses spinal microglia activation in rats with chronic constriction injury. Bioelectron Med. 11 (1), 8(2025).
- Glasenapp, A., Bankstahl, J. P., Bähre, H., Glage, S., Bankstahl, M. Subcutaneous and orally self-administered high-dose carprofen shows favorable pharmacokinetic and tolerability profiles in male and female C57bl/6j mice. Front Vet Sci. 11, 1430726(2024).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
