Мультиомические методы профилирования переходов состояний хроматина в холангиоцитах мышей с низким входом

Краткое содержание

В данной рукописи представлен комплексный протокол для низковходного ChIP-seq для профилирования модификаций гистонов и ATAC-seq для оценки доступности хроматина в небольших количествах первичных холангиоцитов мышей.

Аннотация

Поликистоз печени (PLD) — это наследственное заболевание, характеризующееся образованием заполненных жидкостью кист, происходящих из холангиоцитов, что приводит к прогрессирующему заболеванию и значительному снижению качества жизни пациентов. Современные методы лечения PLD неадекватны, что подчеркивает необходимость новых терапевтических стратегий. Роль эпигенетической регуляции в прогрессировании PLD, в частности доступности хроматина и модификаций гистонов, остается недостаточно изученной. Традиционные методы эпигенетического профилирования, такие как ChIP-seq и DNase-seq, требуют большого количества клеток, которые трудно получить из первичных холангиоцитов. Чтобы решить эту проблему, мы оптимизировали протоколы ChIP-seq и ATAC-seq с низким уровнем ввода для малого количества первичных холангиоцитов. Эти подходы позволяют анализировать модификации гистонов и доступность хроматина с минимальным вводом клеток. Низкозатратный ChIP-seq использует микрококковую нуклеазу (MNase) для фрагментации ДНК, в то время как ATAC-seq использует транспозазу Tn5 для захвата открытых участков хроматина. Эти методы мультиомики дают ценную информацию о динамике состояния хроматина во время переходов судьбы холангиоцитов при PLD и других заболеваниях желчевыводящих путей. Важно отметить, что оптимизированные протоколы надежно применимы к другим первичным клеткам с низким уровнем входа, что позволяет исследовать эпигенетические механизмы в различных клеточных контекстах. В данной работе представлен системный подход к изучению изменений состояния хроматина, способствующий разработке эпигенетических терапевтических стратегий для PLD и связанных с ним заболеваний.

Введение

PLD является наследственным заболеванием, характеризующимся развитием множественных заполненных жидкостью кист, происходящих из холангиоцитов. По мере того, как эти кисты постепенно разрастаются, они серьезно влияют на качество жизни пациентов ^1,2. Существующие стратегии лечения PLD неадекватны, обеспечивая лишь ограниченные преимущества, часто приводя к высокой частоте рецидивов и осложнений ^3,4. Таким образом, существует острая потребность в более безопасных и эффективных терапевтических подходах для решения нерешенных клинических проблем в лечении PLD.

В нормальных условиях холангиоциты остаются в покое, тогда как при PLD они демонстрируют чрезмерную пролиферацию, что является ключевым фактором прогрессирования заболевания ^5,6. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этого кистозного перехода, остаются неясными. В то время как эпигенетическая регуляция, включая доступность хроматина и модификации гистонов, играет жизненно важную роль в переходах к судьбе клеток ^7,8, ее роль в прогрессировании PLD остается недостаточно изученной. Тем не менее, многие методы эпигенетического профилирования требуют большого количества клеток. Традиционный ChIP-seq, который основан на фрагментации хроматина методом ультразвуковой обработки, а также анализы доступности хроматина, такие как DNase-seq и MNase-seq, обычно требуют более 10-6 клеток, что значительно превышает количество, полученное из первичных холангиоцитов.

В данной рукописи представлен всеобъемлющий протокол для низковходного ChIP-seq ^9,10,11 для профилирования модификаций гистонов и ATAC-seq 11,12,13 для оценки доступности хроматина в низком количестве первичных холангиоцитов. Низкозатратный ChIP-seq использует MNase для фрагментации ДНК⁹, в то время как ATAC-seq захватывает фрагменты ДНК из открытых участков хроматина с помощью транспозазы Tn5¹². Мультиомический анализ с использованием этих подходов дает ценную информацию о динамике состояния хроматина во время переходов судьбы холангиоцитов при PLD и других заболеваниях желчевыводящих путей, тем самым способствуя разработке эпигенетически-таргетной терапии.

Протокол

1. Приготовление растворов и холангиоцитов для ATAC-seq

1. Не менее чем за 1 день до начала эксперимента ATAC-seq приготовьте буфер для лизиса ATAC с использованием реагентов, перечисленных в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса ATAC можно хранить при температуре 4 °C в темноте не менее 1 месяца.
2. Для свежевыделенных первичных холангиоцитов¹⁴ подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра сразу после выделения и приступайте к эксперименту ATAC-seq.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чем раньше, тем лучше свести к минимуму влияние на жизнеспособность клеток. Однако, если держать на льду, то в течение 2 часов, как правило, не проблема.

2. ATAC-seq

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 100 000 холангиоцитов для ATAC-seq. Храните образцы и растворы на льду. Для эксперимента ATAC-seq вся процедура занимает примерно 2 дня.

1. Центрифугируйте при 500 × г в течение 5 мин при 4 °C.
2. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 200 мкл буфера для лизиса ATAC, содержащего ингибитор протеазы, аккуратно перемешайте пипеткой и выдерживайте на льду в течение 20 минут. В течение первых 10 минут аккуратно пипеткой перемешать.
3. Центрифуга при 1 500 × г в течение 10 мин при 4 °C.
4. Приготовьте буфер для транспозиционной реакции (50 мкл), смешав 3 мкл смеси ферментов из набора ATAC DNA Library Prep Kit, 10 мкл 5x буфера из набора ATAC DNA Library Prep Kit и 37 мкл воды, не содержащей нуклеазы. Тщательно перемешиваем.
5. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, поместите собранную ядерную гранулу на лед и немедленно добавьте 50 μL Transposition Reaction Buffer. Осторожно ресуспендируйте и инкубируйте при 37 °C в течение 60 минут, переворачивая дно пробирки каждые 10 минут для перемешивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте буфер для транспозиционной реакции перед тем, как отбросить надосадочную жидкость, чтобы предотвратить высыхание клеток.
6. Очистите ДНК с помощью набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
   Остаточные гранулы белка G из процесса выделения холангиоцитов¹⁴ могут быть удалены на этом этапе. Образцы ДНК можно хранить при температуре -80 °C для долгосрочного хранения.
7. Выполните создание библиотеки с помощью набора ATAC DNA Library Prep Kit в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните все образцы и растворы на льду, если не указано иное. Несмотря на то, что процедуры могут отличаться у других марок наборов, все они совместимы с нашим протоколом.
   1. Обогащение ПЦР: Приготовьте смесь для обогащения ПЦР (50 мкл) в пробирке для ПЦР, смешав следующие компоненты в указанном порядке: 10 мкл образца ДНК (из шага 2.6), 14 мкл воды, не содержащей нуклеазы, 10 мкл 5x TAB, 5 мкл PPM, 1 л TAE, 5 мкл праймера P5 и 5 мкл праймера P7. Аккуратно пипеткой перемешать.
   2. Перенесите пробирку в прибор для ПЦР и запустите следующую программу: (72 °C в течение 3 мин) x 1 цикл, (98 °C в течение 30 с) x 1 цикл, (98 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 3 мин) x 15 циклов и (72 °C в течение 5 мин) x 1 цикл и удерживайте при температуре 4 °C.
   3. Очистка: Перед использованием доведите шарики DNA Clean до комнатной температуры в течение 30 минут, затем выполните двухступенчатую магнитную очистку шариками.
      1. Первый раунд: Добавьте 30 мкл гранул DNA Clean в продукты ПЦР (с шага 2.7.2), аккуратно перемешайте пипеткой и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут. Поместите ПЦР-пробирку на магнитный сепаратор и подождите, пока раствор станет прозрачным (~5 минут). Осторожно переложите надосадочную жидкость в новую пробирку и выбросьте шарики DNA Clean.
      2. Второй раунд: Добавьте 7,5 мкл гранул DNA Clean в собранную надосадочную жидкость (из шага 2.7.3.1), аккуратно перемешайте пипеткой и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут. Поместите пробирку на магнитный сепаратор и подождите, пока раствор станет прозрачным (~5 минут). Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость.
   4. Держите пробирку на магнитном сепараторе и промойте шарики DNA Clean в течение 2 x 30 с 200 μл свежеприготовленного 80% этанола при комнатной температуре. Аккуратно выбрасывайте надосадочную жидкость после каждого полоскания. Не снимая трубку с магнитного сепаратора, откройте крышку пробирки и высушите шарики на воздухе в течение 10 минут. Наконец, добавьте 22 мкл воды, не содержащей нуклеазы, чтобы разбавить ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы ДНК можно хранить при температуре -80 °C для долгосрочного хранения.
8. Секвенирование библиотек с помощью стандартного секвенсора нового поколения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем получить не менее 50 миллионов парных прочтений.

3. Приготовление растворов и холангиоцитов для ChIP-секвенирования с низким входом

1. Не менее чем за 1 день до эксперимента с низким уровнем ввода ChIP-seq приготовьте буфер для лизиса ChIP, буфер ChIP MNase, буфер ChIP Stop, буфер ChIP 2x RIPA, буфер ChIP RIPA и буфер ChIP LiCl с использованием реагентов, перечисленных в таблицах 2, 3, 4 и 5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные растворы можно хранить при температуре 4 °C не менее 1 месяца.
2. Для свежевыделенных первичных холангиоцитов¹⁴ подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра сразу после выделения и продолжайте эксперимент с низким уровнем входного ChIP-seq.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чем раньше, тем лучше свести к минимуму влияние на жизнеспособность клеток. Однако, если держать на льду, то в течение 2 часов, как правило, не проблема.

4. День 1 секвенирования ChIP-секвенирования с низким входом: лизис клеток, расщепление MNазы и инкубация антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Для эксперимента с низким уровнем ввода ChIP-seq вся процедура занимает примерно 3 дня.

1. Разделите холангиоциты на аликвоты по 100 000 клеток в пробирке и держите образцы и растворы на льду.
   Примечание: При проведении эксперимента с низким уровнем ввода ChIP-seq для множественных модификаций гистонов допустимо пропорциональное увеличение объема перед добавлением антитела для модификации гистонов. Объемы реагента на следующих этапах основаны на одной пробирке, содержащей 1 × 10⁵ элементов.
2. Центрифугируйте при 2 000 × г в течение 5 мин при 4 °C.
3. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 19 мкл буфера для лизиса ChIP, содержащего ингибитор протеазы, аккуратно перемешайте пипеткой и выдерживайте на льду в течение 10 минут. Избегайте образования пузырей.
4. Добавьте 19 μл буфера ChIP MNase и аккуратно пипеткой перемешайте.
5. Добавьте 2 μL MNase (0,01 Ед/μл) и аккуратно перемешайте пипеткой. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации имеет решающее значение. Конечная концентрация МНазы составляет 0,0005 Ед/мкл. Оптимальная концентрация MNазы может быть определена на основе типа и количества клеток.
6. Немедленно поместите образец на лед, добавьте 5 μL ChIP STOP Buffer для прекращения разложения и аккуратно перемешайте пипеткой.
7. Добавьте 45 мкл буфера ChIP 2x RIPA, содержащего ингибитор протеазы, аккуратно перемешайте пипеткой и далее инкубируйте на льду в течение 10 минут.
8. Центрифугируйте при 20 000 × г в течение 15 мин при 4 °C. Медленно переложите надосадочную жидкость в новую трубку.
   Остаточные гранулы белка G из процесса выделения холангиоцитов¹⁴ могут быть удалены на этом этапе.
9. Добавьте 40 μL буфера ChIP RIPA.
10. Для образцов иммунопреципитации (IP) добавьте 1 г антител на образец и инкубируйте суспензию на ротаторе (20 об/мин) при 4 °C в течение ночи.
11. Для входных образцов не добавляйте антитела и инкубируйте суспензию на ротаторе (20 об/мин) при 4 °C в течение ночи.

5. 2-й день низковходного ChIP-seq: иммунопреципитация, промывка и элюирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов IP выполните шаги 5.1-5.7. Для входных образцов выполните шаги 5.8-5.12.

1. Предварительно промойте шарики Protein G с 1 мл ледяного буфера ChIP RIPA.
2. Добавьте в образцы 400 г гранул протеина G и инкубируйте с вращением (20 об/мин) при 4 °C в течение 2 ч.
3. Промойте шарики в течение 5 x 5 минут 150 μл ледяного буфера ChIP RIPA в течение 5 минут при 4 °C на ротаторе (20 об/мин). Удалите надосадочную жидкость с помощью магнитного сепаратора.
4. Промойте шарики 150 μл ледяного буфера ChIP LiCl в течение 5 минут при 4 °C на ротаторе (20 об/мин). Удалите надосадочную жидкость с помощью магнитного сепаратора.
5. Добавьте 30 мкл элюирующего буфера ChIP (29 мкл воды, не содержащей нуклеазы, и 1 мкл протеиназы К) для ресуспендирования гранул и встряхивайте при 900 об/мин при 55 °C в течение 90 минут. Периодически осторожно переворачивайте трубку, чтобы бусины оставались во взвешенном состоянии.
6. Соберите надосадочную жидкость с помощью магнитного сепаратора и медленно перенесите ее в новую пробирку. Инкубировать при 72 °C в течение 40 мин для инактивации протеиназы К.
7. Измерьте концентрацию ДНК с помощью флуориметра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы ДНК можно хранить при температуре -80 °C для долгосрочного хранения.
8. Для входных образцов добавьте 1 мкл протеиназы К и встряхивайте при 900 об/мин при 55 °C в течение 90 минут.
9. Очистите ДНК с помощью фенол-хлороформной экстракции. Добавьте 130 μл реагента для экстракции ДНК и энергично перемешайте, пока раствор не станет розовым. Центрифуга при 20 000 × г в течение 5 мин.
10. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку, добавьте 130 мкл ледяного изопропанола, а затем добавьте 1 мкл гликогена и 6,5 мкл 3M NaAc. Центрифуга при 20 000 × г в течение 15 мин.
11. Выбросьте надосадочную жидкость, промойте один раз 1 мл 70% этанола и центрифугируйте при 20 000 × г в течение 15 минут. Высушите гранулу и снова суспендируйте ее в 30 μл воды, не содержащей нуклеазы.
12. Измерьте концентрацию ДНК с помощью флуориметра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы ДНК можно хранить при температуре -80 °C для долгосрочного хранения.

6. День 3 низкозатратного ChIP-seq: Построение библиотеки и секвенирование

1. Выполните создание библиотеки с помощью набора для подготовки библиотеки ChIP DNA в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы включают в себя препарирование конца, лигирование адаптера и амплификацию библиотеки. Пипетка 5 нг образцов ChIP (входные и IP образцы) для построения библиотеки. Храните все образцы и растворы на льду, если не указано иное. Несмотря на то, что процедуры могут отличаться у других марок наборов, все они совместимы с нашим протоколом.
2. Подготовка конца: Приготовьте реакционный буфер для подготовки конца (65 мкл) в пробирке для ПЦР, смешав 5 нг образца ДНК (с шага 5.6 или шага 5.11), 15 мкл смеси для подготовки конца 4, 6,5 мкл Tris EDTA и воду, не содержащую нуклеазы, до конечного объема 65 мкл. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Перенесите пробирку в прибор для ПЦР и запустите следующую программу: 20 °C в течение 15 мин, 65 °C в течение 15 мин и удерживайте при температуре 4 °C (горячая крышка: 105 °C).
3. Лигирование адаптера: Разбавляйте DNA Adapter S в соотношении 1:100. Приготовьте буфер для реакции лигирования адаптера (100 мкл) в пробирке для ПЦР, смешав 65 мкл продуктов подготовки концов (начиная с шага 6.2), 25 мкл буфера 2 для быстрого лигирования, 5 мкл быстрой ДНК-лигазы и 5 мкл разбавленного адаптера ДНК S. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Перенесите пробирку в прибор для ПЦР и запустите следующую программу: 20 °C в течение 15 минут, затем удерживайте при 4 °C (горячая крышка: 105 °C).
4. Очистка:
   1. Перед использованием доведите бусины DNA Clean до комнатной температуры в течение 30 минут. Добавьте 60 мкл гранул DNA Clean в продукты Adapter Ligation (из шага 6.3). Аккуратно пипеткой перемешать и выдержать при комнатной температуре в течение 5 минут.
   2. Поместите ПЦР-пробирку на магнитный сепаратор и подождите, пока раствор станет прозрачным (~5 минут). Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость.
   3. Держите трубку на магнитном сепараторе. Промойте шарики DNA Clean в течение 2 x 30 с 200 μл свежеприготовленного 80% этанола комнатной температуры. Аккуратно выбрасывайте надосадочную жидкость после каждого полоскания.
   4. Не снимая трубку с магнитным сепаратором, откройте крышку пробирки и высушите шарики на воздухе в течение 5 минут. Наконец, добавьте 22,5 мкл 10 мМ Tris-HCL (PH 8.0) для элюирования ДНК.
5. Амплификация библиотеки: Приготовьте реакционный буфер для амплификации библиотеки (50 мкл) в пробирке для ПЦР, смешав 20 мкл продуктов очистки (начиная с шага 6.4), 2,5 мкл праймера i5 для ПЦР, 2,5 мкл праймера i7 для ПЦР и 25 мкл смеси для амплификации. Аккуратно пипеткой перемешать. Перенесите пробирку в прибор для ПЦР и выполните следующую программу: (95 °C в течение 3 мин) x 1 цикл, (98 °C в течение 20 с, 60 °C в течение 15 с, 72 °C в течение 30 с) x 18 циклов, (72 °C в течение 5 мин) x 1 цикл и удерживайте при 4 °C.
6. Очистка: Перед использованием доведите шарики DNA Clean до комнатной температуры в течение 30 минут, затем выполните двухступенчатую магнитную очистку шариками.
   1. Первый раунд: Добавьте 30 мкл гранул DNA Clean в продукты Library Amplification (начиная с шага 6.5). Аккуратно пипеткой перемешать и выдержать при комнатной температуре в течение 5 минут. Поместите ПЦР-пробирку на магнитный сепаратор и подождите, пока раствор станет прозрачным (~5 минут). Осторожно переложите надосадочную жидкость в новую пробирку и выбросьте шарики DNA Clean.
   2. Второй раунд: Добавьте 7,5 мкл гранул DNA Clean к собранной надосадочной жидкости. Аккуратно пипеткой перемешать и выдержать при комнатной температуре в течение 5 минут. Поместите пробирку на магнитный сепаратор и подождите, пока раствор станет прозрачным (~5 минут). Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость. Держите трубку на магнитном сепараторе. Промойте шарики DNA Clean в течение 2 x 30 с 200 μл свежеприготовленного 80% этанола комнатной температуры. Аккуратно выбрасывайте надосадочную жидкость после каждого полоскания. Не снимая трубку с магнитного сепаратора, откройте крышку пробирки и высушите шарики на воздухе в течение 10 минут. Наконец, добавьте 22,5 мкл 10 мМ Tris-HCl (PH 8,0) для элюирования ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы ДНК можно хранить при температуре -80 °C для долгосрочного хранения.
7. Секвенирование библиотек в стандартном секвенсоре нового поколения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем получить не менее 10-20 миллионов парных прочтений.

7. Анализ данных ATAC-seq и Low-input ChIP-seq

1. Подготовка виртуальной среды анализа (miniconda)
   1. Загрузите Miniconda3 с веб-сайта с помощью следующих команд и следуйте инструкциям по установке Miniconda.
      wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      Баш Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
   2. Создайте виртуальную среду для конвейера анализа как ATAC-seq, так и ChIP-seq.
      conda create -n NGSpipeline
      conda активирует NGSpipeline
      conda install bioconda::fastqc bioconda::multiqc bioconda::trim-galore bioconda::bowtie2 bioconda::samtools bioconda::macs2 bioconda::d eeptools bioconda::p icard bioconda::igv
   3. Скачайте файл референсной последовательности генома и сделайте индекс выравнивания для выравнивания галстука-бабочки.
      wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      Ганзип GRCm38.p6.genome.fa.gz
      бабочка2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
2. Выполняйте контроль качества считываний ATAC-seq и ChIP-seq с помощью FastQC и суммируйте отчет о контроле качества с помощью MultiQL, чтобы обеспечить смещение GC результатов секвенирования и достаточную сложность библиотеки для последующего анализа. Отбраковка библиотеки последовательностей со значительными различиями в результатах контроля качества.
   fastqc -o <директория вывода> ......
   Multiqc <выходной директория>
3. Адаптер для последовательности обрезки с использованием изобилия обрезки.
   trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 25 -e 0.1 --paired -j <номер потока> -o
4. Сопоставьте обрезанные чтения с эталонной сборкой генома mm10 с помощью Bowtie2, используя параметры по умолчанию, и передайте параметры добавления (--very-sensitive -X 2000) в bowtie2 для ATAC-seq из-за широкого распределения длины фрагмента ATAC-seq.
   1. Для ATAC-seq:
      bowtie2 -p <номер нити> --very y-sensitive -X 2000 -x <индекс генома с шага 7.1.3> -1 <очищенный файл fastq из 4.2 чтение 1> -2 <очищенный файл fastq из 4.2 чтение 2> | samtools view -S -O BAM -@ <номер нити> -o <вывод файла BAM>
   2. Для ChIP-seq:
      bowtie2 -p <номер нити> -x <индекс генома с шага 7.1.3> -1 <очищенный файл fastq из 4.2 read 1> -2 <очищенный файл fastq из 4.2 read 2> | samtools view -S -O BAM -@ <номер нити> -o <вывод файла BAM>
5. Удалите прочтения с низкой оценкой выравнивания (q30) и прочтения, выровненные по митохондриальному геному и нестандартной хромосоме.
   samtools view -bh -q 30 -f 2 | samtools view -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'random' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o <вывод отфильтрованного файла bam>
6. Используйте команду Picard MarkDuplicates для удаления дубликатов прочитанных ПЦР.
   picard MarkDuplicates I=<ввод отфильтрованного файла bam> O=<вывод удаления дублирования файла bam> M=<удаление файла отчета о дублировании> REMOVE_DUPLICATES=true
7. Пиковый вызов с помощью команды MACS2 callpeak с параметром -f BAMPE -g mm -B -q 0.01.
   macs2 callpeak -f BAMPE -t <удалить дублирование файла bam > -g mm -n <вывод префикса> -B -q 0.01
8. Сгенерируйте файлы BigWig с помощью команды BamCoverage от Deeptools.
   Индекс SamTools <Удалить дубликат файла BAM> -@ 4
   bamCoverage -b <удалить дублирование файла bam> -o <вывести файл BigWig> -bs 50 -p <номер нити> --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeUsing RPGC -e -ignoreDuplicates
9. Используйте браузер генома IGV для просмотра файла narrowPeak из macs2 и файлов BigWig из Deeptools BamCoverage.

Результаты

Для создания хроматинового ландшафта первичных холангиоцитов мы оптимизировали протоколы ChIP-seq и ATAC-seq с низким входом для малого количества (~100 000) первичных холангиоцитов. Результаты электрофореза в агарозном геле для первичных холангиоцитов показали, что в течение 1 × 10⁵ первичных холангиоцитов 0,02 ЕД МНаза при 37 °С в течение 5 мин приводили к продукции мононуклеосом, которая была определена как оптимальная концентрация (рис. 1).

...

Обсуждение

Для систематического и всестороннего картирования динамики состояний хроматина, лежащей в основе перехода в состояние кистозных холангиоцитов, мы успешно оптимизировали низковходные ChIP-seq и ATAC-seq для ограниченного числа первичных холангиоцитов. Хотя это исследование было сосредоточено на первичных холангиоцитах, мы уверены, что протокол также может быть применен к другим высокожизнеспособным первичным клеткам с ограниченной доступностью. Аналогичным образом, в то время как в данном...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,5 М ЭДТА	Solarbio	E1170
1 М Трис-HCl (pH=7,5)	Solarbio	T1140
1 М Трис-HCl (pH=8,0)	Solarbio	T1150
3 М NaAc	Beyotime	ST342
8 М LiCl	Sigma	L7026
Агарозный гель	Biosharp	BS081
ATAC Библиотека ДНК Набор для подготовки	Vazyme	TD501
CaCl2	Sangon Biotech	A501330	1 м сток
ChIP Библиотека ДНК Набор	для подготовки Vazyme	ND607
Чистые шарики	ДНК Vazyme	N411
Реагент для экстракции ДНК	Solarbio	P1012
EGTA	Solarbio	E8050	100 мМ (pH = 8) сток
Флуориметр	Invitrogen	Q33226
Glycogen	Thermo Scientific	R0561
Гемоцитометр	QIUJING	XB. К.25.
Igepal CA-630	Sigma	I8896	10% стоковый
магнитный сепаратор	Promega	Z5342
MgCl2	Sangon Biotech	A100288	1,5 М стоковый
MNase	Sigma	N3755	0,01 U/&микро; L stock
NaCl	Sangon Biotech	A610476	5 M stock
NP40	Solarbio	N8030
Nuclease-free water	Life Technologies	AM9937
PCR инструмент	Applied Biosystems	4484073
PCR Purification Kit	QIAGEN	28106
Ингибитор протеазы	Roche
Протеин G шарики	Invitrogen	10004D
Proteinase K	TransGen	GE201-01
Rotator	Kylin-Bell	QB-528
SDS	Solarbio	S8010	10%  сток
Дезоксихолат натрия	Sigma	S1827
Термомиксер комфорт	Eppendorf	5355
Triton X-100	Solarbio	T8200
Tween-20	Solarbio	T8220
Software	Citation (PMID)/Company	Version<	strong>Website
Bowtie2	22388286	2.3.5.1	https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools	27079975	3.4.3	https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC		0.12.1	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV	21221095	2.12.3	https://igv.org/
MACS2	18798982	2.2.7.1	https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
Miniconda	Anaconda	4.7.12.1	https://www.anaconda.com/
MultiQC	27312411	1.23	https://seqera.io/multiqc/
Picard		2.27.5	https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools	33590861	1.6	https://www.htslib.org/
Изобилие		0.6.6	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/