Ультразвуковая локализионная микроскопия для картирования микроциркуляторного русла головного мозга грызуна со сверхвысоким разрешением

Краткое содержание

Ультразвуковая локализационная микроскопия (УЛМ) — это недавно разработанный метод, который позволяет достичь беспрецедентного уровня разрешения при визуализации микроциркуляторного русла in vivo. В этой работе мы подробно описываем, как получить изображения микроциркуляторного русла головного мозга у грызунов со сверхвысоким разрешением с помощью стандартизированной функциональной платформы ультразвуковой визуализации, предназначенной для доклинических исследований.

Аннотация

Ультразвуковая локализационная микроскопия (УЛМ) — это метод визуализации со сверхвысоким разрешением, который позволяет визуализировать микрососудистую архитектуру мозга in vivo , превосходя дифракционный предел обычного ультразвука. Обнаруживая и отслеживая внутривенно вводимые микропузырьки по мере их циркуляции по церебральным сосудам, ULM создает карты плотности сосудов, скорости потока и амплитуды обратного рассеянного сигнала с высоким разрешением в пространственных масштабах до 5-10 мкм. Этот протокол представляет собой полный рабочий процесс для выполнения визуализации УЛМ у грызунов, включая подготовку животных, позиционирование зонда, получение изображения, введение микропузырьков и обработку данных, с использованием специальной функциональной ультразвуковой платформы. Описаны два метода подготовки, адаптированные для мышей (транскраниально) и крыс (с краниальными окнами), за которыми следуют подробные инструкции по выравниванию зонда и анатомическому нацеливанию с использованием интегрированного атласа мозга. Во время сбора данных сверхбыстрые ультразвуковые последовательности синхронизируются с болюсными инжекциями микропузырьков для захвата динамических данных потока. Последующие этапы реконструкции включают фильтрацию помех, интерполяцию изображений, обнаружение микропузырьков, субпиксельную локализацию и отслеживание траектории. Выходные данные включают карты плотности, отражающие заполненность судна, карты скоростей, показывающие характер течения и направленность, а также карты амплитуды, обеспечивающие дополнительный контраст для структурной интерпретации. Репрезентативные результаты иллюстрируют успешную регистрацию в полной корональной плоскости и указывают на распространенные подводные камни, такие как низкое качество инъекции, артефакты движения и аберрации, вызванные черепом. Протокол совместим как с поперечными, так и с продольными исследованиями и особенно подходит для изучения цереброваскулярных изменений в моделях старения, инсульта, аневризмы и нейродегенеративных заболеваний. Сочетая в себе глубинное проникновение, высокое пространственно-временное разрешение и безмаркерную визуализацию сосудов, ULM предлагает мощный инструмент для неинвазивного анализа микроциркуляции мозга в доклинических моделях.

Введение

Несмотря на то, что мозг составляет всего 2% от массы тела, он потребляет около 20% кислорода и глюкозы для^{поддержания активности} нейронов. Эта высокая метаболическая потребность удовлетворяется сложной сосудистой сетью, от крупных артерий и вен до микрососудов, таких как артериолы, венулы и капилляры, регулируемой через нейроваскулярную^связь2. Нарушение этого тонко настроенного процесса связано с широким спектром неврологических расстройств. Нейроваскулярное разъединение, например, является ранним патологическим признаком при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, болезнь Хантингтона и боковой амиотрофический склероз (БАС), часто предшествуя классическим признакам нейродегенерации, таким как бета-амилоидная и тау-патология 3,4,5,6. Таким образом, визуализация сложной природы мозга in vivo имеет первостепенное значение для удовлетворения растущей потребности в понимании физиологических процессов. Технологические достижения предоставили уникальные возможности для исследования функций и активности мозга, как прямо, так и косвенно, с возрастающей точностью, разрешением и доступностью.

Ультразвуковая допплерография стала мощным инструментом для функционального измерения активности мозга с помощью кровотока⁷. В частности, силовая допплеровская визуализация, предназначенная для регистрации движения эритроцитов (эритроцитов), передает повторяющиеся ультразвуковые импульсы в кровеносные сосуды и регистрирует амплитуду ультразвуковых эхо-сигналов, рассеянных обратно движущимися эритроцитами⁸. Появление сверхбыстрой ультразвуковой визуализации, в частности функционального ультразвука (fUS), стало поворотным моментом в преодолении прежних ограничений. Действительно, обычное ультразвуковое исследование сканирует ткани линия за строкой – последовательный подход, который ограничивает его применение основными мозговыми артериями, поскольку медленные потоки крови, типичные для микроциркуляторного русла мозга, не могут^{быть обнаружены}. Более поздний метод fUS использует несколько передач плоских волн для получения тысяч кадров в секунду, значительно улучшая как временное разрешение, так и отношение сигнал/шум (SNR). Важно отметить, что fUS позволяет обнаруживать гемодинамические изменения в очень мелких сосудах со скоростью всего 1 мм/с, поддерживая функциональную визуализацию активности мозга в режиме реального времени вплоть до уровня артериол⁸.

В то время как сверхбыстрые методы допплерографии значительно улучшили микрососудистую визуализацию, они все еще ограничены дифракционным^{разрешением ультразвука}. В тандеме с УЗИ ультразвуковая локализационная микроскопия (УЛМ) преодолевает это препятствие, позволяя визуализировать микрососудистые структуры на капиллярном уровне с использованием контрастных веществ и высокоточных алгоритмов локализации¹¹. Это дает беспрецедентное понимание морфологии и функции сосудов. В частности, при УЛМ в кровоток вводятся контрастные вещества, изготовленные из стабилизированных газонаполненных микропузырьков, диаметром примерно 1-3 мкм. Они действуют как сильные акустические рассеиватели, которые могут быть обнаружены как отдельные точечные источники. Учитывая, что микропузырьки значительно меньше длины ультразвуковой волны, они могут быть пространственно и временно изолированы, проявляясь как функция точечного распространения системы (PSF). Вдохновленная методами оптического сверхразрешения, такими как STORM и PALM, субпиксельная локализация этих микропузырьков достигается с помощью методов деконволюции, которые отображают их положения с высокой точностью 10,12,13,14. Это позволяет разрешать сосудистые структуры с пространственным разрешением 5-10 мкм, что значительно превышает дифракционный предел обычной допплеровской визуализации со сверхбыстрой ультразвуковой мощностью.

УЛМ является мощным и эффективным инструментом для картирования сосудов вплоть до капиллярного масштаба и преодолевает ограничения многих оптических методов, которые ограничены поверхностными слоями. Его способность выполнять микрососудистую визуализацию у живых животных, что позволяет проводить лонгитюдные и фармакологические исследования, является еще одним ключевым преимуществом УЛМ по сравнению с другими методами, требующими фиксации и окрашивания мозга. Извлеченная информация выходит за рамки статических карт сосудов, обеспечивая количественные оценки кровотока вплоть до капиллярного уровня, тем самым открывая многообещающие возможности как для доклинического, так и для клинического применения. Чтобы облегчить воспроизводимость, мы описываем полный рабочий процесс визуализации мозга грызунов на основе УЛМ, реализованный с использованием стандартизированной функциональной платформы ультразвуковой визуализации, предназначенной для доклинических исследований.

Протокол

Все процедуры, описанные в данном исследовании, были проведены в соответствии с Директивой Совета Европейского Сообщества от 22 сентября 2010 г. (010/63/UE) и одобрены местным комитетом по этике (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale No 59, «Paris Centre et Sud», проект #2020-16). Эксперименты проводились на взрослых самцах мышей C57BL/6 Rj (возраст 2 месяца, 20-30 г) и крысах Sprague-Dawley Rj:Han (200-300 г), полученных коммерчески чистым путем. Животные содержались группами по четыре человека в клетке в течение 12-часового цикла свет/темнота, с постоянной температурой 22 °C, а также с предоставлением пищи и воды в неограниченном количестве. Перед началом экспериментов все животные прошли минимум недельный период акклиматизации к условиям содержания. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

1. Анестезия и подготовка животных у мышей
   1. Поместите мышь в индукционную камеру изофлурана, вводя 2% изофлуран с воздухом (0,075 л/мин) и кислородом (0,175 л/мин, или медицинским воздухом).
   2. Через 5 минут после индукции анестезии перенесите животное в стереотаксическую раму, которая помещается на грелку, установленную при температуре 37 °C для поддержания температуры тела, и обеспечьте непрерывную доставку изофлурана через маску с той же концентрацией и скоростью потока.
   3. Подтвердите достаточную глубину анестезии, проверив отсутствие рефлексов в ответ на ущипывание пальца ноги или хвоста с помощью сильного, но не повреждающего давления. Если присутствует рефлекс, немного увеличьте концентрацию изофлурана. Повторите оценку, прежде чем продолжить.
   4. Наносите глазную мазь для предотвращения образования катаракты.
   5. Побрейте голову мыши с помощью триммера. Нанесите крем для депиляции, оставьте на 1-1,5 минуты, затем смойте теплой водой и высушите марлей. Повторяйте по мере необходимости, пока не будут удалены все волосы. Не оставляйте крем для депиляции на более длительное время, так как это может привести к химическому повреждению кожи.
   6. Нанесите центрифугированный ультразвуковой гель (без пузырьков, дегазированный) на голову для обеспечения акустического сцепления.
2. Анестезия и подготовка животных у крыс
   1. После взвешивания крысы ввели внутрибрюшинную инъекцию смеси кетамина (75 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) с помощью шприца объемом 1 мл. Сбрейте шерсть на макушке и очистите кожу раствором йода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кетамин является строго регулируемым веществом во многих странах и может требовать специального разрешения для закупки и использования. Альтернативные режимы анестезии могут быть использованы для достижения анестезии хирургического уровня.
   2. Поместите животное на стереотаксический аппарат, который помещается над грелкой, установленной на 37 °C для поддержания температуры тела. Нанесите обильное количество офтальмологической мази на глаза, чтобы предотвратить высыхание и образование катаракты.
   3. Подкожно ввести мелоксикам (2 мг/кг) с помощью шприца объемом 1 мл для интраоперационной анальгезии.
   4. Подтвердите достаточную глубину анестезии, проверив отсутствие рефлексов в ответ на защемление пальца ноги или хвоста с помощью сильного, но не повреждающего давления. Если присутствует рефлекс, введите дополнительную дозу, равную одной четвертой от начальной дозы анестетика. Подождите примерно 5 минут, прежде чем повторно оценить глубину анестезии. Приступайте к лечению только после подтверждения хирургической плоскости анестезии и повторяйте ее каждые 20-30 минут.
   5. Сделайте продольный разрез вдоль сагиттального шва с помощью скальпеля, убедившись, что разрез достаточно глубокий, чтобы включить кожу и соединительные ткани, прикрепленные к черепу.
   6. Поддерживайте окружающие ткани в хорошем увлажнении на протяжении всей операции с помощью физиологического раствора.
   7. С помощью вращающегося сверла слегка обведите контур черепного окна, отметив поверхностный слой черепа. Для оптимального доступа к мозгу окно должно быть около 14 мм в боковом измерении и не менее 2 мм в переднезаднем размере, в зависимости от размера черепа.
   8. Продолжайте фрезерование по контуру до тех пор, пока не останется сопротивления кости. Во время сверления периодически наносите несколько капель физиологического раствора для охлаждения кости и минимизации термических повреждений. Тонкий шпатель с закругленными краями должен легко вставляться в щель без усилий.
   9. С помощью коротких односторонних ходов разворачивания утончите последний слой кости до тех пор, пока сопротивление не станет едва заметным.
   10. Вставьте тонкий, слегка изогнутый шпатель с закругленными краями у бокового края черепного окна.
   11. Медленно двигайте шпатель к центру, аккуратно отделяя кость от мозговых оболочек. Как только сопротивление перестанет ощущаться, поднимите и полностью снимите отделенный кусок кости.
   12. Нанесите центрифугированный гель для ультразвука поверх твердой мозговой оболочки. Описание экспериментальной установки представлено на рисунке 1.

Рисунок 1: Схема экспериментальной установки для визуализации мозга УЛМ у грызунов. Система визуализации состоит из блока ультразвукового захвата, подключенного к высокочастотному датчику, установленному на моторизованном позиционном столике. И мыши, и крысы показаны в стереотаксических кадрах: мышь имеет выбритую кожу головы для транскраниальной визуализации, в то время как крыса проходит визуализацию через хирургически подготовленное черепное окно. Катетер в хвостовую вену устанавливается для введения контрастного вещества у обоих видов. Такая конфигурация обеспечивает стабильное получение функциональных ультразвуковых данных с высоким разрешением во время введения микропузырьков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Катетеризация хвостовой вены
   1. Используйте крылатый инфузионный набор 27 G × 1/2 дюйма, подключенный к игле 18 G × 1/2 дюйма с трубкой 8 дюймов. По возможности укоротите трубку, чтобы свести к минимуму мертвый объем.
   2. Осторожно поверните хвост животного на 90 градусов, чтобы обнажить боковые хвостовые вены (см. рисунок 2). Закрепите хвост на месте с помощью ленты, чтобы обеспечить устойчивость и предотвратить ненужные движения во время катетеризации.
   3. Определите хвостовую вену, начав с дистального конца (кончика хвоста) и двигаясь к основанию. Чтобы облегчить этот шаг, хвост можно согреть теплой водой, чтобы способствовать расширению сосудов и улучшить видимость вен.
   4. С помощью пальца слегка надавите на основание хвоста и сдвиньте его к месту инъекции (т.е. против направления кровотока). Этот маневр временно препятствует венозному возврату, в результате чего каудальные вены расширяются и становятся более заметными, облегчая введение катетера.
   5. Введите иглу 27 G × 1/2 дюйма крылатого инфузионного набора параллельно вене, следя за тем, чтобы скос был направлен вверх.
   6. Осмотрите трубку на наличие кровавого проблеска, который подтверждает правильность установки иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начните катетеризацию с дистального конца хвоста, чтобы избежать утечки от более ранних проколов во время последующих инъекций. Если катетеризация хвостовой вены оказывается сложной или неудачной, можно рассмотреть альтернативные центральные маршруты. К ним относятся ретроорбитальный синус, яремная вена или подкожная вена.

Рисунок 2: Анатомия поперечного сечения хвоста грызуна, иллюстрирующая сосудистые ориентиры для катетеризации. Схематический рисунок поперечного сечения дистального хвоста грызуна, показывающий взаимное расположение основных кровеносных сосудов. Вблизи средней линии присутствуют две артерии: дорсальная каудальная артерия, расположенная в верхней (дорсальной) области, и вентральная каудальная артерия, расположенная в нижней (вентральной) части поперечного сечения хвоста. Эти артерии обычно избегаются во время внутривенных процедур. По бокам артерий расположены каудальные вены, которые проходят симметрично с обеих сторон и лежат прямо под кожей, что делает их предпочтительными местами доступа для катетеризации или инъекции микропузырьков. Этот анатомический обзор помогает точно локализовать вены, особенно при усилении за счет нагревания для стимулирования расширения сосудов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Позиционирование датчика с помощью программного обеспечения IcoScan
   1. На платформе сбора данных запустите программное обеспечение для сбора данных fUS (например, IcoScan для Iconeus One) и создайте сеанс эксперимента. Отрегулируйте положение ультразвукового зонда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите щуп примерно на 1 мм над головой животного. Убедитесь, что зонд находится в контакте с гелем для ультразвука, прежде чем начинать любую последовательность визуализации.
   2. Запустите сбор данных в режиме Live View и при необходимости отрегулируйте положение зонда с помощью визуализации объема мозговой крови (ОЦК) в режиме реального времени. Мозг должен быть сосредоточен на изображении. Оптимизируйте параметры изображения, такие как контраст и сжатие, для повышения качества визуализации.
   3. Откройте меню Angio3D в программе для сбора данных. Отрегулируйте параметры сканирования («Первый срез», «Последний срез» и «Размер шага»), убедившись, что они охватывают весь мозг. Начните приобретение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При настройке параметров сканирования убедитесь, что сканирование охватывает заднюю часть мозга, а именно все задние артерии.
   4. Оставьте программное обеспечение для сбора данных открытым и запустите программное обеспечение IcoStudio для анализа и визуализации данных. Загрузите Angio3D скан.
   5. Перейдите на панель регистрации мозга и зарегистрируйте сканирование в системе общих координат мыши Allen Mouse в полностью автоматическом или ручном режиме регистрации.
   6. Сохраните регистрацию в виде файла .bps.
   7. Далее перейдите в меню «Навигация мозга ». На панели «Менеджер атласов » используйте навигатор дерева «Родитель/дочерний элемент » для просмотра Атласа мозга Аллена Мыши. Выберите целевые анатомические области, которые будут наложены на скан в панели 3-view panel.
   8. Выберите плоскость изображения, которая перекрывает интересующие области. Вручную установите два маркера в корональном представлении, чтобы определить целевой срез визуализации.
   9. Нажмите на систему позиционирования мозга (BPS), чтобы извлечь моторные координаты, соответствующие положению зонда для визуализации выбранной плоскости. Проверьте предварительный просмотр изображения, рассчитанный на основе сканирования Angio3D, и нажмите «Копировать координаты BPS».
   10. Переключитесь на программу ИкоСкан и откройте панель «Позиционирование щупа ». Нажмите на кнопку «Ввести координаты BPS» и вставьте значения, извлеченные на шаге 1.4.9. Датчик автоматически переместится и выровняется по выбранной плоскости изображения.
   11. Выполните сбор данных в режиме Live View , чтобы убедиться, что текущая плоскость изображения соответствует плоскости, предсказанной на шаге 1.4.8.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняя и повторно используя одни и те же пространственные маркеры, плоскость визуализации может быть последовательно переопределена между сеансами, что обеспечивает точное изменение положения зонда для продольных исследований.

2. Приобретение УЛМ

1. Приготовление микропузырьков
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать различные коммерчески доступные ультразвуковые контрастные вещества. Однако состав газа, концентрация пузырьков, диаметр и стабильность могут варьироваться в зависимости от используемого продукта. Пожалуйста, следуйте рекомендациям производителя по подготовке и хранению.
   1. С помощью стерильного шприца введите во флакон через перегородку 5 мл 0,9% раствора натрия хлорида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для повторного болюсного введения или непрерывной инфузии можно использовать меньший объем 0,9% раствора натрия хлорида для приготовления более концентрированной микропузырьковой суспензии. Отрегулируйте коэффициент разбавления в соответствии с предполагаемым применением.
   2. Энергично перемешивайте флакон в течение 20 с, чтобы полностью суспендировать микропузырьки и добиться равномерного диспергирования.
2. Запись в формате УЛМ
   1. Заранее определите параметры записи, включая последовательность ультразвука, частоту кадров и общее время записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые параметры для записи - 5-10 минут при частоте 2,5 Гц.
   2. Нарисуйте объем микропузырьков, которые будут вводиться, и начните захват. После того, как сбор начался, приступайте к введению микропузырьков. Рекомендуется вводить 200 μL для крыс и 100 μL для мышей в соответствующем разведении в соответствующем разведении.
   3. Подтвердите усиление контрастности на изображении в режиме Live View. Сразу после этого промывайте оставшиеся микропузырьки в мертвом объеме путем введения физиологической жидкости в катетер. Типичный пример профиля интенсивности микропузырьков показан на рисунке 3.
   4. Дождитесь завершения сбора данных и сохраните данные.
   5. По окончании приобретения действуйте следующим образом, в зависимости от используемого протокола:
      1. Для мышей (неинвазивный протокол): Отмените анестезию, прекратив введение изофлурана, и наблюдайте за животным во время выздоровления в теплой среде до полного пробуждения.
      2. Для крыс (инвазивный протокол с краниальным окном): Усыпить животное путем внутрибрюшинной инъекции эвтазола (пентобарбитал натрия, 140 мг/кг) в соответствии с институциональными и этическими рекомендациями.

Рисунок 3: Интенсивность сигнала микропузырьков с течением времени. (A) Иллюстрация области интереса (ROI), используемой для извлечения сигнала, охватывающей весь корональный срез мозга. (B) Временной ход интенсивности сигнала микропузырьков в течение 5-минутного захвата. Комок микропузырьков вводился через 30 с, что приводило к характерному увеличению амплитуды сигнала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Реконструкция изображения с помощью программного обеспечения IcoLab

1. Откройте IcoLab и перейдите в ULM, нажав на вкладку ULM в самой левой части экрана.
2. Нажмите кнопку Compute ULM Maps , чтобы начать процесс обработки, как показано на рисунке 4.
3. Выберите исходную папку, содержащую полученные данные.
4. Выберите конкретный скан для обработки и при необходимости отрегулируйте временные границы обработки.
5. Нажмите « Далее », чтобы перейти к шагу «Отчетность». На шаге Отчеты настройте путь к выходной папке, в которую будут сохраняться обработанные файлы. Задайте параметры визуализации для изображений, которые будут включены в отчет PowerPoint.
6. Просмотрите сводку выбранных параметров, отображаемую на последнем экране.
7. Когда все будет готово, нажмите «ВЫПОЛНИТЬ », чтобы начать обработку. Как только обработка будет завершена, будет сгенерирован файл .trk, содержащий все координаты локализованных микропузырьков, а также растровые файлы TIFF для плотности, скорости и амплитуды обратного рассеяния (BSA).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора данных в течение 5 минут может потребоваться несколько часов обработки. Этот шаг лучше всего выполнять на ночь или на выделенной рабочей станции.
   1. Генерация карт плотности микропузырьков: Локализованные положения всех обнаруженных микропузырьков накапливаются за выбранное время регистрации. Сопоставьте эти положения с пространственной сеткой с фиксированным разрешением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый пиксель в результирующей карте плотности отражает количество микропузырьков, локализованных в этом пространственном бине. Конечным результатом является изображение в оттенках серого (TIFF), где интенсивность пикселей соответствует заполненности сосуда, что позволяет реконструировать сосудистую сеть с высоким разрешением.
   2. Создание карт скоростей: программное обеспечение отслеживает отдельные микропузырьки на последовательных кадрах для формирования траекторий. Для каждой траектории программное обеспечение вычисляет вектор скорости, деля смещение на прошедшее время (в результате чего получается вектор скорости в мм/с).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно создать два типа карт скорости: карты абсолютных скоростей, где каждый пиксель хранит среднюю величину скорости проходящих через них микропузырьков, и карты направленных скоростей, где скорость разлагается вдоль выбранной анатомической оси (т.е. x или z), и сохраняется соответствующий компонент со знаком. Эти карты растрируются на той же пространственной сетке и сохраняются как отдельные изображения в формате TIFF.
   3. Генерация карт BSA: Для каждого локализованного микропузырька отображается амплитуда исходного ультразвукового сигнала (интенсивность обратного рассеяния). Проецируйте эти амплитуды на пространственную сетку, накапливая интенсивность сигнала в каждом пикселе. Полученная карта BSA выделяет области, где микропузырьки прошли через фокальную область луча, обеспечивая контраст, который дополняет карты плотности и скорости¹⁵.

Рисунок 4: Блок-схема технологического конвейера для реконструкции карты УЛМ. На рисунке показаны последовательные этапы обработки, выполняемые в аналитическом программном обеспечении для создания карт ULM на основе необработанных ультразвуковых данных. Начиная с составных кадров (n = 200), Шаг 1 применяет фильтрацию помех при разложении сингулярных значений (SVD) для выделения сигналов микропузырьков (MB) из фона ткани. На шаге 2 сигналы MB подвергаются интерполяции Ланцоша, в результате чего создается предварительно обработанный стек изображений. На шаге 3 выполняется обнаружение локальных максимумов и их соотнесение с функцией распределения точек системы (PSF) для определения потенциальных местоположений микропузырьков. На шаге 4 используется субпиксельная локализация (обнаружение центроидов) и отслеживание частиц для извлечения траекторий микропузырьков, из которых вычисляются карты скорости и амплитуды обратного рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Визуализация данных с помощью программного обеспечения IcoStudio

1. Загрузите файл .trk в IcoStudio, чтобы начать изучение данных.
2. Настройте параметры визуализации, такие как контрастность, сжатие и цветовая карта, на правой боковой панели, чтобы уточнить представление данных.
3. Установите время интеграции с помощью двойного ползунка в нижней части главного вида, чтобы определить начальный и конечный кадры.
4. Откройте вкладку «Плотность », чтобы просмотреть вхождения микропузырьков, и выберите между «Абсолютной плотностью » (количество на пиксель) и «Направленной плотностью » (аксиально взвешенной).
5. Вкладка «Скорость» используется для отображения скорости микропузырьков в мм/с в нескольких режимах: абсолютном, направленном, осевом и боковом. Отрегулируйте пороги контрастности, сжатия и скорости для улучшения визуализации.
6. Изучите вкладку BSA для визуализации отражательной способности микропузырьков, предоставляющей альтернативный механизм контраста, который выделяет микрососудистые структуры и внеплоскостное движение. Экспортируйте скриншоты в формате PNG с высоким разрешением или создавайте файлы TIFF для количественного анализа с настраиваемыми параметрами размера и типа данных в пикселях.

Результаты

Репрезентативные примеры на рисунке 5 показывают типичный пример данных УЛМ мозга крысы, полученных в течение 1 минуты записи после инъекции 200 мкл микропузырьков болюса с разрешением 10 мкм.

Рисунок 5: Репрезентативные выходные данные УЛМ, полученные от краниотомизированной крысы после инъекции одного микропузырька. Примеры карт плотности микропузырьков (МБ) (слева), скорости (в центре) и амплитуды обратного рассеяния (справа) показаны для полного коронального среза мозга, полученного за 1 минуту записи после болюсной инжекции микропузырьков объемом 200 мкл. Масштабная линейка: 2 мм. Увеличенные вставки выделяют микроциркуляторное русло левой коры головного мозга (масштабная линейка: 0,5 мм). Карта плотности отражает пространственное распределение залеганий MB, выявляя структуру сосудистой сети. Карта скоростей иллюстрирует скорость и направленность потока отдельных MB, что позволяет дифференцировать типы судов. Карта амплитуд показывает обратно рассеянный ультразвуковой сигнал от MB, обеспечивая дополнительный механизм контраста, который улучшает визуализацию морфологии сосудов и движения вне плоскости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Полученные карты иллюстрируют три взаимодополняющих представления микроциркуляторного русла головного мозга: плотность микропузырьков (MB) (слева), скорость (в центре) и обратно-рассеянная амплитуда (справа). Каждая карта соответствует полному корональному срезу мозга, с увеличенными вставками, выделяющими левую корковую микроциркуляторную русло (масштабные линейки: 2 мм и 0,5 мм соответственно).

Карта плотности показывает пространственное распределение вхождений MB по полю зрения. Морфология сосудов разрешается значительно ниже дифракционного предела, обнажая как крупные сосуды, так и мелкие капиллярные структуры. Этот тип карты позволяет четко визуализировать топологию сосудистой сети, включая бифуркации и модели ветвления, даже в глубоких областях коры головного мозга.

Карта скоростей отображает скорость потока отдельных MB, спроецированных в осевом направлении (z). Эта проекция дает знаковые значения скорости, где отрицательные скорости отражают восходящий поток в кору головного мозга, а положительные — нисходящий поток. В коре головного мозга грызунов сосудистая архитектура сильно стереотипизирована: проникающие артериолы опускаются с поверхности пиала в корковые слои, в то время как венулы поднимаются от коры обратно к поверхности для дренирования дезоксигенированной крови¹⁶. Такое последовательное анатомическое расположение позволяет использовать измерения направленной скорости для различения типов сосудов, при этом положительные осевые скорости обычно указывают на артериальный кровоток, а отрицательные скорости указывают на венозный дренаж. В целом, значения скорости, измеренные с помощью УЛМ, согласуются с ранее описанными в литературе диапазонами^10,17, варьирующимися от 10-20 мм/с в проникающих артериолах до нескольких сантиметров в секунду в крупных внутричерепных артериях. Эти результаты согласуются с более ранними наблюдениями о том, что проточные микропузырьки точно имитируют реологическое поведение красных кровяных телец¹⁸, что подтверждает использование ULM для количественной оценки физиологической динамики кровотока на микроуровне.

Карта обратного рассеяния амплитуды (BSA) обеспечивает пространственное представление интенсивности ультразвукового сигнала, возвращаемого каждым MB. Поскольку энергия обратного рассеяния максимизируется при прохождении MB через фокальную область, эта карта предлагает контраст в зависимости от положения на высоте. Он помогает уточнить сегментацию, выявляя внеплоскостное движение или малоамплитудные сосуды, особенно на больших глубинах или вблизи фокальных краев. Карты BSA также полезны для обнаружения затухания сигнала, связанного с глубиной, или выявления несоответствий в фокусном выравнивании¹⁵.

Чтобы продемонстрировать воспроизводимость нацеливания на плоскость с помощью системы позиционирования мозга, на рисунке 6A показаны карты плотности сосудов ULM, полученные у той же мыши под анестезией в день 0 (неделя 1) и день 7 (неделя 2), нацеленные на одну и ту же корональную плоскость. Наложение обеих карт показывает сильное пространственное соответствие сосудистого сигнала, подтверждая точность изменения положения плоскости и надежность продольных экспериментов, как было показано ранее¹⁹.

Количественный анализ может быть применен к любому из этих результатов. Например, пользователи могут сегментировать сосуды, используя пороговые значения интенсивности или алгоритмы кластеризации, а затем извлекать региональные статистические данные, такие как плотность сосудов, средняя скорость потока и морфометрические параметры, включая радиус сосуда, среднюю длину, количество ветвей и другие структурные дескрипторы сосудистой сети. Сравнения между областями коры головного мозга или экспериментальными группами (например, инъекционные и контрольные) могут быть выполнены непосредственно на этих картах или с помощью производной параметрической статистики по часто идентифицируемым сосудам^20,21. В качестве примера такого анализа мы провели регионарную количественную оценку сосудистых параметров в левой соматосенсорной коре (S1BF, рис. 6B) и левом таламусе (рис. 6C). Карты плотности сначала были бинаризованы, скелетированы и рассчитаны радиусы сосудов с помощью преобразования евклидовых расстояний. Скорости течения были получены непосредственно из траекторий MB, а скорость потока была выведена из радиуса судна с использованием закона Пуазейля, как описано ранее²¹. Здесь была применена та же методология, что и описанная в том исследовании. Графики «усов» отображают распределение радиуса сосуда, скорости и расхода для d0 и d7, демонстрируя хорошую воспроизводимость между сеансами. Вместе эти мультимодальные выходы ULM позволяют всесторонне охарактеризовать микрососудистую сеть мозга, предлагая как анатомические, так и динамические сведения с беспрецедентным разрешением.

Рисунок 6: Продольная воспроизводимость плоскостного нацеливания и пример количественного определения сосудов с использованием системы позиционирования мозга. (A) Карты плотности сосудов ULM, полученные от одной и той же мыши под наркозом в день 0 (неделя 1) и день 7 (неделя 2), нацеленные на одну и ту же корональную плоскость с использованием системы позиционирования мозга (масштабная линейка = 1 см). Наложение обеих карт показывает сильное пространственное соответствие сосудистого сигнала, иллюстрируя воспроизводимость положения в плоскости между сеансами. (В,В) Репрезентативная количественная оценка сосудистых параметров, выделенная из двух областей, представляющих интерес: левая соматосенсорная кора (S1BF, B) и левый таламус (C). Для каждой области мы отображаем карту плотности сосудов в точке d0 (масштабная линейка = 0,5 см) вместе с графиками усов, показывающими распределение радиуса сосуда (мкм), скорости потока (мм/с) и скорости потока (мм³/с) в точках d0 и d7 (медиана, 25-75-й процентиль, усы = 1,5×IQR, выбросы нанесены отдельно). Эти результаты иллюстрируют способность конвейера извлекать морфометрические и гемодинамические метрики из данных ULM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Ультразвуковая локализационная микроскопия (УЛМ) представляет собой революционный шаг вперед в ультразвуковой визуализации, позволяющий визуализировать микроциркуляторное русло со сверхвысоким разрешением за пределами обычного дифракционного предела. В этом обсуждении освещаются важнейшие этапы протокола ULM, рассматриваются потенциальные модификации и стратегии устранения неполадок, исследуются ограничения метода, оценивается его значение по сравнению с альтернативными методами визуализации, а также рассматривается его важность и потенциальные применения в биомедицинских исследованиях.

Критические шаги в протоколе ULM

Несколько шагов имеют решающее значение для успешной реализации ULM, и их влияние проиллюстрировано на рисунке 7. Одним из наиболее важных этапов является введение микропузырьков, поскольку как концентрация, так и качество доставки напрямую влияют на результаты визуализации. Оптимальная концентрация необходима для обеспечения баланса между пространственным разрешением и обнаруживаемостью. Неадекватное доставление, такое как плохое размещение катетера или экстравазация, может привести к очень низкому сосудистому сигналу и неполным реконструкциям, как показано на рисунке 7B, где в кровоток попадает лишь небольшое количество микропузырьков. Изображения с высокой частотой кадров, обычно в килогерцовом диапазоне, необходимы для фиксации быстрого движения микропузырьков и обеспечения надежного отслеживания кадров. Любая нестабильность во время регистрации, такая как движение, вызванное дыханием, плохая фиксация или недостаточная анестезия, может ухудшить точность локализации. Пример этого показан на рисунке 7C, где чрезмерное движение во время сбора данных приводит к размытой и непригодной для использования карте плотности.

Локализация и отслеживание микропузырьков зависят от передовых алгоритмов обработки изображений, которые обнаруживают отдельные пузырьки, выполняют субпиксельную локализацию и реконструируют траектории с субдифракционной точностью. Даже при правильном сборе и обработке анатомические факторы, такие как аберрации, вызванные черепом, все равно могут влиять на качество изображения. При транскраниальной визуализации, особенно у старых мышей, утолщение черепа может привести к акустическим искажениям. Это приводит к появлению характерных артефактов затенения под сагиттальным швом, где не обнаруживаются микропузырьки, как показано на рисунке 7D. Такие аберрации снижают соотношение сигнал/шум и могут скрывать сосудистые структуры, если их не скорректировать с помощью адаптивной фильтрации или уточнения размещения зондов.

Когда все шаги выполнены успешно, можно получить высококачественные карты УЛМ, как показано на рисунке 7A, где плотная и хорошо разрешенная сосудистая сеть реконструируется с помощью транскраниального доступа.

Рисунок 7: Примеры и примеры устранения неполадок для качества визуализации ULM у мышей. На панели (A) показана высококачественная карта плотности транскраниальных микропузырьков (MB) ULM, полученная у молодой взрослой мыши, иллюстрирующая успешное сосудистое картирование по всей корональной плоскости. На панели (B) показан пример слабого сосудистого сигнала из-за экстравазации микропузырьков или недостаточного венозного доступа, что приводит к редкому обнаружению MB. На панели (C) показано приобретение, на которое влияет чрезмерное движение животного, что создает размытую и неинтерпретируемую карту плотности. На панели (D) выделена акустическая аберрация, вызванная черепом, обычно наблюдаемая у старых мышей, видимая в виде теневого конуса под сагиттальным швом, где MB не обнаруживаются из-за сниженного отношения сигнал/шум. Эти примеры служат визуальными ориентирами для выявления и устранения распространенных экспериментальных артефактов в визуализации ULM. Масштабная линейка: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Ограничения метода

Несмотря на множество преимуществ, УЛМ имеет присущие ему ограничения, которые влияют на его применимость. Смещение сосудов вне плоскости является важной проблемой при 2D-визуализации, поскольку сосуды, выходящие за пределы плоскости изображения, не реконструируются адекватно, что приводит к неполным сосудистым картам. Это ограничение может быть смягчено путем перехода к объемной (3D) визуализации²², хотя это увеличивает вычислительную сложность. Проблемы внутривенной катетеризации также представляют собой препятствие, особенно в моделях мелких животных, где достижение стабильной доставки микропузырьков может быть технически сложным. Стабильность микропузырьков также является ограничивающим фактором, особенно при длительных сеансах визуализации. Из-за короткого периода полувыведения микропузырьков может потребоваться повторная болюсная инъекция или протоколы непрерывной инфузии для поддержания адекватного контраста в течение всего периода приобретения. Артефакты движения остаются серьезной проблемой, особенно для бодрствующих объектов, где даже небольшие непроизвольные движения могут ухудшить визуализацию со сверхвысоким разрешением. Наконец, глубина проникновения в УЛМ по своей природе ограничена затуханием ультразвука. Хотя для визуализации грызунов на высоких частотах (например, 15 МГц) это обычно не проблематично, у более крупных животных, таких как свиньи или приматы. В этих случаях для достижения достаточной глубины визуализации могут потребоваться более низкочастотные зонды, но это происходит за счет снижения пространственного разрешения, что подчеркивает ключевой компромисс между глубиной и детализацией, который необходимо учитывать при переносе УЛМ в более крупные доклинические модели.

Значение ЕЛМ по сравнению с существующими методами

Ультразвуковая локализационная микроскопия (УЛМ) имеет значительные преимущества по сравнению с традиционными методами визуализации, особенно в контексте микрососудистой визуализации. Среди его наиболее заметных преимуществ — его способность превосходить дифракционный предел традиционного ультразвука, достигая субдифракционной визуализации в пространственных масштабах, сравнимых с оптическими методами, такими как двухфотонная микроскопия. Однако, в отличие от этих оптических методов, ULM обеспечивает более глубокое проникновение в ткани, позволяя получить доступ к областям мозга, которые в противном случае трудно визуализировать неинвазивно.

ULM также предлагает возможности функциональной визуализации, позволяющие количественно оценить скорость кровотока, динамику перфузии и ремоделирование сосудов. Эти особенности делают его очень подходящим для исследования как физиологических процессов, так и патологических изменений в нейроваскулярных сетях. По сравнению с МРТ и ПЭТ, УЛМ более экономичен, не требует тяжелой инфраструктуры и позволяет избежать использования контрастных веществ с известными рисками токсичности, полагаясь вместо этого на заполненные газом микропузырьки с благоприятными профилями безопасности.

Сочетание высокого пространственного и временного разрешения делает ULM особенно ценным для целого ряда исследовательских приложений. Он особенно эффективен в исследованиях, нацеленных на микрососудистые структуры и глубокие ядра мозга, где традиционные методы часто не справляются. Кроме того, в отличие от гистологических подходов, требующих фиксации и окрашивания тканей, ULM позволяет визуализировать живых животных в режиме реального времени, поддерживая продольный дизайн и динамические вмешательства, такие как фармакологические проблемы.

Помимо статического картирования сосудов, ULM также позволяет получать функциональную визуализацию с высоким разрешением, захватывая динамику мозгового кровотока с исключительной пространственной и временной точностью. Последние достижения продемонстрировали его возможность для функциональной нейровизуализации всего мозга у грызунов, выявив вызванные стимулами и спонтанную активность изменения кровотока на капиллярном уровне в распределенных^{сетях мозга}. Это позиционирует ULM как мощный инструмент для функциональных исследований, эффективно преодолевая разрыв между мезомасштабной гемодинамической визуализацией и картированием нейронной активности.

Вопросы удобства использования, эффективности и воспроизводимости

Рабочий процесс ULM, описанный в этом протоколе, был оптимизирован для простоты реализации и воспроизводимости в различных экспериментальных установках. Использование коммерчески доступных компонентов, включая микропузырьки, одобренные FDA и EMA, и стандартные процедуры анестезии грызунов, обеспечивает широкую доступность. Кроме того, интеграция всего конвейера обработки в специализированное программное обеспечение (IcoLab) значительно повышает удобство использования за счет автоматизации сложных этапов, таких как локализация микропузырьков, реконструкция траектории и генерация карты. Этот оптимизированный интерфейс снижает потребность в пользовательском коде и сводит к минимуму вмешательство пользователя, обеспечивая согласованные результаты для всех пользователей и экспериментов. В то время как обработка ULM с высоким разрешением требует больших вычислительных ресурсов, особенно для длительных сборов или объемных данных, инструменты пакетной обработки и ускорение GPU значительно сокращают время анализа. Модульная конструкция протокола также поддерживает воспроизводимость, что позволяет исследователям точно настраивать параметры сбора и обработки, сохраняя при этом надежную аналитическую структуру. Протокол также включает в себя специальный раздел о позиционировании зонда с помощью IcoScan и IcoStudio, что позволяет пользователям надежно перемещать зонд на одном и том же срезе изображения в течение сеанса с точностью до 100 мкм. Эта функция особенно ценна для лонгитюдных исследований, где точная пространственная согласованность имеет важное значение для отслеживания сосудистых изменений с течением времени. Эти функции в совокупности снижают барьер входа для новых пользователей и поддерживают масштабируемое развертывание ULM как в исследовательских, так и в лонгитюдных исследованиях визуализации.

Заключение

Этот протокол представляет собой полный рабочий процесс для внедрения ультразвуковой микроскопии локализации (УЛМ) в визуализацию мозга грызунов, охватывающий хирургическую подготовку, введение микропузырьков, получение изображений и сосудистое картирование с высоким разрешением с использованием стандартизированной платформы сбора и анализа, оптимизированной для доклинических исследований. ULM представляет собой значительный шаг вперед в биомедицинской визуализации, предлагая сверхреалистичную визуализацию микроциркуляторного русла in vivo с беспрецедентной детализацией. По сравнению с существующими методами визуализации, ULM обеспечивает уникальное сочетание высокого пространственного разрешения, количественной оценки функционального потока и доступности, что делает его особенно подходящим для исследований развития сосудов, нейроваскулярного взаимодействия и патофизиологии заболевания. По мере того, как технология продолжает развиваться, ULM готова стать краеугольным камнем как в доклинических исследованиях, так и, в конечном итоге, в приложениях клинической нейровизуализации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Регулятор температуры животных (нагревательная пластина в сочетании с ректальным зондом)	Physitemp	TCAT-2DF
Atipamezole	Orion Pharma, Франция	Антиседан	5 мг/мл инъекционный раствор
Мыши C57BL/6	Лаборатория Жанвье	SC-C57J-M	C57BL/6Rj самцы мышей, 8 недель
Стоматологическая дрель	Фордом, США	K.1070 Комплект для высокоскоростного роторного микромотора
Депиляционный крем	Виши	Н/Д
Мазь для глаз	TVM, Великобритания	Ocry-gel
Триммер для волос	Phymep	ISIS GT 421 Aesculap
Программное обеспечение для обработки IcoLab (версия 1.2.0.0)	Иконей, Франция	IcoLab
Конфигурация Iconeus One Xpand	Иконей, Франция	IconeusOne Xpand
Зонд IcoPrime 15 МГц	Иконей, Франция	Зонд IcoPrime-15 МГц
Программное обеспечение для приобретения IcoScan (версия 1.9.0)	Иконей, Франция	IcoScan
Программное обеспечение для анализа IcoStudio (версия 2.2.0)	Иконей, Франция	IcoStudio
Йодный раствор	Милан, Франция	Н/Д
Анестезиологическая станция Изофлуран	Минерв, Эстерне, Франция	Н/Д
Кетамин	Вирбак, Франция	Ketamine1000	100 мг/мл инъекционный раствор
Мелоксикам	Бёрингер Ингельхайм	Metacam	0,5 мг/мл инъекционный раствор
Иглы	Терумо, Франция	AN*1838R1	18 G x и фрак12; ” игла с 8" Трубки
Соленая вода	Лаборатория Гилберт Физиодоз, фармация, Франция	Н/Д
Скальпель	DREXCO medical, Франция	80011
Микропузырьки SonoVue	Bracco Imaging	SonoVue 8ul/ml
Лопатка	Фимед, Франция.	K.1070 Комплект для высокоскоростного роторного микромотора
Sprague-Dawley Rj: Ханские крысы	Лаборатория Жанвье	RN-SD-M	RjHan:SD — самцы крыс Sprague Dawley, 200-300 г
Стереотаксичная система	Дэвид Копф (Туджунга, США)	900-WA	Использование Mouse Adaptor  (Ссылка: 922) и неразрывные ушные планки (ссылка: 922)
Шприц	DREXCO medical, Франция	2058
Гель для ультразвука	DREXCO medical, Франция	Medi'Gel
Набор для инфузии с крыльями	Терумо, Франция	SV*27EL
Ксилазин 2%	Байер, Франция	Ромпун	20 мг/мл инъекционный раствор