Методическая статья

Определено ксеносвободное перепрограммирование предшественников пуповинной крови в индуцированные плюрипотентные и бластомероподобные стволовые клетки

583 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68613

⸱

22 августа 2025 г.

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе изложены химически определенные методы для ксеносвободного (XF), безфидерного (FF) эписомального перепрограммирования миелоидных предшественников пуповинной крови человека (CB) в обычные человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC). Эти XF/FF CB-hiPSC (XF-hiPSC) могут быть эффективно возвращены к бластомероподобным стволовым клеткам Tankyraza/PARP1 Inhibitor-Regulated Naive (TIRN-SC), обладающим усиленной дифференцировкой и межвидовым химерным потенциалом.

Аннотация

Перепрограммирование миелоидного предшественника пуповинной крови человека (КБ) в состояние индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК) с высокой точностью может быть достигнуто с использованием неинтегрирующихся эписомальных векторов и стромальных сигналов. Эти обычные, праймированные линии CB-hiPSC впоследствии могут быть химически возвращены с высокой эффективностью в бластомероподобное состояние наивных стволовых клеток танкиразы/ингибитора PARP (TIRN-SC) с функциональной тотипотентностью. PARP-регулируемые TIRN-SC представляют собой стволовые клетки человека с высокой эпигенетической пластичностью, стабильными эпигеномными импринтами и обладают большей дифференцировочной активностью, чем обычные, праймированные по линии ИПСК. В данной работе представлены оптимизированные методы XF/FF для эффективного эписомального перепрограммирования миелоидных предшественников CD34+ CD33+ CB в обычные XF/FF hiPSC, активируемые мезенхимальной стромой. Реверсия TIRN воспроизводимо потенцировала XF/FF обычный hiPSC для адаптации транскрипционных, эпигенетических и функциональных особенностей клеток человеческого эмбриона на стадии расщепления со сниженной экспрессией генов, праймированных по линии. Мы подтвердили, что XF-hiPSC, полученный из TIRN-reverted-CB, продемонстрировал заметное улучшение направленной многолинейной дифференцировки (включая гематоваскулярные линии) в широком репертуаре генетически независимых фонов. Эти методы служат первым шагом на пути к созданию соответствующих cGMP линий TIRN-SC для банков TIRN-SC (UTIRN-SC), определенных HLA. Выведение линий UTIRN-SC с улучшенной универсальностью дифференцировки из предшественников CD34+ CD33+ CB может оказать большое влияние на регенеративную медицину. Например, UTIRN-SC могут создавать банки тканей HLA-определенных, криоконсервированных кардиологических, сосудистых и нейронных донорских предшественников для комплексной многолинейной клеточной терапии.

Введение

Несмотря на то, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) открывают многообещающие возможности для персонализированной клеточной терапии, их клиническое применение сталкивается с серьезными проблемами, включая опухолегенность, иммуногенность, фенотипическую и функциональную гетерогенность1, что влияет на их безопасность, эффективность и экономическую эффективность. Кроме того, предшественники, приверженные линии, полученные от обычных, праймированных линий hiPSC, генерируются с сильно вариабельной эффективностью межлинейной дифференцировки2 и демонстрируют ограниченное приживление и функциональность in vivo. Однако такие ограничения могут быть преодолены с помощью оптимизированных методов перепрограммирования3 или альтернативных состояний стволовых клеток 4,5.

Несмотря на то, что эффективность невирусного эписомального перепрограммирования соматических клеток кожи или крови в hiPSC низка (~0,01%-2%)6, может быть достигнуто высокооптимизированное четырехфакторное перепрограммирование предшественников CB, которое может достигать до 50% объемной эффективности в условиях совместного культивирования мезенхимального стромального стромального стволового предшественника (МСК)7. В этой системе клеточное перепрограммирование миелоидных предшественников CB ускорялось за счет растворимых и контактно-зависимых стромальных сигналов. Стромы-праймированные (СП) эписомальные линии КБ, полученные из КБ, дифференцированы в сосудистые предшественники (ВП) с более высокой эффективностью, чем обычные ИПСК, полученные из фибробластов 3,5. VP, полученный из SP-CB-iPSC, продемонстрировал более аутентичную транскрипционную идентичность эмбриона VP, меньшую старение и чувствительность к повреждениям ДНК 3,4. VP, полученный из SP-CB-iPSC, также продемонстрировал более надежное приживление in vivo, чем обычный VP, полученный из hiPSC, после системной или прямой трансплантации в стекловидное тело взрослых мышей с иммунодефицитом, поврежденных ишемией реперфузии сетчатки 3,4.

Zimmerlin et al. разработали двухступенчатую систему химического перепрограммирования («LIF-5i -> LIF-3i»), которая переводит праймированные, обычные плюрипотентные стволовые клетки человека в состояние TIRN-SC с улучшеннымпотенциалом многолинейной дифференцировки. Дифференцированные сосудистые предшественники, полученные из TIRN-SC, продемонстрировали более высокую функциональность, большую стабильность генома и превосходное приживление in vivo, о чем свидетельствует их улучшенная способность к миграции и реваскуляризации глубоких нейронных слоев ишемизированной сетчатки4. TIRN-SC подвергся протеогеномному перепрограммированию для приобретения функционального гибридного бластомероподобного состояния с высоким вкладом в анализ межвидовой химеры8. TIRN-SC поддерживали экспрессию DNMT1 и были защищены от эрозии в CpG-метилированных участках генома. Интересно, что SP-CB-hiPSC были возвращены в TIRN-SC более эффективно, чем hiPSC, полученные с помощью альтернативных, менее эффективных методов 5,9.

Таким образом, TIRN-SCs являются альтернативным состоянием стволовых клеток с улучшенной способностью к многолинейной дифференцировке и эффективным вкладом в химеры. Дальнейшая оптимизация
Перепрограммирование TIRN-SC в определенных, совместимых с цGMP культуральных условиях будет способствовать созданию широкого спектра функциональных, приживляемых типов клеток и тканей для терапии. Для удовлетворения потребности в экономически эффективных терапевтических предшественниках эти методы могут быть применены для создания банков класса cGMP «Универсального донора» TIRN-SC (UTIRN-SC) с использованием HLA-определенных CD34+ гемопоэтических КБ или предшественников периферической крови. HLA-определенные предшественники UTIRN-SC могут удовлетворить потребности большего числа пациентов, нуждающихся в немедленной многолинейной регенерации сложных тканей.

Парадигмы, разработанные для клинической трансплантации костного мозга (ТКМ), могут служить руководством для разработки банков UTIRN-SC из частично HLA-совместимых или HLA-гаплоидентичных гемопоэтических стволовых клеток из национальных регистров доноров. Прогностический, глобальный вычислительный анализ объединенных 10 лучших гаплотипов из 18 стран, включая США, обеспечит средний охват пациентов в 68,4% от таких «гаплобанков» hiPSC10. Определенный банк UTIRN-SC мог бы не только предоставить предшественников, приверженных линии, но и поддержать терапевтические приложения TIRN-SC систем комплементации межвидовых бластоцист у домашних животных (например, свиней) для целого поколения органов11,12, включая генерацию гемопоэтических предшественников, индуцирующих толерантность, для снижения отторжения трансплантата в популяциях с широким генетическим разнообразием (например, в США).

Этот модифицированный протокол перепрограммирования для создания TIRN-совместимых линий XF/FF hiPSC является первым шагом на пути к разработке будущих cGMP-совместимых банков UTIRN-SC. Этот протокол описывает поэтапное перепрограммирование стромы и функциональную валидацию миелоидных предшественников CB человека в обычные линии XF-hiPSC. Эти методы XF-hiPSC продемонстрировали легкий возврат в TIRN-SC с эффективностью, аналогичной методам без XF7, и достигли неограниченной функциональной плюрипотентности, включая улучшенную способность производить хорошо сформированные тератомы, уменьшенные с коррекцией смещения линии (по сравнению с изогенным праймированным XF-hiPSC)4,5,9. Мы также описываем протоколы, которые валидируют TIRN-возвращенный XF-hiPSC на предмет их улучшенной и надежной прямой дифференцировки в гематоваскулярные линии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты по перепрограммированию соответствовали рекомендациям, опубликованным Национальной академией наук и Международным обществом исследований стволовых клеток (ISSCR). Для получения hiPSC протоколы сбора донорских клеток и информированное согласие донора были одобрены Институциональным наблюдательным советом (IRB) Университета Джонса Хопкинса (JHU). Все эксперименты проводились в рамках Институционального надзора за исследованиями стволовых клеток (ISCRO) JHU и соответствуют институциональным стандартам в отношении информированного согласия и оценки происхождения. Кроме того, все операции с использованием животных и хирургические процедуры были выполнены в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Института JHU (IACUC). Все эксперименты с использованием процедур на животных (например, подкожные/внутримышечные инъекции NOD. Мыши Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NOG SCID) (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) для анализа тератомы и переноса бластоцисты у псевдобеременных мышей ICR) были рассмотрены и одобрены JHU IACUC. Эти обзоры включали соображения в отношении этических жертв, гуманного содержания и соответствующих мер по минимизации дискомфорта животных.

1. Эписомальное перепрограммирование без ксенофри hiPSC

  1. Препарат донорских гемопоэтических клеток-предшественников
    1. Используйте криоконсервированные CD34+ гемопоэтические стволовые/прогениторные клетки (например, 1x106 неонатальных клеток CB) сразу после доставки или храните криополиальные клетки в резервуаре для хранения жидкого азота. Убедитесь, что клетки постоянно поддерживаются в замороженном состоянии во время транспортировки и обработки.
      Примечание: В качестве альтернативы, некриоконсервированные донорские клетки также могут быть использованы сразу после сбора и обогащения CD34 с использованием утвержденных протоколов.
    2. Перед размораживанием клеток на водяной бане осторожно откройте стерилизованный криовиал в шкафу биобезопасности, чтобы выпустить весь захваченный газ внутри флакона, а затем плотно закройте флакон.
    3. Поместите флакон на водяную баню при температуре 37 °C на 1-2 минуты. Аккуратно поворачивайте флакон до тех пор, пока льда почти не останется. Снимите флакон с водяной бани и тщательно простерилизуйте его (т.е. спреем с 70% этанолом).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы требуют надлежащей асептической техники и выполняются в стерильном шкафу с биологической защитой.
    4. Аккуратно и медленно переложите клетки в пустую стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте флакон 1 мл холодной расширительной среды для безгемопоэтического предшественника (XF-HP) (Таблица 1) и аккуратно соедините (по каплям по краям пробирки) с клетками для разбавления криопротектора ДМСО.
    5. Оставьте пробирку в штативе на 30 с и медленно (по каплям) добавьте 2 мл холодной среды XF-HP. Аккуратно взбалтывайте клеточную суспензию при добавлении среды. Повторите этот шаг дважды, добавив последовательно 4, 8 и 4 мл холодной среды XF-HP (общий объем до 20 мл). Центрифугируйте разведенные ячейки при 100 x g в течение 10 минут при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пипетируйте клетки вверх и вниз в растворе криопротектора и на этапах разведения. Добавляйте XP-HP умеренно и медленно, пока ДМСО не разбавится хотя бы в 10 раз. Используйте холодную среду, так как разбавление ДМСО приводит к экзотермической реакции.
    6. Аспират бесклеточный надосадочный агент в шкафу биобезопасности. Аккуратно вытесните клеточную гранулу. Ресуспендируйте в 2 мл расширяющей среды XF-HP для подсчета клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
    7. Перенесите размороженные клетки на многолуночные планшеты для клеточных культур со сверхнизким уровнем прикрепления (например, перенесите 2 мл смеси клеток/среды XF-HP в 1 лунку 6-луночного планшета).
    8. Плотно заверните тарелку в сарановую пленку для имитации гипоксических условий. Перенесите планшет в инкубатор (37 °C, 5%CO2, влажная атмосфера). В качестве альтернативы поместите незавернутую тарелку в инкубатор с контролем O2 (5% O2, 5% CO2, влажная атмосфера).
    9. Культивируют гемопоэтические предшественники в течение 3 суток в среде XF-HP.
  2. Препарат мезенхимальных стволовых клеток-предшественников (МСК)
    1. Разморозьте аликвоту (0,75 - 1x106 клеток) МСК человека с низким проходом (p2 - p3) путем инкубации криоконсервированной аликвоты на водяной бане при температуре 37 °C в течение 1-2 минут. Аккуратно поворачивайте флакон до тех пор, пока льда почти не останется. Снимите флакон с водяной бани и тщательно простерилизуйте (т.е. 70% этанолом).
      ПРИМЕЧАНИЕ: МСК человека с низким проходом (p2) может быть приобретен или получен из костного мозга человека с использованием установленных протоколов и криоконсервирован. МСК можно разморозить примерно за 7-10 дней и облучать/осаждать в качестве питающего слоя за день до нуклеофекции (Рисунок 1).
    2. Осторожно и медленно (по каплям вдоль краев пробирки) перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую холодную среду мезенхимальных стволовых клеток (XF-MSC) без ксеносвободной сыворотки (Таблица 1) в биобезопасном шкафу, чтобы разбавить криопротектор ДМСО не менее чем в 10 раз (например, перенесите 1 мл криоконсервированной клеточной аликвоты в среду XF-MSC объемом 9 мл).
    3. Используйте 1 или 2 мл холодной среды XF-MSC, чтобы промыть пробирку и соединить в коническую пробирку. Центрифугируйте разведенные ячейки при 100 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    4. Аспират бесклеточный надосадочный агент в шкафу биобезопасности. Аккуратно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды XF-MSC для подсчета клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
    5. Перенесите размороженные клетки на обработанные тканями многолуночные планшеты для клеточных культур (например, 5000-6000 клеток насм2 или около 50000 клеток в 1 лунке 6-луночного планшета). Поместите планшеты в инкубатор (37 °C, 5%CO2, влажная атмосфера). Обновляйте среду XF-MSC каждые 2-3 дня в шкафу биобезопасности.
    6. За день до нуклеофекции аспирируйте бесклеточную надосадочную жидкость в шкафу биобезопасности. Промойте MSC один раз PBS (2 мл/лунка). Аспират PBS. Добавьте 1 мл/лунку реагента для диссоциации клеток (например, 1X раствор трипсина-ЭДТА). Инкубировать в течение 5 минут при 37 °C в инкубаторе сCO2 .
    7. Нейтрализуйте диссоциативный реагент, добавив 1 мл среды XF-MSC (не менее 2-кратного разведения) и аккуратно растирайте пипеткой в одноклеточную суспензию. Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте при 100 х г в течение 5 мин.
    8. Аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды XF-MSC для подсчета клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
    9. Облучают (2000 рад) мезенхимальные предшественники под 5 пассажами с помощью g- или рентгеновского облучателя и наносят на синтетическую поверхность, покрытую пептидами Arg-Gly-Asp (RGD) в 6-луночных планшетах (2x10по 5 клеток на лунку) в среде XF-MSC. Держите тарелки на ночь в инкубаторе (37 °C, 5%CO2, влажная атмосфера).
  3. Ксенофри перепрограммирование эпизодов
    1. Соберите культуры CB HP 3-дневной давности в расширительной среде XF-HP в коническую пробирку объемом 15 мл в боксе биобезопасности. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин.
    2. Аспират бесклеточный надосадочный агент в шкафу биобезопасности.  Аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл расширительной среды XF-HP для подсчета клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
    3. Соедините 1x106 расширенных HP-клеток со 100 μл раствора нуклеофекции клеток CD34+ человека (набор нуклеофекторов клеток CD34+ человека). Добавьте 6 г очищенной концентрированной эписомы (<5 μл) и осторожно перенесите в кювету нуклеофэктора с помощью пластиковой передаточной пипетки набора для нуклеофекции. Избегайте образования пузырей. Поместите кювету в нуклеофекторное устройство и используйте программу U-008.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте запасы эписомального вектора pCEP4 pEP4 EO2S EM2K на основе эписомальной EBNA (OCT4, SOX2, MYC, KLF4) путем рутинной трансформации в TOP10 E. coli и очистите с помощью наборов для подготовки плазмид Maxi-prep. В день нуклеофекции очистите и сконцентрируйте плазмиду с помощью набора для очистки ПЦР 7.
    4. Сразу после нуклеофекции добавьте 500 мкл предварительно подогретой расширительной среды XF-HP в кювету и перенесите клетки в 1 мл среды XF-HP на 1 лунку 6-луночного планшета для клеточной культуры со сверхнизким прикреплением с помощью стерильной трансферной пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нуклеофectированные клетки очень хрупкие и не выдержат напряжения сдвига от обычных наконечников пипеток объемом 1 мл. Перенос на культуральные планшеты со сверхнизким уровнем прикрепления — это этап, который способствует восстановлению клеток после нуклеофекции перед окончательным прикреплением к планшетам с покрытием RGD.
    5. Плотно заверните тарелку в пищевую пленку для имитации гипоксических условий. Поместите планшет в инкубатор сCO2 (37 °C, 5%CO2, влажная атмосфера). В качестве альтернативы поместите незавернутую тарелку в инкубатор с контролем O2 (5% O2, 5% CO2, влажная атмосфера). Выдерживайте от 4 до 6 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволит нуклеофекцированным клеткам HP восстановиться перед переносом на монослои MSC.
    6. Соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл в шкафу биобезопасности. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин.
    7. Аспирируйте надосадочную жидкость в шкафу биобезопасности. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл расширяющей среды XF-HP. Пластинчатые нуклеофекты HP на облученных МСК с плотностью около 17 500 клеток/см2 в пластинах, покрытых RGD, в расширяющей среде XF-HP (2 мл/лунка) с добавлением ингибитора ROCK Y-27632 (конечная концентрация 10 мкМ). Поместите планшет в инкубатор сCO2 (37 °C, 5%CO2, влажная атмосфера).
    8. Через два дня после нуклеофекции добавьте по 2 мл (равный объем) среды E8 в каждую лунку в шкафу биобезопасности.
    9. Заменяйте половину объема питательной среды через день средой Е8. Соберите плавающие клетки в коническую пробирку объемом 15 мл, центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут и добавьте восстановленные клетки обратно в культуру.
    10. На 21-й день приготовьте покрытые витронектином 6-луночные планшеты, обработанные культурой тканей. Добавьте 1 мл разбавленного раствора витронектина (например, 40 мл/мл для Vitronectin-XF) в 1 лунку 6-луночного планшета и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре.
    11. Вручную отбирайте отдельные колонии XF-hiPSC с помощью инвертированного микроскопа в шкафу биобезопасности. Растирать с помощью пипетки и переносить одиночные колонии на покрытые витронектином планшеты в среде Е8 с добавлением ингибитора ROCK Y-27632 (конечная концентрация 5 мкМ). Поместите планшет в инкубатор сCO2 (37 °C, 5%CO2, влажная атмосфера).
    12. На следующий день осторожно замените среду на среду E8 без добавления ингибитора ROCK. После этого меняйте среду E8 каждый день (2 мл/лунка) в боксе биобезопасности.

2. Плановое культивирование и поддержание гиПСК

  1. Когда через 5-6 дней колонии станут больше (т.е. от 0,5 до 1 мм в диаметре или около 80% слияния), аспирируйте среду в биобезопасном шкафу.
  2. Добавьте 2 мл PBS на лунку для промывки клеток. Аспирация PBS. Добавьте 1 мл раствора для диссоциации клеток на основе ЭДТА. Инкубировать в течение 5 минут в инкубаторе сСО2 (37 °C, 5%СО2, влажная атмосфера). С помощью микроскопа убедитесь, что клетки прикреплены слабо (например, блестящие круглые клетки, но все еще прикреплены к пластине).
  3. Аккуратно отсасывайте раствор для диссоциации в шкафу биобезопасности, не нарушая клетки организма.
  4. Соберите клетки в 1-2 мл среды Е8 с добавлением ингибитора ROCK Y-27632 (конечная концентрация 5 мкМ) с неактивным пипетированием для поддержания клеточных скоплений. Перенесите клеточные скопления на покрытые витронектином (см. раздел 1.3.11) 6-луночные планшеты, обработанные клеточными культурами (эквивалентно 10 колониям на лунку или разделению 1:10). Поместите планшет в инкубатор сCO2 (37 °C, 5%CO2, влажная атмосфера).
  5. Продолжайте субкультивирование с использованием раствора для диссоциации клеток на основе ЭДТА каждые 5-7 дней.
    Примечание: Для перепрограммирования SP-CB-hiPSC обычно не требуется дополнительное субклонирование или ручной отбор колоний, но если клоны hiPSC содержат колонии с аномальной морфологией (например, спонтанная дифференцировка, такая как фибробласты или образование эмбриоидных тел, появление аномальных неплоских колоний), выберите колонии вручную с помощью микропипетки и микроскопа в шкафу биобезопасности или отбракуйте аберрантные клоны. Неэффективное, нестабильное перепрограммирование hiPSC несовместимо с реверсией TIRN-SC.

3. Фенотипическая валидация клонов XF-hiPSC

  1. Расширьте клоны XF-hiPSC по крайней мере на 5-7 пассажей для первоначальной валидации (рис. 2), как описано в разделе 2, перед долгосрочным криоконсервированием и применением в функциональных исследованиях. Запишите количество проходов на каждой криоконсервированной пробирке.
    Примечание: Первоначальная характеристика клонов XF-hiPSC с низким пассажем может быть подтверждена множественными анализами, такими как активность акалифосфатазы и иммунодетекция антигена TRA-1 или NANOG.
  2. Проведите валидацию и перечисление XF-hiPSC с помощью окрашивания щелочной фосфатазой (рис. 2A, B).
    Примечание: Эффективность перепрограммирования в объемных культурах может быть определена при P0 через 3-5 недель после эписомальных нуклеофекций путем подсчета количества полностью перепрограммированных колоний на одну входную клетку, покрытую на 3-й день 7,13.
    1. Аспиративная питательная среда в шкафу биобезопасности.
    2. Промойте ячейки PBS (2 мл на лунку). Аспират PBS. Зафиксируйте клетки, добавив 2% раствор параформальдегида/PBS. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре.
    3. Удалите и утилизируйте раствор параформальдегида/PBS в соответствии с рекомендациями по безопасности химических отходов.
    4. Промойте ячейки PBS (2 мл на лунку). Аспират PBS. Добавьте 1-2 мл субстрата щелочной фосфатазы и инкубируйте от 10 до 15 минут при комнатной температуре при медленном перемешивании.
    5. Промойте PBS 3 раза, чтобы остановить реакцию. Сфотографируйте микрофотографию и перечислите.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного времени инкубации или температуры, так как это может привести к ложноположительному окрашиванию.
  3. Выполните валидацию и перечисление окрашивания XF-hiPSC с помощью иммуноокрашивания антигена TRA-1 (рис. 2C).
    Примечание: Для эпизодического перепрограммирования обнаружение трансгенной экспрессии и векторного каркаса EBNA1 во время начальных пассажей должно быть выполнено с использованием опубликованных протоколов7. Рутинная валидация включает кариотипирование с помощью G-полос (рисунок 2D) или анализ покрытия всего генома. Базовую функциональную плюрипотентность также можно оценить с помощью протоколов дифференцировки тератомы (рисунок 2E) или количественных мультигенных карт экспрессии ненаправленных эмбриоидных дифференцировок тел14.
    1. В боксе биобезопасности иммунокраситель в течение 30 мин реплицирует лунки для антигенов TRA-1-60 или TRA-1-81 путем добавления фторохром-конъюгированных антител к живому окрашиванию в среду Е8 в соответствующей концентрации.
    2. Аспирируйте питательную среду. Дважды промыть средой Е8 (2 мл на лунку).
    3. Сделайте микрофотографию и пронумеруйте в среде Е8 или среде без фенола красного.
      Примечание: В качестве альтернативы можно зафиксировать клетки с помощью 2% раствора параформальдегида/PBS в течение 10 минут при комнатной температуре и иммуноокрашивания на антигены TRA-1 с использованием стандартных антител.
  4. Валидация иммунофенотипа XF-hiPSC с помощью проточной цитометрии.
    1. В шкафу биобезопасности используйте аспирацию питательной среды.
    2. Промойте ячейки в PBS (2 мл на лунку). Аспират PBS. Добавьте ферментативный реагент для диссоциации (например, Аккутаза, 1 мл на лунку). Инкубируйте планшет в течение 5 минут при температуре 37 °C в инкубаторе сCO2 (5%CO2, влажная атмосфера).
    3. Соберите клетки, добавив равный объем питательной среды, и пропустите через клеточное сетчатое фильтр (фильтр 40-70 мкм). Центрифугируйте ячейки при 200 x g в течение 5 мин.
    4. Ресуспендируйте клеточную таблетку в PBS с 5% FBS (1 мл на луночный эквивалент). Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Распределите около 100 000-200 000 клеток в пробирках с круглым дном на один анализ FACS (сохраняя объем около 100 мкл на анализ).
    5. Для внеклеточного окрашивания, после необязательного этапа блокирования с использованием чистой мышиной сыворотки (добавьте 5 мкл на анализ, 5 мин при комнатной температуре), инкубируйте с фторохром-конъюгированными антителами (например, TRA-1-81 PE, SSEA4 APC) в соответствии с инструкциями производителя. Умойтесь 3 мл PBS. Центрифуга в течение 5 мин при 300 x g. Повторная суспензия в буфере FACS (например, PBS с 5% FBS) и получение с помощью инструмента FACS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: всегда используйте соответствующий контроль изотипа и окрашивайте параллельные образцы для подтверждения специфичности иммунодетектируемых белков.
    6. Для внутриклеточного окрашивания (например, NANOG-PE, OCT3/4-PE, SOX2-PE) следуйте инструкциям производителя по этапам фиксации/пермеабилизации. Инкубируйте с конъюгированными с флуорохромом антителами или соответствующими контрольными изотипами. Получение данных с помощью инструмента FACS.

4. Криоконсервация и размораживание клонов XF-hiPSC

  1. Разверните клоны XF-hiPSC по крайней мере на 5-7 пассажей для выполнения первоначальной валидации (рис. 2) перед долгосрочным криоконсервированием и применением в функциональных исследованиях. Запишите количество проходов на каждой криоконсервированной пробирке.
    1. Аспиративная питательная среда в шкафу биобезопасности.
    2. Промойте ячейки PBS (2 мл на лунку). Аспират PBS.  Добавьте раствор для отслоения клеток на основе ЭДТА (1 мл на лунку) для диссоциации колоний XF-hiPSC в клеточные скопления. Инкубируйте планшет в течение 5 минут в инкубаторе сCO2 (37 °C, 5%CO2, влажная атмосфера). Убедитесь, что клетки слабо прикреплены (например, блестящие круглые клетки) с помощью микроскопа.
    3. Осторожно отсасывайте диссоциативный раствор, не нарушая колонии монослоя клеток, и соберите клетки в среду E8 объемом 1-2 мл с неактивным пипетированием для поддержания клеточных скоплений (10-50 клеток в группе). Соберите XF-hiPSC в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте ячейки при 200 x g в течение 5 мин.
    4. Аспирируйте надосадочную жидкость в шкафу биобезопасности. Ресуспендируйте клеточную гранулу в замораживающем растворе (табл. 2, ~ 1 луночный эквивалент на мл).
    5. Перенос клеток в криогенные пробирки длительного хранения. Поместите пробирки в контейнер для медленной заморозки и дайте образцам застыть на ночь в морозильной камере при температуре -80 °C. На следующий день поместите криоциалы в морозильную камеру с жидким азотом для длительного хранения.
  2. Для размораживания подготовьте пластину, предварительно покрыв ее витронектином (см. раздел 1.3.11).
    1. Поместите замороженный флакон на водяную баню при температуре 37 °C и разморозьте ячейки в течение ~1-2 мин. Стерилизуйте (т.е. распылите этанол).
    2. Медленно перенесите XF-hiPSC в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 9 мл размораживающей среды (Таблица 2), чтобы медленно разбавить клетки в 10 раз в стерильном шкафу с биологической защитой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не пипишите в больших количествах.
    3. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин.
    4. Аспирируйте бесклеточную надосадочную жидкость в шкафу биобезопасности. Ресуспендировать клеточную гранулу в среду Е8 (1-2 мл) с добавлением ингибитора ROCK (конечная концентрация 5 мМ).
      Примечание: Исключение Y-27632 приведет к снижению эффективности восстановления после размораживания.
    5. Перенесите размороженные клетки на 1 или 2 лунки, покрытые витронектином, из 6-луночного планшета. На следующий день смените среду на обычную среду Е8 без ингибитора ROCK для размножения клеток.

5. Ксеносвободная гематоваскулярная дифференцировка XF-hiPSC

  1. Дифференцируйте XF-hiPSC с помощью нашего оптимизированного протокола гематоваскулярной дифференцировки без ксенообразования (Рисунок 3)4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол изменен по сравнению с15.
    1. Приготовьте XF-hiPSC при конфлюенции ~40-50% (через 1-3 дня после пассажа).
    2. Аспиратируйте питательную среду и добавьте 2 мл мезодермальной среды для определения (табл. 2) в биобезопасном шкафу.
    3. Через 2 дня аспирируйте среду и добавьте 2 мл/лунку среды для сосудистой дифференцировки (табл. 2) в бокс биобезопасности. Если на этом этапе видно много мертвых или плавающих клеток, промойте один раз 2 мл PBS.
    4. Заменяйте среду для сосудистой дифференцировки через день в боксе биобезопасности до 11 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если среда становится желтой из-за высокой плотности клеток и низкого pH, добавляйте 1 мл свежей среды или передавайте каждый день.
  2. После 7-10 дней культивирования в среде для дифференцировки сосудов очистить CD31+ или CD34+ сосудистые клетки от адгезивного монослоя методом сортировки клеток магнитными шариками.
    Примечание: Каждый отдельный клон может демонстрировать различную кинетику дифференцировки. Определение пиковой временной точки для экспрессии CD31/CD34 с помощью анализа FACS (рис. 4A). Требуется анализ обогащения FACS до и после магнитного обогащения. Гемопоэтические предшественники (ГП) могут быть выделены на этой стадии из надосадочной жидкости и обогащены с помощью микрогранул CD34. Полученный из CD34+ XF-hiPSC HP может быть дополнительно валидирован с помощью анализа метилцеллюлозы (рисунок 4B-C)16.
    1. В шкафу биобезопасности аспирируйте питательную среду и промойте клетки в PBS (2 мл на лунку). Аспиратуйте PBS и диссоциируйте колонии hiPSC в отдельные клетки, добавляя ферментативный реагент диссоциации (например, Аккутазу, 1 мл на лунку). Инкубируйте клетки в течение 5 минут при 37 °C в инкубаторе сCO2 (5%CO2, влажная атмосфера).
    2. В шкафу биобезопасности соберите клетки, добавив равный объем питательной среды. Центрифугируйте ячейки при 200 x g в течение 5 мин.
    3. Ресуспендируйте клеточный гранулу в среду для сосудистой дифференцировки (табл. 2). Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Выделите около 50 000-100 000 клеток для предварительного анализа FACS обогащения магнитными шариками с использованием непосредственно сопряженных анти-CD31 или анти-CD34 антител.
    4. Центрифугируйте оставшиеся клетки при 300 x g в течение 5 минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в буфере для обогащения магнитными шариками (PBS pH 7,2, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ ЭДТА) в биобезопасном шкафу.
    5. Пропустите клетки через сетчатое фильтр (фильтр 40-70 мкм). Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин. Ресуспендируйте в буфере для обогащения магнитных шариков объемом 60 μл.
    6. Добавьте 20 μL блокирующего реагента FcR, затем добавьте 20 μL микрогранул CD31 или CD34 и инкубируйте в течение 15-20 минут при 4 °C.
    7. Промойте ячейки с помощью буфера для обогащения магнитными шариками объемом 2 мл в шкафу биобезопасности и центрифуге (300 x g, 5 мин).
    8. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл магнитного буфера для обогащения шариков в шкафу биобезопасности.
    9. Поместите колонну LS в магнитное поле магнитного сепаратора ячеек в шкафу биобезопасности. Промывочная колонка с магнитным буфером для обогащения шариков объемом 3 мл.
    10. Примените ячейки к столбцу.  Соберите немеченые клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Промойте колонку 3 раза магнитным буфером для обогащения шариков объемом 3 мл.
    11. Снимите колонку с сепаратора и установите ее на новую коническую трубку объемом 15 мл.
    12. Промойте магнитно помеченные клетки, добавив 3-5 мл эндотелиальной питательной среды. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин.
    13. Ресуспендируйте в 1 мл эндотелиальной питательной среды в биобезопасном шкафу. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Выделите около 50 000 клеток для постмагнитного обогащения сортов с помощью анализа FACS с использованием непосредственно конъюгированных антител против CD31 или анти-CD34.
    14. Выделенный ВП может быть дополнительно расширен на покрытых фибронектином (10 мкг/мл) тканевых планшетах колб в эндотелиальной питательной среде.

6. Руководство по экспериментальному дизайну для функциональной валидации XF-hiPSC

  1. Создание запасов валидированного XF-hiPSC на самых ранних пассажах с использованием установленного неинтегрирующего метода, такого как перепрограммирование эписомального 7,17, вируса Сендай18 или мРНК19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнение эффективности и надежности методов, не требующих перепрограммирования, приведено в другом месте6. Клиренс трансгенного материала при эписомальном или сендайском методах перепрограммирования вируса может быть проверен во время начальных пассажей с использованием методов ПЦР 7,20. Ретенция трансгена не совместима с генерацией TIRN-SC.
  2. Валидация нормального кариотипа у клонов XF-hiPSC с помощью G-полос или анализов покрытия на основе полногеномной матрицы9.
  3. Проверка экспрессии генов и эпигеномной целостности линий XF-hiPSC (т.е. родительских импринтов, активации X) с использованием массивов метилирования ДНК и экспрессии генов или методов секвенирования 5,11,14.
  4. Подтвердите базовую функциональную плюрипотентность с помощью протоколов дифференцировки тератомы (рис. 2E), количественные анализы дифференцировки эмбриоидного тела (БЭ) с использованием матриц ОТ-ПЦР14 или направленные дифференцировочные анализы в направлении 3 зародышевых слоев9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количественные методы определения многолинейной дифференцировочной способности и внутрилинейного пролиферативного индекса анализов тератомы с использованием гистологической характеристики с помощью микроскопии представлены в другом месте4. Ранеебыли подробно описаны протоколы направленной дифференцировки в направлении мезодермальных линий и гематоваскулярной спецификации (рис. 4A-C) 4,5,9, а также направленного дифференцировочного анализа в сторону дефинитивной энтодермы (рис. 4D)5. Примеры анализа направленной дифференцировки в сторону эктодермы приведены в других разделах 4,5.

7. Химическая адаптация XF-hiPSC в TIRN

  1. Приобретите или приготовьте собственные кормушки MEF с низким проходом из эмбрионов мыши CF1 или CF1 x DR4 гибрида E13.5 в соответствии с опубликованными протоколами 9,21. Наберите 200 000 питателей MEF на лунку в желатинизированном (0,1% желатина в воде, 1 мл на лунку) 6-луночном планшете, обработанном культурой тканей, по крайней мере, за один день до этапа адаптации TIRN (подробные протоколы TIRN приведены в других местах 4,5,9).
  2. Поддерживайте и расширяйте свободные от трансгенов культуры XF-hiPSC с валидированными нормальными кариотипами в системе без питательных культур (например, в среде E8, см. Таблицу 1 для собственной рецептуры).
  3. Замените среду Е8 на среду LIF-5i (2 мл на лунку; Таблица 1) после того, как культуры XF-hiPSC достигнут ~50% конфлюенции (т.е. через 3-5 дней после первоначального осаждения) в биобезопасном шкафу.
  4. На следующий день отсадите питательную среду и однократно промойте LIF-5i-адаптированный XF-hiPSC PBS (2 мл на лунку) в биобезопасном шкафу. Аспират надосадочной жидкости и добавить в каждую лунку по 1 мл реагента для ферментативной диссоциации клеток. Инкубировать в течение 5 минут при 37 °C в инкубаторе сCO2 .
  5. Аккуратно растирайте с помощью пипетки в одноклеточную суспензию в шкафу биобезопасности. Нейтрализовать средой LIF-5i (1мл на лунку). Соберите клеточную суспензию в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл.  Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин.
  6. Аспирируйте надосадочную жидкость в шкафу биобезопасности. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 2 мл среды LIF-5i.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, возьмите аликвоту для подсчета клеток. Нейтрализация ферментативной активности средой LIF-5i/LIF-3i возможна без добавления ингибиторов или факторов роста.
  7. Дважды промойте MEF-планшет PBS (2 мл на лунку в 6-луночных планшетах) и добавьте ячейки (1 хорошо эквивалент адаптированных клеток LIF-5i на 1 лунку питателей MEF в среде LIF-5i объемом 2 мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизация начальной плотности покрытия для каждой отдельной линии XF-hiPSC не является обязательной. Если клетки были подсчитаны на предыдущем этапе, поместите минимум 1x106 клеток на лунку в питатели.  Перенесите планшет в инкубатор сCO2 (37 °C, 5%CO2, влажная атмосфера).
  8. Культивировать и поддерживать XF-hiPSC в течение 3-5 дней в LIF-5i на MEF в инкубаторе CO2 (37 °C, 5% CO2, влажная атмосфера). Меняйте LIF-5i средний ежедневно.
  9. При образовании куполообразных колоний ТИРН-СК (после 3-5 дней культивирования на кормушках) отсасывайте питательную среду в биобезопасном шкафу. Промойте каждую лунку 2 мл PBS.
  10. Аспират PBS. Добавьте 1 мл раствора для отслойки клеток (например, Аккутазы) в каждую лунку. Инкубировать в течение 5 минут при 37 °C в инкубаторе сCO2 (5%CO2, влажная атмосфера).
  11. Добавьте 1 мл среды LIF-3i (Таблица 1) в каждую лунку в шкафу биобезопасности для нейтрализации диссоциативного реагента. Аккуратно растирайте и соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин.
  12. Аспирируйте надосадочную жидкость в шкафу биобезопасности. Повторно суспендировать в среде LIF-3i (1 мл на лунку) для подсчета клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Планшет ~5 x 105 ячеек в среде LIF-3i объемом 2 мл на лунку на облученный MEF в желатинизированных 6-луночных планшетах в шкафу биобезопасности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: повторяйте шаги 7.12 5o 7.16 для всех последующих отрывков.  После исходной LIF-5i-адаптированной культуры, планшетные культуры LIF-3i с более низкой плотностью (2x105 клеток/лунка) и проходом каждые 3-4 дня.
  13. Пассаж XF-hiPSC в течение не менее 6-7 непрерывных пассажей в среде LIF-3i перед использованием в функциональных исследованиях или криоконсервации. Запишите количество пассажей либо в культуральной среде, подготовленной ксенофридом (например, E8), либо в среде LIF-5i/LIF-3i TIRN.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реверсирование TIRN линий XF-hiPSC с высоким проходом (например, >p40) неэффективно и не рекомендуется. Линии высокого проходимости часто содержат хромосомные или субхромосомные дефекты, которые несовместимы с эффективной реверсией TIRN и приводят к низкой эффективности реверсии и ограниченной стабильности культуры. Кроме того, для функциональных исследований не рекомендуется использовать культуры TIRN, которые претерпели более 15 пассажей в среде LIF-3i. Функциональное влияние реверсии XF-hiPSC в TIRN наиболее заметно между 7 и 15 пассажами в среде LIF-3i.

8. Рекомендации по разработке эксперимента для направленной дифференцировки XF/FF hiPSC-TIRN-SC.

  1. Прямое использование TIRN-SC, полученного из XF/FF hiPSC, в установленных протоколах направленной дифференцировки без какого-либо этапа «повторного прайминга» (т.е. без необходимости переключения стволовых клеток TIRN обратно в обычные «праймированные» условия перед их использованием в анализах направленной дифференцировки).
  2. Для функциональной оценки влияния TIRN на XF-hiPSC параллельно устанавливают родственные изогенные культуры с эквивалентным числом пассажей. Поддерживайте изогенные культуры XF-hiPSC с праймированными/родственными TIRN параллельно в их соответствующих средах (например, E8 на витронектине против LIF-3i на MEF), и одновременно выполнять анализ тератомы (Рисунок 5) или дифференцировать с использованием идентичных эмбриоидных тел или протоколов и материалов направленной дифференцировки (Рисунок 6).
  3. По возможности выполняйте функциональную оценку терминальных дифференцированных линий. Например, сосудистые предшественники могут быть оценены по экспрессии белка, анализу поглощения DiI-конъюгированного ацетилированного липопротеина низкой плотности (ЛПНП) и анализу трубки Матригеля (рис. 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные функциональные анализы для ВП, полученных из CB-hiPSC и TIRN-SC (т.е. анализы поглощения/старения/пролиферации/миграции DiI-Ac-LDL, анализы in vitro в пробирках Матригеля, плугасы Матригеля на животных, анализы ксенотрансплантации) подробно описаны в других разделах 3,4.
  4. Отрегулируйте и оптимизируйте начальную плотность и кинетику покрытия (рис. 6) для каждого отдельного клона XF-hiPSC в каждом анализе дифференцировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: XF-hiPSC, восстановленные в TIRN, обладают более высокой пролиферативной и дифференцировочной способностью в анализах направленной дифференцировки, чем праймированные XF-hiPSC.Культуры TIRN обычно требуют более низкой начальной плотности покрытия, чем культуры E8, и не требуют использования антиапоптотических добавок для повышения клональной выживаемости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол оптимизирует опубликованные методы эффективного перепрограммирования миелоидных предшественников в высокоточное праймированное плюрипотентное состояние с использованием эписомальных векторов и стромальных сигналов7. В протоколе (рис. 1) изложены определенные методы XF/FF-стромально-праймированного эписомального перепрограммирования предшественников CB CD34+ человека в XF-hiPSC, а также указано, как проверить их функциональность с помощью <...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Группа Замбидиса первоначально сообщила о высокооптимизированном четырехфакторном эписомальном методе для перепрограммирования миелоидных предшественников CB в CB-hiPSC с объемной эффективностью, достигающей до 50% в очищенных клетках, экспрессирующих эписомы. В данной работе мы представили модифицированную версию оригинального протокола эписомального перепрограммирования прогенитора человеческого CB в условиях XF/FF стромы. В этом методе использовалась увеличенна...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Никаких разглашений для декларирования.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH/NEI (R01EY032113; ETZ), Фонд исследований стволовых клеток штата Мэриленд (2023-MSCRFV-5995; 2024-MSCRFV-6248; 2025-MSCRFV-0005; 2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ) и Фонд Лизы Дин Мозли (ETZ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Амакса Биосистемы Нуклеофектор IIЛонзаААБ-1001
антитело к CD143 (BB9), конъюгированное с APC BD Biosciences557929Используйте 10-20 & микро; Л на пробу (FACS)
антитело к CD144, конъюгированное ПЭ BD Biosciences560410Используйте 10-20 & микро; Л на пробу (FACS)
антитело к CD146, конъюгированное ПЭ BD Biosciences550315Используйте 10-20 & микро; Л на пробу (FACS)
антитела к CD184/CXCR4, конъюгированные с APC BD Biosciences555976Используйте 10-20 & микро; Л на пробу (FACS)
антитела к CD31BD Biosciences550389Развести 1:100 в блокирующем растворе для иммунофлуоресцентного анализа
антитело к CD31, конъюгированное с APC eBioscience17-0319-42использование 2 & микро; Л на пробу (FACS)
антитело к CD34, конъюгированное с APC BD Biosciences555824использовать 5 & микро; Л на пробу (FACS)
антитело к CD45, конъюгированное ПЭ BD Biosciences555483Используйте 10-20 & микро; Л на пробу (FACS)
антитело anti-NANOG, конъюгированное с ПЭBD Biosciences560483Используйте 10-20 & микро; Л на пробу (FACS)
антитело к OCT4, конъюгированное с ТЭЛАНИР Системы DIC1759PИспользуйте 10 & микро; Л на пробу (FACS)
антитело к SOX17, конъюгированное Alexa488 BD Biosciences562205использовать 5 & микро; Л на пробу (FACS)
антитело к SOX2, конъюгированное с ПЭНИР Системы DIC2018PИспользуйте 10 & микро; Л на пробу (FACS)
антитело к SSEA-4, конъюгированное с APC  НИР Система DFAB1435Aиспользовать 5 & микро; Л на пробу (FACS)
антитело anti-SSEA-4 GloLIVE, конъюгированное с NL493НИР Система DNLLC1435GИспользование в разведении 1:50 (живое и фиксированное иммуноокрашивание)
анти-ТРА-1-60 А488 конъюгированный комплектThermoFisher ScientificА25618
антитело анти-TRA1-60, конъюгированное с ПЭBD Biosciences560193Используйте 10 & микро; Л на пробу (FACS)
антитело anti-TRA-1-60 GloLIVE, конъюгированное с NL557 НИР Системы DNLLC4770RИспользуйте AT  разведение в соотношении 1:50 (живое и фиксированное иммуноокрашивание)
anti-TRA-1-60 StainAlive антитело, конъюгированное с DyLight 488Стемгент09-0068Использование в соотношении 1:100 (живое и фиксированное иммуноокрашивание)
антитело анти-TRA1-81, ПЭ конъюгированноеBD Biosciences560161Используйте 10 & микро; Л на пробу (FACS)
anti-TRA-1-81 StainAlive антитело, конъюгированное с DyLight 488Стемгент09-0069Использование в соотношении 1:100 (живое и фиксированное иммуноокрашивание)
CD31 Набор микрошариков, человекМилтеньи Биотек130-091-935
CD34 Набор микрошариков, человеческийМилтеньи Биотек130-046-702
CD34+ Смешанные доноры,  Пуповинная кровь, 1 миллион клетокВсе элементыCB, CR, CD34+, Смешанный, PS, CS10, 1MАльтернативными источниками клеток являются фетальная печень, костный мозг взрослого человека и мобилизованная периферическая кровь
Мышь CF1Река Чарльз023
CHIR99021НИР Система DЛ5283восстанавливается при 100 мМ в ДМСО
6-луночные планшеты Corning Costar, обработанные культурой тканейКорнинг3506
Субстрат Corning Synthemax II-SC, флакон 10 мгКорнинг3535Используйте при 5 μ g/cm2 в качестве замены для Corning 3978
6-луночный планшет Corning Synthemax-RКорнинг3978Снято с производства и заменено на 3535
Costar 6-луночный прозрачный плоскодонный планшет со сверхнизким уровнем крепленияКорнинг3471
Графиня  Ползунок камеры подсчета ячеекThermo Fisher ScientificС10228
Автоматизированный счетчик ячеек графиниThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Криомагазин CS10Технологии стволовых клеток100-1061
DII-Ac-LDLThermo Fisher ScientificЛ3484Использование в 5-15 лет & микро; г/мл
DMEM (модифицированная среда Dulbecco's Eagle) Thermo Fisher Scientific11995065
DMEM/F-12 , Добавка GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565018
DMEM/F-12, ГЕПЕСThermo Fisher Scientific11330032
ДМСО (диметилсульфоксид)Сигма ОлдричД2650
Мышь DR4Лаборатория Джексона3208
Essential 8 (E8) среднийТехнологии стволовых клеток5940
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
FIX & Набор для перманентной перманентной обработки клетокThermo Fisher ScientificГАЗ004
ФорсколинСтемгент04-0025восстанавливается при 100 мМ в ДМСО
Желатин (свинина)Сигма ОлдричГ1890-100ГСуспендировать в воде и простерилизовать автоклавом
CD34+ клеточный нуклеофектор человека  комплектЛонзаВПА-1003
Изотип мыши IgG1 PE конъюгированныйBD Biosciences554680
Изотип мыши IgG2a PE конъюгированныйBD Biosciences558595
Изотип крысы IgG2b PE конъюгированныйНИР Системы DИК013П
Замена сыворотки KnockOutThermo Fisher Scientific10828-028
L-аскорбиновая кислотаМиллипора СигмаА8960
L-глютамин (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
Колонны LSМилтеньи Биотек130-042-401
МатригельКорнинг356237Используйте 200 &микро; L/лунка в 48-луночных планшетах
MEM Заменимая аминокислота (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
МетоКульт СФ H4436Технологии стволовых клеток04436
Сепаратор MidiMACSМилтеньи Биотек130-042-302
mTeSR1 среднийТехнологии стволовых клеток85850
Криогенные флаконы NalgeneThermo Fisher Scientific5000-0020
Раствор параформальдегида, 4% в PBSThermo Fisher ScientificJ19943. К2разбавить до необходимой концентрации с помощью PBS
PD0325901Сигма ОлдричПЗ0162восстанавливается при 100 мМ в ДМСО
Пенициллин/стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Thermo Fisher Scientific15140-122
Эписома pEP4 E02S EM2KАдджен20923Плазмиды размножались в TOP10 E.  кишечная палочка (Invitrogen) и очищенные с помощью наборов QIAGEN Plasmid Maxi.
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Биологическая промышленность02-023-1А
Поэтика мезенхимальные стволовые клетки человека ЛонзаПТ-2501750 000 ячеек на проходе 2 могут быть разморожены и расширены в соответствии с инструкциями производителя на 1-2 прохода перед использованием или вторичным банкингом
ПурморфаминСтемгент04-0009восстановление при 10 мМ в ДМСО
рекомбинантный Активин АПепротех120-14ЕПриостановка работы AT  (100 & микро; г/мл) в стерильных PBS, 0,1% сывороточного альбумина человека или крупного рогатого скота
рекомбинантный человеческий FGF2Пепротех100-18ВПриостановка работы AT  (100 & микро; г/мл) в стерильных PBS, 0,1% сывороточного альбумина человека или крупного рогатого скота
рекомбинантный человеческий FGF-basic (bFGF)Пепротех100-18ВПополнение в 100 & микро; г/мл в 0,1% бычьей сыворотки/человеческого альбумина в PBS
рекомбинантный человеческий лиганд FLT3НИР Системы D308-FKHB или 308E-GMPПриостановка работы AT  (100 & микро; г/мл) в стерильных PBS, 0,1% сывороточного альбумина человека или крупного рогатого скота
рекомбинантный человеческий инсулинБиодрагоценные камни10-365
рекомбинантный человеческий Kit-лигандНИР Системы DBT-SCF или BT-SCF-GMPПриостановка работы AT  (100 & микро; г/мл) в стерильных PBS, 0,1% сывороточного альбумина человека или крупного рогатого скота
рекомбинантный человеческий LIFПепротех300-05Пополнение в 100 & микро; г/мл в 0,1% бычьего/человеческого сывороточного альбумина в PBS
рекомбинантный человеческий TGFβ 1Пепротех  100-21Пополнение в 100 & микро; г/мл в 0,1% бычьего/человеческого сывороточного альбумина в PBS
Рекомбинантный человеческий тромбопоэтин НИР Системы D288-TPN или 288E-GMPПриостановка работы AT  (100 & микро; г/мл) в стерильных PBS, 0,1% сывороточного альбумина человека или крупного рогатого скота
Рекомбинантный человеческий трансферринМиллипора СигмаТ3705
рекомминантный человек BMP4Пепротех120-05Приостановка работы AT  (100 & микро; г/мл) в стерильных PBS, 0,1% сывороточного альбумина человека или крупного рогатого скота
SB431543СеллекхемС1067восстановление при 10 мМ в ДМСО
SIGMAFAST, субстрат щелочной фосфатазы, хромогенный, таблеткаМиллипора СигмаВ5655растворить 1 таблетку в 10 мл очищенной воды
Селенит натрияМиллипора СигмаС5261
Стемолекула Y27632 в раствореСтемгент04-0012-02Ингибитор ROCK в растворе (10 мМ)
Реагент для диссоциации клеток аккутазы StemProThermo Fisher ScientificА11105-01
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)Thermo Fisher ScientificA1067501Приготовьте среду XF-MSC, смешав 5 мл добавки StemPro MSC SFM XenoFree с 500 мл базальной среды StemPro MSC SFM. Аликвотируемая среда может быть криоконсервирована при -20°С.
StemSpan SFEMТехнологии стволовых клеток9600
Thermo Scientific Mr. Frosty Морозильный контейнерThermo Fisher Scientific5100-0001
Ulex Europaeus Agglutin I (UEA-1), биотинилированныйЛаборатория «Вектор»Б-1065-2Разведите 1:200 в блокирующем растворе для флуоресцентного анализа
ВЭГФПепротех100-20Приостановка работы AT  (100 & микро; г/мл) в стерильных PBS, 0,1% сывороточного альбумина человека или крупного рогатого скота
Решение VerseneThermo Fisher Scientific15040066
Матрица Vitronectin XFТехнологии стволовых клеток7180разбавляют при 40 & микро; Л/мл в буфере для разбавления CellStick
ХАВ939Сигма ОлдричХ3004восстанавливается при 100 мМ в ДМСО
&бета;-меркаптоэтанолThermo Fisher Scientific21985-023светочувствительность

Ссылки

  1. Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy: Promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
  2. Kyttala, A., et al. Genetic variability overrides the impact of parental cell type and determines iPS cell differentiation potential. Stem Cell Rep. 6 (2), 200-212 (2016).
  3. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  4. Park, T. S., et al. Vascular progenitors generated from tankyrase inhibitor-regulated naïve diabetic human iPS cells potentiate efficient revascularization of ischemic retina. Nat Commun. 11 (1), 1195(2020).
  5. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naïve pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33 (1), 58-63 (2015).
  7. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), e42838(2012).
  8. Zimmerlin, L., et al. Proteogenomic reprogramming to a functional human blastomere-like stem cell state via a PARP-DUX4 regulatory axis. Cell Rep. 44 (5), 115671(2025).
  9. Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical reversion of conventional human pluripotent stem cells to a naive-like state with improved multi-lineage differentiation potency. J Vis Exp. (136), e57921(2018).
  10. Maiers, M., et al. Harnessing global HLA data for enhanced patient matching in iPSC haplobanks. Cytotherapy. 27 (3), 300-306 (2025).
  11. Thomas, J., et al. Running the full human developmental clock in interspecies chimeras using alternative human stem cells with expanded embryonic potential. NPJ Regen Med. 6 (1), 25(2021).
  12. Zheng, C., Ballard, E. B., Wu, J. The road to generating transplantable organs: From blastocyst complementation to interspecies chimeras. Development. 148 (12), 195792(2021).
  13. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  14. Bock, C., et al. Reference maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
  15. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion, and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  16. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  17. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  18. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  19. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  22. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing human naïve pluripotency in the embryo and in the dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  23. Brunner, S., et al. Circulating angiopoietic cells and diabetic retinopathy in type 2 diabetes mellitus, with or without macrovascular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4655-4662 (2011).
  24. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56 (4), 960-967 (2007).
  25. Jarajapu, Y. P., Grant, M. B. The promise of cell-based therapies for diabetic complications: Challenges and solutions. Circ Res. 106 (5), 854-869 (2010).
  26. Khullar, M., Cheema, B. S., Raut, S. K. Emerging evidence of epigenetic modifications in vascular complications of diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 237(2017).
  27. Manzar, G. S., Kim, E. M., Zavazava, N. Demethylation of induced pluripotent stem cells from type 1 diabetic patients enhances differentiation into functional pancreatic beta cells. J Biol Chem. 292 (34), 14066-14079 (2017).
  28. French, A., et al. Enabling consistency in pluripotent stem cell-derived products for research and development and clinical applications through material standards. Stem Cells Transl Med. 4 (3), 217-223 (2015).
  29. Zimmerlin, L., Park, T. S., Bhutto, I., Lutty, G., Zambidis, E. T. Generation of pericytic-vascular progenitors from tankyrase/parp-inhibitor-regulated naïve (tirn) human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2416, 133-156 (2022).
  30. Thorsell, A. G., et al. Structural basis for potency and promiscuity in poly(adp-ribose) polymerase (PARP) and tankyrase inhibitors. J Med Chem. 60 (4), 1262-1271 (2017).
  31. Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
  32. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  33. Theunissen, T. W., et al. Molecular criteria for defining the naïve human pluripotent state. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  34. Pastor, W. A., et al. Naïve human pluripotent cells feature a methylation landscape devoid of blastocyst or germline memory. Cell Stem Cell. 18 (3), 323-329 (2016).
  35. Taapken, S. M., et al. Karyotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  36. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  37. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  38. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  39. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
  40. Yang, Y., et al. Derivation of pluripotent stem cells with in vivo embryonic and extra-embryonic potency. Cell. 169 (2), 243-257.e25 (2017).
  41. Yang, J., et al. Establishment of mouse expanded potential stem cells. Nature. 550 (7676), 393-397 (2017).
  42. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nat Cell Biol. 21 (6), 687-699 (2019).
  43. Liu, B., et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun. 12 (1), 3017(2021).
  44. Wu, J., et al. Interspecies chimerism with mammalian pluripotent stem cells. Cell. 168 (3), 473-486.e15 (2017).
  45. Yamaguchi, T., et al. Interspecies organogenesis generates autologous functional islets. Nature. 542 (7640), 191-196 (2017).
  46. Kobayashi, T., et al. Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells. Cell. 142 (5), 787-799 (2010).
  47. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naïve human pluripotency. Cell Stem Cell. 15 (4), 471-487 (2014).
  48. Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground-state naïve pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  49. Fang, R., et al. Generation of naïve induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 15 (4), 488-496 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PARP
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи