Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Целевое истощение сенсорных нервов роговицы с помощью субконъюнктивальной инъекции: модель для исследования бактериальной адгезии и нейроиммунных взаимодействий

446 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68614

⸱

29 августа 2025 г.

 ,  ,  , 
1New England College of Optometry

В этой статье

Краткое содержание

Это исследование устанавливает уточненную модель истощения сенсорных нервов роговицы с использованием бупивакаина, раскрывая его влияние на роговичный нерв и бактериальную адгезию. Модель моделирует невропатические состояния, дает представление о нейроиммунных взаимодействиях при глазных инфекциях и предлагает применение в исследованиях доставки лекарств, нейропротекции, иммуномодуляции и модификации генов.

Аннотация

Сенсорные нервы роговицы играют ключевую роль в поддержании целостности глазной поверхности и механизмов иммунной защиты. Потеря этой иннервации была связана с повышенной уязвимостью к микробной инвазии, однако точный вклад истощения нервов в бактериальную адгезию на роговице остается недостаточно описанным. В данной работе мы представляем воспроизводимый и контролируемый во времени метод селективного подавления сенсорных нервов роговицы с использованием бупивакаина, блокатора натриевых каналов длительного действия. Сочетая субконъюнктивальный и местный пути доставки, эта стратегия двойного применения обеспечивает надежную и устойчивую денервацию, что позволяет точно исследовать, как измененный сенсорный вход влияет на восприимчивость эпителия роговицы к бактериальной колонизации.

Используя эту модель, мы исследуем, как сенсорная денервация влияет на динамику микробной адгезии для Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis и Pseudomonas aeruginosa трех клинически значимых патогенов с различными механизмами адгезии. Стандартизированный бактериальный посев методом блоттинга с помощью лабораторной салфетки обеспечивает равномерное осаждение на поверхности роговицы с последующей количественной оценкой бактериальной адгезии. Истощение нервов, вызванное бупивакаином, коррелирует со снижением плотности нервов роговицы и увеличением бактериальной адгезии, подтверждая функциональную связь между сенсорным истощением и восприимчивостью микробов.

Моделируя нейропатические состояния, такие как диабетическая нейропатия и нейротрофический кератит, этот подход обеспечивает новую основу для изучения нейроиммунных взаимодействий при глазных инфекциях. Помимо моделей инфекций, эта стратегия субконъюнктивы предлагает универсальную платформу для исследования фармакокинетики глазных препаратов, нейропротекторных вмешательств и иммунной модуляции. Кроме того, он может быть адаптирован для исследований генной модификации, включая субконъюнктивальную доставку конструкций CRISPR/Cas или вирусных векторов, расширяя его применение в офтальмологических исследованиях и терапии.

Введение

Сенсорная иннервация роговицы играет решающую роль в поддержании целостности глазной поверхности и иммунного гомеостаза. Роговица является одной из наиболее плотно иннервированных тканей в организме, преимущественно снабжаемой глазным отделом тройничного нерва1. Эти сенсорные нервы не только опосредуют ноцицепцию и мигающие рефлексы, но также регулируют пролиферацию эпителия, заживление ран и иммунный надзор 2,3. Таким образом, любое нарушение сенсорной иннервации может поставить под угрозу роговичный барьер, изменяя микроокружение глазной поверхности и повышая восприимчивость к микробным инфекциям.

Сенсорная дисфункция роговицы связана с системными заболеваниями, такими как сахарный диабет, и способствует развитию глазных патологий, включая болезнь сухого глаза, диабетическую кератопатию, нейротрофический кератит и послеоперационные осложнения 3,4,5,6,7,8,9,10 . Нарушение чувствительных нервов приводит к снижению выработки слезы, истончению эпителия и замедленному заживлению ран, что способствует колонизации бактерий11,12. Тем не менее, точная механистическая связь между истощением сенсорных нервов и бактериальной адгезией остается недостаточно изученной. В то время как исследования продемонстрировали повышенную бактериальную адгезию после денервации роговицы, существует нехватка стандартизированных моделей, которые позволяют контролировать изучение этой взаимосвязи.

Чтобы восполнить этот пробел, мы разработали целевую модель истощения сенсорных нервов роговицы с использованием бупивакаина, блокатора натриевых каналов длительного действия, который имитирует клиническую нейропатию, не вызывая необратимого повреждения нервов 13,14,15. Этот фармакологический подход обеспечивает контролируемый и воспроизводимый метод изучения истощения роговичных нервов и его влияния на поверхность глаза15. Интегрируя эту модель с анализами бактериальной адгезии, мы можем систематически оценивать влияние истощения сенсорных нервов на микробную колонизацию, имитируя ключевые аспекты диабетической кератопатии и нейротрофического кератита.

Микробная адгезия является критическим ранним событием при инфекциях роговицы, на которое влияют состав слезной пленки, свойства поверхности эпителия и иммунные реакции хозяина. Среди разнообразных патогенов, способных колонизировать поверхность глаза, S. aureus, S. epidermidis и P. aeruginosa представляют собой три клинически значимые бактерии с различными механизмами адгезии. P. aeruginosa, высоковирулентная грамотрицательная бактерия, использует пили, жгутики и секретируемые факторы вирулентности для быстрого прикрепления и вторжения в эпителиальные клетки роговицы, что часто приводит к тяжелому язвенному кератиту16,17. Напротив, S. epidermidis, грамположительная комменсальная бактерия, преимущественно использует разрушенные эпителиальные поверхности и изменения слезной пленки для создания биопленок, способствуя персистирующим и часто субклиническим инфекциям18,19. Различия в стратегиях адгезии между этими видами подчеркивают необходимость понимания того, как истощение нервов роговицы изменяет микросреду глаза, способствуя бактериальной колонизации.

Ключевой проблемой в изучении бактериальной адгезии является выбор подходящей модели инокуляции. Обычная модель царапинной травмы, часто используемая в исследованиях инфекций, создает эпителиальные дефекты для облегчения адгезии бактерий. Несмотря на то, что этот подход эффективен в моделировании инфекций, вызванных травмой, он вводит значительные искажающие переменные, включая чрезмерное повреждение тканей и преувеличенную воспалительную реакцию, которые не точно отражают ранние стадии бактериальной колонизации в нейропатической роговице. Кроме того, вариабельность механических травм затрудняет достижение воспроизводимых результатов. Чтобы преодолеть эти ограничения, требуется более контролируемый и физиологически значимый метод бактериального посева.

Метод блоттинга с помощью лабораторных салфеток предлагает стандартизированный подход к отложению бактерий, обеспечивая равномерное прилипание бактерий без нарушения эпителиального барьера20. Этот метод близко имитирует реальные сценарии восприимчивости, в которых бактериальная адгезия происходит в отсутствие явной механической травмы, но в условиях измененного состава слезы и эпителиального гомеостаза. Устраняя вариабельность, связанную с механической травмой, метод блоттинга с помощью лабораторной салфетки обеспечивает более точную оценку динамики микробной адгезии в нейропатической роговице. Кроме того, это позволяет контролировать вклад слезной пленки в бактериальную колонизацию, что особенно актуально в случаях сенсорной дисфункции роговицы, когда секреция слезы нарушена.

Учитывая критическую роль сенсорных нервов роговицы в регулировании продукции слезы и эпителиального гомеостаза, важно создать воспроизводимую модель для изучения последствий истощения сенсорных нервов на микробную адгезию. Это исследование направлено на уточнение протокола целенаправленного истощения сенсорных нервов роговицы с использованием бупивакаина, местного анестетика длительного действия, для оценки его влияния на секрецию слезы и бактериальную адгезию. Используя комбинацию субконъюнктивы и местного применения бупивакаина, этот подход обеспечивает локализованное и устойчивое сенсорное истощение в определенный момент времени пиковой эффективности. Используя эту модель, мы исследуем, как сенсорная денервация изменяет динамику адгезии S. aureus, S. epidermidis и P. aeruginosa, предоставляя ценную информацию о взаимосвязи между истощением нервов, изменениями слезной пленки и восприимчивостью микробов. Эти результаты имеют более широкие последствия для понимания восприимчивости к инфекциям при нейропатических состояниях, таких как диабетическая кератопатия и нейротрофический кератит, и предлагают основу для будущих исследований глазных нейроиммунных взаимодействий и терапевтических вмешательств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с участием животных проводились в соответствии со стандартами, установленными Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии, и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) в Колледже оптометрии Новой Англии и соответствовали политике PHS по гуманному уходу и использованию лабораторных животных. Самцы и самки мышей C57BL/6J (Wild-Type; штамм No 000664) в возрасте от 6 до 8 недель были получены из лаборатории Джексона, и мышей разводили в соответствии с нормальными циркадными ритмами (12-часовой цикл свет/темнота) и давали пищу и воду. Поддерживайте стерильную технику на протяжении всех процедур.

1. Препарат животного для субконъюнктивы

  1. Вызывайте анестезию с помощью 2-3% изофлурана в кислороде с помощью откалиброванного испарителя. Контролируйте глубину анестезии, проверяя отсутствие рефлекторной реакции на легкое пощипывание пальца ноги.
  2. Постоянно наблюдайте за животным на предмет любых признаков сильного дискомфорта или стресса.
  3. Если наблюдается дистресс, введите глубокую анестезию 5% изофлураном и подтвердите отсутствие реакции.
  4. Выполнить вывих шейки матки для обеспечения эвтаназии.
  5. В противном случае немедленно выполните энуклеацию с помощью изогнутых энуклеационных щипцов для последующих анализов.

2. Блокада нерва роговицы с помощью субконъюнктивальной инъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Внедрите двухэтапный протокол, включающий субконъюнктивальную инъекцию и местное применение бупивакаина для достижения целенаправленного истощения сенсорных нервов роговицы. Завершите субконъюнктивальные инъекции и местные аппликации в течение 15 минут, чтобы свести к минимуму воздействие системных анестетиков.

  1. Подготовка участка и надрез
    1. Сделайте небольшой (~0,5 мм) разрез в надвисочной лимбальной области с помощью иглы 30 G. Избегайте кровеносных сосудов и минимизируйте травмирование тканей. Используйте разрез для доступа к субконъюнктивальному пространству для контролируемой доставки лекарств.
  2. Инъекции бупивакаина
    1. Приготовьте 0,5% раствор бупивакаина гидрохлорида в стерильных условиях.
    2. Загрузите 5 мкл раствора в шприц Hamilton объемом 10 мкл, оснащенный тупой иглой с малым концентратором 33 G (тип 3).
    3. Вводите раствор в субконъюнктивальное пространство под углом 15-20°, чтобы свести к минимуму рефлюкс и обеспечить равномерное распределение.
    4. Наблюдать за образованием пузырьков в месте инъекции; Дайте ему постоять в течение 5-10 с и диспергируйте в субконъюнктивальном кармане до полного поглощения.
  3. Местное усиление десенсибилизации роговицы
    1. Внесите еще 5 мкл 0,5% бупивакаина непосредственно в центральную роговицу сразу после субконъюнктивальной инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот шаг для усиления десенсибилизации поверхностных нервов и продления местного анестезирующего эффекта.
  4. Контрольная группа
    1. Вводите 5 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) как субконъюнктивально, так и местно в одинаковые моменты времени для контрольных животных. Сопоставляйте процедурные этапы и объем с учетом эффектов, связанных с инъекцией.
  5. Анализ продолжительности лечения и конечной точки
    1. Проводите лечение бупивакаином через день в течение 15 дней для достижения устойчивого истощения сенсорных нервов при минимизации токсичности.
    2. На 15-й день усыпляют мышей через 4 ч после заключительного лечения бупивакаином с использованием 5% изофлурана в кислороде с помощью калиброванного испарителя с последующим вывихом шейки матки.
    3. Немедленно соберите роговицы у одной группы мышей (см. шаг 5.5.) для оценки изменений плотности нервов с помощью иммуногистохимии (см. рисунок 1 и раздел 6 протокола) и у другой группы для анализа бактериальной адгезии (см. рисунок 1 и раздел 5 протокола).

3. Подготовка животных к бактериальному инокуляции

  1. Вводите внутрибрюшинный кетамин (80-100 мг/кг) и дексмедетомидин (0,25-0,5 мг/кг) для обезболивания мышей через четыре часа после последней инъекции бупивакаина и местного применения на 15-й день.
  2. Подтвердите глубокую анестезию, проверив отсутствие рефлекторных реакций на защемление пальцев ног.
  3. Промойте поверхность глаза 3 раза с помощью пипетки с 5 мкл стерильного PBS для удаления остатков слезной жидкости и мусора, обеспечивая чистую поверхность роговицы для исследования бактериальной адгезии (см. Рисунок 1)
  4. В назначенной экспериментальной группе используйте лабораторную протирку для безворсовой ткани для промокания поверхности роговицы стандартизированным способом.
    1. Сложите папиросную бумагу, чтобы обеспечить надежный захват.
    2. Аккуратно протрите роговицу мыши, находящейся под наркозом, 4 раза, начиная с центральной роговицы и используя вращательные движения вправо и влево, чтобы включить в нее периферические области20.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прилагайте минимальное давление, чтобы избежать механических травм, и эффективно удаляйте слезную жидкость для облегчения бактериальной адгезии.

4. Бактериальный посев и посев роговицы

  1. Бактериальное культивирование и подготовка
    1. Культивируют S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 и P. aeruginosa O1 на триптическом соевом агаре (TSA) и инкубируют при 37 °C со стерильной водой, помещенной в инкубатор для поддержания влажности.
    2. Соберите отдельные колонии и суспензируйте в фосфатно-солевом буфере (PBS). Центрифугируйте суспензию при 5000 × г в течение 5 минут однократно, чтобы удалить мертвые клетки и побочные продукты метаболизма.
    3. Повторно суспендируйте бактериальную гранулу в PBS и отрегулируйте концентрацию до ~10¹¹ КОЕ/мл, чтобы обеспечить высокую бактериальную нагрузку для исследований адгезии.
  2. Протокол инокуляции роговицы
    1. Применяйте аликвоту 5 мкл приготовленной бактериальной суспензии на поверхность роговицы один раз в час в течение 4 ч под длительной анестезией.
    2. Расположите мышей под небольшим наклоном, чтобы предотвратить сток и обеспечить постоянное воздействие инокулюма.
    3. Повторяйте инокуляцию с интервалом в час, чтобы имитировать стойкое воздействие бактерий, соответствующее сценариям клинической инфекции.
  3. Оценка эвтаназии и адгезии бактерий после инокуляции
    1. Через 4 ч ввести внутрибрюшинную инъекцию кетамина (80-100 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг) для обеспечения глубокой анестезии.
    2. Выполните вывих шейки матки, чтобы гуманно усыпить мышей.
    3. Энуклеируйте глаза с помощью стерильных щипцов с изогнутым концом, сохраняя при этом строгие асептические условия для предотвращения загрязнения.
    4. Промойте поверхность глаза 5-6 раз стерильными 2 мл PBS в чашке Петри, осторожно встряхивая для тщательного удаления неадгезивных бактерий.
    5. Гомогенизируйте энуклеированные глаза в 1 мл стерильного PBS с помощью механического гомогенизатора тканей для обеспечения стабильного восстановления бактерий и поддержания асептических условий для предотвращения загрязнения.
    6. Проводите последовательные шестикратные разведения гомогената в стерильном PBS.
    7. Поместите аликвоты каждого разведения на планшеты TSA и инкубируйте в течение ночи при 37 °C, чтобы обеспечить рост колонии.
    8. Подсчитывайте колониеобразующие единицы (КОЕ) и выражайте результаты в виде log КОЕ на роговицу для количественного сравнения.

5. Иммуногистохимия

  1. Усыпляйте мышей при вывихе шейки матки на 15-й день после лечения.
  2. Тщательно измельчите глаза и промойте один раз PBS при комнатной температуре при осторожном вращении.
  3. Зафиксируйте энуклеированные глаза в 2% параформальдегиде (PFA) на 1 ч для сохранения структурной целостности
  4. Промыть неподвижные глаза 3 х 10 мин в 1 мл PBS при осторожном вращении при комнатной температуре.
  5. Следуйте описанному ранее протоколу диссекции роговицы21,22
    1. Рассеките роговицы в чашке Петри шириной 35 мм, заполненной минимальным количеством PBS.
    2. Используйте щипцы с прямым краем для стабилизации энуклеированного глаза и хирургические ножницы для создания небольшого разреза на задней стороне глазного яблока.
    3. Используйте небольшую точку разреза, чтобы аккуратно разрезать вдоль задней стороны на 360°.
    4. Откажитесь от мышиной сетчатки, зрительного нерва, хрусталика, пигмента радужки и любых дополнительных тканевых структур, которые не являются роговицей.
    5. Удалите лишнюю ткань с помощью щипцов с прямым краем или путем осторожного разреза хирургическими ножницами, сохраняя роговицу неповрежденной.
    6. Рассеченные роговицы промыть 3 х 10 мин в 1 мл PBS, помещенных в микроцентрифужные пробирки при осторожном вращении при комнатной температуре.
  6. Инкубировать роговицы в 1 мл блокирующего раствора (3% БСА + Тритон Х-100 в PBS) в течение 1 ч при комнатной температуре при непрерывном вращении.
  7. Усильте пермеабилизацию тканей путем инкубации роговицы в 1 мл 20% ЭДТА в течение дополнительного часа при тех же условиях.
  8. Инкубируйте роговицы в течение ночи при 4 °C с первичным антителом к β-тубулину III кролика при осторожном вращении при комнатной температуре.
  9. На следующий день инкубируйте ткани с конъюгированным с Alexa Fluor 488-конъюгированным вторичным антителом Goat против кролика IgG и DAPI для ядерного окрашивания в течение 2-3 часов при 4 °C в темноте.
  10. Промойте роговицу 3 x 10 мин PBS при осторожном вращении.
  11. Следуйте описанному ранее протоколу плоского монтажа роговицы21,22
    1. Плоско закрепите окрашенную роговицу на стеклянных предметных стеклах, поместив роговицу на край предметного стекла, чтобы удалить лишнюю жидкость.
    2. Переместите роговицу в центр предметного стекла микроскопа эпителиальной стороной вниз, в контакт с поверхностью предметного стекла.
    3. Сделайте четыре прямых разреза (1-2 мм в длину) от периферического края к центру с помощью лезвия хирургического пера, чтобы создать полуквадранты.
    4. Нанесите 20 мкл монтанта и наложите на роговицу стеклянный покровный стекло толщиной 8 мм.
    5. Аккуратно надавите на покровную трубку, чтобы удалить пузырьки воздуха и предотвратить сморщивание роговицы.
    6. Храните образец при комнатной температуре в темноте для сушки.
    7. Закройте края покровного стекла прозрачным протектором для ногтей, чтобы предотвратить высыхание на воздухе, и храните предметные стекла в темноте до тех пор, пока они не будут готовы к визуализации.

6. Визуализация

  1. Выполняйте конфокальную микроскопию с помощью вертикального двухфотонного конфокального микроскопа с объективом для погружения в воду 20x/1,00 NA.
  2. Поместите плоские образцы на предметный столик микроскопа и установите водно-иммерсионный объектив 20x/1.00 NA.
  3. Приглушите свет в комнате и накройте микроскоп непрозрачной черной тканью, чтобы свести к минимуму внешние световые помехи во время съемки.
  4. Визуализируйте нервы роговицы с помощью лазерного канала Alexa Fluor 488 нм и обнаруживайте ядра клеток с помощью лазерного канала DAPI 405 нм.
  5. Установите размер рамки на 1 536 x 1 536, отверстие для отверстия — на 1 единицу Эйри (AU), а скорость сканирования — на 1,02 μс. Включите двунаправленное сканирование и примените 2-кратное усреднение.
  6. Отрегулируйте коэффициент усиления мастера (~750 В) и минимизируйте интенсивность лазерного излучения, чтобы предотвратить фотообесцвечивание и фототоксичность, обеспечивая при этом четкое изображение при съемке.
  7. Выполните визуализацию Z-стека, чтобы получить полную толщину роговицы. Установите Первую фокальную плоскость на крайнем переднем аспекте, а Последнюю — на крайнем заднем аспекте образца.
  8. Получение Z-стеков с интервалом 0,8 мкм или 1,0 мкм, захват примерно 60–80 стеков на образец.
  9. Оценка плотности нервов роговицы
    1. Анализируйте плотность нервов роговицы с помощью программного обеспечения Imiris.
    2. Подтвердите полную толщину изображения, проверив объемные размеры.
    3. Включите опцию объемного рендеринга для создания 3D-реконструкции.
    4. Создание проекции максимальной интенсивности для преобразования Z-стека в 2D-вид для визуализации и количественной оценки.
    5. Оценивайте плотность роговичных нервов по шкале от 0 до 10 с помощью слепых оценщиков для обеспечения объективной оценки.

7. Статистический анализ

  1. Оцените распределение данных с помощью тестов Шапиро-Вилка и Колмогорова-Смирнова.
  2. Если большинство данных имеют нормальное распределение, представьте результаты в виде среднего значения ± стандартного отклонения (SD).
  3. Для сравнения между двумя группами примените t-критерий Стьюдента и используйте однофакторный ANOVA, за которым следует тест множественных сравнений Тьюки для анализов, включающих три или более групп.
  4. Рассмотрим p-значение < 0,05 статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Если не указано иное, все эксперименты проводились независимо друг от друга в трех экземплярах, при этом каждая репликация включала 3-4 мыши в группе.

Значительное снижение плотности нервов роговицы после лечения бупивакаином
Для систематической оценки влияния целевого истощения сенсорных нервов роговицы плотность роговичного нерва оценивали с помощью иммуномечения и конфокальной микроскопии. Мыши получали субконъюнктивальные инъекции бупивакаина через день в течение 15 дне...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сенсорные нервы роговицы играют ключевую роль в поддержании целостности поверхности глаза, регулировании эпителиального гомеостаза и модуляции иммунных реакций. Неврит роговицы, характеризующийся дегенерацией нервов и воспалением, обычно наблюдается при системных состояниях, таких как сахарный диабет, когда хроническая гипергликемия способствует периферической нейропатии, включая потерю роговичных нервов. Исследования показали, что диабетическая нейропатия приводит к снижению чувствитель...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5% раствор бупивакаина гидрохлорида Pfizer INC. СШАНДЦ 00409-1162-01
Игла 30 гПроизводитель: BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США305106
33 G маленькая ступица тупой иглой (тип острие 3) Компания Hamilton, Рино, Невада, США7803-05
4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлоридThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, СШАД1306
Бычий сывороточный альбуминSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАА7906
C57BL/6J (Wild-Type) мыши Лаборатория Джексона. 000664
Кантрифуге ротаторThe Lab Depot, Inc. (Доусонвилль, Джорджия, США)Р2020
Прозрачный защитный кожух для ногтейВлажный и дикийН/Д
Препарирующий микроскоп (SMZ-160-TLED Stereo (disquitting) Microscope с тринокулярным портом)Stellar Scientific (Балтимор, штат Мэриленд, США)1.1002Э+12
Этилендиаминтетрауксусная кислотаSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАЕ6511
Козий антикроличий IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, СШАА-11008
Гамильтон 10-μ Шприц LКомпания Hamilton, Рино, Невада, США7635-01
Высокоточные микроножницы для препарированияThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США08-953-1Б
ИзофлуранВетеринарная клиника Паттерсона, США07-890-8115
Исофруран вапорайзерKent Scientific, СШАVETFLO1205S
Кетамина гидрохлоридDechra Veterinary Products, Оверленд Парк, Канзас, СШАDP00050
Безворсовая папиросная бумага KimwipeKimberly-Clark Professional, Розуэлл, Джорджия, США34155
Микрорассекающий щипец изогнутый фронт (для энуклеации)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАФ4142-1ЭА
Микрорассекающие щипцы прямыми фронтальнымиSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАФ4017
Чашки Петри (100 мм)Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США263991
Чашки Петри (35 мм)Avantor, через VWR International (Раднор, Пенсильвания, США).25373-041
Фосфатно-солевой буфер Thomas Scientific, Сведенсборо, Нью-Джерси, СШАC987D24
Крепление ProLong Gold AntifadeThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, СШАП36930
Кролик анти-&бета;-тубулин IIIСигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США)Т2200
Круглая крышка Slip Немецкое стекло (8 мм)Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США50-949-314
Рукоятки скальпелейСигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США)С2896-1ЭА
Предметные стекла, микроскопСигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США)С8902-1ПАК
Пробирки для микроцентрифуг с защелкивающейся крышкой с низким удержаниемThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США3453
Настольная центрифуга Sorvall Instruments RT6000BThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США3367898
Хирургические перьевые лезвияWorld Precision Instruments (Сарасота, Флорида, США)504169 
Триптический соевый агарСигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США)22091
Ксилазин Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США1236-20-8

Ссылки

  1. Belmonte, C. Pain, dryness, and itch sensations in eye surface disorders are defined by a balance between inflammation and sensory nerve injury. Cornea. 38 (Suppl 1), S11-S24 (2019).
  2. Müller, L. J., Marfurt, C. F., Kruse, F., Tervo, T. M. T. Corneal nerves: Structure, contents and function. Exp Eye Res. 76 (5), 521-542 (2003).
  3. Gao, N., Me, R., Yu, F. S. X. Diabetes exacerbates Pseudomonas aeruginosa keratitis in streptozotocin-induced and db/db mice via altering programmed cell death pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (7), 14(2023).
  4. Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
  5. Asiedu, K., et al. Tear film and ocular surface neuropeptides: Characteristics, synthesis, signaling and implications for ocular surface and systemic diseases. Exp Eye Res. 218, 108973(2022).
  6. Zhou, T., Lee, A., Lo, A. C. Y., Kwok, J. S. W. J. Diabetic corneal neuropathy: Pathogenic mechanisms and therapeutic strategies. Front Pharmacol. 13, 816062(2022).
  7. Yu, F. S. X., et al. The impact of sensory neuropathy and inflammation on epithelial wound healing in diabetic corneas. Prog Retin Eye Res. 89, 101039(2022).
  8. Bron, A. J., et al. TFOS DEWS II pathophysiology report. Ocul Surf. 15 (3), 438-510 (2017).
  9. Belmonte, C., et al. TFOS DEWS II pain and sensation report. Ocul Surf. 15 (3), 404-437 (2017).
  10. Vereertbrugghen, A., Galletti, J. G. Corneal nerves and their role in dry eye pathophysiology. Exp Eye Res. 222, 109191(2022).
  11. Gonzalez, O. A., et al. Antimicrobial peptides: Defending the mucosal epithelial barrier. Front Oral Health. 1 (3), 958480(2022).
  12. Fusco, A., Savio, V., Perfetto, B., Mattina, R., Donnarumma, G. Antimicrobial peptide human β-defensin-2 improves in vitro cellular viability and reduces pro-inflammatory effects induced by enteroinvasive Escherichia coli in Caco-2 cells by inhibiting invasion and virulence factors' expression. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1009415(2022).
  13. Nau, C., Vogel, W., Hempelmann, G., Brä, M. E. Stereoselectivity of bupivacaine in local anesthetic-sensitive ion channels of peripheral nerve. Anesthesiology. 91, 786-795 (1999).
  14. Valenzuela, C., Snyders, D. J., Bennett, P. B., Tamargo, J., Hondeghem, L. M. Stereoselective block of cardiac sodium channels by bupivacaine in guinea pig ventricular myocytes. Circulation. 92 (10), 3014-3024 (1995).
  15. Becker, D. E., Reed, K. L. Local anesthetics: Review of pharmacological considerations. Anesth Prog. 59 (2), quiz 103-103 90-102 (2012).
  16. Khalifa, A. B. H., Moissenet, D., Thien, H. V., Khedher, M. Virulence factors in Pseudomonas aeruginosa: Mechanisms and modes of regulation. Ann Biol Clin (Paris). 69 (4), 393-403 (2011).
  17. Laventie, B. J., et al. A surface-induced asymmetric program promotes tissue colonization by Pseudomonas aeruginosa. Cell Host Microbe. 25 (1), 140-152.e6 (2019).
  18. Büttner, H., Mack, D., Rohde, H. Structural basis of Staphylococcus epidermidis biofilm formation: Mechanisms and molecular interactions. Front Cell Infect Microbiol. 5 (17), 14(2015).
  19. Brescó, M. S., et al. Pathogenic mechanisms and host interactions in Staphylococcus epidermidis device-related infection. Front Microbiol. 8, 1401(2017).
  20. Wan, S., et al. Nerve-associated transient receptor potential ion channels can contribute to intrinsic resistance to bacterial adhesion in vivo. FASEB J. 35 (10), e21899(2021).
  21. Datta, A., et al. TRPA1 and TPRV1 ion channels are required for contact lens-induced corneal parainflammation and can modulate levels of resident corneal immune cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (11), 21(2023).
  22. Datta, A., et al. Contact lens-induced corneal parainflammation involving Ly6G+ cell infiltration requires IL-17A and γδ T cells. Ocul Surf. 28, 79-89 (2023).
  23. Datta, A., Orallo, G. K., Nelson, N. Corneal sensory nerve loss induced by repeated subconjunctival and topical bupivacaine disrupts tear secretion and enhances bacterial adhesion via neuropeptide modulation. PLOS ONE. , In Press (2025).
  24. Schultz, R. O., Peters, M. A., Sobocinski, K., Nassif, K., Schultz, K. J. Diabetic keratopathy as a manifestation of peripheral neuropathy. Am J Ophthalmol. 96 (3), 368-371 (1983).
  25. Belmonte, C., Acosta, M. C., Gallar, J. Neural basis of sensation in intact and injured corneas. Exp Eye Res. 78 (3), 513-525 (2004).
  26. Sitompul, R. Corneal sensitivity as a potential marker of diabetic neuropathy. Acta Med Indones. 49 (2), 166-172 (2017).
  27. O'Brien, P. D., Hur, J., Hayes, J. M., Backus, C., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analyses. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
  28. Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin-and leptin receptor-deficient rodent models: Relevance for human type 2 diabetes. Curr Diabetes Rev. 10 (2), 131-145 (2014).
  29. Islam, M. S. Animal models of diabetic neuropathy: Progress since 1960s. J Diabetes Res. 2013, 149452(2013).
  30. Ma, L., et al. CGRP released by corneal sensory nerve maintains tear secretion of the lacrimal gland. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (4), 30(2024).
  31. Bower, J. J., Song, Z., Song, L. Subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models. J Vis Exp. (181), e63532(2022).
  32. Jumelle, C., Gholizadeh, S., Annabi, N., Dana, R. Advances and limitations of drug delivery systems formulated as eye drops 1. J Control Release. 321, 1-22 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.