Методическая статья

Сортировка клеток на основе лейциновой молнии для очистки двухвекторных трансдуцированных клеток

DOI:

10.3791/68628

⸱

24 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье мы описываем протокол селективной очистки Т-клеток с двойным трансдуцированием из смеси совместно трансдуцированных Т-клеток. Этот подход сочетает в себе два ретровирусных вектора, каждый из которых кодирует один компонент методологии сортировки клеток на основе парного лейцина-молнии, которая обеспечивает селективную иммуномагнитную очистку двухвекторных клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Адоптивная терапия Т-клетками, включая Т-клетки химерного антигенного рецептора (CAR), продемонстрировала впечатляющую клиническую активность против гематологических злокачественных новообразований и демонстрирует перспективность в лечении злокачественных опухолей солидных опухолей. Несмотря на эти успехи, были выявлены множественные механизмы резистентности к Т-клеточной иммунотерапии, которые ограничивают терапевтический успех, включая потерю или слабую экспрессию целевых антигенов, развитие истощения Т-клеток и наличие иммуносупрессивного опухолевого микроокружения. Для преодоления этих механизмов резистентности было разработано несколько стратегий клеточной инженерии. Тем не менее, несколько механизмов резистентности могут возникать одновременно, что требует комбинации нескольких инженерных стратегий для оптимизации противоопухолевой активности. Ограничения упаковки векторов ограничивают доставку больших объемов генетической информации к Т-клеткам и представляют собой проблему для совместной экспрессии нескольких инженерных конструкций. Здесь мы описываем протокол совместной трансдукции Т-клеток с двумя векторами для кодирования нескольких трансгенов, тем самым увеличивая количество инженерных функций. Совместно экспрессируя методологию сортировки клеток на основе лейциновой молнии, называемую Zip-сортировкой, мы направляем селективную иммуномагнитную очистку клеток с двойным трансдуцированием, которые включают в себя два различных вектора.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR-T-клеточная терапия произвела революцию в лечении В-клеточного лейкоза, лимфомы и множественной миеломы 1,2. CAR-Т-клетки также исследуются на предмет злокачественных опухолей солидных опухолей3. Тем не менее, были выявлены повторяющиеся механизмы неэффективности терапии CAR-Т-клетками, включая плохую экспрессию или потерю молекулы-мишени антигена CAR, развитие дисфункции Т-клеток (истощение), активное подавление иммунитета микроокружением опухоли, а также ограниченный транспорт Т-клеток в микроокружение опухоли и их персистенцию в микроокруженииопухоли 3,4,5,6 . В то время как отдельные инженерные решения были разработаны для преодоления каждого изэтих механизмов резистентности CAR-Т-клеток3, внедрение нескольких инженерных функций в продукт клеточной терапии для одновременного преодоления нескольких механизмов резистентности является сложной задачей из-за ограниченной генетической упаковочной способности ретровирусных и лентивирусных векторных систем7.

Для преодоления ограничений в возможностях упаковки векторов все чаще используется котрансдукция Т-клеток с несколькими векторами. Векторная котрансдукция использовалась для изучения логически зависимых и регулируемых лекарственными препаратами стратегий инженерии Т-клеток в доклинических исследованиях 8,9,10 и в недавнем клиническом исследовании по оценке CD19/CD22 двойных CAR-Т-клеток для преодоления ограничений векторной упаковки11. Тем не менее, котрансдукция генерирует продукты смешанных клеток, содержащие комбинации Т-клеток с одной и двумя трансдуцированными клетками, что может ухудшить функциональность продукта, если она зависит от компонентов, кодируемых обоими векторами, а также может привести к конкуренции между одинарно трансдуцированными Т-клетками12.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали методологию под названием Zip-sort, в которой используются гетеродимеризующие лейциновые молнии, каждая из которых экспрессируется одним из двух совместно трансдуцированных векторов, для прямой одноступенчатой иммуномагнитной очистки двойных трансдуцированных клеток. В этом протоколе мы описываем методы создания ретровирусных векторов, включающие нашу методологию Zip-сортировки, производство и концентрацию ретровирусной надосадочной жидкости, активацию и котрансдукцию Т-клеток, а также иммуномагнитную очистку двойных трансдуцированных клеток (Zip-сортировка).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования на животных проводились в Исследовательской лаборатории Парвина в Городе Надежды (COH) в соответствии с протоколом #23145, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию в учреждениях COH, и в виварии Мемориального онкологического центра им. Слоуна-Кеттеринга (MSKCC) в соответствии с протоколом #99-07-025, утвержденным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию. Человеческие Т-клетки были выделены из обезличенных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), которые были выделены по методу Фиколла-Паке из фильтров для снижения лейкоцитов, полученных в Центре доноров крови «Город надежды», и использованы в соответствии с протоколом #24427, одобренным Институциональным наблюдательным советом «Города надежды». Все процедуры проводились в соответствии с институциональными нормами биобезопасности.

1. Векторный дизайн с зип-сортировкой

  1. Выберите вектор экспрессии для генетической модификации интересующих клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Методология почтовой сортировки включает в себя секретируемые молнии и захватывающие молнии, которые экспрессируются из разных векторов и которые образуют внутриклеточную пару и трафик на поверхность клетки, чтобы обеспечить селективную очистку клеток, включающих оба вектора (Рисунок 1A-D)13. Скрытые молнии выражены из Vector 1 и содержат метку сродства. Захват молний выражен из вектора 2 и удерживает скрытую молнию на поверхности ячейки. Блокирующая модификация молнии состоит из ковалентно связанной второй молнии, которая блокирует неспецифическое внеклеточное спаривание секретируемой молнии. Модификация блокирующей молнии требуется для предотвращения внеклеточного спаривания при добавлении захватывающей молнии к белкам с удлиненными внеклеточными доменами (обычно внеклеточными доменами размером больше, чем домен с короткими шарнирами).
  2. Выберите набор секретных и захватывающих застежек-молний из Дополнительной таблицы 1 и Дополнительного файла 1 для тестирования и построения векторов.
  3. Клонируйте последовательности молнии в парные экспрессирующие векторы с использованием стандартных методов молекулярной биологии13- каждый из двух векторов будет кодировать либо секретируемую молнию аффинити-метки, либо захватывающую молнию (рис. 1D).
    1. Последовательности конструкций молнии см. в Дополнительной таблице 1 и Дополнительном файле 1 . Последовательности застежек-молний были размещены на 5' (N конце) полицистронного сообщения для усиления их экспрессии и, таким образом, увеличения выхода сорта. Поместите последующие трансгены вниз по потоку, разделенные саморасщепляющимися 2А-пептидами (рис. 1D). Тем не менее, предыдущие эксперименты имели успех при размещении молний в 3-футовой конфигурации, если поддерживается высокая экспрессия.

2. Производство ретровирусов

  1. За 1 сутки до трансфекции получают клетки Phoenix-Eco (ATCC CRL-3214, мышиный тропный вирус) или Phoenix-Eco ɑ-V β-3 клетки13 (добавление ɑ-V β-3 для усиления адгезии Phoenix-Eco) или 293Vec-RD11414 (вирус тропики человека) или клетки 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 (добавление ɑ-V β-3 для усиления адгезии 293Vec-RD114) за 1 сутки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол не требует модификации упаковочных линий с интегринами ɑ-V β-3, но такая модификация улучшает адгезию этой клеточной линии к колбам для тканевых культур и облегчает сбор ретровирусной надосадочной жидкости.
    1. Трипсинизируйте клетки в колбе T175, содержащей клетки Phoenix или 293Vec-RD114 при ~80% слиянии с 0,25% трипсин-ЭДТА.
      1. Удалите среду, промойте адгезивные клетки 10 мл PBS, не нарушая клетки, чтобы удалить компоненты сыворотки, которые ингибируют трипсин, добавьте 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 5 минут.
      2. Диссоциируйте и соберите клетки в 5 мл DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина/стрептомицина и 1% GlutaMAX (называемого полным DMEM).
      3. Гранулируйте ячейки в коническую пробирку объемом 15 мл центрифугированием при 340 x g в течение 5 мин при 4 °C. Декантные среды.
    2. Ресуспендируйте центрифужные гранулированные клетки в 10 мл полного DMEM и планшете на 10-сантиметровой чашке для культуры тканей примерно 1,5 x 106 клеток Phoenix-Eco, клеток Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114 или 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 клеток, подсчитанных с помощью гемацитометра.
    3. Осторожно встряхните или покрутите планшет, чтобы равномерно распределить клетки, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C, чтобы клетки прилипли к планшету.
  2. Примерно через 18-24 часа убедитесь, что клетки на 60-70% сливаются, а здоровые, адгезивные клетки демонстрируют дендритные проекции.
  3. Стабильно трансфектируйте клетки Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114 или 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 с помощью ретровирусных LZRS-векторных конструкций (Addgene Plasmid #31601, эписомальная стабильная трансфекция на основе EBNA) или PB-векторных конструкций13 (геномная стабильная интеграция на основе транспозона piggyBac, Дополнительный файл 1) с использованием трансфекционного набора (Таблица материалов), как описано ниже.
    1. Соедините 2 мкг LZRS-векторной ДНК или PB-векторной ДНК и 16 мкл энхансерного реагента в 300 мкл EC-буфера в микроцентрифужной пробирке для каждой реакции трансфекции.
    2. Для стабильной интеграции PB-векторных конструкций также добавьте 1 мкг гиперактивного вектора транспозазы piggyBac pCMV-hyPBase15 (Институт Сэнгера).
    3. Осторожно перемешать в течение 5 с и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавьте 20 μл реагента для трансфекции, сделайте вихрь в течение 10 с и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут для получения комплексов мицелл ДНК.
    4. Добавьте в пробирку 300 мкл полного DMEM, несколько раз проведите пипеткой для тщательного перемешивания и добавьте мицеллу суспензии по каплям в покрытые ячейки упаковочной линии с помощью пипетки объемом 1 мл.
    5. Аккуратно взболтайте, чтобы обеспечить равномерное отложение мицелл. Через 24 ч трипсинизировать трансфицированные клетки и оценить исходную экспрессию ретровирусных кодируемых конструкций с помощью проточной цитометрии.
    6. Перенесите трипсинизированные клетки в колбу T75 с 20 мл полного DMEM и добавьте 2 мкг/мл пуромицина или 10 мкг/мл бластицидина, в зависимости от генов устойчивости к антибиотикам, чтобы выбрать трансфицированные клетки. Как только клетки достигнут 70-75% конфлюенции, трипсинизируйте и перенесите в колбу T175 с 40 мл полного DMEM. Сохраняйте выбор антибиотиков в средах при расширении упаковочной линии.
    7. Когда клетки сливаются на 80-85%, трипсинизируйте снова и подтверждайте экспрессию конструкций с помощью проточной цитометрии. Заморозьте соответствующую часть клеток с помощью замораживающей среды (50% полного DMEM, 40% FBS, 10% DMSO) и пропустите ячейки в две колбы T175 (соотношение разделения 1:10-1:12) с 40 мл полного DMEM.
  4. Соберите и сконцентрируйте ретровирусную надосадочную жидкость с полностью отобранных стабильных упаковочных линий, выращенных в колбах T175, когда клетки достигнут 80%-85% конфлюенции.
    1. Удалите антибиотики из среды перед первым сбором урожая, заменив среду в T175 40 мл свежей полной DMEM за 24 ч до первого предполагаемого сбора.
    2. Соберите и отфильтруйте надосадочную жидкость через 24 ч после замены фильтрующего материала, пропустив собранную надосадочную жидкость через шприцы объемом 50 мл с шприцевыми фильтрами (0,45 мкм, поливинилиденфторид). Соберите в коническую пробирку объемом 50 мл.
    3. Добавьте 5x концентрат раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) (40% (масс./об.) ПЭГ 8 000 МВт, содержащий 2,4% (масс./об.) NaCl) отфильтрованную надосадочную жидкость и переверните пробирку несколько раз для полного перемешивания (стадия осаждения ПЭГ).
    4. Добавьте 40 мл полного DMEM обратно в исходную собранную колбу T175, инкубируйте еще 24 часа и собирайте вирусный надосадочный слой ежедневно в течение еще 2 дней подряд в общей сложности.
    5. Выведите вирус в осадок на 1-2 дня при температуре 4 °C. Выпавший в осадок вирус будет выглядеть в виде хлопьевидного, плавающего или осажденного материала.
    6. Центрифуга для ПЭГ-осаждения вирусной суспензии при 2100 x g в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте невыпавшую надосадочную жидкость.
    7. Ресуспендируйте каждую ПЭГ-осажденную вирусную гранулу в 500 мкл RPMI с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина, 1% GlutaMAX, 1% пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот и 0,1% β-меркаптоэтанола (называемого полным RPMI).
    8. Немедленно используйте ресуспендированный вирус для трансдукции или переноса в микроцентрифужную пробирку и храните при температуре −80 °C.

3. День 0: обогащение и активация Т-клеток мыши

  1. Покрыть обработанный культурой тканью 6-луночный планшет 1,5 мл PBS на лунку, содержащий 2 мкг/мл анти-CD3 (клон 145-2C11) и 2 мкг/мл анти-CD28 (клон 37.51). Выдерживать в течение 2 ч при температуре 37 °C.
  2. Забор селезенки у донорской мыши, диссоциация клеток через фильтр 40 мкм и сбор спленоцитов в полную RPMI. Гранулированные спленоциты центрифугируют при 340 x g в течение 5 мин при 4 °C.
    Примечание: Самки мышей BALB/cJ в возрасте от 6 до 8 недель использовались в качестве донорских мышей в этом исследовании.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость, аккуратно смешайте вихревую гранулу, добавьте 1 мл буфера для лизиса эритроцитов, пипетку 3-5x для смешивания, инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 минуты, закалите 10 мл полного RPMI и замедлите клетки центрифугированием при 340 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  4. Откажитесь от надосадочной жидкости, добавьте 800 мкл PBS с 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА (так называемый буфер MACS) и добавьте 200 мкл мышиных микрогранул CD19. Пипетку перемешать и выдержать в течение 15 мин при температуре 4 °C.
  5. Подготовьте 1 колонку LD на селезенку мыши. Закрепите столбец LD на разделителе MACS. Поместите под нее коническую трубку объемом 15 мл для сбора истощенных CD19 спленоцитов. Смочите колонку 2 мл буфера MACS.
  6. После инкубации с микрогранулами CD19 промойте клетки 5 мл холодного буфера MACS, гранулируйте ячейки центрифугированием при 340 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте в 1 мл буфера MACS и добавьте ячейки в столбец LD. Подождите, пока суспензия пройдет, прежде чем умываться 1 мл, а затем 2 мл буфера MACS.
  7. Соберите проточные CD19-истощенные спленоциты для использования в последующем потоке. Выбросьте колонку LD, уменьшите CD19-истощенные спленоциты путем центрифугирования при 340 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 18 мл полного RPMI. Добавьте рекомбинантный человеческий IL-2 (rhIL-2) до конечной концентрации 50 МЕ/мл.
  8. Выбросьте раствор антитела из 6-луночного планшета, покрытого антителами. Добавьте 3 мл ресуспендированных В-клеток, обедненных В-клетками, в каждую лунку 6-луночного планшета, покрытого антителами.

4. День 1: Ретровирусная трансдукция Т-клеток мыши

  1. Покройте 6-луночный планшет, не обработанный тканевой культурой, 1,5 мл PBS на лунку, содержащий 2 мкг/мл анти-CD3 (клон 145-2C11), 2 мкг/мл анти-CD28 (клон 37,51) и 20 мкг/мл ретронектина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты, не содержащие тканевых культур, используются во время нанесения покрытия RetroNectin в соответствии с рекомендациями производителя.
  2. Выдерживать в течение 2 ч при температуре 37 °C. Выбросьте раствор для покрытия или сохраните для повторного использования (можно использовать повторно один раз). Запорную пластину с 1 мл PBS с 2% BSA на лунку, инкубировать в течение 10 минут при 37 °C и выбросить блокирующий раствор.
  3. Тем временем разморозьте ПЭГ-осажденный вирусный надосадочный слой на водяной бане при температуре 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 500 мкл каждого ко-трансдуцированного ПЭГ-концентрированного ретровируса, полученного из колбы T175, должно быть достаточно для двойной трансдукции до 2 x 106 активированных Т-клеток на лунку с эффективностью двойной трансдукции > 20%.
  4. Добавьте котрансдукционные вирусные надосадочные жидкости в лунку с 6-луночным планшетом в соответствии с желаемыми условиями, доведите конечный объем по крайней мере до 2 мл при полном RPMI и 50 МЕ/мл rhIL-2 и вращайте в течение 1 ч при 2100 x g и 32 °C.
  5. Добавьте 0,5-2 x 106 активированных Т-клеток в лунку и вращайте планшет при 340 x g в течение 10 минут при 32 °C. Если ячейки не прилипли, повторите вращение при 340 x g еще 10-20 минут при 32 °C. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи.

5. День 2: Оценка экспрессии вектора и необязательная ретрансдукция

  1. Разрушайте 100-200 мкл адгезивных клеток за одно условие из трансдукционной пластины для проточной цитометрии. Пользователь должен идентифицировать маркер, обнаруживаемый с помощью проточной цитометрии, для каждого отдельного вектора и аффинной метки и использовать их для оценки эффективности векторной одновекторной трансдукции, эффективности двухвекторной трансдукции и представления аффинной метки с помощью проточной цитометрии.
  2. Проведите проточную цитометрию на котрансдуцированных клетках, как описано ниже.
    1. Настройте оси параметров сбора данных для отображения векторных репортеров для векторов 1 и 2 (рис. 1C).
    2. Постройте гистограммы для окрашивания на молнии аффинити-меток (например, FLAG или CD34) для каждого из четырех квадрантов экспрессии Vector 1 и Vector 2, чтобы убедиться, что окрашивание аффинных меток ограничено клетками, совместно экспрессирующими репортеры трансдукции Vector 1 и Vector 2.
  3. Если клетки имеют достаточную двойную трансдукцию для обеспечения достаточного количества клеток для последующих экспериментов (обычно 20% или более двойной трансдукции), выполните следующие шаги.
    1. Покройте в два раза больше исходных лунок, используемых для трансдукции каждой линии Т-клеток, PBS, содержащим 2 мкг/мл анти-CD3 и анти-CD28 антител для поддержания стимуляции Т-клеток. Выдерживать в течение 2 ч при температуре 37 °C.
    2. Перенос клеток в новые лунки с полным RPMI с 50 МЕ/мл rhIL-2 (поддерживает стимуляцию Т-клеток).
  4. Если двойная трансдукция клеток недостаточна для обеспечения достаточного количества клеток для последующих экспериментов (обычно < 20% двойной трансдукции), выполните следующие шаги.
    1. Повторную трансдукцию проводят по тому же протоколу, что и в день 1, но увеличивая в два раза количество лунок, первоначально использованных для учета экспансии Т-клеток.
    2. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи. Повторите проточную цитометрию через 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Векторно-закодированные конструкции, включая застежку-молнию аффинити-тега, демонстрируют максимальную экспрессию через 2 дня после первоначальной трансдукции.

6. День 3: Т-клеточный иммуномагнитный отбор (Zip-сорт)

  1. Пул лунок клеток, полученных с использованием тех же условий котрансдукции, в коническую трубку объемом 15 мл.
  2. Центрифугируйте ячейки при давлении 340 x g в течение 5 мин при 4 °C. Отбраковать надосадочную жидкость и инкубировать клетки в 500 мкл буфера MACS, содержащего 30 мкл микрогранул (DYKDDDDK (FLAG) или CD34 человека) на 1 x 107 клеток в течение 30 мин при 4 °C.
  3. После инкубации промойте клетки 5 мл холодного буфера MACS. Центрифугируйте ячейки при давлении 340 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл буфера MACS.
  4. Положительно отберите трансдуцированные Т-клетки с помощью колонки LS, как описано ниже.
    1. Смочите колонку 2 мл буфера MACS. Нанесите суспензию ячеек на колонку LS в магнитной стойке.
    2. Промывайте последовательно с помощью буфера MACS (1 мл, 2 мл, 3 мл). Элюируйте ячейки из колонки, сняв колонку с магнитной стойки, добавив 5 мл полного RPMI в колонку и вставив поршень ячейки.
    3. Захватывайте клетки в коническую пробирку объемом 15 мл или непосредственно в колбу T25. Уравновешивайте клетки при концентрации 0,5 x 106 клеток/мл в полном RPMI с 50 МЕ/мл rhIL-2.
    4. Если вы начинаете с < 20% двойной трансдукции, при необходимости элюируйте клетки на вторую колонку LS для последовательного положительного отбора для повышения чистоты после сортировки.
  5. Культивируйте CAR-Т-клетки в колбах Т25 или Т75 в концентрации примерно 0,5 x 106 клеток/мл полного RPMI и 50 МЕ/мл rhIL-2.
  6. Если Т-клетки будут использоваться для экспериментов in vivo, рассмотрите возможность культивирования в 1 мкМ дазатиниба для ослабления дисфункции, вызванной тонизирующей сигнализацией CAR-Т-клеток, возникшей в течение начального периода культивирования13,16.
  7. Проточную цитометрию в соответствии с шагами 2.1 и 2.2 выше для предварительно отсортированных и постсортированных Т-клеток для оценки выхода и чистоты после сортировки Zip (% двойной трансдукции).
    Выход = 100 x общее количество восстановленных двойных трансдуцированных клеток / общее количество двойных трансдуцированных клеток, присутствующих в популяции предварительной сортировки)

7. День 4: Продолжение культивирования Т-клеток

  1. Добавьте свежий полный RPMI и 50 МЕ/мл rhIL-2 на весь объем культуры для поддержания концентрации Т-клеток на уровне 0,5-1 x 106 клеток/мл.
  2. Необязательно: Если Т-клетки будут использоваться для экспериментов in vivo , добавьте свежий 1 мкМ дазатиниб.

8. День 5: Определение характеристик Т-клеток, отсортированных по Zip

  1. Дополнительно: Приготовьте 100-200 мкл суспензии Т-клеток для каждого состояния, окрашенного антителами, для обнаружения CAR или других белковых продуктов, кодируемых векторами Zip-сортировки, с помощью проточной цитометрии.
  2. Проводите эксперименты in vitro или in vivo с CAR-Т-клетками.
  3. Необязательно: Если Т-клетки будут использоваться для экспериментов in vivo , промойте клетки для удаления дазатиниба. Ресуспендируйте клетки в концентрации, необходимой для инъекции в ретроорбитальную или хвостовую вену в соответствии с рекомендациями учреждения.

9. День 0: Очищение и стимуляция Т-клеток человека

  1. Быстро разморозьте флакон с криоконсервированными мононуклеарными клетками периферической крови человека на водяной бане (или используйте свежевыделенные мононуклеары периферической крови человека). Добавьте размороженные PBMC в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл буфера MACS, приготовьте аликвоту для подсчета и гранулированные ячейки центрифугированием при 340 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  2. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в буфере MACS (используйте 40 мкл буфера на 1 x 10 всего7 клеток). Приступайте к выделению Т-клеток с помощью набора для выделения Т-клеток Pan для человека, в соответствии с инструкциями производителя.
    1. Вкратце, добавьте 10 μL коктейля Pan T-Cell Biotin-Antibody Cocktail на 1 x 107 всего клеток. Выдерживать 5 минут при температуре 4 °C.
    2. Добавьте 30 μL буфера MACS на 1 x 10всего 7 ячеек. Добавьте 20 μL коктейля Pan T Cell MicroBead Cocktail на 1 x 107 всего.
    3. Выдерживать в течение 10 минут при температуре 4 °C. Заполните объем клеточной суспензии с помощью буфера MACS не менее чем до 500 μл.
    4. Приступайте к разделению магнитных ячеек с помощью колонки LS и собирайте поток через содержащие обогащенные (нетронутые) Т-клетки.
  3. Подсчитайте выход Т-клеток и грануляторов путем центрифугирования при 340 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте человеческие Т-клетки в полной RPMI в концентрации 1 x 106 клеток/мл с rhIL-2 в концентрации 50 МЕ/мл.
  4. В коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл PBS, добавьте необходимое количество Dynabeads Human T-activator CD3/CD28 для расширения и активации Т-клеток (25 мкл гранул на 1 x 106 клеток, используя соотношение шариков и Т-клеток 1:1) и уменьшите при 340 x g в течение 5 минут при 4 °C, чтобы промыть шарики. Выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Смешайте ресуспендированные Т-клетки с промытыми шариками и переложите в колбу Т25 для посева.

10. День 3: Ретровирусная трансдукция Т-клеток человека

  1. Покройте 6-луночный планшет без культуры тканей 1,5 мл PBS на лунку, содержащую 20 мкг/мл ретронектина.
  2. Выдерживать в течение 2 ч при температуре 37 °C. Выбросьте раствор для покрытия или сохраните для повторного использования (можно использовать повторно один раз).
  3. В то же время разморозьте осажденные ПЭГ вирусные надосадочные жидкости для совместной трансдукции в водяной бане при температуре 37 °C.
  4. Добавьте котрансдукционный вирусный супернатант в лунки 6-луночного планшета, покрытого ретронектином, в соответствии с желаемыми условиями трансдукции, подсчитайте и добавьте желаемое количество Т-клеток (обычно 0,5 - 2 x 106 Т-клеток/лунку), доведите объем до 3 мл с полным RPMI, содержащим rhIL-2, и вращайте в течение 45 минут при 340 x g при 32 °C.
  5. Через 24 ч поддерживать концентрацию Т-клеток на уровне 1 x 106 клеток/мл в полном RPMI с 50 МЕ/мл rhIL-2.
  6. Переведите ячейки из 6-луночного планшета в колбу Т25, если объем, необходимый для поддержания желаемой концентрации Т-клеток, превышает объемную емкость 6-луночного планшета.

11. День 6: Zip-сортировка CAR-Т-клеток человека

  1. Удалите Dynabead из Т-клеток перед иммуномагнитной очисткой на основе аффинных меток (Zip-sort), чтобы избежать возможного удержания Dynabead, связанного с магнитной колонкой, и перед проточной цитометрией, чтобы избежать потенциальных помех при анализе проточной цитометрии.
  2. Vortex кратковременно диссоциирует Dynabeads и переносит Т-клетки в коническую трубку объемом 15 мл и вставляет в Dynabead Magnet. Переверните трубку несколько раз и подождите 5 минут, пока Dynabeads не привяжется к магниту.
  3. Осторожно перенесите клеточную суспензию без Dynabeads в новую коническую пробирку объемом 15 мл путем аспирации с помощью пипетки. Подсчитайте концентрацию восстановленных клеток и используйте объем для расчета общего выхода клеток.
  4. Оцените экспрессию CAR с помощью проточной цитометрии в соответствии с приведенным выше протоколом трансдукции мыши.
  5. Отжим клетки путем центрифугирования при 340 x g в течение 5 мин при 4 °C и инкубируем в 500 мкл буфера MACS, содержащем 30 мкл микрогранул (DYKDDDDK (FLAG) или CD34 человека) на 1 x 107 клеток.
  6. Выполните шаги 6.3-6.5 для получения отсортированных с помощью Zip человеческих CAR-Т-клеток.
  7. Оцените жизнеспособность после сортировки с помощью проверки жизнеспособности гемацитометра с использованием исключения трипанового синего. Ожидается, что жизнеспособность перед сортировкой составит > 80%. После Zip-сортировки этот показатель может упасть ниже 80%, но восстанавливается в течение 4-5 дней.
  8. Размножите человеческие Т-клетки в полном RPMI с 50 МЕ/мл rhIL-2 и поддерживайте концентрацию Т-клеток на уровне примерно 1 x 106 клеток/мл. Расширение и обслуживание Т-клеток после сортировки может быть адаптировано в соответствии со стандартными протоколами расширения и использования пользователя.
  9. Проведите последующие экспериментальные испытания, такие как анализы на убийство, выработку цитокинов, анализ in vivo с использованием Т-клеток, как правило, после 8-го дня.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы демонстрируем котрансдукцию и одноступенчатый иммуномагнитный отбор Т-клеток, дважды трансдуцированных двумя различными ретровирусными векторами (называемыми Zip-сортировкой, рис. 1)13. Каждый вектор кодирует одну часть гетеродимеризующейся пары лейциновой молнии, которая избирательно отображается на поверхности Т-клеток с двойным трансдуцированием (рис. 1A). Секретируемая застежкой-молнией аффинити-метки экспрессирует...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описали протокол для генерации наборов векторов Zip-сортировки, производства ретровируса, совместной трансдуцации Т-клеток мыши и человека, а также иммуномагнитной очистки двойных трансдуцированных клеток (Zip-сортировка). Указанный протокол был оптимизирован для ретровирусных векторов, а также для Т-клеток мыши и человека. Несмотря на то, что методология Zip-сортировки не оценивалась с другими векторными системами, в принципе, другие векторные системы, вероятно, будут совместим...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.R., S.C., S.E.J. и M.v.d.B. являются соавторами патентных заявок, связанных с технологией Zip-сортировки. A.P.B. предоставляет консультационные услуги для Abbvie и Bristol Myers Squibb. M.v.d.B. получила исследовательскую поддержку от Seres Therapeutics, а опционы на акции от Seres Therapeutics и ThymoFox; он получал гонорары от Wolters Kluwer; он консультировал, получал гонорар или участвовал в работе консультативных советов компаний Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis (супруг), Synthekine (супруг), Beigene (супруг), Kite (супруг), MustangBio (супруг) и Cellectar (супруг); он имеет лицензию на интеллектуальную собственность в компаниях Seres Therapeutics и Juno Therapeutics; он занимает фидуциарную роль в Совете фонда DKMS (некоммерческая организация); и он является председателем научно-консультативного совета Smart Immune.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C. получил поддержку от Немецкого научно-исследовательского общества (Research Fellowship; Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG). S.E.J. получает поддержку в виде премии за развитие карьеры от NCI (номер награды K08-CA252157). S.E.J. также получил поддержку от Американского общества клинической онкологии (премия Young Investigator), Национальной программы доноров костного мозга (премия Amy Program) и Института иммунотерапии рака Паркера (премия Bridge Scholar). Исследования в лаборатории ван ден Бринка поддерживаются наградами Национального института рака P01-CA023766, R35-CA284024, R01-CA228308; Премия Национального института сердца, легких и крови R01-HL164902 и премия Национального института старения P01-AG052359. Это исследование частично поддерживается фондом Дины и Стива Кэмпбеллов, главного врача, исполнительного заслуженного председателя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильная>сильная клеточная линия
С1498 г.АТКСТИБ-49
БМ185-КД19Ссылка 13
БМ185-КД20Ссылка 13
Блок ядра 4D-нуклеофэктораЛонзаААФ-1003Б
4D-нуклеофектор XЛонзаААФ-1003Х
Комплект буферов Lonza SF
<сильное>Производство вируса
10-сантиметровая чашка для клеточных культур, обработанная тканевой культурой (TC)Корнинг353003
Коническая трубка 50 млТермо Сайентиал339652
ЭффектенЦягэн301425
Плазмида pENTR1aАдджен17398
ЛЗРС-РфаАдджен31601
PB MMLV puro (вирусный вектор для Т-клеток мыши)Ссылка 13
PB SFG blastR (вирусный вектор для Т-клеток человека)Ссылка 13
pCMV-hyPBaseИнститут Сэнгера
Феникс-ЭкоАТКСЦРЛ-3214
Феникс-Эко альфа V бета 3Ссылка 13Феникс-Эко модифицирован для прилипания к колбам с культурой с повышенной жадностью
PB-EF1a интрон WPRE mCD4 P2A MCS интегрин бета 3Ссылка 13Опционально для повышения адгезии ячеек упаковочной линии к колбам с культуральными колбами
PB-EF1a интрон WPRE hCD8a 2A интегрин альфа VСсылка 13Опционально для повышения адгезии ячеек упаковочной линии к колбам с культуральными колбами
Биовек-РД113Биовек Фарма
Biovec-RD113 альфа V бета 3Биовек ФармаЭто исследование, трансфицированное альфа V бета 3 векторами
Шприцевые фильтры Millex-HV (0,45 мкм; m)МногородностьSLHVR33RRS
Полиэтиленгликоль 8000 (ПЭГ)Научный центр ФишераБП233-1
Хлорид натрияНаучный центр ФишераС271-500
ПуромицинСанта Крус БиотехСК-108071Б
БластицидинСанта Крус БиотехСК-204655
T175 Колбы, обработанные TC Корнинг353112
Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красныйGibco25200056
<сильная>клеточная среда
2-меркаптоэтанолGibco21985023
RPMI1640Gibco11-875-119
DMEMGibco11-965-118
ФБССигмаФ2442
ГлутамаксGibco35050061
Заменимые аминокислоты MEMGibco11140050
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-163
Пируват натрияGibco11360070
<сильная>стимуляция/трансдукция Т-клеток
Коническая трубка 15 млТермо Сайентиал339650
6-луночный планшет без ТСGibco351146
6-луночный планшет TCGibco353046
анти-CD19 микрогранулы Милтеньи Биотек130-121-301
Антимышь InVivoMab CD28 (клон 37.51)БиоXCellБЭ0015-1
Антимышь InVivoPlus CD3ε (Клон 145-2C11)БиоXCellБЭ0001-1
Бычий сывороточный альбуминСигма ОлдричА4737-1Г
ДазатинибКайман Кемикал11498
Dynabeads Т-активатор человека CD3/CD28Gibco11131Д
ЭДТА (0,5 М), pH 8,0, без РНКазыИнвитрогенAM9260G
Буфер для лизиса эритроцитов HybriMaxСигмаР7757-100МЛ
Колонна LDМилтеньи Биотек130-042-901
Набор для изоляции Т-клеток Pan, человекМилтеньи Биотек130-096-535
Магнит Dynamag-15Инвитроген12301Д
Фосфатно-солевой буфер (1X)Корнинг21040С.В.
РетронектинТакараТ100Б
rhIL-2Пролейкин (альдеслейкин)
Колба для клеточных культур T25Корнинг353109
Zip-sort
&микро; Изоляционный комплект MACS DYKDDDDKМилтеньи Биотек130-101-591
CD34 Набор микрошариков, человеческийМилтеньи Биотек130-046-702
КвадроMACSМилтеньи Биотек130-090-976
MACS MultiStandМилтеньи Биотек130-042-303
Колонна LSМилтеньи Биотек130-042-401
<сильная>проточная цитометрия и мониторинг клеток
Anti-CD90.1 Thy1.1 APC (клон OX-7)BD BiosciencesКат# 561409; РРИД:AB_10683163
Антитело к V5-метке, (клон 4C12E11) iFluor 488GenScriptКат# A01803, RRID:AB_2925231
Myc PEТехнология клеточной сигнализацииКат# 2233; РРИД:AB_823474
Мик Алекса 647Технология клеточной сигнализацииКат# 2233; РРИД:AB_823474
Метка APC anti-DYKDDDK (клон L5)БиолегендаКат# 637307; РРИД:AB_2561496
Мышиное антитело к CD34, Alexa Fluor 647, (клон QBEnd/10)Novus BiologicalsКат# NBP2-34713AF647; РРИД:AB_2925234
Стрептаг ФИТКGenScriptКат# A01736; РРИД:AB_2622221
Инкуцит SX5Сарториус
Проточный цитометр PenteonAgilent

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. New Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Mikkilineni, L., Kochenderfer, J. N. CAR T cell therapies for patients with multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 71-84 (2021).
  3. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614 (7949), 635-648 (2023).
  4. Berger, T. R., Maus, M. V. Mechanisms of response and resistance to CAR T cell therapies. Curr Opin Immunol. 69, 56-64 (2021).
  5. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming CAR-T cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  6. Fucà, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing Chimeric Antigen Receptor T-Cell Efficacy in Solid Tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  7. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral Vector Systems for Gene Therapy: A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges. Appl Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  8. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Medi. 13 (591), eabd8836(2021).
  9. Tousley, A. M., et al. Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells. Nature. 615 (7952), 507-516 (2023).
  10. Li, Y., et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med. 28 (10), 2133-2144 (2022).
  11. Ghorashian, S., et al. CD19/CD22 targeting with co-transduced CAR T-cells to prevent antigen negative relapse after CAR T-cell therapy of B-ALL. Blood J. , (2023).
  12. Qin, H., et al. Preclinical Development of Bivalent Chimeric Antigen Receptors Targeting Both CD19 and CD22. Mol Ther Oncol. 11, 127-137 (2018).
  13. James, S. E., et al. Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1592-1614 (2024).
  14. Ghani, K., et al. Efficient Human Hematopoietic Cell Transduction Using RD114- and GALV-Pseudotyped Retroviral Vectors Produced in Suspension and Serum-Free Media. Human Gene Ther. 20 (9), 966-974 (2009).
  15. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S Am. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  16. Weber, E. W., et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 372 (6537), eaba1786(2021).
  17. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Targeted Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  18. Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc Natl Acad Sci. 107 (4), 1343-1348 (2010).
  19. Shy, B. R., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat Biotechnol. 41 (4), 521-531 (2023).
  20. Liu, Z., et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep. 7 (1), 2193(2017).
  21. Cui, Z., Yuan, P., Zhao, Z., Zhao, F., Lu, L. Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro. J Vis Exp. (213), e66966(2024).
  22. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J Clin Invest. 119 (4), 964-975 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Leucine ZipperCell SortingDual Vector TransductionT Cell EngineeringImmunomagnetic PurificationAdoptive T Cell TherapyCAR T CellsTumor MicroenvironmentTransgene CoexpressionCell Purification

Похожие статьи