Методическая статья

Оптимизированная техника минимально инвазивной транссклеральной субретинальной инъекции мышам

DOI:

10.3791/68631

⸱

25 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Duke University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Субретинальные инъекции являются незаменимой методикой для доклинической разработки терапевтических средств при заболеваниях фоторецепторов и РПЭ. Мы описываем оптимизированную технику транссклеральной субретинальной инъекции у мышей, которая улучшает показатели интраоперационного успеха и минимизирует повреждение сетчатки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционный метод доставки материала в субретинальное пространство у мыши включает двойную перфорацию нервной сетчатки, что приводит к обширному хирургическому повреждению. Это приводит к вариабельности последующих показателей исхода зрительной функции, таких как запись электроретинограммы (ЭРГ) или поведенческие анализы зрения, которые искажают оценки эффективности экспериментальных методов лечения. Чтобы преодолеть эти барьеры, мы оптимизировали транссклеральную минимально инвазивную технику субретинальной инъекции у мышей. В этой технике доступ к верхнему своду осуществляется с помощью изготовленного на заказ зеркала век из вольфрамовой проволоки для выполнения конъюнктивальной перитомии и тенотомии. Точечная склеротомия проводится с помощью алмазного ножа без проникновения в сетчатку, через который под небольшим углом осторожно вводится тонкая стеклянная игла. Полезная нагрузка доставляется в субретинальное пространство с помощью микроинъекционного насоса. Оптическая когерентная томография (ОКТ) используется для оценки размера и положения субретинального пузыря сразу после инъекции. Мы сравнили результаты этой методики с традиционным трансретинальным методом, выполненным с использованием пружинного шприца с игольчатой склеротомией 33G. Записи ERG показали превосходное сохранение функции сетчатки у транссклерально инъекционных мышей, сравнимое с таковой у неинъекционных контрольных мышей. Напротив, заметное снижение сигнала ЭРГ наблюдалось в когортах, получавших традиционную инъекцию. Таким образом, мы оптимизировали минимально инвазивную технику субретинальной инъекции мышам. Мы демонстрируем, что этот метод является надежным и эффективным методом введения генной терапии, который сводит к минимуму анатомические повреждения сетчатки и оказывает минимальное влияние на функцию сетчатки. Этот метод снижает порог для разработки методов лечения, нацеленных как на пигментный эпителий сетчатки, так и на фоторецепторы для лечения широкого спектра заболеваний сетчатки и макулы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Субретинальная инъекция — это офтальмологическая хирургическая процедура, при которой материал доставляется в потенциальное пространство между сетчаткой и пигментным эпителием сетчатки (РПЭ). По сравнению с другими методами доставки лекарств в задний сегмент, такими как интравитреальные или супрахориоидальные инъекции, субретинальные инъекции обеспечивают наиболее непосредственный доступ как к фоторецепторам, так и к РПЭ. Для доставки вирусных генотерапевтических частиц субретинальная инъекция обеспечивает гораздо более высокую скорость трансдукции фоторецепторов и РПЭ, что позволяет снизить титры вируса и снизить риск вирусной

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты проводились в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Дьюка и Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения.

1. Подготовка животных

  1. Введите внутрибрюшинную инъекцию 1 мг/кг атропина (в общем объеме 50 мкл) за 30 минут до выполнения субретинальной инъекции. Этот шаг значительно повышает шансы на успех, предотвращая потенциально летальные глазокардиальные и глазореспираторные рефлексы, вызванные преходящ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При успешной инъекции с использованием этой транссклеральной техники образуется субретинальный пузырь, наблюдаемый на ОКТ сразу после процедуры инъекции (рис. 2A). Учитывая техническую сложность этого метода, этап визуализации незаменим для идентификации успешно введенных животных. Исследователям, которые планируют использовать эту методику для экспериментов по генной терапии, мы рекомендуем проводить практические инъекции частиц аденоассоциированного вируса (AAV), несущих флуоресцентный реп.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанная здесь методика вносит несколько усовершенствований в ранее описанный подход к транссклеральной инъекции4, которые повышают надежность процедуры и еще больше уменьшают хирургическое повреждение глаза. Одним из таких улучшений является использование зеркала для втягивания верхнего века, что обеспечивает стабильный, беспрепятственный и свободный доступ к глазу. Коммерческие зеркала часто плохо оптимизированы, даже для взрослых мышей, и совершенно недоступны.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Джона Фланнери (Калифорнийский университет в Беркли) за предоставление нам вируса AAV1-Best1-GFP. Полученное финансирование: NIH R01 EY031748 (CBR), NIH P30 EY005722 (Университету Дьюка); Премия FFB Free Family AMD Award (CBR); неограниченный грант от Исследования по предотвращению слепоты (Глазной центр Дьюка); Программа ускорения трансляционных исследований FFB TA-GT-0424-0875-DUKE-TRAP (VA), NIH K08 EY033857 (OA); Премия врача-ученого Университета Дьюка «Сильный старт» (OA).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% хлорида натрия для инъекций, USPХоспираPAA130066
1% офтальмологический раствор атропина сульфата, USPАкорнНДЦ 17478-215-05
30° алмазный ножКатенаК2-6560
AmScope 6 Вт светодиодный двойной осветитель на гусиной шееАмСкопСВЕТОДИОД-11КР
Угловые ножницы VannasРобозРС-5618
BSS Стерильный раствор для орошенияАлкон289010-0902
Цикломидрил расширяющие глазные каплиАлкон0065-0359-020,2% циклопентолят, 1% фенилэфрин
Наконечники для дозатора epT.I.P.S. MicroloaderTMЭппендорф5242 956.003
Микроинъектор FemtoJet 4iЭппендорфE5252000021Снятый с прoизъединения продукт
GenTeal Tears смазочная мазь для глазАлкон16027802
Стеклянные иглы для микроинъекцийКланбери СайентификВ100-58-5030° скашивать. Диаметр: 50 & микро; м внешний, 29 и микро; м внутренний
Раствор изофлуранаКоветрус29405
МИКРОСКОП MICRON IV для визуализации сетчатки с ОКТ под визуальным контролемФениксН/Д
Стереомикроскоп SteREO Discovery.V8Цейсс495015-0001-000
Стопорные зубчатые щипцы Stern-CastroviejoКатенаК5-2552
Зубчатые щипцыРобозРС-5172
Проволока для чистки вольфрама для игл калибра 23sГамильтон18306
Ultracell PVA Глазные копьяМедицинское учреждение на Британских Виргинских островах40400-8
Инсулиновые шприцы Ultra-Fine2015 БД3284383/10 мл, 8 мм (5/16"), 31G

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapani, I., Banfi, S., Simonelli, F., Surace, E. M., Auricchio, A. Gene therapy of inherited retinal degenerations: prospects and challenges. Hum Gene Ther. 26, 193-200 (2015).
  2. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

AAV

Похожие статьи