Методическая статья

Оптимизированная техника минимально инвазивной транссклеральной субретинальной инъекции мышам

DOI:

10.3791/68631

⸱

25 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Duke University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Субретинальные инъекции являются незаменимой методикой для доклинической разработки терапевтических средств при заболеваниях фоторецепторов и РПЭ. Мы описываем оптимизированную технику транссклеральной субретинальной инъекции у мышей, которая улучшает показатели интраоперационного успеха и минимизирует повреждение сетчатки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционный метод доставки материала в субретинальное пространство у мыши включает двойную перфорацию нервной сетчатки, что приводит к обширному хирургическому повреждению. Это приводит к вариабельности последующих показателей исхода зрительной функции, таких как запись электроретинограммы (ЭРГ) или поведенческие анализы зрения, которые искажают оценки эффективности экспериментальных методов лечения. Чтобы преодолеть эти барьеры, мы оптимизировали транссклеральную минимально инвазивную технику субретинальной инъекции у мышей. В этой технике доступ к верхнему своду осуществляется с помощью изготовленного на заказ зеркала век из вольфрамовой проволоки для выполнения конъюнктивальной перитомии и тенотомии. Точечная склеротомия проводится с помощью алмазного ножа без проникновения в сетчатку, через который под небольшим углом осторожно вводится тонкая стеклянная игла. Полезная нагрузка доставляется в субретинальное пространство с помощью микроинъекционного насоса. Оптическая когерентная томография (ОКТ) используется для оценки размера и положения субретинального пузыря сразу после инъекции. Мы сравнили результаты этой методики с традиционным трансретинальным методом, выполненным с использованием пружинного шприца с игольчатой склеротомией 33G. Записи ERG показали превосходное сохранение функции сетчатки у транссклерально инъекционных мышей, сравнимое с таковой у неинъекционных контрольных мышей. Напротив, заметное снижение сигнала ЭРГ наблюдалось в когортах, получавших традиционную инъекцию. Таким образом, мы оптимизировали минимально инвазивную технику субретинальной инъекции мышам. Мы демонстрируем, что этот метод является надежным и эффективным методом введения генной терапии, который сводит к минимуму анатомические повреждения сетчатки и оказывает минимальное влияние на функцию сетчатки. Этот метод снижает порог для разработки методов лечения, нацеленных как на пигментный эпителий сетчатки, так и на фоторецепторы для лечения широкого спектра заболеваний сетчатки и макулы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Субретинальная инъекция — это офтальмологическая хирургическая процедура, при которой материал доставляется в потенциальное пространство между сетчаткой и пигментным эпителием сетчатки (РПЭ). По сравнению с другими методами доставки лекарств в задний сегмент, такими как интравитреальные или супрахориоидальные инъекции, субретинальные инъекции обеспечивают наиболее непосредственный доступ как к фоторецепторам, так и к РПЭ. Для доставки вирусных генотерапевтических частиц субретинальная инъекция обеспечивает гораздо более высокую скорость трансдукции фоторецепторов и РПЭ, что позволяет снизить титры вируса и снизить риск вируснойтоксичности. Кроме того, субретинальное пространство анатомически ограничено, что ограничивает системное распространение вирусных частиц и снижает риск иммунных реакций2. У человека профиль безопасности субретинальных инъекций очень благоприятный, при этом структура и функция сетчатки восстанавливаются до исходного уровня в течение 1 месяца после инъекции 3,4. Субретинальные инъекции используются в ряде применений, таких как трансплантация стволовых клеток и доставка низкомолекулярных лекарств2, причем наиболее распространенным их применением является доставка вирусных векторов для генотерапевтического лечения заболеваний сетчатки. Относительно низкие титры вируса, минимальное системное воздействие, а также высокая скорость и специфичность трансдукции, связанные с субретинальными инъекциями, сделали их незаменимым методом в области сетчатки. Субретинальные инъекции успешно применяются у пациентов для лечения наследственных заболеваний сетчатки, включая пигментный ретинит и врожденный амавроз Лебера 5,6.

Учитывая важность для этой области, возможность выполнения субретинальных инъекций у мышей имеет решающее значение для доклинических исследований, изучающих методы лечения наследственных заболеваний сетчатки. Тем не менее, современные методы субретинальных инъекций у мышей имеют высокую частоту неудач и часто вызывают хирургическое повреждение сетчатки, что может ограничить надежность и согласованность показателей функциональных исходов. Условно субретинальные инъекции у грызунов выполняются трансретинально, таким образом, что игла проникает в переднюю сетчатку, проходит мимо хрусталика и в результате повторного проникновения в сетчаткупопадает в субретинальное пространство 7,8 (рисунок 1А). Несмотря на то, что эта процедура относительно проста в выполнении, она вносит заметную непоследовательность в экспериментальные результаты из-за различной степени хирургического повреждения. Это особенно ограничивает исследования с использованием поведенческих и функциональных показателей оценки результатов зрения. Кроме того, хрусталик непропорционально велик у мышей по сравнению с человеком; Это значительно увеличивает риск повреждения хрусталика во время трансретинальной инъекции, что делает животное непригодным для оценки функционального зрения4.

Альтернативным вариантом является транссклеральный путь инъекции, который позволяет избежать этих проблем за счет доступа к субретинальному пространству с использованием заднего доступа, где игла проникает в склеру, сосудистую оболочку, мембрану Бруха и RPE 4,9 (рис. 1B). Такой подход сводит к минимуму повреждение сетчатки, полностью исключая проникновение сетчатки. Это также связано с уменьшением рефлюкса вводимого материала из субретинального пространства10, что позволяет получать более стабильные результаты и получать меньшие экспериментальные когорты. Несмотря на то, что техника транссклеральной субретинальной инъекции мышам была ранее описана в литературе, ее широкое применение остается ограниченным из-за технической сложности, которая можетпрепятствовать достижению успеха. В этой статье мы описываем несколько усовершенствований процедуры транссклеральной инъекции, которые делают ее проще и быстрее, снижают экспериментальную вариабельность и улучшают показатели успешности инъекции. Эти усовершенствования включают в себя разработку зеркала для век мыши, предоперационное введение атропина, создание точечной склеротомии с использованием алмазного ножа, а также оптимизацию размера иглы и подхода к инъекции. Этот метод обеспечивает превосходное покрытие фоторецепторов и РПЭ вирусной трансдукцией, не вызывая хирургического воздействия, обнаруживаемого ЭРГ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты проводились в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Дьюка и Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения.

1. Подготовка животных

  1. Введите внутрибрюшинную инъекцию 1 мг/кг атропина (в общем объеме 50 мкл) за 30 минут до выполнения субретинальной инъекции. Этот шаг значительно повышает шансы на успех, предотвращая потенциально летальные глазокардиальные и глазореспираторные рефлексы, вызванные преходящим повышением внутриглазного давления во время инъекции11,12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наша дозировка атропина оптимизирована для мышей C57BL/6 и, возможно, потребуется корректировка для других линий мышей. Мы не наблюдали каких-либо заметных половых или возрастных различий в дозировке атропина.
  2. Во время всей процедуры держите мышь на теплой поверхности, чтобы обеспечить максимальный комфорт животного и уменьшить развитие холодовой катаракты.
  3. Обезболивайте мышей с помощью 2% ингаляционного изофлурана в кислороде (2 л/мин) до тех пор, пока не будет наблюдаться положение лежа и животное больше не будет реагировать на защемление пальцев ног. Нанесите каплю 0,5% пропаракаина на глаз для местной анестезии.
  4. Нанесите каплю смеси 0,2% циклопентолата и 1% фенилэфрина на глаз для расширения зрачка для послеоперационной визуализации субретинального пузыря методом ОКТ. Фенилэфрин также служит для уменьшения интраоперационного кровотечения за счет сужения поверхностных кровеносных сосудов13.

2. Склеротомия

  1. Перед началом процедуры загрузите стеклянную микроиглу с нужным объемом раствора, который будет введен для инъекции. Присоедините иглу к микроинъектору с компенсационным давлением, установленным на уровне 5 гектопаскалей (гПа), чтобы противодействовать капиллярному действию. Обычно мы используем объем 1 мкл для субретинальных инъекций.
  2. Поместите мышь под препарирующий стереомикроскоп. Используйте 20-кратное увеличение для шагов 2.3-2.6 и 50-кратное увеличение для шагов 2.7-3.5.
  3. Для молодых мышей выполните латеральную кантотомию перед процедурой, чтобы обеспечить достаточный доступ и визуализацию места операции.
  4. Обнажите верхний свод с помощью изготовленного на заказ миниатюрного проволочного зеркала (рисунок 1В). Иммобилизуйте зеркало, чтобы обеспечить втягивание верхнего века без помощи рук.
  5. Используя наклонные ножницы Ваннаса, выполните паралимбальный разрез (~1 мм позади лимба) в верхней конъюнктиве и капсуле Тенона, чтобы обнажить верхнюю 3-4 часовых часа склеры. Следите за тем, чтобы не допустить прокола ретроорбитального венозного синуса. Осторожно, но тщательно удалите остатки капсулы Тенона, расположенные над предполагаемым местом инъекции.
  6. Захватите передний край конъюнктивальной перитомии и тенотомии с помощью фиксирующих зубчатых щипцов и осторожно проведите глобу, чтобы обнажить верхнюю склеру. Иммобилизуйте заблокированные щипцы, чтобы можно было провести операцию без помощи рук.
  7. Немедленно нанесите каплю сбалансированного буферного физиологического раствора (BSS) на глаза, чтобы предотвратить высыхание голой склеры. Мы также считаем полезным оптическое увеличение, создаваемое каплей BSS.
  8. С помощью алмазного ножа сделайте точечную склеротомию на отметке ~12 часов и на расстоянии ~1-2 мм от лимба. Расположите лезвие в тангенциальной плоскости по отношению к склере, чтобы склеротомия была как можно меньше и неглубока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается по двум причинам: (1) небольшая склеротомия позволяет плотно прилегать к стеклянной игле, тем самым уменьшая рефлюкс на этапе инъекции, и (2) неглубокая склеротомия имеет решающее значение для предотвращения проникновения в сетчатку. Обратите внимание, что в месте склеротомии может появиться небольшое количество крови хориоидеи, что не влечет за собой каких-либо негативных последствий для исхода процедуры.

3. Транссклеральная субретинальная инъекция

  1. При подготовке к инъекции используйте хирургическую губку, чтобы аккуратно удалить всю BSS с поверхности глаза.
  2. Держите иглу скосом вниз под небольшим углом к склере и медленно и осторожно введите кончик в склеротомию, чтобы получить доступ к субретинальному пространству. Чтобы избежать проникновения в сетчатку, делайте это под относительно небольшим углом и достаточно глубоко, чтобы очистить склеротомическое отверстие на 0,5-1 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скос иглы расположен вниз, чтобы свести к минимуму возможность родов хориоидеи и снизить вероятность прокола сетчатки с продвигающимся кончиком иглы.
  3. Удерживая иглу в неподвижном положении, начните инъекцию с усилием 500 гПа с помощью ножной педали и сохраняйте непрерывное давление в течение 15 с.
  4. Чтобы закончить инъекцию, поддерживайте давление инъекции до тех пор, пока игла полностью не будет удалена из склеротомии. Если давление преждевременно прекращается, когда игла все еще находится в субретинальном пространстве, большая часть введенной полезной нагрузки может быстро выйти из глаза обратно в иглу за счет капиллярного действия.
  5. После извлечения иглы обратите внимание на частичный рефлюкс введенного раствора через место склеротомии. Это ожидаемо, учитывая, что объем 1 мкл превышает емкость субретинального пространства даже у взрослых мышей. Отсутствие рефлюкса может свидетельствовать об неудачной инъекции из-за непреднамеренной хориоидеи или интравитреального рода.
  6. Снимите с глаза фиксирующие щипцы и зеркало века. Будьте осторожны, чтобы не оказывать давление на шар, так как это может вызвать дальнейший рефлюкс введенного раствора.
  7. Сразу после инъекции нанесите на глаз достаточное количество глазной мази-смазки, чтобы обеспечить визуализацию субретинального пузыря к14 октября.
  8. Нанесите местное применение эритромициновой мази на глаз и обеспечьте общий послеоперационный уход за животным.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При успешной инъекции с использованием этой транссклеральной техники образуется субретинальный пузырь, наблюдаемый на ОКТ сразу после процедуры инъекции (рис. 2A). Учитывая техническую сложность этого метода, этап визуализации незаменим для идентификации успешно введенных животных. Исследователям, которые планируют использовать эту методику для экспериментов по генной терапии, мы рекомендуем проводить практические инъекции частиц аденоассоциированного вируса (AAV), несущих флуоресцентный реп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанная здесь методика вносит несколько усовершенствований в ранее описанный подход к транссклеральной инъекции4, которые повышают надежность процедуры и еще больше уменьшают хирургическое повреждение глаза. Одним из таких улучшений является использование зеркала для втягивания верхнего века, что обеспечивает стабильный, беспрепятственный и свободный доступ к глазу. Коммерческие зеркала часто плохо оптимизированы, даже для взрослых мышей, и совершенно недоступны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Джона Фланнери (Калифорнийский университет в Беркли) за предоставление нам вируса AAV1-Best1-GFP. Полученное финансирование: NIH R01 EY031748 (CBR), NIH P30 EY005722 (Университету Дьюка); Премия FFB Free Family AMD Award (CBR); неограниченный грант от Исследования по предотвращению слепоты (Глазной центр Дьюка); Программа ускорения трансляционных исследований FFB TA-GT-0424-0875-DUKE-TRAP (VA), NIH K08 EY033857 (OA); Премия врача-ученого Университета Дьюка «Сильный старт» (OA).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% хлорида натрия для инъекций, USPХоспираPAA130066
1% офтальмологический раствор атропина сульфата, USPАкорнНДЦ 17478-215-05
30° алмазный ножКатенаК2-6560
AmScope 6 Вт светодиодный двойной осветитель на гусиной шееАмСкопСВЕТОДИОД-11КР
Угловые ножницы VannasРобозРС-5618
BSS Стерильный раствор для орошенияАлкон289010-0902
Цикломидрил расширяющие глазные каплиАлкон0065-0359-020,2% циклопентолят, 1% фенилэфрин
Наконечники для дозатора epT.I.P.S. MicroloaderTMЭппендорф5242 956.003
Микроинъектор FemtoJet 4iЭппендорфE5252000021Снятый с прoизъединения продукт
GenTeal Tears смазочная мазь для глазАлкон16027802
Стеклянные иглы для микроинъекцийКланбери СайентификВ100-58-5030° скашивать. Диаметр: 50 & микро; м внешний, 29 и микро; м внутренний
Раствор изофлуранаКоветрус29405
МИКРОСКОП MICRON IV для визуализации сетчатки с ОКТ под визуальным контролемФениксН/Д
Стереомикроскоп SteREO Discovery.V8Цейсс495015-0001-000
Стопорные зубчатые щипцы Stern-CastroviejoКатенаК5-2552
Зубчатые щипцыРобозРС-5172
Проволока для чистки вольфрама для игл калибра 23sГамильтон18306
Ultracell PVA Глазные копьяМедицинское учреждение на Британских Виргинских островах40400-8
Инсулиновые шприцы Ultra-Fine2015 БД3284383/10 мл, 8 мм (5/16"), 31G

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapani, I., Banfi, S., Simonelli, F., Surace, E. M., Auricchio, A. Gene therapy of inherited retinal degenerations: prospects and challenges. Hum Gene Ther. 26, 193-200 (2015).
  2. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Res. 58, 217-226 (2017).
  3. Simunovic, M. P., Xue, K., Jolly, J. K., MacLaren, R. E. Structural and Functional Recovery Following Limited Iatrogenic Macular Detachment for Retinal Gene Therapy. JAMA Ophthalmol. 135, 234-241 (2017).
  4. Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. J Vis Exp. (118), e54808(2016).
  5. Testa, F., et al. Three-year follow-up after unilateral subretinal delivery of adeno-associated virus in patients with Leber congenital Amaurosis type 2. Ophthalmology. 120, 1283-1291 (2013).
  6. Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Hum Genet. 135, 327-343 (2016).
  7. Bennett, J., Anand, V., Acland, G. M., Maguire, A. M. Cross-species comparison of in vivo reporter gene expression after recombinant adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Methods Enzymol. 316, 777-789 (2000).
  8. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
  9. Hejri, A., et al. A non-surgical method for subretinal delivery by trans-scleral microneedle injection. Bioeng Transl Med. 10 (3), e10755(2025).
  10. Sastry, A., et al. Microscope-Integrated OCT-Guided Volumetric Measurements of Subretinal Blebs Created by a Suprachoroidal Approach. Transl Vis Sci Technol. 10, 24(2021).
  11. Blanc, V. F., Jacob, J. L., Milot, J., Cyrenne, L. The oculorespiratory reflex revisited. Can J Anaesth. 35, 468-472 (1988).
  12. Dewar, K. M. The oculocardiac reflex. Proc R Soc Med. 69, 373-374 (1976).
  13. Katzung, B. G. Basic & clinical pharmacology. , 9th ed, Lange Medical Books/McGraw Hill. New York, USA. (2004).
  14. Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J Vis Exp. (179), e63421(2022).
  15. L'Abbate, D., Prescott, K., Geraghty, B., Kearns, V. R., Steel, D. H. W. Biomechanical considerations for optimising subretinal injections. Surv Ophthalmol. 69, 722-732 (2024).
  16. Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nat Protoc. 17, 1468-1485 (2022).
  17. Stockslager, M. A., et al. Optical method for automated measurement of glass micropipette tip geometry. Precis Eng. 46, 88-95 (2016).
  18. Li, Q., Rycaj, K., Chen, X., Tang, D. G. Cancer stem cells and cell size: A causal link. Semin Cancer Biol. 35, 191-199 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

AAV

Похожие статьи