Методическая статья

Выделение перехода митохондриального цитохрома С с помощью иммунотрансмиссионной электронной микроскопии

DOI:

10.3791/68633

⸱

15 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Department, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 3Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd, 4Department of Critical Care Medicine, Deyang Hospital Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В протоколе описаны методы изучения микроморфологических изменений в нейронах и перехода митохондриального цитохрома с методом иммунотрансмиссионной электронной микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изменения расположения белков в микроструктуре часто представляют собой точный механизм регуляции на уровне патологических органелл. То, как точно зафиксировать место переноса этого белка органеллы, имеет положительное значение и ценность для диагностики и лечения заболеваний. Митохондрии играют центральную роль в некрозе и внутреннем пути апоптоза. В нормальных условиях цитохром с (Cyt c) существует только между внутренней и внешней мембранами митохондрий и в ядре. Когда клетки подвергаются апоптозу, проницаемость внутренней мембраны митохондрий изменяется, и Cyt c высвобождается из митохондрий в цитоплазму. В данном исследовании была создана модель ишемия-реперфузионного повреждения головного мозга на крысах, а микроморфологические изменения нейронов, подвергающихся апоптозу, были показаны с помощью иммунотрансмиссионной электронной микроскопии. Кроме того, в нем более точно показано видение переноса Cyt c мечения иммунозолотом из митохондриального матрикса в цитоплазму после ишемия-реперфузионного повреждения головного мозга. Метод иммунотрансмиссионной электронной микроскопии, представленный в этом протоколе, подходит для демонстрации любых переходов положения белка на микроскопическом уровне.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Согласно исследованию «Глобальное бремя болезней» за 2021 год, инсульт был3-й по значимости причиной смерти и4-й по значимости причиной жизни с поправкой на инвалидность. Было зарегистрировано 11,9 млн новых случаев инсульта, из которых ишемический инсульт составил 65,3% (7,8 млн)1. Гибель нейронов происходит после ишемии головного мозга, включая некроз и апоптоз. Наиболее сильно пораженная ткань мозга впоследствии подвергается некротической гибели клеток. Нейроны в зоне ишемической полутени или периинфаркта могут подвергаться апоптозу через несколько часов или дней2. В дополнение к биоэнергетическим и метаболическим функциям, митохондрии также играют центральную роль во внутреннем пути апоптоза 3,4,5,6.

Cyt C — белок, кодируемый ядерными генами. В нормальных условиях Cyt C существует только между внутренней и внешней мембранами митохондрий и в ядре. Апоптотический путь, опосредованный его высвобождением, связан с регуляторным контролем членов семейства Bcl-2. После стимуляции апоптозом олигомеры Bax/Bak образуются и встраиваются в пору митохондриальной наружной мембраны, что приводит к изменению митохондриального осмотического давления и потере трансмембранного потенциала. Цит С высвобождается из митохондрий в цитоплазму, где он связывается с активатором апоптоза 1, образуя апоптотический комплекс и активируя про-каспазу-9. В свою очередь, активируются каспазы-3 и каспаза-7, которые инициируют каскад каспаз и индуцируют апоптозклеток7.

С помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) можно четко наблюдать изменения в структуре клеток на разных стадиях апоптоза. Морфологическое наблюдение с помощью электронной микроскопии является надежным методом определения апоптоза8. Однако он не может наблюдать изменения Cyt C в ультраструктуре. Существует несколько методов детектирования специфических белков в ультраструктуре: проточная цитометрия, иммуноферментный анализ, иммуноферментный анализ, спектрофотометрия и вестерн-блоттинг. Тем не менее, они не могут точно зафиксировать изменения расположения белка в микроструктуре. Коллоидное золото имеет частицы разного размера, а электронная плотность коллоидного золота высокая. Технология Immunogold особенно подходит для исследований локализации с одной или несколькими метками в иммуноэлектронной микроскопии. Благодаря присущей ему окраске от светлого до темно-красного цвета, коллоидное золото также поддается наблюдению при световой микроскопии. Когда специфические белки мечутся Immunogold, изменения местоположения могут быть визуализированы с помощью ПЭМ с субклеточным разрешением9.

В этом протоколе описывается выделение перехода митохондриального Cyt C с помощью иммунотрансмиссионной электронной микроскопии (ИЭМ). Общая цель этого метода заключается в визуализации субклеточной транслокации Cyt C во время ишемий-индуцированного апоптоза с помощью IEM. Обоснование ИЭМ заключается в том, чтобы пометить Cyt C коллоидным золотом и визуализировать изменения его локализации при субклеточном разрешении с помощью TEM9. ИЭМ может наблюдать динамические изменения белков на пространственном уровне, обеспечивая мощное средство для объяснения физиологической и патологическойактивности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Программа для животных была одобрена Этическим комитетом SLAS (выпуск IACUC No: SYST-2024-018). Здесь 6 безпатогенных самцов крыс SD (200-220 г) были выращены в независимых клетках с поддержанием лабораторных условий при температуре 22-25 °C и относительной влажности 45%-65%. Все крысы проходили адаптивное кормление в течение 1 недели со свободной водой и рационом в течение периода.

1. Установление модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAO)

  1. Случайным образом разделите крыс на группу MCAO и группу фиктивных операций, по три крысы в каждой группе. Экспериментальная блок-схема приведена на рисунке 1 .
  2. Проверьте оборудование, участвующее в этом протоколе, в соответствии со списком на рисунке 2.
  3. Для установления модели МКАО ишемии-реперфузионного повреждения крыс используют процедуру внутрипросветного шва.
  4. Голодайте на крысах в течение 12 часов перед операцией с доступом к воде.
  5. Обезболивайте крыс SD 2% изофлураном (см. Таблицу материалов) в воздушно-кислородной смеси со скоростью 0,6 л/мин. Подтвердите правильную анестезию путем обрезания кожи конечностей щипцами; У крыс не должно быть втягивания или рефлекса ног. Пристегните полностью бессознательных крыс к операционному столу и поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C с помощью устройства для поддержания температуры животного. Заклейте глаза пластырем во время операции, чтобы предотвратить сухость.
  6. Снимите шерсть вокруг шеи с помощью электробритвы и продезинфицируйте кожу бетадином. Хирургическими ножницами сделайте разрез шеи по средней линии 1,5 см (см. Таблицу материалов), выполните тупое рассечение мышцы и периваскулярной фасции и обнажите трахею, чтобы определить место правой общей сонной артерии (ОСА), наружной сонной артерии (ЭКА) и внутренней сонной артерии (ВСА). Хирургические инструменты должны быть стерилизованы для предотвращения инфицирования.
  7. Перевязать дистальный конец ЭХА хирургическим швом 6-0 и наложить еще один хирургический шов свободно вокруг проксимального конца ЭКА до точки бифуркации. Следите за тем, чтобы не навредить блуждающему нерву.
  8. Зафиксируйте ОСА и ВСА сосудистыми зажимами и сделайте небольшой разрез в ОСА между двумя хирургическими швами.
  9. Введите монофиламентный шов в просвет ECA вниз по направлению к CCA, затяните хирургический шов вокруг культи ECA для фиксации внутрипросветного шва и предотвращения кровотечения. Убедитесь, что монофиламентный шов соответствует весу животного, чтобы свести к минимуму повреждение и достичь целевого объема инфаркта 40% в ипсилатеральном полушарии.
  10. Разрежьте оставшуюся часть ECA, чтобы освободить пень, и расположите пень ECA ниже точки бифуркации так, чтобы он находился примерно на одной линии с ICA.
  11. Удалите микрососудистый зажим из ВСА, продолжайте продвигаться по шву до тех пор, пока не будет ощущаться слабое сопротивление, указывающее на окклюзию средней мозговой артерии; Эта длина обычно составляет около 2 см. Плотно завяжите шов вокруг мононити. Извлеките другой микрососудистый зажим из CCA.
  12. Закройте разрез хирургическим швом и поместите крысу в клетку для восстановления, ухаживайте за животным до 2 ч после ишемии.

2. Восстановление кровотока в средней мозговой артерии

  1. Перед повторной анестезией проверьте нейрооценку с помощью шкалы Longa Score, чтобы оценить успешность операции, как описано в шаге 3.
  2. Обезболите крысу, как указано выше, и снова откройте разрез. Поместите микрососудистый зажим на ОСА, оттяните окклюзионный шов на полпути от ВСА до тех пор, пока конец шва не станет виден через ВСА.
  3. Поместите еще один микрозажим на ВСА над местом расположения внутрипросветного шва, полностью удалите окклюзирующий шов и перевяжите культю ЭКА. Реперфузия в течение 24 часов.
  4. Извлеките зажимы из CCA и ICA. Закройте разрез хирургическим швом. Вводите бупренорфин (0,05 мг/кг; см. Таблицу материалов) подкожно.
  5. Посадите крысу обратно в клетку, обеспечьте водой и пюре и ухаживайте до тех пор, пока она не придет в сознание. Поддерживайте температуру тела крыс на уровне 37± 0,5 °C в течение всей экспериментальной процедуры.

3. Оценка нейроскоринга

  1. Оцените неврологический дефицит после операции и через 24 ч после реперфузии по шкале Лонга11: (0) отсутствие дефицита; (1) неполное выгибание левой (парализованной стороны) передней лапы; (2) круговое движение влево (парализованная сторона); (3) падение влево (парализованная сторона); (4) отсутствие спонтанной ходьбы и снижение сознания; (5) мертвы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Три оператора оценивались в соответствии с вышеуказанными стандартами.

4. Забор тканей мозга

  1. Соберите ткани головного мозга через 24 ч после реперфузии после того, как был диагностирован и оценен неврологический дефицит.
  2. Обезболите крысу, как описано выше. Разрежьте кожу, чтобы обнажить голову и шею, и отрежьте шейный канатик от шейного отдела позвоночника хирургическими ножницами (см. Таблицу материалов).
  3. Отделите и удалите задние мышцы шеи. Осторожно удалите череп с помощью изогнутых щипцов (см. Таблицу материалов). Обратите внимание на твердую мозговую оболочку при разделении черепа, чтобы не поцарапать ткани мозга. Полностью удалите ткани мозга.
  4. Поместите ткани мозга в фиксаторы ПЭМ и ИЭМ, предварительно охлажденные при 4 °С, и храните в холодильнике при температуре 4 °С.

5. Фиктивная операция

  1. При фиктивных операциях выполняйте все процедуры, как описано выше, за исключением того, что окклюзия не производится.

6. Подготовка ультратонких срезов и визуализация

  1. Подготовка ультратонкого среза ПЭМ
    1. Фиксация: Определите место отбора проб свежей ткани, чтобы свести к минимуму механические повреждения, такие как вытяжение, ушиб и экструзия, и убедитесь, что толщина ткани не превышает 2 мм. Убедитесь, что объем ткани не превышает 1 мм x 1 мм x 1 мм.
    2. Зафиксировать фиксатором TEM при температуре 4°C в течение 24 часов. Промыть 3 раза по 15 мин каждый в 0,1 М фосфатном буфере PB (pH 7,4; см. Таблицу материалов).
    3. После фиксации: Добавьте 1% осмиевую кислоту ·0,1 М ПБ (см. Таблицу материалов) в течение 2 ч при комнатной температуре (25 °C).
    4. Обезвоживание: Последовательно обезвоживайте ткань в 30% этаноле в течение 10 минут, 50% этаноле в течение 10 минут, 70% этаноле в течение 15 минут, 90% этаноле в течение 15 минут, абсолютном этаноле в течение 15 минут и 100% ацетоне в течение 15 минут.
    5. Погружение десен: Последовательно погружайте ткани в раствор эпоксидной смолы SPI-Pon 812: ацетон = 1:3 на 30 мин, раствор SPI-Pon 812: ацетон = 1:1 в течение 30 мин и раствор SPI-Pon 812: ацетон = 3:1 в течение 1 ч (см. Таблицу материалов).
    6. Полимеризация и встраивание: Погрузите образец в чистый SPI-Pon 812 на ночь при 37 °C, замените на свежий SPI-Pon 812 на 8 часов и полимеризуйте при 60 °C в течение 48 часов (см. Таблицу материалов).
    7. Секция: Заложенный блок полутонкими ломтиками на толщине 0,8 мкм с помощью алмазного ножа, окрашивать аминотолуоловым синим при температуре 25 °C в течение 5 минут. Находите и выделяйте области с плотно упакованными нейронами с помощью светового микроскопа для наблюдения с большим увеличением. Сделайте ультратонкие срезы микротомом на толщине 90 нм. Поместите образцы на медные сетки с формварным покрытием 200 меш (см. Таблицу материалов).
    8. Последующее окрашивание: Сетки окрашивать в уранилацетат при температуре 25 °C в течение 15 мин, затем окрашивать сетки в цитрат свинца при температуре 25 °C в течение 5 мин.
  2. Подготовка ультратонкого сечения IEM
    1. Выполните шаги 6.1.1-6.1.4.
    2. Погружение десен: Погрузите ткани последовательно в раствор L. R. White Resin: Ethanol = 1: 3 в течение 2 ч, раствор L. R. White Resin: Ethanol = 1: 1 в течение 2 ч, и раствор L. R. White Resin: Ethanol = 3: 1 в течение 2 ч.
    3. Полимеризация и внедрение: Погрузите образец в чистую смолу L. R. White Resin на ночь при температуре 4 °C, замените на свежую смолу L. R. White Resin на 4 часа при 25 °C и полимеризуйте при 55 °C в течение 78 часов.
    4. Срез (как сделано на шаге 6.1.7): Нарежьте заложенные блоки полутонким слоем толщиной 0,8 мкм, окрасьте аминотолуоловым синим при температуре 25 °C в течение 5 мин. Найдите и выберите участки с плотно упакованными нейронами с помощью светового микроскопа. Делайте ультратонкие срезы толщиной 90 нм. Поместите образцы на медные сетки.

7. Маркировка Immunogold

  1. Промойте 2 раза PBS и 1 раз глициновым буфером при 25 °C в течение 5 минут каждый, затем добавьте 2% фосфатный буфер бычьего сывороточного альбумина (PBS-BSA) и инкубируйте в течение 30 минут.
  2. Инкубировать в растворе первичного антитела (поликлонального антитела кролика к цитохрому С) при 37 °С в течение 2 ч. Первичное антитело разводят PBS-BSA в соотношении 1:50.
  3. Смойте PBS при 25 °C в течение 5 раз по 5 минут каждый. Инкубировать в растворе коллоидного вторичного антитела, меченного золотом (Gold-conjugated Goat anti-rabbit IgG) при 25 °C в течение 1 ч. Вторичное антитело разводят PBS-BSA в соотношении 1:20 (см. Таблицу материалов).
  4. Смойте PBS при 25 °C в течение 5 раз по 5 минут каждый. Промойте дистиллированной водой при температуре 25 °C в течение 5 раз по 5 минут (см. Таблицу материалов).
  5. Последующее окрашивание: Окрашивать сетки в уранилацетат при температуре 25 °С в течение 10 мин, затем окрашивать сетки в цитрат свинца при температуре 25 °С в течение 2 мин (см. Таблицу материалов).
  6. Визуализируйте ультратонкий срез и сделайте фотографии на просвечивающем электронном микроскопе при напряжении 80 кВ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка нейрооценки подтверждает успешность MCAO, согласно шкале Longa Score Scale, крысы в группе MCAO были представлены по крайней мере кружащимися влево (нейрооценка 2). У крыс из группы фиктивной операции явной неврологической дисфункции не наблюдалось (нейрооценка 0). Смертельного исхода в течение операционного дня не наблюдалось. Нейрооценка животных приведена в таблице 1.

Анализ ИЭМ группы MCAO выявил нейроны с усохшими ядрами и повышенной цитоплазматической электронной ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основной целью реперфузионной терапии при остром ишемическом инсульте является восстановление перфузии крови в ишемизированной области. Теперь мы можем достичь этой цели с помощью внутривенного тромболизиса, эндоваскулярного лечения и антитромботической терапии. Однако восстановление перфузии крови приводит к ишемско-реперфузионному повреждению, усугубляет некроз нейронов и апоптоз, приводит к неврологическим нарушениям. Во время ишемии-реперфузии аномальная утечка электронов из митохонд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Специальным научно-исследовательским проектом по традиционной китайской медицине Управления традиционной китайской медицины провинции Сычуань (2021MS414).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% нормального физиологического раствораSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.
200 меш медные сетки с формварным покрытиемZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.BZ10262a
220-230г Мононити MCAOCinontech Co., Ltd.A4-243250
Абсолютный этанолChengdu  Келонг  Химическая промышленность
ацетонChengdu  Келонг  Химическая промышленность
Система анестезии для животныхRayward Life Technology Co., Ltd.R500
Устройство для поддержания температуры животныхRayward Life Technology Co., Ltd.69020
Стол для выпечкиShenzhen Bangqi Chuangyuan Technology Co., Ltd.CT-946
Ножницы для костиFine Science Tools16102-11
капсульные формы для встраиванияZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GP130-B
ЦентрифугаSCILOGEXD3024R
Обычная светлопольная оптическая микроскопияZeiss (Германия)Изогнутые
(10 см)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Алмазный ножDiatome (Швейцария)DU4530
Щипцы для рассеченияRayward Life Technology Co., Ltd.F12018-10
Щипцы для рассеченияRayward Life Technology Co., Ltd.F12010-10
Электрическая печь шоковой сушкиShanghai YiHENG Scientific Instrument Co., Ltd.DHG-9030A
ЭлектробритваYiwu Kemei Electric Appliances Co., Ltd.KM-PG5002
Фиксирующая жидкостьSichuan Scientist Biotechnology CO., Ltd.SC0001
стеклянная горкаNantong Mevid Life Science Co., Ltd.
Золотисто-конъюгированный козий антикроличий lgGSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Кровоостанавливающие щипцы (12,5 см)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL068
Гемостатические щипцы (14 см)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL002
ИзофлуранRayward Life Technology Co., Ltd.
L. R. White ResinTianjin Tainuo Science and Technology Co., Ltd.
Цитрат свинцаSPI (США)GA10701
Иглодержатель Jiachi Medical Technology Co., Ltd.
Тетраоксид осмияTED PELLA (US)4008-220501
PBSServicebioG4202
Кроличье поликлональное антитело к цитохрому c   Affinity Biosciences, Ltd.AF0146
КрысыПекин Хуафуканг Биотехнология Ко., Лтд.
Набор смолы для встраивания SPI-Pon 812SPI (US)GS02660
СтереомикроскопSunny Optical Technology Co., Ltd.Soptop SZMN
Ножницы с прямой головкой (10 см)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL063
Прямой офтальмологический щипцы (10 см)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Хирургические ножницыRayward Life Technology Co., Ltd.S14001-10
Просвечивающая электронная микроскопияHitachi (Япония), Ltd.HT7800
ультрамикротомLeica (Германия)UC7
Ацетат уранаSPI (СШАGS02624
H20083400 Beijing 20231012012023120501 офтальмические щипцы Primo Star 211001220518001D1110942024071201AGR1281A10044036898028110322241102187881211001

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2021 Nervous System Disorders Collaborators. Global, regional, and national burden of disorders affecting the nervous system, 1990-2021: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet Neurol. 23 (4), 344-381 (2024).
  2. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (3), 231-341 (2008).
  3. Li, G. R., et al. Albiflorin: a promising natural monoterpene glycoside with potential therapeutic benefits for multiple physiological systems. Food Med Homol. , (2025).
  4. Ye, X. S., et al. The food and medicine homologous Chinese Medicine from Leguminosae species: A comprehensive review on bioactive constituents with neuroprotective effects on nervous system. Food Med Homol. 2 (2), 9420033(2025).
  5. Mubeen, M., Sakarwala, A. S., Bijarani, A. I., Kamal, M. T. Enhancing heart health: expanding the use of SGLT2 inhibitors in cardiovascular disease. Med Adv. 3 (2), 122-126 (2025).
  6. Zhang, Y. C., et al. Comprehensive analyses of nuclear mitochondria-related genes in the molecular features, immune infiltration, and drug sensitivity of clear cell renal cell carcinoma. Med Adv. 2 (3), 238-253 (2024).
  7. Broughton, B. R., Reutens, D. C., Sobey, C. G. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia. Stroke. 40 (5), e331-e339 (2009).
  8. Guo, M. J., Lu, B., Gan, J. L., Wang, S. C., Jiang, X. J., Li, H. H. Apoptosis detection: a purpose-dependent approach selection. Cell cycle. 20 (11), 1033-1040 (2021).
  9. Squarzoni, S. Immunoelectron Microscopy Methods. Methods Mol Biol. 2655, 201-210 (2023).
  10. Liu, Y., Ohgaki, R., Okanishi, H., Xu, M., Kanai, Y. Amino acid transporter LAT1 is expressed on cancer cell-derived exosomes with potential as a diagnostic and prognostic biomarker. Sci Rep. 14 (1), 28458(2024).
  11. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  12. Sanderson, T. H., Reynolds, C. A., Kumar, R., Przyklenk, K., Hüttemann, M. Molecular mechanisms of ischemia-reperfusion injury in brain: pivotal role of the mitochondrial membrane potential in reactive oxygen species generation. Mol Neurobiol. 47 (1), 9-23 (2013).
  13. Lesnefsky, E. J., Chen, Q., Tandler, B., Hoppel, C. L. Mitochondrial Dysfunction and Myocardial Ischemia-Reperfusion: Implications for Novel Therapies. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 57, 535-565 (2017).
  14. Hetz, C., et al. channel inhibitors prevent mitochondrion-mediated apoptosis and protect neurons in a model of global brain ischemia. J Biol Chem. 280 (52), 42960-42970 (2005).
  15. Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. J Neurochem. 106 (3), 1248-1258 (2008).
  16. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labelling for scanning electron microscopy. Methods Mol Biol. 657, 297-313 (2010).
  17. Sachse, M., de Castro, I. F., Fournier, G., Naffakh, N., Risco, C. Metal-Tagging Transmission Electron Microscopy and Immunogold Labeling on Tokuyasu Cryosections to Image Influenza A Virus Ribonucleoprotein Transport and Packaging. Methods Mol Biol. 1836, 281-301 (2018).
  18. Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).
  19. Veeramachaneni, R., Gu, X., Herrera, G. A. Atypical amyloidosis: diagnostic challenges and the role of immunoelectron microscopy in diagnosis. Ultrastruct Pathol. 28 (2), 75-82 (2004).
  20. Fossmark, R., et al. Ultrastructure and chromogranin A immunogold labelling of ECL cell carcinoids. APMIS. 113 (7-8), 506-512 (2005).
  21. Page, L. J., et al. Secretion of amyloidogenic gelsolin progressively compromises protein homeostasis leading to the intracellular aggregation of proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (27), 11125-11130 (2009).
  22. Vainer, B., Sørensen, S., Nielsen, O. H., Horn, T. Subcellular localization of intercellular adhesion molecule-1 in colonic mucosa in ulcerative colitis. Ultrastruct Pathol. 26 (2), 113-121 (2002).
  23. Cheng, X. T., et al. Revisiting LAMP1 as a marker for degradative autophagy-lysosomal organelles in the nervous system. Autophagy. 14 (8), 1472-1474 (2018).
  24. Karreman, M. A., van Donselaar, E. G., Gerritsen, H. C., Verrips, C. T., Verkleij, A. J. VIS2FIX: a high-speed fixation method for immuno-electron microscopy. Traffic. 12 (7), 806-814 (2011).
  25. Wang, X. B., et al. Mechanistic Insights into salidroside's mitochondrial protection via AMPK/Sirt1/HIF-1α pathway in hypoxic HT22 Cells. J Vis Exp. (218), e66923(2025).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи