Method Article

Одновременная безметочная автофлуоресцентная мультигармоническая микроскопия

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе представлено пошаговое руководство по методу одновременной безметочной автофлуоресцентной мультигармоники (SLAM) микроскопического метода, включая подробную информацию о том, как генерировать лазерный источник света, готовить образец ткани, проводить визуализацию и анализировать данные. SLAM развивает нелинейную микроскопию, измеряя четыре дополнительных безмаркерных контраста для исследования микроокружения тканей.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нелинейная оптическая микроскопия позволяет получать изображения биологических образцов путем детектирования сигналов от нелинейного взаимодействия ультракоротких лазерных импульсов с эндогенными молекулами. Этот метод позволяет проводить быструю химическую и структурную идентификацию с субклеточным разрешением без меток или меток и неразрушающим способом, тем самым обеспечивая эффективный подход к исследованию клеток и тканей. Эти характерные нелинейные контрасты включают в себя автофлуоресценцию с многофотонным возбуждением и генерацию гармоник. Поскольку каждый из этих контрастов обладает уникальными преимуществами и ограничениями, их комбинация и пространственно-временная совместная регистрация обеспечивают дополнительную палитру контрастов, которая расширяет аналитические возможности нелинейной оптической микроскопии. Поэтому наша группа разработала одновременную безметочную автофлуоресцентную мультигармоническую микроскопию (SLAM) — метод визуализации, который измеряет четыре или более одновременно генерируемых нелинейных оптических сигнала с целью идентификации различных морфологических, метаболических и функциональных особенностей в биологических образцах. В этой статье мы представляем протокол визуализации тканей с помощью SLAM, уделяя особое внимание основным компонентам метода, включая лазерный источник, сжатие импульса и микроскоп. Кроме того, мы обсуждаем подготовку образцов и описываем конвейер обработки данных SLAM. Представленный рабочий процесс подходит для исследования метаболического состояния, расположения, клеточных реакций и состава тканей как человека, так и животных без опоры на экзогенные метки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нелинейная оптическая микроскопия использует реакцию образца на интенсивное оптическое излучение (свет с электрическими полями более 3 × 103 В/см) для получения контраста изображения, где индуцированная поляризация (и, следовательно, генерируемый сигнал) нелинейно зависит от интенсивности падения 1,2,3. Поскольку каждый из этих множественных контрастов опосредован различными взаимодействиями света и вещества, нелинейная микроскопия обеспечивает одновременный доступ к уникальной информации, касающейся как морфологии, так и химического ландшафта образца 1,2,3. В то время как традиционные методы микроскопии, включающие линейное взаимодействие с освещающим светом, также позволяют получать количественные изображения, нелинейная микроскопия позволяет использовать более мультимодальный подход, часто имея улучшенную глубину изображения и оптический срез, а также нанося меньший фотоущербобразцу. В контексте биомедицинских приложений, таких как интраоперационная гистологическая оценка тканей 5,6, этот метод позволяет проводить прямое зондирование нативных биомолекул, облегчая бесшовные исследования живых клеток без необходимости использования внешних маркеров или модификаций. Этот подход позволяет избежать использования меток, меток7, экзогенных молекул, генетически экспрессированных флуоресцентных белков или наночастиц, которые не только требуют значительных трудозатрат, но и могут нарушить естественную биохимию образца и негативно повлиять на клетки-мишени или ткани 8,9,10. Таким образом, нелинейный микроскоп служит мощным и подлинным аналитическим инструментом, который обеспечивает непрерывное изображение микроскопических структур без изменения химической и структурной целостности образца. Эта возможность открывает широкий спектр применений, начиная от диагностики и разработки лекарств до клеточной сигнализации и системной биологии.

Многофотонные контрасты, такие как двухфотонная автофлуоресценция (2PAF), трехфотонная автофлуоресценция (3PAF), генерация второй гармоники (SHG) и генерация третьей гармоники (THG), дают аналитические преимущества при определении характеристик образцов. 2PAF образуется эндогенными флавинами, причем флавин аденозиндинуклеотид (FAD) является наиболее распространенным в биологических системах11. 3PAF использует возбуждение в ближнем инфракрасном диапазоне для визуализации внутренних хромофоров, таких как NAD(P)H, и позволяет получать метаболическую визуализацию, обходя проблемы фототоксичности и затухания, связанные с ультрафиолетовым излучением12. ГВГ, в частности, выявляет нецентросимметричные молекулярные структуры, такие как фибриллярный коллаген (типы I, II и III) и белковые массивы 13,14,15,16,17, обеспечивая структурное понимание 1. Наконец, THG, чувствительный к границам раздела и малым структурным особенностям, превосходен в визуализации распределения липидов и внеклеточных везикул 18,19,20,21,22.

Каждый из этих контрастных сигналов был независимо исследован исследовательскими группами, создав нишу для многофотонной нелинейной микроскопии как надежного и универсального инструмента для биологических приложений 23,24,25,26. Эти усилия были инициированы изобретателями микроскопа 2PAF, которые использовали свою инновационную технологию для получения нового представления о морфологии тканей, клеточном метаболизме и даже морфофункциональных особенностях таких патологий, как болезнь Альцгеймераи рак. Их работа в конечном итоге привела к революционным приложениям в нейронауке27,28. В последующие годы несколько исследователей обратили внимание на чувствительность ГСП к изменениям во внеклеточном матриксе, каркасе, который обеспечивает структурную поддержку клеток и который претерпевает существенные изменения во время патогенезарака. В частности, Campagnola et al.14,24,30,31 продемонстрировали, что микроскопия ГВГ позволяет визуализировать макромолекулярные и супрамолекулярные сборки, выявляя такие детали, как расположение, концентрация и тип коллагена, которые не могут быть обнаружены с помощью обычных методов, основанных на флуоресценции. Эти результаты подчеркнули потенциал микроскопии ГВГ в качестве жизнеспособного инструмента диагностики в клинических условиях. Наконец, микроскопия THG была успешно применена для визуализации слоев сетчатки у грызунов с субклеточным разрешением25, картирования структур мозга32 и захвата многосторонней топографии инвазии клеток меланомы33.

Эти исторические реализации нелинейной микроскопии обычно включали в себя фемтосекундный лазер с синхронизацией мод (fs), соединенный с объективом с высокой числовой апертурой (NA) для генерации и сбора нелинейных сигналов, которые затем направлялись с помощью дихроичного зеркала на полосовой фильтр и собирались с помощью фотоумножителя (ФЭУ)34. Несмотря на схожие реализации, большинство приложений было сосредоточено на получении только одного или, самое большее, двух контрастов, игнорируя при этом остальные. Чтобы в полной мере реализовать потенциал многофотонного микроскопа, Боппарт и др. сначала реализовали последовательный сбор множественных нелинейных контрастов 21,35,36,37 с последующим их одновременным детектированием 4,22,38,39,40,41 . Полученный метод, известный как одновременная безметочная автофлуоресцентная мультигармоническая микроскопия (SLAM), пространственно и временно совмещает нелинейные сигналы 2PAF, 3PAF, SHG и THG с помощью одномоментного возбуждения и мультиплексного детектирования, тем самым достигая превосходной аналитической мощности. Пространственно-временная колокализация этих четырех каналов обеспечивает высокоранжированные и богатые функциямиданные42, предлагая преимущества по сравнению с последовательно полученными данными, устраняя артефакты движения и обеспечивая улучшенную регистрацию изображений. Следовательно, SLAM позволяет создавать композитные характеристики, такие как оптические коэффициенты восстановления-окисления, которые эффективно характеризуют метаболические свойства 43,44,45. Кроме того, комбинированный анализ сигналов по модальностям облегчает разработку дополнительных функций на основе корреляции и колокализации каналов. Например, Shi et al. продемонстрировали важность особенностей колокализации микроскопии SLAM для точной классификации клеток яичников китайского хомяка (CHO), используемых в фармацевтическом производстве42. Таким образом, SLAM закладывает основу для того, что в настоящее время считается самым современным в многофотонной микроскопии, прокладывая путь к будущим достижениямв этой области.

В этом протоколе мы описываем ключевые компоненты микроскопа SLAM (рисунок 1) и описываем пошаговую методологию его реализации. Это включает в себя генерацию и формирование импульсов возбуждения, подготовку репрезентативного образца ткани, процедуры визуализации и обработки, а также отображение полученных данных. Благодаря использованию готовых технологий и проверенных методов, этот протокол является универсальным, переносимым и может быть легко воспроизведен с использованием аналогичных оптических систем в различных лабораториях.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Оптическая конструкция одновременного безметочного автофлуоресцентного мультигармонического микроскопа (SLAM). Фемтосекундный лазер излучает свет с длиной волны 1040 нм в импульсах с длительностью 370 фс с частотой следования 10 МГц. Интенсивность и поляризация лазера тщательно контролируются перед накачкой фотонного кристалла для создания суперконтинуума. Затем импульсы сжимаются формирователем импульсов и направляются в специализированный лазерный сканирующий микроскоп (пунктирная коробка). Дихроичные зеркала и полосовые фильтры изолируют нелинейные сигналы, генерируемые образцом, прежде чем они будут обнаружены высокочувствительными фотонными детекторами, такими как фотоумножители (ФЭУ) или гибридные фотодетекторы (УВД). Оптическая схема основана на ранее описанной системе41. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все исследования на животных проводились в соответствии с протоколом UIUC#23031, утвержденным Комитетом по уходу и использованию животных Университета штата Иллинойс, и в строгом соответствии со всеми соответствующими рекомендациями и правилами.

1. Расщепление и выравнивание фотонного кристаллического волокна (PCF)

  1. С помощью волоконных резаков или кусачек отрежьте участок фотонно-кристаллического волокна (PCF, Table of Materials) длиной чуть более 15 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длина не менее 1,5 см будет откалываться от каждого конца PCF, так как эта длина требуется для надежного зажима PCF во время расщепления. Окончательная длина PCF (12 см), использованная в данном исследовании, была определена на основе предыдущего моделирования с использованием обобщенного нелинейного уравнения Шредингера47 и эмпирического тестирования. В целом, оптимальная длина PCF может варьироваться в зависимости от типа PCF, входного лазера накачки и желаемого суперконтинуума.
    ВНИМАНИЕ: Во время резки PCF надевайте средства индивидуальной защиты (СИЗ) для защиты глаз и кожи экспериментатора. Немедленно выбросьте обрезки волокна в контейнер для утилизации острых предметов.
  2. Снимите около 3 см пластикового покрытия с каждого конца PCF с помощью устройства для удаления волокна (Таблица материалов) или лезвия бритвы, а остатки пластика очистите папиросной бумагой (Таблица материалов) и 100% метанолом.
  3. Поместите один конец PCF в держатель на прецизионном скалывателе оптического волокна (Таблица материалов) и выровняйте лезвие на расстоянии 1,5 см от конца PCF. Осторожно закройте зажимы и нажмите кнопку расщепления .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно следуйте руководству пользователя скалывателя волокна, включая конкретные рекомендации по расщеплению PCF. Настройки, такие как натяжение волокна, могут потребовать тонкой настройки для обеспечения стабильного и высококачественного расщепления для каждого типа PCF.
  4. Осмотрите расколотую поверхность и боковую сторону ФХП с помощью встроенного микроскопа (увеличение 10×) на рабочей станции для обработки стекловолокна (Таблица материалов), убедившись, что расщепление имеет хорошее качество (Рисунки 2A, C). Повторное расщепление, если есть мусор (Рисунок 2D), царапины (Рисунок 2E) или поверхность расколотого материала не плоская и не перпендикулярна длине PCF (Рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом и последующих этапах следует проявлять крайнюю осторожность, чтобы не прикасаться отколовшимися концами PCF к любой поверхности во избежание повреждения.
  5. Разбейте второй конец PCF, обеспечив желаемую конечную длину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PCF, используемый в этом протоколе, обрезан до 12 см.
  6. Как и в предыдущих шагах, осмотрите только что отколовшийся конец PCF (см. шаг 1.4). Если расщепление кажется неисправным или непоследовательным, выбросьте текущий PCF и повторите процесс с новым.
  7. Зажмите входной конец PCF на 3-осевом столике (таблица материалов) примерно на фокусном расстоянии линзы волоконного соединения, измеренном с помощью линейки. Надежно закрепите другой конец PCF с помощью временного столба или крепления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пока не зажимайте выход, чтобы не сломать PCF во время грубой регулировки.
    ВНИМАНИЕ: Поддержка выходного конца и окружение его достаточным количеством блоков луча необходимы для снижения риска лазерного воздействия.
  8. Поместите измеритель оптической мощности (таблицу материалов) на пути луча непосредственно перед PCF, чтобы измерить входную мощность. Перед включением лазера убедитесь, что фемтосекундный лазер (Таблица материалов) заблокирован затвором 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда проходите все необходимые программы обучения безопасности лазеров, чтобы понимать риски, связанные с использованием лазера.
    ВНИМАНИЕ: При работе с лазером надевайте соответствующие защитные очки для лазера, специально рассчитанные на длину волны и мощность используемого лазера. Перед эксплуатацией лазера удалите все украшения, часы и другие светоотражающие предметы, которые могут вызвать опасные паразитные отражения.
  9. Включите лазер и дайте ему нагреться в течение указанного лазером «времени холодного прогрева». Откройте затвор 1 и отрегулируйте мощность с помощью полуволновой пластины (HWP1) непосредственно перед поляризационным светоделителем, пока измеритель мощности не покажет 260 мВт или меньше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 260 мВт для юстировки было эмпирически определено как достаточно низкое, чтобы избежать повреждения PCF (даже при смещении), в то же время обеспечивая яркий луч для визуализации на ИК-зрителе или флуоресцентной мишени.
  10. Заблокируйте лазер с помощью затвора 1 и переместите измеритель мощности к выходному концу PCF.
  11. Разблокируйте лазер и отрегулируйте оптическую ось входной поверхности PCF с помощью 3-осевого каскада до тех пор, пока на измерителе мощности не появится сигнал, указывающий на то, что некоторый свет связан с сердцевиной, оболочкой или пластиковым покрытием PCF. Если расположение входа PCF в фокусе луча находится за пределами диапазона 3-осевого столика, заблокируйте лазер, затем отрегулируйте и снова зажмите PCF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инфракрасный (ИК) наблюдатель или флуоресцентная мишень могут использоваться для визуализации места фокусировки луча.
  12. Используя 3-осевой столик, настройте одно измерение оптической оси PCF, чтобы найти расстояние, в котором свет связан, вычислите середину этого диапазона и переместите столик туда. Повторите это для второго размера, чтобы примерно отцентрировать балку на сердцевине PCF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Деления μm на 3-осевом столике могут помочь измерить расстояния и найти центр PCF.
  13. Итеративная регулировка трех размеров 3-осевого столика в повторяющейся последовательности при одновременной оптимизации эффективности связи для точного центрирования и фокусировки луча в ядре PCF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если максимальный КПД соединения, измеренный измерителем мощности, заметно ниже 80% от входной мощности, закройте затвор 1, разожмите PCF и осмотрите его на наличие повреждений. Если он поврежден, начните заново с шага 1.1, в противном случае заблокируйте лазер, снова зажмите PCF и начните юстировку с шага 1.11.
  14. Заблокируйте луч затвором 1 и увеличьте мощность лазера до 1,6 Вт.
    Примечание: Использование 1,6 Вт было определено с помощью моделирования и эмпирических испытаний для создания достаточно широкого суперконтинуума, оставаясь при этом ниже порога повреждения PCF.
  15. Откройте затвор 1 и еще раз итеративно отрегулируйте 3-осевой столик, чтобы отрегулировать расположение входа PCF для оптимизации эффективности связи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмпирически установлено, что максимальный КПД обычно составляет около 80%.
  16. Закройте затвор 1 и зажмите выход PCF примерно на фокусном расстоянии параболического зеркала. Поместите блок луча на выходе параболического зеркала.
  17. Снова уменьшите мощность лазера до 260 мВт или меньше.
  18. Откройте затвор 1 и используйте 3-осевой столик параболического зеркала для выравнивания оптической оси параболического зеркала, чтобы свести к минимуму искажения луча. Далее отрегулируйте фокус и коллимируйте луч в дальней зоне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ИК-просмотрщик или флуоресцентную мишень для просмотра выходного луча.
  19. Отрегулируйте зеркала после параболического зеркала, чтобы обеспечить выравнивание луча относительно остальной части оптической системы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите постоянные мишени для выравнивания по флипу или диафрагмы, чтобы сделать этот шаг воспроизводимым.
  20. Закройте затвор 1 и увеличьте мощность лазера до 1,6 Вт. Откройте затвор 1 и убедитесь, что траектория луча не изменилась.
  21. Измерьте выходную мощность импульсного формовщика (Таблица материалов) с помощью измерителя мощности. Поверните полуволновую пластину перед формирователем импульсов (HWP3) для оптимизации эффективности передачи данных формирователя импульсов.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Отщепленные концы фотонного кристаллического волокна (PCF). (А, Б) Изображения боковой стороны расщепления. (К-Ж) Изображения лица расщепления. (A) Хорошо расщепленный PCF имеет плоскую и перпендикулярную поверхность. (B) Плохо расщепленный PCF с наклонной и сколотой поверхностью. (C) Хорошо расщепленный PCF с чистой поверхностью. (D) Неправильно обработанный PCF, на поверхности которого есть грязь. (E) Плохо расщепленный PCF с царапинами на поверхности. (F) Старый PCF, который был заменен. Есть видимые повреждения в ядре PCF, что видно по темному пятну в центре PCF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

2. Определение и оптимизация импульсных характеристик

  1. С помощью спектрометра или оптического анализатора спектра (OSA, Table of Materials) измерьте лазер после параболического зеркала, чтобы проверить генерацию суперконтинуума PCF.
  2. Поверните полуволновую пластину после поляризационного светоделителя (HWP2) для оптимизации ширины суперконтинуума.
  3. Включите автокоррелятор микроскопии (Таблица материалов). С помощью программного обеспечения установите детектор на внутренний детектор и установите диапазон сканирования на 5 пс, чтобы обеспечить захват всей ширины автокорреляции импульса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для установок с большей длительностью импульса (например, из-за дисперсии в длинном PCF) диапазон сканирования должен быть соответствующим образом увеличен. Имейте в виду, что ширина импульса, измеренная автокоррелятором интенсивности, не является истинной длительностью импульса, но она все же может служить полезным ориентиром для сжатия импульса. Для точного и полного определения амплитуды и фазы импульса следует использовать методы со спектральным разрешением, такие как оптический стробирование с частотным разрешением (FROG)48 .
  4. Разблокируйте лазер и направьте автокоррелятор по лучу, выходящему из формирователя импульсов, до тех пор, пока не появится сигнал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение временных зеркал (два на входе и два на выходе автокоррелятора) позволит выровнять луч по автокоррелятору, не затрагивая остальную оптическую систему.
  5. Убедитесь, что затвор 2 закрыт, и нанесите на линзу объектива соответствующую иммерсионную среду (например, воду или масло) (Таблица материалов). Поместите внешний детектор автокоррелятора на предметный столик микроскопа (Table of Materials) и отрегулируйте предметный столик так, чтобы детектор располагался непосредственно над объективом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от обычных объективов микроскопа, рекомендуемыми объективами, используемыми для микроскопии SLAM, являются ультрафиолетовое излучение для улучшения обнаружения THG38.
  6. Включите сканирующие зеркала гальванометра (Таблица материалов), чтобы установить их напряжение в ноль. Откройте затвор и используйте ИК-просмотрщик или флуоресцентную мишень, чтобы убедиться, что луч достигает внешнего детектора.
  7. Установите детектор автокоррелятора в качестве внешнего детектора. Регулируйте положение рабочей области до тех пор, пока не появится сигнал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если детектор переполняется, уменьшите мощность с помощью фильтра нейтральной плотности.
  8. Отрегулируйте полиномиальные коэффициенты (порядки дисперсии) формирователя импульсов, чтобы итеративно минимизировать ширину импульса, измеренную автокоррелятором. Уменьшите диапазон сканирования автокоррелятора соответствующим образом по мере уменьшения длительности импульса для повышения точности и визуализации функции автокорреляции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная ширина импульса, измеренная с помощью гауссова аппроксимации, должна составлять несколько десятков фемтосекунд (fs).

3. Подготовка образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для простоты этот протокол описывает визуализацию тканей ex vivo . Тем не менее, из-за безмаркерной природы SLAM, процедуры визуализации in vivo легко адаптируются38.

  1. Усыпьте животное с помощью удушения CO2 или другого метода эвтаназии, одобренного IACUC.
  2. Извлекают представляющий интерес орган (органы) с использованием стандартной процедуры вскрытия49 в течение 10 минут после вскрытия и промывают предварительно охлажденным фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления крови.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании были собраны печень и легкие.
  3. Препарируйте орган вертикально или горизонтально с помощью лезвия, в зависимости от необходимой ориентации для анализа. Убедитесь, что рассечение выполнено с точностью, чтобы сохранить целостность структуры ткани.
  4. Поместите кусочек ткани в стерильную чашку для культуры тканей, заполненную средой для сплошных клеточных культур, не содержащей фенола, красного. Охладите салфетку при температуре 4 °C, если вы не собираете изображения сразу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовалась среда для культивирования клеток HEPES с буферной буферизацией Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 4 мМ глутамина и добавки среды для роста эндотелиальных клеток (Таблица материалов). Эту среду тщательно подбирали для поддержания физиологической жизнеспособности эпителиальных и эндотелиальных клеток, находящихся в образце почечной ткани в течение50 км визуализации.
  5. Чтобы подготовить калибровочные стандарты флуоресценции, обнулите прецизионные весы по весу антистатической весовой лодки и измерьте приблизительно 5 мг флавинадениндинуклеотиддинатриевой соли (FAD, Таблица материалов) или 5 мг восстановленной никотинамидадениндинуклеотиддинатриевой соли (NADH, Таблица материалов).
  6. Используйте одноканальную пипетку для дозирования соответствующего объема 1 М буфера HEPES в весовые лодочки, содержащие предварительно взвешенные порошки FAD или NADH, для приготовления 5 мМ исходных растворов. Проводите пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы порошок растворился.
  7. Из исходных растворов готовят 1 мМ рабочих растворов путем разведения 1:5 в буфер HEPES.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочая концентрация 1 мМ, используемая в этом исследовании, была определена эмпирически для получения высокого сигнала при избегании насыщения детектора.
  8. Храните исходные растворы FAD и NADH в микроцентрифужных пробирках при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандарты растворов могут храниться в холодильнике в течение нескольких дней, но рекомендуется готовить свежие растворы для каждого эксперимента.
  9. Непосредственно перед сбором микроскопических изображений SLAM поместите образцы тканей в чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм (Таблица материалов). В качестве альтернативы можно использовать стеклянный покровный лист. Разложите растворы FAD и NADH в идентичную посуду или покровные листы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется использовать стекло без покрытия или стекло с покрытием из поли-D-лизина из-за снижения фонового сигнала. Убедитесь, что толщина стекла соответствует используемому объективу микроскопа (в этом исследовании использован #0).

4. Настройка и эксплуатация SLAM

  1. Убедитесь, что вход лазера в PCF заблокирован затвором 1, и включите лазер. Дайте лазеру прогреться за указанное «время холодного прогрева» лазера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании для лазера используется 30 минут холодного прогрева.
  2. Убедитесь, что на пути луча нет препятствий, и поместите измеритель оптической мощности на пути луча непосредственно перед PCF. Откройте затвор 1 и измерьте входную мощность.
  3. Закройте затвор 1 и переместите измеритель мощности на выход PCF после параболического зеркала. Откройте затвор 1 и увеличьте производительность PCF с помощью входного 3-осевого столика.
  4. Дайте PCF прогреться в течение 10 минут, затем снова увеличьте выходную мощность. Запишите передачу PCF. Если трансмиссия падает ниже 50%, замените PCF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей работы микроскопа SLAM (в последующих шагах) рекомендуется измерять выходную мощность PCF каждый час, чтобы обеспечить согласованность данных.
  5. Переместите измеритель мощности за нейтральным фильтром (ND) и поверните фильтр, чтобы контролировать мощность лазера, поступающего на образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Умножьте измеренную мощность на коэффициент пропускания остальных оптических компонентов. Коэффициент пропускания измеряется путем размещения измерителя мощности после линзы объектива. Для данного исследования использовалась средняя мощность лазера 20 мВт на образце. Мощность лазера была определена опытным путем для данного образца, глубины изображения и системы микроскопа для получения высококачественных изображений без повреждения образца или нелинейности детектора. Несмотря на отсутствие определенного стандарта, типичная многофотонная визуализация без меток ограничена несколькими десятками и сотнями милливатт 7,32,33,51,52.
  6. Включаем гальванометры и выступаем на сцене. Откройте программное обеспечение для сбора данных и введите нужные параметры для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались 512 × 512 пикселей и время задержки пикселя 13,65 мс для получения изображения с полем зрения 360 × 360мкм2 . Пять кадров, снятых с частотой 0,333 Гц, были усреднены в один высококачественный кадр.
  7. Поместите образец на рабочую область, используя подходящий для объектива иммерсивный носитель, как это было сделано ранее в шаге 2.5.
  8. Выключите свет в комнате и закройте шторы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы не повредить датчики, никогда не включайте свет в комнате, когда датчики включены или жалюзи датчиков открыты.
  9. Включите на детекторе источники питания и усилители.
  10. Закройте световой короб, окружающий сцену.
  11. Используйте электронные переключатели для ручного открытия жалюзи датчика (S3, S4, S5, S6).
  12. В программном обеспечении для сбора данных микроскопом нажмите «Нажмите, чтобы начать сбор », чтобы начать сбор изображений SLAM. Отрегулируйте фокус микроскопа, вращая ручку на контроллере предметного столика микроскопа (Table of Materials) до тех пор, пока образец не попадет в фокус.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянное покровное стекло генерирует сильный сигнал THG, который можно использовать для точного определения глубины изображения с помощью положения предметного столика, отображаемого на контроллере предметного столика микроскопа. Например, все изображения стандартов раствора, сделанные в этом исследовании, были сделаны в фокальной плоскости на 20 мкм выше покровного стекла.
  13. Используйте джойстик на контроллере предметного столика микроскопа, чтобы найти нужное поле зрения в образце, затем нажмите «Стоп и сброс».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображение насыщено, вернитесь к шагу 4.5 и уменьшите энергопотребление. Если соотношение сигнал/шум на изображении ниже 10, мощность можно осторожно увеличить.
  14. На вкладке Сохранение нажмите кнопку Сохранить данные , чтобы переключить его на положение Да, а затем нажмите кнопку Нажмите, чтобы начать сбор данных. Подождите, пока сбор данных не завершится, прежде чем продолжить.
  15. Чтобы изменить образец или манипулировать им во время визуализации, закройте шторки детектора и используйте фонарик или налобный фонарь для освещения. После изменения образца вернитесь к шагу 4.10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения воспроизводимости и количественного анализа соберите SLAM-изображения стандартов решений FAD и NADH. Убедитесь, что поле зрения, размер изображения и мощность возбуждения соответствуют тому, что использовалось для биологических образцов.
  16. Чтобы завершить съемку изображения SLAM, закройте жалюзи датчика и выключите датчики перед включением освещения в комнате.
  17. Заблокируйте лазер с помощью затвора 1, затем выключите лазер.
  18. Выключите гальванометры и сцену. Закройте программное обеспечение для сбора данных микроскопом.
  19. Утилизируйте салфетку надлежащим образом и очистите рабочее место.

5. Визуализация данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий анализ изображений может выполняться в программном обеспечении для анализа изображений, таком как ImageJ53 (Table of Materials), или в языке программирования с возможностями анализа изображений, таком как Python или MATLAB. Ниже описано, как выполнить визуализацию данных с помощью ImageJ.

  1. Убедитесь, что изображения из каждого канала представлены в формате без потерь (например, TIFF или PNG).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Специализированное программное обеспечение для управления микроскопом, используемое в этом исследовании, автоматически сохраняло изображения в формате TIFF. Чтобы сохранить изображение в формате TIFF, откройте его в программе ImageJ и выберите «Файл» > «Сохранить как > Tiff».
  2. Чтобы создать стандартные изображения освещения, откройте изображения каналов FAD и NAD(P)H решений FAD и NADH соответственно в программе ImageJ. Для каждого изображения выберите «Обработка > Фильтры > размытие по Гауссу...», установите Сигма (Радиус) на 41, затем нажмите OK.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте сигма (радиус) фильтра Гаусса по мере необходимости, чтобы обеспечить достаточное сглаживание изображения.
  3. Чтобы одновременно исправить неравномерное освещение и нормализовать интенсивность флуоресценции, откройте изображения образца в каналах FAD и NAD(P)H. Для каждого изображения выберите Process > Image Calculator..., для Image1 выберите образец изображения, для Operation выберите Divide, а для Image2 выберите стандартное изображение освещения, соответствующее каналу образца изображения, затем нажмите OK.
    Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для коррекции вариабельности системы и поддержания согласованности в количественных оценках автофлуоресценции, таких как оптическое окислительно-восстановительное отношение (ЧОО).
  4. Если для создания большего поля зрения или z-стека используется несколько изображений, сшейте или объедините изображения в одно изображение или стопку изображений.
  5. Чтобы создать изображение ORR, сначала суммируйте изображения FAD и NAD(P)H. Выберите Process > Image Calculator..., для Image1 и Image2 выберите изображения каналов FAD и NAD(P)H соответственно, для параметра Операция выберите Добавить, затем нажмите OK. Чтобы вычислить изображение ORR, выберите Калькулятор обработки > изображения..., для Изображения1 выберите изображение канала FAD, для Операции выберите Разделить, а для Изображения2 выберите результат суммы FAD и NAD(P)H, затем нажмите OK.
  6. Чтобы применить цветовую карту к изображению ORR, выберите Изображение > Цвет > Редактировать LUT..., нажмите Открыть, выберите нужный файл таблицы преобразования (.lut) и нажмите OK. Выберите Изображение > Настроить > Яркость/Контрастность и отрегулируйте контрастность по своему усмотрению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать изолюминантную цветовую карту, такую как (инвертированная) цветовая карта CET-I254,55, используемая в этом исследовании. Чтобы инвертировать цветовую карту в ImageJ после ее применения к изображению, выберите «Изображение» > «Цвет» > «Инвертировать таблицы LUT».
  7. Чтобы повысить четкость особенностей на изображении ORR, масштабируйте яркость в соответствии с интенсивностью флуоресцентных каналов. Сначала выберите результат суммы FAD и NAD(P)H и выберите Process > Enhance Contrast..., убедитесь, что отмечена опция Normalize , затем нажмите OK. Выберите «Изменить» > «Копировать », чтобы скопировать этот результат в буфер обмена. Затем выберите изображение ORR и выберите «Изображение > типом > цветом RGB», затем выберите «Изображение > типом > HSB (32-разрядная версия)». Переместите ползунок в нижней части изображения до упора вправо, чтобы просмотреть канал яркости , выберите «Редактировать» > «Вставить», затем выберите «Изображение > тип > цвет RGB».
  8. Чтобы визуализировать изображение SLAM как составное, откройте четыре канала SLAM в ImageJ и выберите: Изображение > Цвет > Объединить каналы... Для C2 (зеленый) выберите изображение канала SHG, для C5 (голубой) выберите изображение канала NAD(P)H, для C6 (пурпурный) выберите изображение канала THG, а для C7 (желтый) выберите изображение канала FAD. Убедитесь, что установлен флажок Создать композит, и нажмите OK.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сложный многоканальный, мультимодальный подход микроскопа SLAM (рис. 1) может затруднить для новых пользователей устранение неполадок и понимание результатов. Во-первых, хорошо расщепленный PCF имеет чистую поверхность (рисунок 2C) с плоской поверхностью, которая перпендикулярна длине PCF (рисунок 2A). Скошенная поверхность расщепления под углом (Рисунок 2B) и наличие царапин (Рисун...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Создание подходящего суперконтинуума имеет решающее значение для успешной визуализации SLAM, но это может быть сложно из-за сложности настройки PCF. Обеспечение точного расщепления и бережного обращения с PCF имеет важное значение для поддержания чистоты поверхностей без мусора, грязи или царапин, которые могут помешать эффективному соединению, образованию суперконтинуума и даже сократить срок службы PCF. Поскольку PCF требует регулярной замены, практика расщепления волокна и точная наст...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование оборудования, используемого в этом исследовании, было частично предоставлено GSK через Центр оптической молекулярной визуализации при Институте передовой науки и технологий Бекмана. Эта работа также была частично поддержана Центром безмаркерной визуализации и многомасштабной биофотоники (CLIMB) NIH/NIBIB (P41EB031772) и Научно-техническим центром количественной клеточной биологии NSF. K.K.D.T был поддержан Исследовательской учебной программой NIEHS в области токсикологии и гигиены окружающей среды (5T32ES007326-25), A.D.C был поддержан программой постдокторантов Института передовой науки и технологий Бекмана, а A.H. был поддержан Программой обучения тканевому микроокружению NIBIB (T32EB019944). Авторы благодарят Дарольда Спиллмана за его управление лабораторными пространствами, оборудованием и технологиями, а также благодарят докторов Джанет Э. Сорреллс и Ришиашринга Р. Айера за их прошлый вклад в систему микроскопа SLAM, использованную в этом исследовании.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-осевая сценаТорЛабсМАКС316Прекращено.
Тарелка для визуализации со стеклянным дном 35 ммМатТекП35Г-0-14-КПокровное стекло #0 без покрытия.
DMEMGibco21063029Высокий уровень глюкозы, HEPES, без фенола красного.
Добавки для роста эндотелиальных клетокPromoCellС-39210Исключите сыворотку для плода телят.
Фемтосекундный лазер FemtoTrainСпектрофизика1040-5Средняя мощность: >5,0 Вт, Энергия импульса: >500 нДж, Длина волны: 1040 нм; 8 нм, Частота повторения: 10 МГц, Ширина импульса (FWHM): < 220 фс.
Фетальная бычья сывороткаЦитиваSH30071.03Характеристика HyClone.
Стриппер для удаления волокнаТорЛабсТ10С13
Флавин адениндинуклеотид динатрия соль гидратСигма-ОлдричФ6625
Зеркала гальванометраКембриджские технологии6215HПрекращено.
Рабочая станция по обработке стеклаВитранGPX3800
ИзображениеJЛаборатория Элисейри в Висконсинском университете в МэдисонеВерсия 2.16.0Распределение на Фиджи.
Папиросная бумага KimwipeKimberly-Clark Professional34120
L-глютаминЦитиваSH30034.01
Предметный столик для микроскопаПрикладное научное приборостроениеФЦП-2050
Контроллер предметного столика для микроскопаПрикладное научное приборостроениеМС-2000-500-УДСВ
Микроскопический автокорреляторAngewandte Physik und Elektronik GmbHКарпе
ОбъективОлимпXLPLN25XWMP2Погружение в воду, 25-кратное увеличение, 1,05 На.
Измеритель оптической мощностиНьюпорт919П-003-10600 - 1700 нм.
Анализатор оптического спектраТорЛабсOSA202C
Фотонное кристаллическое волокноНКТ ФотоникаЛМА-ПМ-15 НКТБольшая площадь моды, сохранение поляризации. Диаметр сердечника: 15 мкм.
Прецизионный скалыватель оптического волокнаФудзикураКТ-101
Формирователь импульсовБиофотоника Солюшнс Инк.ФемтоДжок-ДПрекращено.
β-Никотинамидадениндинуклеотид, восстановленный гидрат соли натрияСигма-Олдрич10128023001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic Press. Amsterdam. (2008).
  2. Potma, E. O. Foundations of nonlinear optical microscopy. , John Wiley and Sons. (2024).
  3. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1999).
  4. Boppart, S. A., You, S., Li, L., Chen, J., Tu, H. Simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond. APL Photonics. 4 (10), 100901(2019).
  5. Sun, Y., et al. Real-time three-dimensional histology-like imaging by label-free nonlinear optical microscopy. Quant Imaging Med Surg. 10 (11), 2177-2190 (2020).
  6. Yang, L., et al. Intraoperative label-free multimodal nonlinear optical imaging for point-of-procedure cancer diagnostics. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 27 (4), 6801412(2021).
  7. Talone, B., et al. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals features of bone composition in pathophysiological conditions. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1042680(2022).
  8. Liu, H. S., Jan, M. S., Chou, C. K., Chen, P. H., Ke, N. J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells. Biochem Biophys Res Commun. 260 (3), 712-717 (1999).
  9. Tsoi, K. M., Dai, Q., Alman, B. A., Chan, W. C. W. Are quantum dots toxic? Exploring the discrepancy between cell culture and animal studies. Acc Chem Res. 46 (3), 662-671 (2013).
  10. Alford, R., et al. Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging: Literature review. Mol Imaging. 8 (6), (2009).
  11. Macheroux, P., Kappes, B., Ealick, S. E. Flavogenomics - a genomic and structural view of flavin-dependent proteins. FEBS J. 278 (15), 2625-2634 (2011).
  12. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Top Fluoresc Spectrosc. 5, 471-540 (2002).
  13. Ranjit, S., et al. Imaging fibrosis and separating collagens using second harmonic generation and phasor approach to fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 5 (1), 13378(2015).
  14. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  15. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  16. Aghigh, A., Bancelin, S., Rivard, M., Pinsard, M., Ibrahim, H., Légaré, F. Second harmonic generation microscopy: A powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  17. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  18. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  19. Oron, D., et al. Depth-resolved structural imaging by third-harmonic generation microscopy. J Struct Biol. 147 (1), 3-11 (2004).
  20. Débarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nat Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
  21. Tu, H., et al. Stain-free histopathology by programmable supercontinuum pulses. Nat Photonics. 10 (8), 534-540 (2016).
  22. You, S., et al. Label-free visualization and characterization of extracellular vesicles in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (48), 24012-24018 (2019).
  23. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  24. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  25. Masihzadeh, O., et al. Third harmonic generation microscopy of a mouse retina. Mol Vis. 21, 538-547 (2015).
  26. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  27. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: Why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  28. Maiti, S., Shear, J. B., Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Measuring serotonin distribution in live cells with three-photon excitation. Science. 275 (5299), 530-532 (1997).
  29. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nat Commun. 11 (1), 5120(2020).
  30. Campagnola, P. J., Dong, C. Y. Second harmonic generation microscopy: Principles and applications to disease diagnosis. Laser Photonics Rev. 5 (1), 13-26 (2011).
  31. Pavone, F. S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging. , CRC Press. Boca Raton. (2016).
  32. Witte, S., et al. Label-free live brain imaging and targeted patching with third-harmonic generation microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 5970-5975 (2011).
  33. Weigelin, B., Bakker, G. J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1 (1), 32-43 (2012).
  34. Carriles, R., et al. Imaging techniques for harmonic and multiphoton absorption fluorescence microscopy. Rev Sci Instrum. 80 (8), 081101(2009).
  35. Graf, B. W., Jiang, Z., Tu, H., Boppart, S. A. Dual-spectrum laser source based on fiber continuum generation for integrated optical coherence and multiphoton microscopy. J Biomed Opt. 14 (3), 034019(2009).
  36. Graf, B. W., et al. In vivo multimodal microscopy for detecting bone-marrow-derived cell contribution to skin regeneration. J Biophotonics. 7 (1-2), 96-102 (2014).
  37. Liu, Y., Tu, H., Benalcazar, W. A., Chaney, E. J., Boppart, S. A. Multimodal nonlinear microscopy by shaping a fiber supercontinuum from 900 to 1160 nm. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 18 (3), (2012).
  38. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9 (1), 2125(2018).
  39. You, S., Chaney, E. J., Tu, H., Sun, Y., Sinha, S., Boppart, S. A. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  40. Cadena, A. D. L., Park, J., Tehrani, K. F., Renteria, C. A., Monroy, G. L., Boppart, S. A. Simultaneous label-free autofluorescence multi-harmonic microscopy driven by the supercontinuum generated from a bulk nonlinear crystal. Biomed Opt Express. 15 (2), 491-505 (2024).
  41. Lee, J. H., et al. Simultaneous label-free autofluorescence and multi-harmonic imaging reveals in vivo structural and metabolic changes in murine skin. Biomed Opt Express. 10 (10), 5431-5444 (2019).
  42. Shi, J., et al. Accelerating biopharmaceutical cell line selection with label-free multimodal nonlinear optical microscopy and machine learning. Commun Biol. 8 (1), 157(2025).
  43. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  44. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  45. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  46. Cadena, A. D. L., Renteria, C. A., Aksamitiene, E., Boppart, S. A. Label-free hyperspectral multiphoton microscopy. Opt Lett. 50 (5), 1484-1487 (2025).
  47. Agrawal, G. Nonlinear fiber optics. , 5th ed, Academic Press. 553-612 (2013).
  48. Trebino, R., et al. Measuring ultrashort laser pulses in the time-frequency domain using frequency-resolved optical gating. Rev Sci Instrum. 68 (9), 3277-3295 (1997).
  49. Stewart, K., Schroeder, V. A. Diagnostic necropsy and tissue harvest in rodents. J Vis Exp. , e10294(2020).
  50. Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney Int. 65 (6), 2223-2227 (2004).
  51. Huttunen, M. J., et al. Multiphoton microscopy of the dermoepidermal junction and automated identification of dysplastic tissues with deep learning. Biomed Opt Express. 11 (1), 186-199 (2020).
  52. Fung, A. A., et al. Label-free multimodal optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. Nat Commun. 16 (1), 4509(2025).
  53. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  54. Kovesi, P. Good colour maps: How to design them. arXiv. , (2015).
  55. Kovesi, P. ColorCET perceptually uniform colour maps. , https://colorcet.com (2025).
  56. Tian, Z., Liang, M. Renal metabolism and hypertension. Nat Commun. 12 (1), 963(2021).
  57. Wang, G., Shi, J., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Tu, H. Fiber-optic nonlinear wavelength converter for adaptive femtosecond biophotonics. arXiv. , (2024).
  58. Lozovoy, V. V., Pastirk, I., Dantus, M. Multiphoton intrapulse interference. IV. Ultrashort laser pulse spectral phase characterization and compensation. Opt Lett. 29 (7), 775-777 (2004).
  59. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), (2014).
  60. Theodossiou, A., et al. Autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism. J Vis Exp. (177), e63282(2021).
  61. Yang, L., et al. Label-free multimodal polarization-sensitive optical microscope for multiparametric quantitative characterization of collagen. Optica. 11 (2), 155-165 (2024).
  62. Smith, H. E., et al. The use of NADH anisotropy to investigate mitochondrial cristae alignment. Sci Rep. 14 (1), 5980(2024).
  63. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (4), (2011).
  64. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr Protoc Cytom. 61 (1), 9.39.1-9.39.18 (2012).
  65. Sorrells, J. E., et al. Label-free nonlinear optical signatures of extracellular vesicles in liquid and tissue biopsies of human breast cancer. Sci Rep. 14 (1), 5528(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Free MicroscopyNonlinear Optical MicroscopyMultiphoton MicroscopyHarmonic GenerationAutofluorescence ImagingPhotonic Crystal FiberPulse CompressionTissue ImagingMetabolic ImagingRedox Ratio

Related Articles