Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация мутантов-матерей с помощью zpc:cas9 Knock-in данио-рерио

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68642

⸱

22 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем протокол генерации материнского мутанта, который сочетает стабильную линию npc:cas9 с Tol2-опосредованной доставкой кассет экспрессии sgRNA.

Аннотация

Оогенез и раннее эмбриональное развитие в значительной степени зависят от мРНК и белков, полученных от матери. Устранение этих материнских факторов требует гомозиготных мутаций у самок данио-рерио, что часто приводит к летальному или бесплодному фенотипу, который препятствует приобретению мутантных эмбрионов у матери. В нашей предыдущей работе был представлен быстрый подход к обходу зиготической летальности с помощью редактирования генома, специфичного для ооцитов. Тем не менее, ранее описанный трансген cas9 проявляет нестабильность и подвергается постепенному подавлению в течение последующих поколений. Кроме того, присутствие перемещаемых элементов Tol2 по бокам кассеты zpc:cas9 в этой линии препятствует потенциалу для дальнейшего трансгенеза sgRNA с использованием системы Tol2, которая в настоящее время является наиболее эффективной трансгенной системой у рыбок данио. Следовательно, существует острая потребность в линии данио-рерио без Tol2, которая обеспечивает стабильную и устойчивую экспрессию Cas9, специфичную для ооцитов. Здесь мы представляем строку с zpccas9 knock-in в локусе rbm24a , которая удовлетворяет этому требованию. Используя этот усовершенствованный инструмент, мы обеспечиваем конвейер для быстрого создания материнских мутантов генов с зиготически летальными мутантными фенотипами в рамках модели рыбок данио.

Введение

Раннее эмбриональное развитие позвоночных в значительной степени зависит от РНК и белков, хранящихся в яйцеклетке, которые в совокупности называются материнскими факторами. Эти материнские продукты преимущественно синтезируются во время диплотеновой стадии мейоза I 1,2,3. Чтобы исследовать их функциональные роли, важно создать гомозиготных мутантных особей женского пола, так как только гомозиготная мутация в ооцитах может полностью истощить эти материнские факторы. Однако получение таких гомозиготных мутантных самок становится сложной задачей, когда зиготические гомозиготные мутации приводят к летальности или бесплодию 4,5. Это создает значительный барьер для выяснения функций материнских продуктов, кодируемых зиготическими, летальными или стерильными генами. Для преодоления этого технического ограничения было разработано несколько инновационных подходов 6,7,8. Тем не менее, эти методы часто страдают от длительных экспериментальных сроков или значительных технических проблем.

В нашей предыдущей работе мы также разработали стратегию условного нокаута, которая позволяет генерировать материнские мутанты в пределах одного поколения 9,10. Система состоит из двух ключевых компонентов: трансгенной рыбки данио Tg(zpczcas9) и трансгенной плазмидной системы I-SceI, содержащей 3-4 кассеты экспрессии sgРНК. Используя эту систему, мы успешно добились условного нокаута материнских факторов в ооцитах 9,10, но еще есть возможности для улучшения. Во-первых, эффективность редактирования генома ранее описанной трансгенной линии Tg(zpczcas9) не была стабильной в поддержании трансгенной экспрессии Cas9. Кроме того, поскольку эта трансгенная линия была сгенерирована с использованием системы транспозона Tol2, транспозиция Tol2 не может быть дополнительно использована для интеграции кассеты экспрессии sgРНК; вместо этого требуется I-SceI-опосредованный трансгенез. Однако этот подход менее эффективен, чем Tol2, а также более подвержен трансгенерационному молчанию.

Чтобы преодолеть эти ограничения, мы стремились создать «нокаут-ин» для обеспечения надежной и стабильной экспрессии Cas9, специфичной для ооцитов. Эта линия позволяет использовать транспозонную систему Tol2 для высокоэффективной доставки плазмид экспрессии sgRNA у рыбок данио. Используя стратегию редактирования генома11 на основе интронов, мы успешно сгенерировали интронную линию zpccas9 с интегрированным сайтом в последнем интроне гена rbm24a (рис. 1A, B). Мы выбрали этот локус в качестве кандидата в качестве геномной безопасной гавани для экспрессии материнских трансгенов на основе двух независимых наблюдений. 1) Безвредная интеграция: в нашем недавнем исследовании гомозиготные рыбы, несущие экзогенную ДНК в этом месте, оставались полностью жизнеспособными и фертильными. 2) Устойчивая экспрессия: когда кассета zpccas9 была вставлена в тот же локус, Cas9 экспрессировался на высоких уровнях, что давало неизменно высокую эффективность редактирования генома на протяжении поколений (рис. 1C). Являясь основным компонентом зародышевой плазмы, РНК-связывающий белок Rbm24a в партнерстве с Buc встраивает РНК зародышевой плазмы в зародышевые гранулы. Следовательно, материнский дефицит Rbm24a приводит к полному отсутствию первичных половых клеток (ПГК)12. Здесь, ориентируясь на rbm24a в качестве примера в нашей недавней работе, мы предоставляем улучшенный видеопротокол для генерации и характеристики мутантов-матерей на наличие зиготических летальных генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами ARRIVE, и были этически одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными Шаньдунского университета (Approval No. SYDWLL-2021-15). Обзор этого протокола показан на рисунке 2.

1. Генерация вбивной линии rbm24a-RFP zpc:cas9

  1. Скрининг sgRNA на knock-in
    1. Отбор и синтез нокаут-ин кандидатов на sgРНК
      1. Отправьте последовательность последнего интрона rbm24a в CRISPRscan (http://www.crisprscan.org) для определения оптимальных кандидатов на sgРНК, демонстрирующих как высокие баллы CRISPRscan (указывающие на целевую эффективность), так и низкие баллы CFD (отражающие побочные эффекты). Синтезируйте длинное олиго для каждой sgRNA (олиго sgRNA).
        ПРИМЕЧАНИЕ: CRISPRscan генерирует олигопласты sgRNA, содержащие основные функциональные элементы, включая последовательность промотора T7, 20-нуклеотидную последовательность sgRNA-мишени и 16-нуклеотидную последовательность sgRNA scaffold. Здесь мы выбрали sgРНК со следующей последовательностью: 5'-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG
        GTgttttagagctagaa-3′ (T7 промотор в нижнем регистре, 20-нт в верхнем регистре, частичный скаффолд в нижнем регистре).
      2. Чтобы получить ДНК-матрицу для синтеза sgРНК, приготовьте 50 μL для ПЦР-реакции Fill-in: 2x Taq Master mix 25 μL; праймер sgRNA (10 μM) 2 μL; Универсальный праймер (10 мкМ) 2 мкл; Деионизированный H2O 21 μL.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность всех грунтовок приведена в Таблице материалов.
      3. Тщательно перемешайте и перенесите реакционную смесь в предварительно запрограммированный термоамплификатор и запустите протокол амплификации с использованием параметров циклирования следующим образом: 1 цикл при 94 °C в течение 3 мин, 35 циклов (94 °C в течение 15 с, 50 °C в течение 15 с, 72 °C в течение 30 с) и 1 цикл при 72 °C в течение 5 мин.
      4. Приготовьте реакционную смесь для синтеза sgРНК в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл; Соедините все компоненты при комнатной температуре в следующем порядке: 11 мкл дистиллированной воды, 2 мкл АТФ/ГТФ/CTP/UTP (по 10 мМ), 10 мкл продукта ПЦР, 4 мкл 10-кратного реакционного буфера РНК-полимеразы, 2 мкл Т7-РНК-полимеразы и 1 мкл ингибитора РНКазы. Общий реакционный объем составляет 40 μл. Тщательно перемешайте путем перелистывания и проведите кратковременное центрифугирование.
      5. Выдерживать при 37 °C в течение 1,5 ч. Добавьте 1 мкл ДНКазы I, перемешайте перемешиванием и быстро центрифугируйте. Инкубировать при 37 °C в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное удаление матрицы ДНК.
      6. Добавьте 5 μL магнитных гранул диоксида кремния, а затем 120 μL (в 4 раза объем) РНК-связывающего буфера (Gu-HCl 1 M 9,55 г, Tween-20 0,05%, этанол 100 мл). Тщательно перемешайте с помощью пипетки. Инкубировать в термомиксере при 1 500 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре.
      7. Поместите пробирку на магнитную подставку и осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки или вакуумной системы.
      8. Добавьте 400 μл 90% этанола и вортекс, чтобы повторно суспендировать шарики. Поместите трубку на магнитную подставку и выбросьте надосадочную жидкость.
      9. Повторите шаги промывки этанолом, чтобы выполнить в общей сложности два цикла стирки.
      10. Удалите остатки надосадочной жидкости и высушите открытую трубку на воздухе на нагревательном блоке при температуре 50 °C в течение 10 минут.
      11. Добавьте 15 μL воды, не содержащей нуклеаз, и инкубируйте в термомиксере при 1500 об/мин в течение 5 минут при комнатной температуре.
      12. Поместите пробирку на магнитную подставку и переложите элюат в свежую микроцентрифужную пробирку.
      13. Подтвердите полосу sgRNA 98.о. с помощью агарозного электрофореза. Количественно оценивайте концентрацию РНК с помощью микроспектрофотометра и агарозного электрофореза, четко маркируйте и храните при -20 °C.
    2. Тестирование эффективности sgRNA
      1. Чтобы определить фактическую эффективность sgРНК, подготовьте комплекс рибонуклеопротеинов (RNP) для микроинъекций. Смешайте 1 мкл каждой гРНК (конечная концентрация 50 нг/мкл) с 1 мкл белка Cas9 (конечная концентрация 100 нг/мкл) на льду с помощью пипетирования. Доставьте 2 нл комплекса РНП в каждый эмбрион на одноклеточной стадии путем микроинъекции.
      2. Через 24 ч после оплодотворения (HPF) соберите 10 эмбрионов для каждого введенного Cas9 RNP в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и осторожно удалите лишнюю среду. Добавьте 100 мкл 50 мМ NaOH (10 мкл на эмбрион) и инкубируйте при 95 °C в течение 15 мин с помощью нагревательного блока или термоамплификатора. Нейтрализуйте лизат, добавив 10 мкл 1 М Трис-HCl (pH 7,0).
      3. Используйте нейтрализованный лизат эмбриона непосредственно в качестве матрицы для амплификации ПЦР. Спроектируйте праймеры для амплификации фрагмента, содержащего целевой сайт, с помощью фланкирующих последовательностей ≥100.о. с обеих сторон. Верифицируйте продукты ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле и при необходимости очистите с помощью экстракции гелем. Выполните секвенирование по Сэнгеру амплифицированных продуктов.
      4. Количественная оценка эффективности редактирования CRISPR: анализируйте хроматограммы секвенирования с помощью инструмента анализа ICE (Inference of CRISPR Edits) (https://ice.synthego.com/#/). Нормализуйте эффективность редактирования по сравнению с неинъецированными контрольными образцами в соответствии с протоколами, рекомендованными веб-сайтом.
  2. Конструирование донорской плазмиды для вбивания
    1. Используйте установленную методику TEDA (Т5-экзонуклеаза ДНК сборки) для проведения реакции лигирования13.
    2. Используйте стратегию сборки Гибсона из трех фрагментов для создания донорской плазмиды rbm24a-RFP KIzpc:cas9 . Первый фрагмент включает плечо гомологии размером 1704.о. 5', охватывающее область генома непосредственно перед стоп-кодоном rbm24a . Второй — это последовательность кодирования GFP. Третья содержит гомологическое плечо 2274.н. 3' ниже стоп-кодона rbm24a , за которым следует кассета для экспрессии zpccas9 , расположенная в направлении 3' дистальнее rbm24a 3'-UTR.
    3. Соберите три фрагмента в ApaI сайт pBluescript SK-vector с помощью сборки Gibson.
    4. Верифицируйте окончательную плазмиду с помощью рестрикционного расщепления и секвенирования по Сэнгеру.
  3. Микроинъекции и отбор эмбрионов с ранней интеграцией
    1. Приготовьте смесь для инъекций, содержащую 12 пг рбм24а-RFP KI вбитой донорской плазмидыzpc:cas9 , 200 пг сгРНК и 600 нг рекомбинантного белка Cas9 в воде, не содержащей нуклеаз. Введите 1-2 нл смеси в бластодиск эмбрионов одноклеточной стадии с помощью стандартных методик микроинъекций. При 30 hpf скрининг эмбрионов на паттерны экспрессии RFP, которые имитируют эндогенную экспрессию rbm24a, что указывает на интеграцию донорской плазмиды уже на стадии расщепления. Отбирайте эти эмбрионы с ранней интеграцией для разведения, которые показали сигнал RFP в хрусталике, сердце, скелетных мышцах и волосковых клетках внутреннего уха (рис. 3A, B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите плазмиду с помощью экстракции фенол-хлороформа перед инъекцией, чтобы удалить любые остаточные РНКазы, введенные во время подготовки плазмиды.
    2. Проанализируйте паттерны экспрессии материнского Rbm24a-RFP у эмбрионов поколения F1, полученных от инкроссов rbm24a-RFP KIzpc:cas9 (рис. 4A, B).
  4. Оценка экспрессии белка Cas9 и эффективности редактирования
    1. Чтобы оценить эффективность редактирования Cas9, микроинъекции 200 пг bmp2b sgRNA в 1-клеточные эмбрионы rbm24a-RFP KIzpc:cas9 (рис. 1C,D).
    2. Чтобы оценить стабильность редактирования Cas9, количественно оцените количество эмбрионов, демонстрирующих фенотипы дорсализации, и выполните анализ секвенирования по Сэнгеру для оценки эффективности редактирования (рис. 5A-D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя мы не обнаружили никакого снижения экспрессии Cas9 в течение трех поколений, мы все же рекомендуем проверять эффективность редактирования в каждом поколении этой линии.

2. Трансгенез sgRNA в линии rbm24a-RFP KI zpc cas9

  1. Отбирайте и синтезируйте sgРНК для нокаута rbm24a .
    1. Выберите и синтезируйте кандидатов на sgRNA, как описано в шаге 1.1.1.
      Примечание: Крайне важно выбирать sgРНК, которые нацелены на переднюю половину кодирующей области, чтобы обеспечить высокоэффективную потерю функции. Кроме того, если критические белковые домены идентифицированы в С-концевой области, sgРНК, нацеленные на 3'-конец кодирующей последовательности, также являются приемлемыми. CRISPRscan генерирует олигопласты sgРНК, содержащие основные функциональные элементы, включая последовательность промотора T7, 20-нуклеотидную последовательность sgRNA-мишени и 16-нуклеотидную последовательность sgRNA scaffold. Для достижения эффективного нокаута материнского гена целесообразно сконструировать 6-8 кандидатов для надежной идентификации 3-4 высокоэффективных sgРНК. Подробный протокол можно найти в предыдущей статье9.
    2. Проверьте эффективность sgРНК на ранних стадиях эмбриона данио-рерио, как описано в шаге 1.1.2.
      Примечание: предпочтение отдается sgРНК с эффективностью редактирования более 50%.
  2. Конструирование sgRNA-экспрессирующей трансгенной плазмиды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимальной эффективности редактирования мы рекомендуем использовать четыре отдельных, неперекрывающихся sgРНК, каждая из которых разделена не менее чем на 36.о. Эти sgРНК по отдельности лигированы в векторы pU6x:sgRNA (pU6x:sgRNA #1, #2, #3, #4), каждый из которых содержит уникальные промоторы U6 вместе с 3'-каркасом14. Впоследствии эти четыре вектора U6, каждый из которых содержит кассету экспрессии sgРНК, собираются в вектор назначения pGGDestISceIEB-4sgRNA с помощью лигирования Golden Gate.
    Векторы pU6x:sgRNA следует выбирать последовательно. Например, если вы клонируете три sgРНК, используйте векторы от #1 до #3; при клонировании четырех sgRNA, используйте векторы от #1 до #4.
    1. Субклонирование последовательности-мишени sgRNA в векторы pU6x:sgRNA
      1. В соответствии с последовательностью выбранных sgRNA синтезировать праймеры отжига: Прямой праймер: TTCGN(19); Обратный праймер: AAAC[N(19)]*. Где GN(19) — 20 нт последовательность-мишень sgРНК. [N(19)]* представляет собой последовательность обратного комплемента 19 nt мишени sgRNA в направлении 3'.
      2. Для отжига грунтовок приготовьте смесь следующим образом: 1 мкл прямого праймера (100 мкМ), 1 мкл обратного праймера (100 мкМ), 2 мкл 10-кратного буфера и 16 мкл деионизированного H2O до достижения общего объема 20 мкл. Тщательно перемешайте.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность всех грунтовок была показана в Таблице материалов.
      3. Поместите смесь в амплификатор и запустите программу следующим образом: 1 цикл при 95 °C в течение 15 минут, затем постепенно охлаждайте до 50 °C при контролируемой скорости нарастания 0,1 °C / с и поддерживайте эту температуру в течение 10 минут; держать при температуре 4 °C в течение 10 минут.
      4. Приготовьте реакционную смесь для клонирования отожженной последовательности-мишени sgRNA в векторы pU6x-sgRNA, как показано на рисунке: 1 мкл 10-кратного ферментного буфера рестрикции, 1 мкл 10-кратного Т4-лигазного буфера, 0,3 мкл Т4-лигазы, 0,3 мкл BsmBI, 0,2 мкл PstI, 0,2 мкл SalI, 1 мкл отожженного праймера sgРНК, 5 мкл pU6x:sgRNA#x (20 нг/мкл) и 1 мкл деионизированного H2O, регулируя конечный объем реакции до 10 мкл.
      5. Тщательно перемешайте компоненты реакции и запустите следующую программу термоамплификатора: 6 циклов (37 °C в течение 20 мин, 16 °C в течение 15 мин), 1 цикл при 37 °C в течение 10 мин, 1 цикл при 55 °C в течение 15 мин, 1 цикл при 80 °C в течение 15 мин.
      6. Для трансформации разморозьте компетентные клетки DH5α на льду, аккуратно смешайте 50 мкл клеток со смесью для лигирования, щелкнув пробиркой, и инкубируйте смесь на льду в течение 30 минут. Проведите тепловой шок при температуре 42 °C в течение 60 с, затем немедленно перенесите трубку обратно в лед на 2 минуты. Распределите трансформированные клетки на LB-планшете, содержащем 100 мкг/мл спектиномицина, и инкубируйте планшет вверх дном при 37 °C в течение не менее 16 часов, чтобы обеспечить образование колоний.
      7. Для ПЦР колоний выберите каждую бактериальную колонию с помощью наконечника для пипетки и перенесите в нее 10 мкл деионизированного H2O. Тщательно ресуспендируйте колонию, пипетируя вверх и вниз, чтобы обеспечить полное диспергирование для последующего ПЦР-анализа. Приготовьте реакционную смесь для ПЦР, смешав 5 мкл 2x Taq Mix, 2 мкл колонийной жидкости, по 0,4 мкл прямого праймера M13 (10 мкМ) и обратного праймера (10 мкМ) и 2,2 мкл деионизированного H2O, в результате чего общий объем реакции составит 10 мкл.
      8. Запустите программу, как показано ниже: 1 цикл при 94 °C в течение 3 минут, 23 цикла (94 °C в течение 15 с, 55 °C в течение 15 с, 72 °C в течение 30 с) и 1 цикл при 72 °C в течение 5 мин.
      9. Подвергнуть ПЦР-продукты электрофорезу. Выберите положительную колонию с ожидаемым размером 482.о. (рисунок 6).
      10. Инокулируйте оставшуюся жидкость колонии в 3 мл LB среды с добавлением 100 мкг/мл спектиномицина. Инкубировать при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин в течение 14 часов.
      11. Извлеките плазмиды из бактериальной культуры с помощью набора Plasmid Miniprep Kit в соответствии с инструкциями производителя. Измерьте концентрацию плазмид с помощью микроспектрофотометра.
      12. Подвергнуть извлеченные плазмиды секвенированию по Сэнгеру с использованием прямого праймера M13. Совместите результаты секвенирования с ожидаемой картой вектора U6, чтобы убедиться в правильности вставки мишени sgRNA.
    2. Сборка вектора pGGDestEB-4sgRNA
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как показано на рисунке 7, четыре кассеты экспрессии sgРНК, управляемые U6, могут быть эффективно лигированы в основной вектор pGGDestEB-4sgRNA с использованием сборки Golden Gate. Количество sgРНК, подлежащих лигированию, определяет использование векторов. Например, при сборке четырех кассет sgRNA используйте pU6a:sgRNA#1, pU6a:sgRNA#2, pU6b:sgRNA#3, pU6c:sgRNA#4 и pGGDestEB-4sgRNA.
      1. Приготовьте 20 мкл реакционной смеси Golden Gate, содержащей: 2 мкл 10× буфера фермента рестрикции, 2 мкл 10x T4 ДНК-лигазы, по 100 нг каждой конструкции pU6x:sgRNA#x, 50 нг вектора назначения pGGDestIEB-4sgRNA, 1 мкл BsaI, 1 мкл T4 ДНК-лигазы и деионизированную воду для доведения конечного объема до 20 мкл.
      2. Проведите реакцию сборки Golden Gate в течение 3 циклов по 20 минут при 37 °C, затем 15 минут при 16 °C, затем завершите 15-минутную инкубацию при 80 °C для инактивации ферментов.
      3. Для преобразования перенесите 5 μL реакционной смеси в компетентные клетки и планшет на среду с добавлением ампициллина.
      4. Проведите ПЦР колоний путем скрининга колоний с использованием прямого и обратного праймеров Dest (см. Таблицу материалов) для подтверждения наличия вставки (рис. 8).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для положительного клона должна присутствовать основная полоса в 2,415.о. и лестничная модель.
      5. Извлекайте плазмиды из положительных колоний и секвенируйте с помощью прямых и обратных праймеров Dest для каждой мишени sgRNA.
      6. Выровняйте результаты секвенирования по Сэнгеру с предсказанной векторной последовательностью для проверки.
  3. Микроинъекции и предварительный скрининг трансгенных основателей
    1. Соберите эмбрионы, нерестящиеся гомозиготными рыбами rbm24a-RFP KIzpc:cas9 .
    2. Приготовьте инъекционную смесь, соединив 1 мкл pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA (12 нг/мкл) с 1 мкл мРНК транспозазы Tol2 (50 нг/мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите плазмиду с помощью экстракции фенол-хлороформа перед инъекцией, чтобы удалить любую остаточную РНКазу, которая могла быть введена в процессе экстракции плазмидами. Плазмиду и мРНК Tol2 разводили непосредственно в чистой воде.
    3. Положите стеклянный покровный лист в посуду диаметром 15 см. Выровняйте зародыши по краю покровного стекла и аккуратно удалите лишнюю воду с помощью пипетки. Введите 2 нл смеси в бластодиск каждого эмбриона 1-клеточной стадии. После инъекции аккуратно промойте эмбрионы голубой водой и переложите их в свежую посуду. Наконец, поместите чашку в инкубатор с температурой 28 °C для выращивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте рабочий раствор метиленового синего (голубая вода) следующим образом: Растворите 180 г морской соли в 2,7 л дистиллированной воды и простерилизуйте до 100-кратного запаса морской воды. Разбавьте этот бульон в 200 раз стерильной дистиллированной водой, чтобы получить морскую воду в 1/100 раза. Добавьте 10 мкл 5% (м/в) раствора метиленового синего в 1 л этой 1/100x морской воды для приготовления окончательного рабочего раствора.
    4. При 24 hpf выберите эмбрионы, демонстрирующие устойчивую и повсеместную экспрессию BFP. При 4 dpf повышайте только те из них, которые поддерживают сильные трансгенные флуоресцентные сигналы (рис. 9).

3. Характеристика двойных трансгенных эмбрионов

  1. Фенотипирование двойных трансгенных эмбрионов
    1. Соберите эмбрионы у мозаичных трансгенных самок-основателей, спаривающихся с самцами дикого типа.
    2. Подберите BFP-положительные (BFP+) эмбрионы на одноклеточной стадии под флуоресцентным стероидомикроскопом.
    3. Выявление дефектов развития, возникающих у эмбрионов BFP+ , но не у эмбрионов BFP- .
    4. Зафиксируйте эмбрионы в 4% параформальдегиде (PFA) при 4 °C на ночь. При необходимости проведите полноразмерную гибридизацию in situ , иммунофлуоресцентное окрашивание или другие гистологические анализы.
      Примечание: Надежными являются только дефектные фенотипы, которые возникают исключительно у GFP- или BFP-положительных эмбрионов, экспрессирующих sgRNA. Выводы следует делать с осторожностью, а материнские мутантные фенотипы должны быть обоснованы более чем 10 случаями.
  2. Генотипирование материнских мутантных эмбрионов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для идентификации Мrbm24a эмбрионов, их можно легко обнаружить по отсутствию Rbm24a-RFP под флуоресцентным микроскопом. В отличие от этого, идентификация материнских мутантов других генов опирается в основном на стратегию клеточной аспирации до активации зиготического генома, за которой следует анализ материнских мРНК в собранных клетках с помощью ОТ-ПЦР (Рисунок 10).
    1. Клеточная аспирация
      1. Приготовьте 1,5% раствор агарозы, растворив его в 1/3х буфере Рингера и кипятите до растаяния. Налейте раствор в чашку Петри диаметром 90 мм и вставьте форму (WPI, z-формы) в расплавленный агароз. После застывания аккуратно снимите форму, в результате чего получится готовая к использованию тарелка.
      2. Используйте стеклянные капилляры и пуллер для создания игл, запечатанных расплавом. Для оптимальной аспирации ячеек установите два легких груза и мощность нагрева на уровнях Lv1: 60 и Lv2: 90 и выберите процедуру Step2. Обрежьте кончики капилляров заостренным пинцетом (см. Таблицу материалов) до диаметра отверстия 30-40 мкм. Затем создайте шип на кончике иглы с помощью микрокузницы, который способствует проникновению и сводит к минимуму повреждение эмбриона.
      3. Спаривайте предполагаемых самок основателей с рыбками данио дикого типа и собирайте эмбрионы. Изолируйте BFP-положительные эмбрионы на одноклеточной стадии.
      4. При 3 hpf дехорионате эмбрионы путем инкубации в 1 мг/мл проназы в 1/3x Ringer's buffer в течение 10 мин и осторожного пипетирования и осторожно поместите эмбрионы на агарозную пластину, залитую 1/3x Ringer's Buffer с добавлением 1x пенициллин-стрептомицина. Переориентируйте эмбрионы так, чтобы бластомер был направлен к кончику капилляра.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно переносить эмбрионы с осторожностью, потому что они чрезвычайно хрупкие без защиты хориона. Не позволяйте им соприкасаться с поверхностью среды!
      5. Используйте микроинъектор для аспирации 20-40 клеток из каждого эмбриона, осторожно снижая равновесное давление, которое компенсирует силу аспирации от капиллярногодействия. Высвобождайте эти элементы в 2 мкл деионизированного H2O на открывающемся крае ПЦР-пробирок путем увеличения равновесного давления.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание перекрестного загрязнения стеклянную иглу следует очищать путем отсасывания и выталкивания деионизированного H2O 3x перед каждой аспирацией.
      6. Добавьте 200 мкл реагента для экстракции РНК, чтобы промыть клетки, и временно храните пробирки на льду. Впоследствии проанализируйте генотипы клеток эмбрионов с пороками развития или без них.
        Примечание: Клетки, сохраненные в экстракционном реагенте, могут храниться при температуре -20 °C до тех пор, пока соответствующие эмбрионы не проявят аберрантные фенотипы.
      7. Оставьте эмбрионы после аспирации клеток в агарозном планшете или поместите их по отдельности в 24-луночные планшеты, залитые 1/3x раствором Рингера, содержащим 1x пенициллин-стрептомицин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при переносе дехорионированных эмбрионов! Как правило, мы исследуем 20-40 эмбрионов в одном эксперименте, который занимает примерно 1 час.
    2. Анализ материнской мРНК, представляющей интерес для аспирированных клеток
      1. Добавьте 40 мкл хлороформа в клетки в реагенте для экстракции и аккуратно перемешайте. Центрифугируйте смесь при 12 000 × г в течение 1 минуты при 4 °C.
      2. Тщательно соберите надосадочную жидкость. Добавьте 1 μL раствора гликогена (20 мг/мл) и равный объем изопропанола (Если объем надосадочной жидкости составляет 100 μL, то добавьте 100 μL изопропанола) и хорошо перемешайте. Инкубируйте смесь при температуре -20 °C в течение 30 минут, чтобы облегчить выпадение осадков.
        Примечание: Из-за небольшого количества общей РНК в аспирированных клетках необходимо добавлять гликоген для повышения эффективности осаждения и облегчения визуализации осадка.
      3. Центрифугируйте образец при давлении 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
      4. Промойте гранулу 2 раза, добавив 500 мл 70% этанола и центрифугируя при 12 000 × г в течение 1 минуты.
      5. Слейте жидкость и откройте крышку, чтобы гранулы высохли при комнатной температуре в течение 5 минут.
      6. Добавьте 7 μL воды, чтобы растворить гранулы. Проведите обратную транскрипцию с помощью набора для синтеза кДНК первой цепи, следуя подробному протоколу, приведенному в руководстве по эксплуатации.
      7. Амплифицируйте всю кодирующую область соответствующими праймерами (см. Таблицу материалов) и запустите агарозный электрофорез.
      8. Клонируйте продукты ПЦР и секвенируйте не менее 30 клонов для каждого эмбриона, чтобы проанализировать мутацию, возникшую в мРНК.
        Примечание: Чтобы подтвердить, что наличие дефектного фенотипа вызвано целевой мутацией заинтересованного материнского фактора, все эмбрионы (n > 5) с дефектными фенотипами должны демонстрировать отсутствие материнских транскриптов дикого типа. И наоборот, материнские мРНК дикого типа должны присутствовать во всех нормально развивающихся эмбрионах, экспрессирующих sgРНК (n > 5). В то же время у sgRNA-отрицательных эмбрионов обнаруживаются только мРНК дикого типа (n > 5).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Быстрая генерация материнских мутантов rbm24a
Мы сконструировали трансгенный вектор, обеспечивающий экспрессию материнского маркера BFP и четырех высокоэффективных sgРНК, нацеленных на кодирующую последовательность rbm24a. После введения этого вектора в гомозиготные эмбрионы rbm24a-RFP KIzpc:cas9 через транспозицию Tol2, Mrbm24a был легко и быстро идентифицирован среди BFP-положительных эмбрионов F1 из-за отсутс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Летальные зиготические мутации препятствуют анализу материнского вклада гена. Альтернативные стратегии, в первую очередь замена зародышевой линии и микроинъекция ооцитов in situ (OMIS), являются технически сложными 6,8. В процессе трансплантации клеток замещения зародышевой линии эмбрион-реципиент получает очень мало ПГК, что часто препятствует нормальному развитию самки 16,17,18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Этот протокол был выдан в качестве патента Национальным управлением интеллектуальной собственности Китая, которое освободит от ограниченного использования метода после получения разрешения авторов. Авторы заявляют, что у них нет других конкурирующих или финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Цзяньлинь Шэнь, Итэн Сюй и Цинцин Вэй из Основной платформы объектов и услуг Школы наук о жизни. Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (гранты 32170816, 32370860, 32450630 и 31871451), Программы выдающихся ученых среднего и молодого возраста Шаньдунского университета, Тайшаньских ученых провинции Шаньдун.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2x M5 HiPer Taq PCR миксМэй5биоКат#MF001-BD-100
АгарозаМДбиоКат#A006L
Набор AxyPrep Plasmid MiniprepАксигенКошка#AP-MN-P-4
Инструмент для капиллярного электрофореза (Qsep400)БиоптикН/Д
DIG-этикетка миксРошКот#11277073910
ДНКаза IРошКошка#4716728001
ДТТThermo Fisher ScientificКот#R0861
Набор для синтеза кДНК первой цепиТрансГен БиотехКот#AT301
Нуклеаза GenCrispr NLS-Cas9-NLSGenScriptКот#Z03389
Стеклянные капилляры (1,0 x 100 мм)Завод учебного оборудования РантайКошка#OS-2B
ГликогенBBI Медико-биологические наукиКот#28985
ГрафПад Призма 9ГрафПадhttps://www.graphpad.com/
ИзображениеJИз открытых источниковhttps://imagej.net/software/fiji/
Легкоплавкая агарозаБиотехнологииКат#CA1351
Микрокузница (MF2)НАРИСИГЭН/Д
Микроспектрофотометр (Нано-300)АЛЛШЭНН/Д
ОлиВИЯОЛИМПН/Д
Пенициллин-стрептомицинGibcoКошка#15140122
Пиколитровый инжектор (PLI-100A) Гарвардский аппаратН/Д
Остроконечный пинцетВПИКошка#500341
Остроконечный пинцет  WPI 500341
Съемник (ПК-100)НАРИСИГЭН/Д
Ингибитор РНКазы RiboLockThermo Fisher ScientificКот#EO0381
rNTPThermo Fisher ScientificКот#R0481
Гидроксильные магнитные шарикиСангон БиотехКот#B518720-0001
Т7 РНК-полимеразаКЛЮВКат#M0251L
ЗольдВПИZ-формы Cat#

Ссылки

  1. Fuentes, R., et al. The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish. Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).
  2. Yan, L., et al. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science. 362 (6417), eaat1045(2018).
  3. Abrams, E. W., et al. Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions. PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).
  4. Shao, M., et al. Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).
  5. Weidinger, G., et al. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).
  6. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  7. Xing, Y. Y., et al. Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements. PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).
  8. Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary. J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).
  9. Zhang, C., et al. Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system. Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).
  10. Zhang, C., et al. Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish. Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).
  11. Li, J., et al. Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).
  12. Zhang, Y., et al. Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish. EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).
  13. Xia, Y., et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).
  14. Yin, L., et al. Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
  15. Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector. Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).
  16. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  17. Aharon, D., Marlow, F. L. Sexual determination in zebrafish. Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).
  18. Ye, D., et al. Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline. Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).
  19. Wang, X., et al. Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors. Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).
  20. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  21. Bertho, S., et al. Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition. Development. 148 (7), dev.187773(2021).
  22. Houwing, S., et al. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell. 129 (1), 69-82 (2007).
  23. Shao, M., et al. Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish. Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Tol2
Генерация мутантов-матерей с помощью zpc:cas9 Knock-in данио-рерио
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.