Методическая статья

Уменьшение масштаба для достижения больших результатов: оптимизированное высокопроизводительное производство рекомбинантных аденоассоциированных вирусов

DOI:

10.3791/68646

⸱

12 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Basel, Hoffmann-La Roche Ltd, 2Roche Pharma technical development Cell and Gene Therapy, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 3Center of Biomedical Education and Research - ZBAF, University of Witten/Herdecke, 4Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 5Biozentrum, University of Basel

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на широкое использование рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов (rAAV) в доставке генов, они сталкиваются с серьезными проблемами в производстве. В этом протоколе описываются микро- и минимасштабные методы производства с использованием как адгезивных, так и суспензионных клеток. Эти методы оптимизируют генерацию, очистку и оптимизацию векторов, тем самым ускоряя доклинические исследования и способствуя прогрессу в области генной терапии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (rAAV) стали ведущей платформой для применения в генной терапии. Тем не менее, громоздкие процессы производства и очистки остаются значительными узкими местами в разработке лекарств. Высокопроизводительное мелкосерийное производство rAAV без трудоемких и длительных процедур очистки представляет собой ценную альтернативную стратегию для ускорения доклинических исследований и терапевтического скрининга на ранних стадиях. Этот подход позволяет быстро генерировать различные варианты rAAV или терапевтические конструкции с достаточным качеством для первоначальной оценки in vitro и in vivo . Этот протокол вводит два метода, различающихся по типу клеток и масштабу производства: микромасштабное и минимасштабное производство rAAV. Микромасштабное производство осуществляется в формате 6 лунок с использованием адгезивных клеток эмбриональной почки человека (HEK) 293T (микро-6 лунок), в то время как минимасштабное производство использует суспензионные клетки в 24-луночных планшетах (mini-HT24). Векторы, полученные с помощью этих методов, подвергаются последующему анализу для оптимизации условий культивирования клеток и/или используются для оценки биологической активности трансгенов. Ключевые аналитические данные включают титрование векторного генома (vg/mL), определение титра капсида (vp/mL), вестерн-блоттинг и анализы клеточной трансдукции. Кроме того, векторы, полученные в мини-масштабе и полуочищенные с использованием аффинных смол, сравниваются с препаратами среднего масштаба, очищенными с помощью градиентов плотности хлорида цезия. Описанные здесь усовершенствованные методы демонстрируют значительный потенциал для уточнения параметров клеточных культур, идентификации ведущих кандидатов во время скрининга (т.е. оптимизированных трансгенных кассет или превосходных капсидов AAV) и повышения экспрессии трансгенов. В совокупности представленные рабочие процессы поддерживают создание надежной и эффективной платформы для итеративной разработки в процессе разработки генной терапии, которая может быть легко внедрена в любой исследовательской лаборатории.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка лекарственных препаратов является сложным и ресурсоемким процессом, требующим интеграции высококачественных данных с различных этапов, включая идентификацию мишени, доклиническую валидацию и клинические испытания1. В ответ на растущий спрос на более сжатые сроки и снижение затрат2 фармацевтическая промышленность все чаще внедряет высокопроизводительные (HT) маломасштабные анализы в сочетании с передовым искусственным интеллектом (ИИ) в качестве краеугольного камня современных стратегий развития 3,4,5. Анализы HT позволяют проводить быстрый скрининг и оценку большого количества кандидатов в лекарственные препараты или переменных анализа с меньшими затратами времени и затрат по сравнению с традиционными методами 5,6.

В приложениях генной терапии, особенно с использованием аденоассоциированных вирусных (AAV) векторов, высокая стоимость товаров и длительные сроки производства создают значительные проблемы7. Процесс разработки начинается с получения плазмидного материала, необходимого для трансфекции, за которым следует рост клеток до высокой плотности, достаточной для производства вирусных векторов. После перевоплощения перед сбором урожая требуется инкубационный период от двух до пяти дней, и процесс завершается очисткой и определением характеристик партии 8,9. В совокупности этот рабочий процесс может занимать до месяца и, как правило, ограничен ограниченным числом препаратов, которые могут выполняться параллельно при использовании аффинных колонок или градиентного ультрацентрифугирования 9,10,11,12.

Осознавая потребность в небольших, мини- или микромасштабных протоколах производства AAV, компания адаптировала несколько подходов для производства рекомбинантных AAV (rAAV) в небольших лабораторных установках. Эти подходы обычно включают использование нескольких 15-сантиметровых чашек для адгезивных клеток,13, 14 или 50-2000 мл15 колб для встряхивания для суспензионных культур. В прошлом применялись методы очистки AAV, такие как градиентное ультрацентрифугирование (например, йодиксанол16, хлорид цезия (CsCl)17 или градиенты сахарозы18). Этот недорогой и независимый от серотипа метод был очень хорош для производства rAAV в лабораторных масштабах, но его трудоемкий характер и ограниченная мощность ультрацентрифуги делают его менее подходящим для высокопроизводительных применений19,20.

Постоянный спрос на более высокую производительность привел к изучению альтернативных подходов к сокращению производства rAAV. С использованием адгезивных ячеек были исследованы такие форматы, как 6-луночные 13,21,22, 96-луночные23 и даже 384-луночные планшеты24. В последнее время стали использовать суспензионные клетки, учитывая их улучшенную масштабируемость и сопоставимую или даже превосходящую эффективность векторных препаратов8.

Тем не менее, высокопроизводительное производство rAAV в суспензионных клетках с объемом культивирования менее 15 мл остается специализированной областью, с ограниченными опубликованными протоколами 7,25,26. Большинство исследований сосредоточены на больших объемах для достижения достаточного выхода продукции для последующих применений 8,9,27, но, как и в случае с адгезивными ячейками, мини-форматы обеспечивают значительное сокращение потребления ресурсов и времени обработки, тем самым удовлетворяя критические потребности в полевых условиях. Важно отметить, что в мини- и микромасштабных протоколах часто используются «сырые лизаты» или неочищенные клеточные культуры, содержащие векторные частицы, для последующей характеристики и анализа.

В этом исследовании описаны два протокола, в которых используются как адгезивные, так и суспензионные клетки-продуценты (Рисунок 1). Сырые лизаты rAAV, полученные из адгезивных HEK293T клеток, используются непосредственно для последующих применений, таких как трансдукция клеток-мишеней. Напротив, rAAV, образующиеся в суспензионных клетках, подвергаются дальнейшей обработке с помощью высокопроизводительной аффинной смолы. Эти методы были специально разработаны для повышения урожайности, оценки качества векторов и мониторинга экспрессии трансгенов при минимизации потребления дорогостоящих реагентов и материалов. Представленные здесь результаты показывают, что в зависимости от сферы применения подходят как сырые лизаты (из адгезивных клеток), так и аффинно-очищенный материал (из суспензионных клеток). Кроме того, rAAV, полученный с использованием аффинных смол, был напрямую сравнен с аналогами, очищенными с использованием традиционного ультрацентрифугирования хлорида цезия, с точки зрения выхода, чистоты и эффективности трансдукции в нейрональных культурах человека.

Внедрение высокопроизводительных маломасштабных анализов при разработке геннотерапевтических препаратов представляет собой незаменимый прогресс, ускоряющий инновации и сокращающий разрыв между научными открытиями и терапевтической реальностью. Эти методы не только сокращают затраты и сроки, но и позволяют проводить параллельное тестирование многочисленных заболеваний, что в конечном итоге способствует эффективному развитию трансформационной терапии.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Микро-6-луночная продукция векторов rAAV в адгезивных клетках

ПРИМЕЧАНИЕ: Производство rAAV в микро-6 лунках является адаптированным вариантом ранее опубликованного протокола Fakhiri et al.21.

  1. Посев и трансфекция HEK293T клеток
    1. Разморозьте флакон с HEK293T ячейками28 на водяной бане при 37 °С.
    2. Перенесите клетки в 30 мл адгезивных питательных сред для клеточных культур в колбах T175 и поддерживайте в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% сыворотки плода телят (FCS) при 37 °C и 5%CO2.
    3. Разделяйте HEK293T каждые 2-3 дня: Аспирируйте среду для культивирования клеток и осторожно добавьте 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) для промывания клеток.
      Примечание: В этом протоколе использовались только клеточные пассажи ниже пассажа номер 15 для обеспечения целостности и здоровья клеток, что напрямую влияет на выработку rAAV.
    4. Добавьте 2 мл 0,025% трипсина/этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в клетки и инкубируйте в течение 2 минут при 37 °C (или до отделения клеток).
    5. Остановите реакцию, добавив 20 мл свежей среды и суспензируя клетки в среде с помощью пипетки объемом 25 мл. В зависимости от конфлюенции клетки могут быть разбавлены в соотношении 1:10 или 1:20 в 24 мл среды DMEM с высоким содержанием глюкозы. Чтобы получить достаточную плотность клеток для трансфекции, засейте 7 ×10 6 HEK293T клеток в колбу T175.
    6. Через 72 ч при 37 °C соберите клетки методом трипсинизации (как описано на шагах 1.1.3-1.1.5), ресуспендируйте в 20 мл среды и подсчитайте клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки могут быть подсчитаны с помощью различных методов, в зависимости от желаемой точности, пропускной способности и доступного оборудования. В основном используются два подхода: ручной подсчет (камера Нейбауэра) и автоматизированные счетчики ячеек. В этом протоколе используется полностью автоматизированный клеточный анализатор на основе изображений для измерения критических параметров клеток, таких как жизнеспособность, плотность клеток и скорость агрегации.
    7. Затравочные клетки плотностью 0,5 × 106 клеток/лунку в 6-луночном планшете. Чтобы равномерно распределить ячейки, аккуратно встряхните пластину и поместите ее в инкубатор сСО2 .
    8. Через 24 ч клетки достигают конфлюенции 60-70% и могут быть трижды трансфицированы.
    9. Для каждой лунки смешайте 90 мкл бессывороточной среды с общим количеством 2,6 мкг плазмидной ДНК, включая pTransgene, pRep/Cap и pHelper в молярном соотношении 1:1:1.
    10. Во вторую пробирку добавьте 5 μL полиэтиленимина (PEI) к 90 μL среды, не содержащей сыворотки, непосредственно перед трансфекцией.
    11. После соединения двух растворов перемешайте смесь и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут.
    12. Добавьте смесь для трансфекции по каплям в каждую лунку. Осторожно встряхните пластины, прежде чем поместить их обратно в инкубатор.
      Примечание: После трансфекции можно провести смену среды, но она не применялась в качестве стандартной практики, так как клетки сохраняли хорошую жизнеспособность на протяжении всего эксперимента.
  2. Забор и лизис клеток
    1. Через 72 ч после трансфекции осторожно отсасывайте клеточную среду из пластины (пластин).
    2. Отделите ячейки, добавив 500 μL PBS в каждую лунку, и осторожно пипетируйте вверх и вниз.
    3. Перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
    4. Измеряйте жизнеспособность и плотность клеток вручную или автоматически, следуя инструкциям производителя.
    5. Перенесите 50 мкл из суспензии в 96 U-образную дневную пластину для определения эффективности трансфекции путем количественного определения репортер-положительных популяций с помощью проточной цитометрии.
      Примечание: Всегда рекомендуется проводить трансфекцию параллельно, т.е. трансфекцию 1-2 лунок трансгеном, несущим флуоресцентный белок (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP), mCherry и т.д.) для контроля эффективности трансфекции на планшете. Лунки с нетрансдуцированными клетками служат отрицательным контролем.
    6. Оставшуюся клеточную суспензию центрифугировать при 800 × г в течение 10 мин при ОТ до гранул клеток, которые содержат основную часть полученных векторов.
    7. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 100 мкл PBS. Суспензию клеток можно хранить при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить сырой лизат из собранных клеток, используйте один из двух подходов, описанных ниже.
    8. В первом подходе клетки могут быть подвергнуты пяти циклам замораживания-оттаивания, каждый из которых длится 5 минут, с использованием предварительно нагретой водяной бани при температуре 37 °C и жидкого азота. Кратковременно переведите образцы в вихрь между циклами в течение 2-3 с.
    9. Вторым и наиболее часто используемым вариантом в этом протоколе является ультразвуковая обработка. Здесь перенесите клеточную суспензию на тонкостенные планшеты или пробирки полимеразной цепной реакции (ПЦР) и поместите при температуре 4 °C в ультразвуковой аппарат на водяной бане.
      1. Ультразвуковые образцы в течение 3 мин с шагом включения-выключения 30 с с амплитудой (интенсивностью) 25%.
    10. После ультразвуковой обработки гранулируют клетки с помощью настольной центрифуги (16 100 × г в течение 10 мин при 4 °C) для удаления клеточного мусора и получения бесклеточной векторной суспензии.
    11. Перенесите надосадочную жидкость в пробирки объемом 1,5 мл и пипетируйте 10 мкл каждого образца в 96-луночный планшет с низким уровнем связывания для цифрового анализа капель (dd)ПЦР или цифровой (d)ПЦР.
    12. Храните пробирки и 96-луночные планшеты при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
  3. Трансдукция HEK293A клеток с использованием сырых лизатов
    ПРИМЕЧАНИЕ: HEK293A клетки могут не подходить для всех серотипов AAV. Чтобы определить подходящую клеточную линию, обратитесь к базам данных, таким как SPIRIT29 (см. Таблицу материалов для ссылки на базу данных SPIRIT) или к соответствующим оригинальным исследовательским статьям30,31.
    1. Затравка HEK293A клетки в трех 96-луночных планшетах за сутки до трансдукции при плотностях 1,5 ×10 6 клеток на планшет.
    2. На следующий день смешайте 10 мкл полученных векторов с различными объемами PBS для получения разведений 1:2, 1:10 и 1:100.
    3. С помощью многоканальной пипетки проводят трансдукцию клеток в 96-луночных планшетах в технических тройках.
    4. Инкубировать клетки с rAAV без обмена средой в течение 72 ч. После этого проведите последующие эксперименты в зависимости от экспрессируемого трансгена, такие как измерение уровня белка, анализ проточной цитометрии на экспрессию флуоресцентных белков, анализ нокдауна/нокаута и т. д.
    5. Для стандартной проточной цитометрии, проводимой в соответствии с этим протоколом, необходимо аспирировать среду и отделить клетки путем добавления 25 мкл 0,025% трипсина/ЭДТА.
    6. Выдерживать при 37 °C в течение 3 минут.
    7. Остановите реакцию, добавив в каждую лунку 175 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS.
    8. Используйте 100 мкл клеточной суспензии для анализа проточной цитометрии.

2. Получение векторов rAAV в суспензионных клетках Mini-HT24

Примечание: В установке mini-HT24, в отличие от описанного ранее микро-6-луночного производства, очищенные препараты векторов rAAV генерируют с использованием суспензионных ячеек. Суспензионные культуры дают большее количество rAAV из-за повышенной плотности клеток, которая может быть достигнута в пределах того же объема культуры. В данном протоколе был использован формат скважины глубиной 24 лунки. Лизаты сырых клеток очищаются с высокой производительностью с использованием аффинных смол AAVX с целью получения более чистых продуктов, необходимых для определенных областей применения, где сырые лизаты не подходят (см. раздел «Обсуждение»).

  1. Культивирование и тройная трансфекция суспензионных клеток в 24-луночных планшетах
    1. Разморозьте флакон с суспензией Viral Production Cells (VPC) на водяной бане при 37 °C. Проходите ячейки менее 30 раз, чтобы гарантировать стабильное качество полученных векторов.
    2. Перенесите клетки в 30 мл суспензионных питательных сред в колбу для встряхивания и культивируйте их в течение 2-3 суток при поддерживающих условиях культивирования: 37 °С, 8%СО2, 95% влажности и 140 об/мин (радиус встряхивающей платформы 25 мм).
    3. Определите жизнеспособную плотность клеток через 2-3 дня (см. ПРИМЕЧАНИЕ на шаге 1.1.6). Продолжайте субкультивирование и выращивание до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое количество жизнеспособных клеток, необходимых для производства AAV.
      Примечание: Субкультуральные клетки при жизнеспособной плотности > 4 ×10 6 клеток/мл и < 6 ×10 6 клеток/мл или в соответствии с инструкциями производителя в зависимости от используемой индивидуальной клеточной линии. Семена при жизнеспособной плотности 6 × 105 клеток/мл в течение 3 дней, разделить или 3 × 105 клеток/мл в течение 4 дней. Разделяют в соответствии с инструкцией производителя.
    4. Засейте 3 × 106 клеток/мл в 2,5 мл каждой лунки луночного планшета глубиной 24 лунки и накройте планшет стерильной мембранной крышкой.
    5. Приготовьте тройную трансфекционную смесь для каждой конструкции rAAV следующим образом:
      1. Приготовьте смесь ДНК плазмид продукции (pHelper, pRep/Capsid, pTransgene) в молярном соотношении 1:1:1 при конечной массе 600 нг ДНК на 1 ×10 6 жизнеспособных клеток.
      2. Приготовьте смесь в суспензионной питательной среде в конечном объеме 2,5% от объема трансфицируемой культуры.
      3. Приготовьте PEI-Mix в суспензионной питательной среде в конечном объеме 2,5% от объема трансфицируемой культуры. Используйте конечную массу 1 нг PEI на 1 нг ДНК.
      4. Объедините DNA-Mix и PEI-Mix, перенеся весь объем отдельного PEI-Mix в соответствующий DNA-Mix, в результате чего объем трансфекционной смеси составит 5% от объема культуры.
      5. Перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не переваривайте трансфекционную смесь после времени инкубации, чтобы избежать нарушения комплексов ПЭИ-ДНК, которые образовались во время инкубации32.
      6. Инкубировать при RT в течение 10 минут.
    6. Добавляйте трансфекционные смеси по каплям в соответствующие лунки, осторожно встряхивая глубоколуночную пластину.
    7. Запечатайте пластину с помощью стерильной дышащей вискозной пленки и дополнительно накройте ее соответствующей мембранной крышкой, чтобы свести к минимуму испарение.
    8. Убедитесь, что тарелка расположена на подходящем поддоне для шейкера и плотно зафиксируйте его.
    9. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C, 8%CO2, влажности 95% и 225 об/мин в течение 72 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные форматы глубоколуночных планшетов требуют индивидуальной оценки скорости встряхивания для обеспечения эффективного газообмена и культивирования клеток в однородной суспензии без оседания клеток на дно с течением времени. Для этого требуется первоначальное тестирование в зависимости от индивидуального лабораторного оборудования и настройки, а также клеточных линий, используемых для производства. Особенно учитывайте радиус встряхивания, формат пластин и форму дна, чтобы сохранить однородность клеточной суспензии и избежать оседания клеток на дно.
  2. Сбор урожая и лизис
    1. Соберите клетки, перенеся полный объем культуры из каждой лунки в индивидуально помеченные пробирки объемом 5 мл, и центрифугируйте при 800 × г в течение 20 мин при 4 °C.
    2. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 550 мкл (D)PBS по Дульбекко и перенесите суспензию в пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 1,8-2,0 мл, чтобы избежать попадания аэрозолей и капель при вскрытии пробирок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе также можно хранить гранулы, чтобы позже приступить к процессу очистки. Храните ресуспендированные гранулы с фосфатно-солевым буфером (DPBS) Dulbecco при температуре -80 °C и обязательно учитывайте это на этапах цикла замораживания-размораживания.
    3. Приготовьте лизаты, поместив пробирки в жидкий азот примерно на 2 минуты, а затем разморозьте их на водяной бане при температуре 37 °C. Повторите этот цикл 3-5 раз.
    4. Центрифуга лизаты в течение 5 мин при 1000 × г при 4 °C. Накройте ведра центрифуг аэрозоленепроницаемыми крышками.
    5. Осторожно извлеките пробирки из центрифуги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лизаты должны быть прозрачными и не содержать видимого мусора или мутности, чтобы избежать засорения смолы, используемой в процессе очистки. Не трясите и не тревожьте гранулы. Повторите этап центрифугирования в случае, если надосадочная жидкость не прозрачна. Рассмотрите возможность более высокой скорости центрифугирования или большей продолжительности в случае высококонцентрированных образцов или образцов с большим количеством мусора.
  3. Высокопроизводительная очистка rAAV на основе аффинной смолы
    1. В стакане приготовьте буфер для элюирования, добавив 720 мг лимонной кислоты к 50 мл сверхчистой воды до конечной концентрации лимонной кислоты 75 мМ.
    2. Перемешайте буфер до полного растворения порошка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что объем лунки достаточен для размещения буферных объемов и наконечников пипеток без разлива или риска перекрестного загрязнения соседних лунок.
    3. Отрегулируйте pH до 3,0, добавив по каплям 1 М соляной кислоты (HCl), постоянно помешивая буфер и измеряя pH электродом.
    4. Проведите стерильную фильтрацию на буфере с размером пор 0,22 мкм.
    5. Подготовить колонны 96 глубинной пластины с объемом лунки 2-2,2 мл для очистки по схеме, описанной в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы здесь были очищены с помощью электронной многоканальной пипетки. Этот процесс совместим с автоматизированными системами работы с жидкостями и может быть масштабирован для повышения производительности проб.
    6. Запустите очистку в шкафу биобезопасности на RT с использованием параметров, показанных на схеме очистки (см. Таблицу 1), или оптимизируйте параметры в соответствии с индивидуальными требованиями, в зависимости от объема смолы или образца, ожидаемого титра и т. д.
    7. После элюирования добавьте 1/4 объема нейтрализационного буфера к каждому образцу.
    8. Перемешайте, пипетируя 80% объема в 10 раз вверх и вниз.
    9. Подготовьте диализные планшеты, сняв мембранные кассеты и добавив в каждую лунку 1600 мкл диализного буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением диализа убедитесь, что мембраны не контактируют с жидкостью, так как повторная сушка может нарушить целостность и функционирование мембраны.
    10. Перенесите полный объем образца (максимум 300 мкл) в диализную кассету с подходящим форматом объема и размером пор мембраны (≥ 20 000 молекулярного порогового значения (MWCO)). Убедитесь, что мембраны равномерно нагружены и в них нет пузырьков воздуха.
    11. Поместите кассеты в загруженные лунки диализной пластины и запечатайте пластину герметизирующей пленкой.
    12. Перенесите диализный планшет на платформу для встряхивания и инкубируйте при 300 об/мин, 4 °C в течение 30 минут.
    13. Замените диализный буфер и повторите инкубацию при 300 об/мин, 4 °C в течение 30 минут.
    14. Повторите обмен буфера и инкубацию в общей сложности 3 раза.
    15. Перенесите весь объем диализованных образцов в пробирки для хранения с маркировкой и храните их при температуре 4 °C, если они впоследствии используются для характеризации или других экспериментов.
    16. Хранить при температуре -80 °C для длительного хранения. Избегайте циклов замораживания и размораживания, так как это может повлиять на эффективность AAV, и при необходимости готовьте аликвоты небольшого объема.
  4. Титрование геномного титра rAAV из сырых лизатов и очистка на основе смолы с помощью цифровой ПЦР (dPCR)
    1. Чтобы определить геномный титр сырых лизатов, т.е. вирусных геномов на мл (vg/мл), разморозьте собранные образцы вектора в RT, а затем пипетируйте 10 мкл в пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько методов определения титра вирусного генома (vg/мл) векторного препарата, при этом абсолютное количественное определение, как правило, основано на двух основных подходах: метод на основе капель или эмульсии (ddPCR) и метод на основе микропланшетов, представленный цифровой ПЦР (dPCR)33,34. В дополнение к этим цифровым методам абсолютная количественная оценка также может быть достигнута с помощью количественной ПЦР (кПЦР). Несмотря на то, что кПЦР традиционно является методом относительной количественной оценки, он может быть адаптирован для абсолютной количественной оценки с помощью стандартной кривой плазмиды. Речь идет о плазмиде, содержащей последовательность-мишень в известной концентрации, которая служит ориентиром для экстраполяции титра вирусного генома21,33. Хотя кПЦР быстрее и дешевле, чем дПЦР или дПЦР, она менее точна и в значительной степени зависит от точности стандарта плазмиды16. Независимо от метода количественной оценки, образцы должны быть предварительно обработаны для высвобождения вирусных геномов из частиц. Этот протокол следует ранее описанному методу Dobnik, D. et al35.
    2. Обрабатывайте образцы rAAV нуклеазой при 37 °C в течение 30 минут для деградации свободной плазмидной ДНК в процессе трансфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опционально, в зависимости от используемого фермента: нагреть образцы до 95 °C в течение 15 минут, чтобы инактивировать фермент и лизировать капсид вектора.
    3. После охлаждения до состояния RT добавьте протеиназу К в течение 15 минут для расщепления фрагментов капсида.
    4. Для инактивации протеиназы К образцы снова нагревают до 95 °C в течение 15 минут.
    5. Приготовьте мастер-смеси для ddPCR или dPCR, следуя инструкциям производителя.
    6. Используйте меченые зонды ДНК, так как они обеспечивают более специфичный сигнал, чем интеркалирующие красители. Спроектируйте зонды так, чтобы они связывались «централизованно» в вирусном геноме, т.е. в трансгене (см. ПРИМЕЧАНИЕ), а не в промоторе или полиА-хвосте, и выберите флуорофор, такой как гексахлор-6-карбоксифлуоресцеин (HEX) или 6-карбоксифлуоресцеин (FAM), совместимый с соответствующей системой ПЦР.
      Примечание: В последнее время для повышения точностиопределения титров была использована мультиплексная ddPCR или dPCR с использованием наборов праймеров/зондов, нацеленных на различные участки вирусного генома. Этот подход позволяет количественно оценить интактные геномы с помощью формул, изложенных в указанных исследованиях, или с помощью интегрированных программных решений.
    7. Проведите 10-кратное серийное разведение обработанных образцов в ddH2O с использованием 96-луночных планшетов с низким уровнем связывания ДНК. Наконец, перенесите 5,5 мкл (для ddPCR) или 2 мкл (для dPCR) матрицы (разведения 104- и 105) на 96-луночный планшет ddPCR, который уже содержит мастер-смесь ddPCR/dPCR, включая праймер/зонды. Регулируйте диапазон разбавления в зависимости от эффективности производства отдельных конструкций, чтобы убедиться, что измерения находятся в пределах линейного диапазона обнаружения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку количественное определение dPCR/ddPCR является высокочувствительным методом, необходимо 104- и 10 5-разведений образцов.
    8. Выполните описанные ниже действия для ddPCR.
      1. Для амплификации ПЦР следуйте инструкциям производителя по оптимизации условий анализа, включая корректировку времени отжига и амплификации в зависимости от используемого набора праймеров/зондов. Стандартный протокол циклирования, использованный в этом исследовании, был следующим: начальная денатурация при 9 °C в течение 10 мин (нарастание °C/с); 35 циклов денатурации при 9°С в течение 30 с и амплификации при 6°С в течение 60 с; затем следует заключительная стадия удлинения при 9 °C в течение 10 мин (нарастание °C/с).
      2. После ПЦР-амплификации мишеней вирусного генома rAAV перенесите планшет в считыватель капель и следуйте инструкциям производителя для измерения интенсивности флуоресценции в каждой лунке. Считыватель капель позволяет абсолютно количественно определять количество копий вирусного генома в реакции μL.
    9. Следуйте инструкциям, описанным ниже для проведения дПЦР.
      1. Как описано для количественного определения на основе ddPCR, следуйте инструкциям производителя по оптимизации условий анализа.
      2. В качестве отправной точки следуйте предварительно заданному термопрофилю на устройстве dPCR, который включает начальную стадию денатурации при 9 °C в течение 2 минут, за которой следуют 40 циклов денатурации при 9 °C в течение 15 с и отжиг/растяжение при 5 °C в течение 30 с.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол был выполнен с использованием рекомендованных скоростей нарастания и объемов реакции, указанных производителем.
    10. Анализируйте данные ddPCR и dPCR с помощью различных программных решений, обычно предоставляемых производителем прибора (например, QX manager и QIAcuity Software Suite 1.2 соответственно). Для обоих методов следует выбирать только образцы разведений с адекватным соотношением положительных и отрицательных разделов/капель для количественного определения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения титров частиц rAAV (vp/мл; vp = вирусные частицы) из сырых лизатов и материала, очищенного смолой AAVX, можно использовать иммуноферментный анализ (ИФА)., Доступны различные коммерчески доступные стандартные наборы ИФА для количественного определения AAV (наборы, использованные в этой работе, перечислены в Таблице материалов). Выполняйте анализ в соответствии с руководством (руководствами) производителя. Убедитесь, что используемый набор ИФА совместим с производимым серотипом AAV.
  5. Анализ соотношения ВП из очищенных rAAV
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения соотношения вирусного капсидного белка (ВП) в каждом образце из отдельных скважин 24 глубоких скважин можно выполнить либо стандартный вестерн-блоттинг, либо автоматизированные протоколы на основе капилляров.
    1. Для обнаружения капсидных белков AAV2 VP1, VP2 и VP3 используйте первичное моноклональное антитело против AAV VP1/VP2/VP3. Убедитесь, что первичное антитело работает с соответствующим серотипом или вариантом капсида.
    2. Используйте подходящие положительные элементы управления, такие как рекомбинантные VP1, VP2 и VP3, или эталонный стандарт AAV.
    3. Приготовьте положительный контроль в молекулярном соотношении 1:1:10 (VP1:VP2:VP3), чтобы имитировать ожидаемое отношение VP. Это также служит эталоном для количественного определения отношения VP с помощью интеграции сигнальной области.
    4. Выберите капиллярный набор с подходящим диапазоном, который охватывает капсидные белки, которые необходимо обнаружить, включая самые маленькие (VP3 с ~ 60 кДа) и самые большие (VP1 с ~ 82 кДа). Это может варьироваться в зависимости от серотипа и используемого варианта капсида.
    5. Приготовьте реагенты и биотинилированный лесенок, входящие в комплект, в соответствии с инструкцией производителя.
    6. Приготовьте серию разведения образцов (либо на основе геномного титра, начиная с 1 ×10 12 вг/мл до 1 × 1010 вг/мл, либо 1:2 разведения, начиная с неразбавленного образца до 1:64) в предусмотренном для разведения набора, чтобы обеспечить хорошую дальность обнаружения для каждого образца.
    7. Разведите первичное антитело в предоставленном буфере для разведения антител в соответствии с инструкциями производителя или в зависимости от предыдущих испытаний. Начните с 1:100.
    8. Используйте соответствующий набор для обнаружения в зависимости от источника первичного антитела.
    9. Загрузите плиту согласно схеме, прилагаемой к комплекту.
    10. Обязательно заполните пустые колонки водой или буфером для разбавления проб, чтобы не повредить капилляры прибора сухим ходом.
    11. Накройте пластину уплотнительной пленкой и центрифугируйте при 1200 × г, 5 мин, при 4 °C.
    12. Перенесите пластину и капилляры на инструмент и используйте заранее заданные стандартные условия для прогона.
    13. Анализируйте прогон с помощью программного обеспечения для анализа данных, такого как Компас (версия 6.3.0)38.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа целостности, монодисперсности и чистоты частиц рекомендуется использовать просвечивающую электронную микроскопию с отрицательным окрашиванием (ns-TEM). ПЭМ-анализ может быть выполнен так, как описано Steininger et. AL25. Тем не менее, другие методы, такие как масс-фотометрия39, SEC-MALS40 и щепочное окрашивание41 , также могут обеспечить дополнительные показания для оценки качества препаратов rAAV.
  6. Трансдукция очищенными вирусными частицами
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансдукции клеток с очищенными вирусными векторами необходимо определить множественность инфекции (MOI). MOI определяется как количество геномов, содержащих частицы, добавляемых на клетку. Важно отметить, что это теоретическая величина; Фактическое количество геномов rAAV, доставляемых на одну клетку, зависит от способности капсида успешно трансдуцировать клетки-мишени. Поэтому оптимальный MOI всегда должен определяться экспериментальным путем. В этом разделе целью было сравнение двух вирусных векторных материалов, которые были получены с использованием различных методов очистки (ультрацентрифугирование хлорида цезия и аффинная смола AAVX). С этой целью с помощью двух препаратов трансдуцировали полученные от человека нейрональные культуры, а эффективность трансдукции оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии.
    1. Покройте 96-луночную черную оптическую нижнюю пластину 0,1% (поли-L-орнитин) PLO на ночь при температуре 4 °C или инкубируйте при 37 °C в течение ≥ 1 ч.
    2. В день посева аспирируйте реагент для покрытия PLO и покройте его матрицей базальной мембраны с пониженным фактором роста и инкубируйте при температуре 37 °C в течение ≥1 ч.
    3. Культивируйте моторные нейроны с помощью астроцитов в соотношении 1:6 или в соответствии с рекомендацией поставщика.
    4. Через 2 дня in vitro (DIV) презуйте сокультуру с MOI 50 000.
    5. Разморозьте вирусные аликвоты при 4 °C.
    6. Готовят трансдукционные среды (вирусные векторы с желаемым MOI на основе вирусных геномов на клетку + клеточные питательные среды в соответствующих объемах для замещения 50% питательных сред на лунку).
    7. Выполнение 50% обмена сред с трансдукционными средами.
    8. В 5 DIV выполняйте полный обмен медиа с обычными медиа культуры.
    9. Поддерживайте клетки с регулярной заменой питательных сред каждые 2-3 дня или в соответствии с рекомендацией поставщика.
    10. Контролируйте уровни экспрессии с помощью микроскопа с изображением в реальном времени, оснащенного правильным возбуждением репортерного трансгена. Для нейронов человеческого происхождения плато экспрессии наблюдается в период между 10-14 днями после трансдукции (см. рисунок 4A).
ШагБуфер/МатериалОбъем скважины [μл]Рабочий объем [μл]ЦикловРасход
[μл/мин]
1. УравновешиваниеРавновесие/
Промывка I буфера		11009502500
2. Загрузка/
Захвата		Проба надосадочной жидкости5505004
3. Моем IРавновесие/
Промывка I буфера		11009502
4. Стирка IIБуфер Wash II11009502
5. ЭлюированиеЭлюирующий буфер70 μL (20 μL Смоляные наконечники)
250 μL (80 μL Смоляные наконечники)		60 μL (20 μL Смоляные наконечники)
240 μЛ (80 μL Смоляные наконечники)		4
6. НейтрализацияБуфер нейтрализацииДобавьте 1/4 объема элюции непосредственно в каждый образец
70 мкл элюированного образца → добавить 17,5 мкл
250 мкл элюированного образца → добавить 62,5 мкл		--

Таблица 1: Схема расположения планшетов и параметры очистки для очистки аффинной смолой rAAV.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы спрос на производство векторов AAV в лабораторных масштабах значительно возрос, что привело к созданию многочисленных контрактных исследовательских организаций, предлагающих это вкачестве услуги. Учитывая высокие затраты и задержки в сроках, часто связанные с аутсорсингом, собственное производство rAAV остается привлекательным вариантом. В частности, протоколы с высокой пропускной способностью, которые минимизируют расход материала и рабочее время при одновременной интеграции этапов очистки, очень полезны в процессе разработки лекарств.

Этот протокол описывает две высокопроизводительные установки для производства rAAV: микро-6-луночный подход с использованием адгезивных клеток и протокол mini-HT24 для суспензионных клеток (см. обзор на рисунке 1). В микро-6-луночной установке используются адгезивные HEK293T ячейки для производства rAAV в 6-луночном формате. Этот материал был использован для оценки влияния двух коммерчески доступных реагентов для трансфекции PEI и хлорида натрия (NaCl) на продукцию rAAV2 (рис. 2A). При этом одновременно контролировались различные параметры: (i) жизнеспособность клетки-продуцента и эффективность трансфекции с использованием трансгена GFP (Рисунок 2B и дополнительный Рисунок 1), и (iii) процент GFP-положительных (GFP+) клеток после трансдукции сырыми лизатами (Рисунок 2C). Эксперимент по трансдукции послужил недорогим и быстрым косвенным считыванием векторных титров и функциональных возможностей. Интересно, что более низкие соотношения трансфекционного реагента к ДНК были достаточными для обеспечения эффективного производства векторов (рис. 2B) при сохранении хорошей жизнеспособности клеток. Кроме того, добавление 150 мМ NaCl оказалось полезным, особенно при использовании реагента PEIpro. Проведение этого эксперимента в микромасштабе дало несколько преимуществ: (i) быстрый рабочий процесс, при котором посев клеток, трансфекция и сбор векторов были завершены в течение одной недели; (ii) совместимость со стандартными аналитическими анализами на последующих этапах; и (iii) широкая применимость ко всем серотипам AAV.

Для приложений, требующих больших количеств векторов rAAV, таких как эксперименты in vivo или кинетические исследования in vitro (где применяется более высокий или более широкий диапазон MOI), необходимо масштабирование. Для создания протокола mini-HT24, который обеспечивает достаточное количество материала для высокопроизводительной очистки, были использованы суспензионные элементы. По сравнению с адгезивными клетками, суспензионные культуры обеспечивают лучшую масштабируемость и более компактны, поскольку они не ограничены площадью поверхности. Поскольку суспензионные клетки свободно растут в среде, они могут занимать весь объем культуры, что упрощает масштабирование в трех измерениях. Это позволяет достичь более высокой плотности клеток по сравнению с культурами слоев. Кроме того, системы подвески проще в обслуживании и обработке, так как не требуются этапы отсоединения во время проходки или сбора урожая. Равномерность производства rAAV в 24-луночном формате оценивалась путем анализа трех ключевых параметров на пластине (рис. 3): (A) титр частиц (vp/мл); (B) коэффициент VP в капсиде; (C) Геномный титр (vg/mL) и (D) Отношение пустого к полному.

Несмотря на то, что наблюдалась некоторая вариабельность по этим параметрам, она оставалась в основном в двукратном диапазоне, что находится в пределах погрешности измерения. Экспрессия белка VP также оценивалась с помощью автоматизированного вестерн-блоттинга (рис. 3E). Наконец, представлено сравнение общих выходов, полученных при производстве микро-6 лунок, мини-HT24 и среднемасштабного производства (встряхивающая колба) для руководства выбором подходящего масштаба на основе экспериментальных требований и последующих аналитических потребностей (рисунок 3F).

Важнейшим аспектом любого протокола очистки AAV является оценка чистоты и эффективности векторов. Здесь векторы, очищенные смолой, сравнивались бок о бок с векторами, очищенными с помощью двухступенчатого метода ультрацентрифугирования (UC) на основе хлорида цезия (CsCl) (рис. 4). Сопоставимая активность между двумя препаратами наблюдалась с помощью флуоресцентной микроскопии, о чем свидетельствует успешная трансдукция моторных нейронов и астроцитов (рис. 4А). Анализ с помощью электронной микроскопии не выявил существенных различий в форме частиц или состоянии агрегации. Тем не менее, наблюдалась небольшая тенденция, указывающая на то, что очистка CsCl более стабильно давала более чистые препараты (рисунок 4B).

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор подходов к производству и подготовке rAAV. На этом рисунке показаны методы производства rAAV, начиная от колб среднего масштаба и заканчивая культурами суспензии mini-HT24 и культурами с микро-6-луночной адгезией. Эти подходы позволяют получать rAAV в различных масштабах, используя различные стратегии лизиса клеток и очистки векторов. Окончательная характеристика rAAV обычно включает qPCR/dPCR для количественного определения вирусного генома (vg/mL), ИФА для определения титра капсида (vp/mL) и анализы клеточной трансдукции для оценки биологической активности. Создано в BioRender. Оланд,. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Оптимизация протокола трансфекции для микро-6-луночного производства rAAV. (А) Схематический обзор эксперимента с проверяемыми параметрами и аналитическими показаниями. (B) HEK293T клетки засеивали в 6-луночные планшеты с плотностью 0,5 ×10 6 клеток/лунку за 24 ч до трансфекции. Были протестированы различные количества ДНК, типы PEI (Pro или Max), соотношения и концентрации NaCl. (C) Процент GFP-положительных (GFP+) HEK293A клеток через 72 ч после трансдукции с равными объемами лизатов из панели А (10 мкл каждая). Для простоты показано только состояние ДНК, которое привело к наибольшему выходу вектора (2650 нг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Аналитическая характеристика rAAV, полученная в установке mini-HT24, и сравнение титров в различных масштабах. (A) Анализ методом иммуноферментного анализа очищенных титров капсида rAAV в каждой скважине. Значения представлены в виде отклонений от среднего титра частиц пластины после очистки. Ожидаемые титры зависят от используемого капсида AAV и упакованного трансгена. Титры частиц для различных векторов AAV варьировались от низких 1011 до высоких 1012 Впик/мл. (B) Анализ коэффициента VP с помощью WES очищенного rAAV из указанных скважин. Рекомбинантные AAV2 VP1, VP2 и VP3 использовали в качестве положительного контроля в молярном соотношении 1:1:10. (C) дПЦР-анализ очищенного rAAV из каждой лунки. Значения показаны в виде вариаций выше среднего геномного титра планшета после очистки. Ожидаемые титры зависят от используемого капсида AAV и упакованного трансгена. Геномные титры для различных векторов AAV варьировали от низких 1010 (rAAV2) до высоких 1011 vg/мл (rAAV9, здесь не показано). (D) Соотношение пустого к полному (E/F) указанных лунок, основанное на результатах геномного титроза и титров частиц из панелей A и C. Значения нормализованы до среднего значения в планшете. Показанное среднее значение E/F в формате mini-HT24 для rAAV2 составляет 10,6% ± 3,0% после очистки аффинной смолы AAVX. (E) Капиллярный вестерн-блоттинг белков VP в очищенных образцах rAAV2 из каждой лунки. (F) Сравнение общего количества выходов вирусного генома с учетом конечных объемов образцов и концентрации каждого метода. Данные представлены в виде разницы в среднем кратности по наименьшему формату (микро-6-лунка), с полосами погрешностей, указывающими на стандартное отклонение (SD) от биологических реплик. Для высокопроизводительной добычи из 24 скважин с аффинной очисткой смолы AAVX SD = ±0,176 (n = 24); для микро-6-луночной ультразвуковой обработки; SD = ±0,349 (n = 6); и для стандартного среднесерийного производства с градиентной очисткой CsCl SD = ±134,70 (n = 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Сравнение эффективности и чистоты между высокопроизводительным (HT) rAAV, очищенным смолой, и стандартными образцами, очищенными CsCl. (A) Полученные от человека моторные нейроны и астроциты трансдуцировали с помощью той же конструкции rAAV, экспрессирующей флуоресцентный репортер mRuby3 под промотором синапсина человека в качестве репортера при MOI 50 000. Изображения флуоресцентной микроскопии были получены на микроскопе с живой визуализацией через семь дней после трансдукции (DPT). rAAV очищали с использованием либо стандартного метода градиента CsCl (вверху), либо подхода, основанного на наконечнике аффинной смолы HT AAVX (внизу). Очищенные от CsCl образцы подвергали одному дополнительному циклу замораживания-оттаивания перед выполнением трансдукции и сравнивали с очищенными смолой rAAV. (B) Анализ с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) вариантов на основе серотипа rAAV2, очищенных с помощью градиента CsCl (вверху) и методом наконечника смолы HT (внизу). Две партии очищенных смолой HT образцов rAAV2 можно сравнить без диализа (внизу слева) и с диализом (внизу справа). Соотношение пустого к полному (E/F) определяли с помощью TEM и составляло > 90% заполнения для образцов, очищенных ультрацентрифугированием градиента CsCl, и < 40% заполнения для образцов, очищенных аффинной смолой AAX. Масштабная линейка = 100 нм. На панели В представлены репрезентативные изображения очищенных партий с использованием указанных методов. Обратите внимание, что эти изображения не относятся к тем же препаратам, которые использовались для экспериментов по трансдукции, показанным на панели А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1:Трансфекция HEK293T клеток для производства rAAV2-GFP с использованием микро-6-луночной установки. Для трансфекции использовали различные количества ДНК, концентрации NaCl (в мМ), продукты PEI и отношения PEI к ДНК (как описано на рисунке 2). Изображения были сделаны через 72 ч после трансфекции с использованием того же времени экспозиции (320 мс). На этом рисунке представлены репрезентативные изображения светлопольной и флуоресцентной микроскопии. Увеличение: 10X. Масштабная линейка не отображается; Изображение предназначено только для иллюстративных целей и качественной оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом документе по протоколу описываются эффективные методы получения rAAV в условиях высокой пропускной способности в небольших масштабах с использованием как адгезивных, так и суспензионных ячеек. Эти методологии отвечают растущему спросу на масштабируемые и гибкие производственные процессы rAAV, которые поддерживают доклинические исследования при минимизации времени, затрат и потребления ресурсов.

Как адгезивные, так и суспензионные системы ячеек имеют явные преимущества и проблемы для мелкосерийного производства rAAV. Адгезивные клеточные системы, такие как HEK293T клетки28 , выращенные в форматах многолуночных планшетов, особенно хорошо подходят для векторного дизайна на ранних стадиях и сравнительных исследований. Их совместимость с установленными протоколами культивирования и трансфекции позволяет легко внедрить их в большинстве лабораторий. Например, Grosse et al. использовал мелкосерийное производство в 6-луночных планшетах для исследования функциональности AAP, белка, имеющего решающее значение для сборки вирусного капсида22. Drittanti et al. получили векторы rAAV в 96-луночных планшетах для оценки кинетики репликации rAAV и проверки влияния различных аденовирусных хелперовна продукцию rAAV. Примечательно, что в последнем исследовании был описан репликационный анализ с использованием специализированных клеток HeLa, экспрессирующих AAV Rep и Cap для дальнейшей амплификации сигнала. Совсем недавно Quan et al. применили протокол производства на 384 лунки с высокой пропускной способностью в контексте скрининга миРНК, сообщив об относительных титрах24. Однако, учитывая ограниченное количество материала, до сих пор остается неясным, сколько анализов и считывания может быть проведено, или могут ли быть достигнуты достаточные MOI в экспериментах по клеточной трансдукции, помимо измерения флуоресцентных белков, что потенциально влияет на воспроизводимость.

В данной работе для оптимизации условий культивирования rAAV2 было использовано производство микро-6-лунок в адгезивных HEK293T клетках (рис. 1 и рис. 2). В соответствии с предыдущими исследованиями и техническими отчетами43,44, более низкое соотношение PEI-to-DNA и добавление NaCl во время трансфекции положительно повлияли на продукцию rAAV. Это косвенно отражалось на эффективности трансдукции полученных векторов в HEK293A клетках. Поразительные различия, наблюдаемые при более низком соотношении PEI:ДНК, в основном объяснялись клеточным стрессом, на что указывает низкая жизнеспособность клеток, особенно при использовании PEIpro. Хотя эффекты были менее заметны в условиях PEImax, микроскопические изображения выявили свободные от клеток участки в клеточном слое, что указывает на стресс или отслоение клеток (дополнительный рисунок 1).

Важно отметить, что эти результаты не были непосредственно применимы к продукции векторов в суспензионных культурах, подчеркивая, что экспериментальные условия, повышающие продукцию rAAV в адгезивных HEK293T клетках, не всегда могут трансформироваться в суспензионные клетки, даже если основной тип клеток остается прежним. Это расхождение может быть связано с различиями на транскриптомном и протеомном уровнях между этими двумясистемами. Следовательно, более тесная согласованность с клиническими производственными процессами может потребовать использования суспензионных культур на ранних стадиях разработки. Основываясь на этих наблюдениях и преимуществе достижения более высокой плотности клеток в суспензии, была принята система с глубиной 24 лунки для производства rAAV в минимасштабных суспензионных культурах (mini-HT24). Эта система прошла обширную валидацию, продемонстрировав стабильные титры vg/мл и vp/мл на планшете, а также равномерную экспрессию и соотношения белков VP (рис. 3A-E). Действительно, более высокая плотность ячеек, достигнутая в установке mini-HT24 (3 × 106 клеток/мл) по сравнению с микро-6-луночным форматом (5 × 105 ячеек на лунку), привела к более высоким титрам rAAV, как показано на рисунке 3F. Это подчеркивает ключевое преимущество систем на основе суспензии, которые не ограничены площадью поверхности емкости для культивирования. Однако для внедрения таких систем требуется специализированное оборудование, которое может быть доступно не во всех лабораториях. Наконец, рекомендуется провести дальнейшую валидацию идентифицированных молекул свинца или превосходных условий культивирования из системы mini-HT24 с использованием систем мини-биореакторов, таких как AMBR15 или AMBR250, поскольку было показано, что эти системы более точно имитируют условия производства в больших биореакторах 46,47.

Выбор уровня очистки играет решающую роль в определении пригодности препаратов rAAV для конкретных последующих применений. Сырые лизаты, полученные как из адгезивных (микро-6-луночных), так и из суспензионных культур (mini-HT24), обеспечивают быстрый и ресурсоэффективный вариант для предварительных скрининговых анализов. Эти лизаты содержат смесь вирусных частиц, клеточного мусора и компонентов среды, что приемлемо для таких приложений, как векторный геном/титр частиц, скрининг эффективности трансдукции и вестерн-блоттинг. Особенно применимо в исследованиях, посвященных фундаментальным биологическим вопросам (как показано выше в исследовании функциональности AAP), оптимизации состояния клеточных культур, а также доклиническому скринингу и отбору кандидатов. Однако присутствие примесей может потребовать более высоких разведений, что приведет к снижению чувствительности анализа. Кроме того, примеси могут негативно влиять на жизнеспособность чувствительных типов клеток, таких как первичные клетки.

В отличие от сырых лизатов, аффинные препараты, очищенные смолой AAVX, используемые исключительно в протоколе на основе суспензии, достигают более высокого уровня чистоты за счет селективного выделения интактных капсидов. Это позволяет преодолеть ограничения сырых клеточных лизатов, что делает эти препараты более подходящими для таких применений, как исследования in vivo , а также для детального анализа кинетики экспрессии трансгенов in vitro и точных функциональных показаний, для которых часто требуется большее количество материала (см. сравнение урожайности на рисунке 3F). Для применений in vitro выходы векторов rAAV, полученных в условиях mini-HT24, обычно были достаточными для большинства считываний, в зависимости от количества клеток и требуемых MOI. Напротив, применение in vivo обычно требует производства в масштабах колбы midi-shake или больше, в зависимости от дозы, способа введения и модели животного. Несмотря на повышенную стоимость и время, необходимые для очистки, однородность и надежность получаемого материала часто оправдывают инвестиции в критически важных случаях использования. В частности, результаты, показанные на рисунке 4 , демонстрируют, что векторы rAAV, очищенные с помощью методов аффинной смолы, работают сопоставимо с векторами, очищенными с помощью традиционного ультрацентрифугирования хлорида цезия (CsCl). Это согласуется с предыдущими наблюдениями о том, что пустые капсиды либо не влияют на трансдукцию, либо даже могут усиливать ее, в зависимостиот присутствующих видов AAV. Однако важно отметить, что в этом эксперименте использовались только один MOI и одна временная точка, и оптимальные условия должны быть определены индивидуально для каждого типа клеток. В то время как очистка CsCl обычно дает более чистый фон, AAV, очищенные смолой HT, демонстрируют большую вариабельность чистоты (см. изображения TEM на рисунке 4). В совокупности эти результаты еще больше поддерживают внедрение высокопроизводительных небольших рабочих процессов.

Использование небольших наконечников, наполненных аффинной смолой, в высокопроизводительной очистке обеспечивает практическое решение для быстрого скрининга rAAV, но некоторые технические аспекты требуют внимания для получения надежных результатов. Из-за ограниченного объема слоя смолы эти наконечники особенно подвержены засорению, особенно при переработке сырых лизатов. Следовательно, осветление лизатов с помощью высокоскоростного центрифугирования имеет важное значение для удаления клеточного мусора перед загрузкой, так как недостаточное осветление может снизить скорость потока и поставить под угрозу выход продукции. Для установки mini-HT24 рекомендуется оптимизировать протоколы трансфекции и поддерживать максимальный рабочий объем 2,5-3 мл на лунку. При работе с различными серотипами или капсидными библиотеками рекомендуется тестировать различные типы смол аффинности, так как эффективность связывания и восстановления может варьироваться в зависимости от структуры капсида49. Портативная электронная многоканальная система пипетирования позволяет легко интегрировать этот рабочий процесс в небольших лабораториях, обеспечивая гибкость без необходимости автоматизации. Однако ручная обработка может привести к изменчивости и различиям между партиями. Для большей согласованности могут быть полезны автоматизированные платформы для работы с жидкостями. Следует уделять особое внимание предотвращению перекрестного загрязнения во время добавления проб и буфера, а также использование соответствующих форматов планшетов с достаточным объемом лунок имеет важное значение для предотвращения переполнения. Учтение этих аспектов, включая осветление проб, оптимизацию протокола, выбор смолы и тщательное пипетирование, позволяет исследователям свести к минимуму технические проблемы и повысить надежность и воспроизводимость высокопроизводительных небольших рабочих процессов аффинной очистки.

В заключение следует отметить, что сочетание высокопроизводительных методов мелкомасштабного производства rAAV со стратегиями очистки, специфичными для конкретного применения, обеспечивает универсальную платформу для продвижения исследований в области генной терапии. Эти протоколы удовлетворяют растущий спрос на экономичные и эффективные рабочие процессы, сохраняя при этом гибкость для удовлетворения разнообразных экспериментальных требований. Балансируя между чистотой, масштабируемостью и потреблением ресурсов, исследователи могут ускорить доклинические разработки и облегчить переход к клиническому применению.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Джулия Фахири с благодарностью признательна за поддержку в рамках постдокторской стипендии «Рош». Данные электронной микроскопии были получены на крио-ЭМ установке Roche Nautilus. Мы благодарим Морица Классена и Любомира Ковачика за их вклад в работу и поддержку объекта.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% Небуферизованный физиологический растворБ. Браун, Мельзунген, Германия7647-14-5Буфер для промывки II
1 М Гидрохлорцирковая кислотаMerck Millipore, Берлингтон, Массачусетс, США1099700050Регулировка pH буферных растворов
10x Буфер DNase IThermo Fisher Scientific, Уолтем, СШАAM8170GddPCR/dPCR
1М Tris-HCl, pH 9,0Thermo Fisher Scientific, Уолтем, СШАДж60707. АПБуфер нейтрализации
Микропланшеты на 24 лункиEnzyscreen, Хемстеде, НидерландыCR1424clОборудование для суспензионного культивирования
Поликарбонатная колба Эрленмейера 250 мл с вентиляционным колпачкомКорнинг, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США431144Оборудование для суспензионного культивирования
Разделение 66 - 440 кДа 8x25 капиллярных картриджейBioTechne, Миннеаполис, Миннесота, СШАСМ-В008Автоматизированный набор для блоттинга
96 Лунка 2,2 мл Полипропилен DeepWell Thermo Fisher Scientific, Уолтем, СШААБ0661Планшет для обработки и хранения образцов
96 лунок черный/прозрачная нижняя пластина, поверхность TCThermo Fisher Scientific, Уолтем, США165305Трансдукционные анализы
AAV2 VP1, рекомбинантный белокPROGEN, Гейдельберг, Германия640823Реагент Уэса
AAV2 VP2, рекомбинантный белокPROGEN, Гейдельберг, Германия640824Реагент Уэса
AAV2 VP3, рекомбинантный белокPROGEN, Гейдельберг, Германия640825Реагент Уэса
AAV2 Xpress ELISAPROGEN, Гейдельберг, ГерманияPRAAV2XPИспользуется для очищенных образцов из HT-смолы.
Модуль защиты от мышей для WesBioTechne, Миннеаполис, Миннесота, СШАДМ-002Автоматизированный набор для блоттинга
Прямой праймер для анализа/шаблонаОбычайОбычайddPCR/dPCR
Пробник для анализа/шаблонаОбычайОбычайddPCR/dPCR
Обратный праймер для анализа/шаблонаОбычайОбычайddPCR/dPCR
BalanCD HEK293 - ЖидкийFUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC, Санта-Ана, Калифорния, СШАNC1192689Среда для культивирования суспензии клеток
Бычья сыворотка альбумин Электрофорез SERVA, Гейдельберг, ГерманияcBovine Serum AlbuminДобавка к адгезивной клеточной среде
Дышащая вискозная пленка, стерильная VWR International LLC, Раднор, Пенсильвания, США391-1262Оборудование для суспензионного культивирования
Амплификатор C1000Bio-Rad Laboratories, Геркулес, США1851096ддПЦР
Набор ИФА для устранения утечки лиганда CaptureSelec AAVXThermo Fisher Scientific, Уолтем, США8113522000ЭЛИЗА
Анализатор Cedex HiRes Roche Holding AG, Базель, Швейцария5650216001Счетчик ячеек
Микропланшет для культивирования клеток, 96 лунокGreiner Bio-One, Kremsmü nster, Австрия655162Оборудование для культивирования адегегенных клеток
Лимонная кислотаSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США5949-29-1Реагент для очистки; ОСТОРОЖНОСТЬ
Камера на базе CMOS ТЭМ TVIPS XF416 Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, Гильчинг, ГерманияXF416 Система обработки видео и изображений
Программное обеспечение «Компас» (версия 6.3.0)BioTechne, Миннеаполис, Миннесота, СШАПрограммное обеспечение WES
Многолуночные многолуночные планшеты Costar с 6 лунками с прозрачным покрытием TCКорнинг, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США    3516Оборудование для культивирования адегегенных клеток
Масло для генератора капель ddPCR Bio-Rad Laboratories, Геркулес, США#1864110Реагент ddPCR
Считыватель капель ddPCR Oil Bio-Rad Laboratories, Геркулес, США#1863004Реагент ddPCR
ddPCR Supermix для зондов (без dUTP) Bio-Rad Laboratories, Геркулес, США#1863023Реагент ddPCR
ДМЭМ, высокий уровень глюкозыThermo Fisher Scientific, Уолтем, США11960044Среда для адгезивной клеточной культуры
ДМЭМ, низкий уровень глюкозыThermo Fisher Scientific, Уолтем, США11885084Среда для адгезивной клеточной культуры
ДНК с низким связыванием 96 луночных планшетовEppendorf, Гамбург, Германия30129504ddPCR/dPCR
Пробирки с низким связыванием ДНКEppendorf, Гамбург, Германия30108051ddPCR/dPCR
ДПБСThermo Fisher Scientific, Уолтем, США14190094Буфер для промывки
Сетки EM (T600H-Cu 698 л/дюйм Шестигранная сетка Тонкий стержень; ЭМС)Электронная микроскопия, Хатфилд, Пенсильвания, СШАFFTH600-Cu-ULАнализ методом электронной микроскопии
Система визуализации EVO M5000Thermo Fisher Scientific, Уолтем, СШАAMF5000Микроскоп с изображением в реальном времени для трансдукционных анализов
EZ Стандарт Пак 3BioTechne, Миннеаполис, Миннесота, СШАПС-СТ03ЭЗ-8Автоматизированный набор для блоттинга
Falcon 15mL Конические центрифужные пробиркиFisher Scientific, Шверте, Германия11507411Обработка образцов
Falcon 50mL Конические центрифужные пробиркиFisher Scientific, Шверте, Германия10203001Обработка образцов
Geltrex LDEV-Free Матрица базальной мембраны с пониженным фактором ростаThermo Fisher Scientific, Уолтем, США  A1413201Покрытие культуральной пластины
Добавка GlutaMAX (L-Alanyl-L-Glutamine)Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США35050061Добавка к адгезивной клеточной среде
HEK293AThermo Fisher Scientific, Уолтем, СШАР70507Трансдукционные анализы (только для исследовательского использования)
HEK293TATCC, Манассас, Вирджиния, СШАКРЛ-3216Адгегентная клеточная культура, используемая для производства rAAV (только для исследовательского использования)
Решение HEPES, 1МMerck, Дармштадт, Германия#H0887Добавка к адгезивной клеточной среде
HL-соль активная нуклеаза, SAN (25 U/&микро; L)ArcticZymes Technologies, Тромс, Норвегия70910-202ddPCR/dPCR
Микропластинчатая шайба HydroSpeedTecan, Mä nnedorf, Швейцария30190101ЭЛИЗА
Набор астроцитов iCell, 01434FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Мэдисон, штат Висконсин, СШАР1092Трансдукционные анализы
Набор для моторных нейронов iCell, 01279FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Мэдисон, штат Висконсин, СШАР1051Трансдукционные анализы
Бесконечное 200 PROTecan, Mä nnedorf, Швейцария30213617ЭЛИЗА
JEM-1400Plus — просвечивающий электронный микроскопJEOL Ltd., Акисима, Токио, ЯпонияДЖЕМ-1400ПлюсПросвечивающий электронный микроскоп
Многослойная крышка с низким испарением и штифтамиEnzyscreen, Хемстеде, НидерландыCR1224cОборудование для суспензионного культивирования
Считыватель микропланшетов  СпектраМакс i3Molecular Devices, Сан-Хосе, Калифорния, СШАi3xЭЛИЗА
Мышиный анит-AAV2 VP1/VP2/VP3 моноклональное антителоPROGEN, Гейдельберг, Германия690058Реагент Уэса
Вода без нуклеазы Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия3036430103ddPCR/dPCR
Opti-MEM, Средство для пониженного содержания сыворотки Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США#31985070Среда для образования комплекса ПЭИ-ДНК
ПБС Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США#10010023Буфер для промывки
PEI-MAX, полиэтиленимин, 1 мг/млПолинауки Европа,  Hirschberg an der Bergstraß e, Германия24765 или 24765Реагент для трансфекции
ПЭИпроPolyplus, Иллкирх-Граффенштаден, Франция101000033/10 млРеагент для трансфекции
Пластина для микродиализа Pierce, 96 лунок, 0,3 мл, 20K MWCOThermo Fisher Scientific, Уолтем, СШАА50472Очистное оборудование
Полоксамер 188Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАP5556-100mLРеагент для клеточных культур; ОСТОРОЖНОСТЬ
Раствор поли-L-орнитина (0.01%)Сигма-ОлдричА-004-МТрансдукционные анализы
Раствор протеиназы К (20 мг/мл)Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США25530049ddPCR/dPCR
ПротеинПростой» Уэс»BioTechne, Миннеаполис, Миннесота, США004-600Прибор для лечения останки вестерн-блоттинг
Восьмиплатформенная система QIAcuityQiagen, Хильден, Германия911052дПЦР
QIAcuity Nanoplate 8.5k 96-луночныйQiagen, Хильден, Германия250021ddPCR/dPCR
Набор для ПЦР QIAcuity ProbeQiagen, Хильден, Германия250101, 250102 или 250103ddPCR/dPCR
Программный комплекс QIAcuity 1.2Qiagen, Хильден, ГерманияПрограммное обеспечение для дПЦР
Менеджер по QX Bio-Rad Laboratories, Геркулес, СШАПрограммное обеспечение ddPCR
QX200 Считыватель капельBio-Rad Laboratories, Геркулес, США1864003ддПЦР
Микропробирка с завинчивающейся крышкой, 1,5 мл, протестирована на эффективность ПЦРSarstedt, Nü mbrecht, Германия72.703.416Оборудование для суспензионного культивирования
Завинчивающаяся крышка, DNA LoBind, 5,0 млEppendorf, Гамбург, Германия30122348Оборудование для суспензионного культивирования
Шейкер ИнкубаторInfors AG, Боттминген, ШвейцарияМультитронОборудование для суспензионного культивирования
Пируват натрия (100 мМ)Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США11360070Среда для адгезивной клеточной культуры
Ультразвуковая система микропластин рупораQSonica, Ньютаун, Коннектикут, СШАQ700MPXCУльтразвуковая аппаратура для получения сырого лизата
ДУХСсылка на базу данных SPIRIT: https://spirit.cladiac.com/aav.html 
Steriflip-GP Стерильная центрифужная трубка с верхним фильтромMerck Millipore, Берлингтон, Массачусетс, СШАSCGP00525Оборудование для приготовления буфера
T-175, КОЛБА ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР, 550 МЛ, 175 СМ²Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Австрия660175Оборудование для культивирования адегегенных клеток
Трипсин/ЭДТА 0,025%Thermo Fisher Scientific, Уолтем, СШАR001100Реагент для клеточных культур
Вирусные клетки, продуцирующие 2.0 (VPC2.0)Thermo Fisher Scientific, Уолтем, СШАА49784 или А51218Производство rAAV
Дж63596. К2Разбавить 1:10 для рабочего раствора PBST

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singh, N. Drug discovery and development: Introduction to the general public and patient groups. Front. Drug Discov. 3, 1201419(2023).
  2. Thakur, G., Mink, S., Bak, H., Tustian, A. D. Improving process efficiency to reduce cost-of-goods per dose in manufacturing of recombinant AAVs. Cell Gene Ther. Insights. 10 (3), 479-499 (2024).
  3. Reid, C. A., Hörer, M., Mandegar, M. A. Advancing AAV production with high-throughput screening and transcriptomics. Cell Gene Ther. Insights. 10 (6), 821-840 (2024).
  4. Matsunaga, R., Tsumoto, K. Accelerating antibody discovery and optimization with high-throughput experimentation and machine learning. J. Biomed. Sci. 32 (1), 46(2025).
  5. Pereira, D. A., Williams, J. A. Origin and evolution of high-throughput screening. Br. J. Pharmacol. 152 (1), 53-61 (2007).
  6. Aldewachi, H., Al-Zidan, R. N., Conner, M. T., Salman, M. M. High-throughput screening platforms in the discovery of novel drugs for neurodegenerative diseases. Bioengineering. 8 (2), 30(2021).
  7. Liu, H., et al. Producing high-quantity and high-quality recombinant adeno-associated virus by low-cis triple transfection. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 32 (2), 101230(2024).
  8. Blessing, D., et al. Scalable production of AAV vectors in orbitally shaken HEK293 cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 13, 14-26 (2019).
  9. Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol. Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  10. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  11. Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
  12. Strobel, B., et al. Standardized, scalable, and timely flexible adeno-associated virus vector production using frozen high-density HEK-293 cell stocks and CELLdiscs. Hum. Gene Ther. Methods. 30 (1), 23-33 (2019).
  13. Rumachik, N. G., et al. Methods matter: Standard production platforms for recombinant AAV produce chemically and functionally distinct vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 18, 98-118 (2020).
  14. Merten, O. W. AAV vector production: State of the art developments and remaining challenges. Cell Gene Ther. Insights. 2 (5), 521-551 (2016).
  15. Trivedi, P. D., et al. Comparison of highly pure rAAV9 vector stocks produced in suspension by PEI transfection or HSV infection reveals striking quantitative and qualitative differences. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 24, 154-170 (2022).
  16. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
  17. Wada, M., et al. Large-scale purification of functional AAV particles packaging the full genome using short-term ultracentrifugation with a zonal rotor. Gene Ther. 30 (7-8), 641-648 (2023).
  18. Kronenberg, S., Böttcher, B., von der Lieth, C. W., Bleker, S., Kleinschmidt, J. A. A conformational change in the adeno-associated virus type 2 capsid leads to the exposure of hidden VP1 N termini. J. Virol. 79 (9), 5296-5303 (2005).
  19. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  20. Shiraishi, Y., Adachi, T., Cacicedo, J. M., Ido, Y. Development of a high-yield, high-quality purification process for adeno-associated virus vectors that can be used in vivo without ultracentrifugation: Application to a lung endothelial cell-targeted adeno-associated virus. FASEB J. 36 (12), e22653(2022).
  21. Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
  22. Grosse, S., et al. Relevance of assembly-activating protein for adeno-associated virus vector production and capsid protein stability in mammalian and insect cells. J. Virol. 91 (20), (2017).
  23. Drittanti, L., Rivet, C., Manceau, P., Danos, O., Vega, M. High throughput production, screening and analysis of adeno-associated viral vectors. Gene Ther. 7 (11), 924-929 (2000).
  24. Quan, D. N., Shiloach, J. rAAV production and titration at the microscale for high-throughput screening. Hum. Gene Ther. 33 (1-2), 94-102 (2022).
  25. Steininger, T., et al. Improved recombinant adeno-associated viral vector production via molecular evolution of the viral Rep protein. Int. J. Mol. Sci. 26 (3), 1319(2025).
  26. Fisher, K., et al. Polo-like kinase inhibitors increase AAV production by halting cell cycle progression. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 33 (1), 101412(2025).
  27. Chen, K., et al. Advanced biomanufacturing and evaluation of adeno-associated virus. J. Biol. Eng. 18 (1), 15(2024).
  28. DuBridge, R. B., et al. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol. Cell. Biol. 7 (1), 379-387 (1987).
  29. Börner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Mol. Ther. 28 (4), 1016-1032 (2020).
  30. Weinmann, J., et al. Identification of broadly applicable adeno-associated virus vectors by systematic comparison of commonly used capsid variants in vitro. Hum. Gene Ther. 33 (21-22), 1197-1212 (2022).
  31. Westhaus, A., et al. High-throughput in vitro, ex vivo, and in vivo screen of adeno-associated virus vectors based on physical and functional transduction. Hum. Gene Ther. 31 (9-10), 575-589 (2020).
  32. Yang, S., Shi, H., Chu, X., Zhou, X., Sun, P. A rapid and efficient polyethylenimine-based transfection method to prepare lentiviral or retroviral vectors:useful for making iPS cells and transduction of primary cells. Biotechnol. Lett. 38 (9), 1631-1641 (2016).
  33. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Adeno-associated virus vectors, design and delivery. Methods Mol. Biol. 1950, 51-83 (2019).
  34. Wang, G., et al. Assessment of key factors impacting variability in AAV vector genome titration by digital PCR. Int. J. Mol. Sci. 25 (10), 5149(2024).
  35. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Front. Microbiol. 10, 1570(2019).
  36. Duong, T., Firmo, M., Li, C. T., Gu, B., Wang, P. Three-dimensional linkage analysis with digital PCR for genome integrity and identity of recombinant adeno-associated virus. Sci. Rep. 15 (1), 2154(2025).
  37. Tereshko, L., et al. A novel method for quantitation of AAV genome integrity using duplex digital PCR. PLOS ONE. 18 (12), e0293277(2023).
  38. Sormunen, A., et al. Comparison of automated and traditional Western blotting methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
  39. Hiemenz, C., et al. Characterization of virus particles and submicron-sized particulate impurities in recombinant adeno-associated virus drug product. J. Pharm. Sci. 112 (8), 2190-2202 (2023).
  40. McIntosh, N. L., et al. Comprehensive characterization and quantification of adeno associated vectors by size exclusion chromatography and multi angle light scattering. Sci. Rep. 11 (1), 3012(2021).
  41. Su, Q., Sena-Esteves, M., Gao, G. Analysis of recombinant adeno-associated virus (rAAV) purity using silver-stained SDS-PAGE. Cold Spring Harb. Protoc. (8), pdb.prot095679(2020).
  42. Capra, E., Gennari, A., Loche, A., Temps, C. Viral-vector therapies at scale: Today's challenges and future opportunities . , McKinsey & Company. https://www.mckinsey.com/industries/life-sciences/our-insights/viral-vector-therapies-at-scale-todays-challenges-and-future-opportunities (2022).
  43. Huang, X., et al. AAV2 production with optimized N/P ratio and PEI-mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications. J. Virol. Methods. 193 (2), 270-277 (2013).
  44. Development of a novel cell culture medium for AAV production with multiple HEK293 lineages and process optimization. , Merck. https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/pharmaceutical-and-biopharmaceutical-manufacturing/gene-therapy-manufacturing/development-of-novel-cell-culture-medium-aav-production (2025).
  45. Malm, M., et al. Evolution from adherent to suspension: Systems biology of HEK293 cell line development. Sci. Rep. 10 (1), 18996(2020).
  46. Warr, S. R. C. Animal cell biotechnology, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 2095, 43-67 (2019).
  47. Manahan, M., et al. Scale-down model qualification of ambr 250 high-throughput mini-bioreactor system for two commercial-scale mAb processes. Biotechnol. Prog. 35 (6), e2870(2019).
  48. Wang, Q., et al. Syngeneic AAV pseudo-particles potentiate gene transduction of AAV vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 4, 149-158 (2017).
  49. Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 28, 146-159 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Recombinant AAVHigh Throughput ProductionGene TherapyAAV Vector ProductionMicroscale AAVMiniscale AAVHEK 293T CellsCell Transduction AssayVector Genome TitrationWestern Blot

Похожие статьи