Методическая статья

Микробиореакторное производство мезенхимальных стромальных клеток, зависящих от анкеража, подготовленных к острому респираторному дистресс-синдрому

DOI:

10.3791/68650

⸱

12 декабря 2025 г.

 ,  ,  , 
1Harvard-MIT Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Departments of Materials Science & Engineering and Biomedical Engineering, Cornell University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описан протокол для производства клеток, зависящих от якоря, с помощью микроносителя-микробиореактора, как потенциальных клеточных терапий. В целях применения острого респираторного дистресс-синдрома показаны сопоставимый клеточный выход и благоприятная экспрессия генов по сравнению с процессами, основанными на колбах. Этот протокол расширяется на другие клетки, зависящие от анкеража, и на целевые показания.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточная терапия — это новый терапевтический подход к лечению ряда заболеваний. Однако производство достаточного количества качественных клеток остаётся активной научной и технической задачей. Конечный клеточный продукт нельзя стерилизовать; поэтому стерильность и качество по дизайну имеют первостепенное значение. Для клеток, зависящих от якоря, экспансия на основе колбы всё ещё используется на уровне развития и промышленности, требующая больших физических следов, ограничивая контроль биохимической среды (pH,CO2 иO2, диффузионные градиенты питательных веществ и метаболитов) и обеспечивая физические сигналы, влияющие на качество конечной клетки. Эти трудности побудили внедрять методы производства на основе биореакторов, но такие подходы обычно реализуются на объемных масштабах, которые создают вызовы и могут быть слишком дорогими для исследовательских лабораторных исследований или разработки процессов. Сообщается, что производство клеточной терапии микробиореактором и микроносителем обеспечивает биохимический контроль при культуре тестового случая клеточного источника — мезенхимальных стромальных клеток. Для первоначальной оценки качества клеток in vitro рассматривался острый респираторный дистресс-синдром как потенциальный сценарий применения. Приведённый здесь подход позволяет быстро развивать процессы на настольных масштабах благодаря малому (2 мл) объёму и строгому биохимическому контролю в микробиореакторе. Для этого для якорных клеток, таких как мезенхимальные стромальные клетки, потребовалась значительная модификация процесса микробиореактора и использовалась желатиновая микронесущая платформа, производимая собственным методом микрофлюидного процесса. Здесь подробно показаны параметры метода и процесса, используемые для культивирования таких клеток, зависящих от якоря, в микробиореакторе, с целью позволить другим исследователям адаптировать эти практики для своих собственных сценариев и типов источников клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование живых клеток в качестве терапевтического продукта недавно стало перспективным новым вариантом лечения ряда проблем со здоровьем. Например, Т-клетки химерного антигенного рецептора (CAR) обеспечили устойчивую ремиссию у пациентов с так называемыми жидкостными видами рака — лейкемией, лимфомой и множественной миеломой — которые были устойчивы ко всем ранее доступным методамлечения 1. В последнее время был одобрен продукт мезенхимальных стволовых/стромальных клеток (MSC) (Ryoncil) для лечения детей с острой болезнью трансплантата против хозяина (SR-aGvHD), состоянием с > 50%смертности 2. Но расширение других неудовлетворённых клинических потребностей требует интенсивной разработки как терапии, так и средств для разработки и производства этого продукта.

Одна из таких неудовлетворённых клинических потребностей встречается у людей, страдающих от острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). ARDS обсуждается здесь, чтобы предоставить конкретный сценарий применения для иллюстрации метода, результатов и обсуждения возможных расширений для других целевых заболеваний. Критический (прогрессирование от часов до дней), распространённый (> 200 000 случаев в год в США) и смертельный показатель (27%-46% смертность, в зависимости от тяжести проявления), ОРДС вновь привлёк широкое внимание во время пандемии COVID-19 как типичный механизм смерти для пациентов, инфицированных SARS-CoV-2 3,4. ОРДС характеризуется повышенной проницаемостью лёгочных сосудов, что приводит к интерстициальным отёкам, альвеолярному затоплению и проникновению клеточных компонентов, включая нейтрофилы и эритроциты, вальвеолярный компартмент 5. В начальной эксудативной фазе ОРДС воспаление, опосредованное врожденными иммунными клетками, вызывает эти патогенные эффекты, нарушая целостность эндотелиального и эпителиального барьера и способствуя рекрутации и активации иммунных клеток через секрецию провоспалительных цитокинов; Успешное устранение воспалительного ответа, восстановление целостности барьера и предотвращение чрезмерного фиброза критически важны длявыживания 3. Хотя противовирусные терапии, такие как Ремдесивир, показали перспективы в борьбе с ОРДС, опосредованной SARS-CoV-2, для других этиологий в настоящее время не существует одобренных фармакологических вмешательств, снижающихсмертность 5.

MSC могут предложить перспективный подход к лечению ОРДС, учитывая их специфический для лёгких тропизм при системной инъекции и способность выделять иммуномодуляторные паракринные сигналы в окружающуюмикросреду 6,7. Механистические исследования показали, что экспрессия таких паракринных факторов, как интерлейкин-10 (IL-10)8, индолеамин 2,3-диоксигеназа 1 (IDO1)9, простагландин E2 (PGE2)10 и других, способствует предполагаемой терапевтической эффективности MSC при различных показаниях, включая острое повреждение лёгких (ALI)/ARDS 11; следовательно, уровни экспрессии этих продуктов генов представляют собой потенциальные критические атрибуты качества (pCQA), которые могут предсказывать клиническую эффективность, обеспечивая приемлемые критерии высвобождения конечного клеточного продукта во время производства. Однако произведение достаточного количества клеток для достижения эффективной терапевтической дозы — задача; Рёнцил, например, рекомендуется для дозировки 2 x 106 клеток/кг массы пациента, вводя два раза в неделю в течение 4недель 12. Для пациента весом 80 кг это эквивалентно >1,2 миллиарду MSC за один курс лечения, что требует большого физического следа для размещения достаточной площади поверхности для такого двумерного роста. Учитывая, что этот продукт живой клетки нельзя стерилизовать до введения пациента без ущерба терапевтическому потенциалу клеток, использование действующих руководящих принципов хорошей производственной практики для стерильного производства имеет первостепенное значение, что увеличивает логистическую сложность производства клеток и, следовательно, стоимостьтоваров 13.

Кроме того, предыдущие исследования показали доказательства того, что типичное производство MSC в колбах полистирола тканевых культур (TCPS) способствует возникновению внутрипопуляционной фенотипической гетерогенности. Для некоторых конечных целей это делает работу по контролю качества между партиями сложной как в исследованиях, так и в клиническомпереводе 14,15,16,17. Предполагается, что ограниченный биохимический контроль, доступный в колбах TCPS, включая диффузионные градиенты газов, питательных веществ и метаболических отходов, плохую регуляцию pH и т.д., способствует этим проблемам.

Эти проблемы мотивируют внедрение культуры на основе биореакторов для использования превосходной биохимической регуляции и плотности клеток, доступных в контролируемом трёхмерном формате роста с динамическимсмешиванием 18. Однако обработка или производство на основе биореакторов имеют свои сложности: как тип клеток, зависящий от якоря, MSC требует определённого субстрата для выращивания в биореакторе, что требует добавления микроносителей. Кроме того, многие коммерчески доступные биореакторы работают на масштабах с чрезмерно ресурсоёмкими масштабами (> 3 л среды роста) для проведения исследовательских лабораторных исследований, необходимых для выявления и уточнения неизвестных параметров процесса, влияющих на выражение измеримых показателей качества клеток. Эти признаки описываются как потенциальные критические атрибуты качества или pCQA19.

Крупчак и др. ранее сообщали о подходе микроносителя с микробиореактором, который давал МСК с улучшенной экспрессией pCQA для ОРДС, ограниченный оценками in vitro 20. Этот подход сочетал использование растворимой платформы с желатиновыми микроносителями, произведённой собственными компаниями, с коммерчески доступной платформой микробиореактора Mobius Breez21. Этот микробиореактор использует одноразовые одноразовые камеры реактора объёмом 2 мл и включает множество желаемых функций для улучшения биохимического контроля, включая регуляцию температуры, pH,CO2 иO2 в динамически смешанной системе с замкнутым контуром с питанием перфузии, но не был разработан с учётом якорных клеток, таких как МСК. Действительно, стандартные микрофлюидные каналы, используемые для впрыска содержимого реактора, слишком малы, чтобы пропускать микроносители, что требует значительной адаптации для успешного производства MSC на этой платформе.

Здесь подробно описан и иллюстрирован подробный протокол для адаптации этого микробиореактора для якорной культуры MSC. Параметры процесса, представленные здесь, были определены с целью информирования для разработки и производства MSC для доклинической in vitro оценки терапевтической эффективности ОРДС. Однако, в принципе, этот протокол может быть адаптирован для других приложений конечных пользователей, других воспалительных или иммуномодуляторных состояний, а также других типов клеток, зависящих от якоря, которые могли бы получить выгоду от усиленного биохимического контроля в условиях настольных масштабов. Рисунок 1 схемирует протокол, описанный в сопроводительном видео, а рисунок 2, рисунок 3 и рисунок 4 иллюстрируют ключевые результаты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Установка и подготовка микробиореактора

  1. Подготовка необходимого количества расходных материалов для микробиореакторов
    1. Убедитесь, что шкаф для биобезопасности (BSC) включён и стерилен. Снимите фольгированный пакет, покрывающий новый расходник, проколов верхнюю часть пакета и оставив фольгированный мешок до завершения эксперимента (чтобы зафиксировать детали лота# на случай дефекта). Откройте внешнюю упаковку блистера и выбросьте внутри гидратационный пакет. Выбросьте внешнюю упаковку от блистеров.
    2. Распылите внутреннюю упаковку блистера 70% этанолом и поместите его в BSC. Откройте внутреннюю упаковку блистера и выбросьте его.
    3. Используя стерильный шприц, снимите поршень и подключите сопло к стерильному фильтру 0,22 мкм. Налейте 50 мл нестерилизованной ультрачистой воды в ствол шприца. Держа шприц над ожидающей, стерильной трубкой на 50 мл, введите поршень обратно в шприц и введите стерильную фильтрованную воду в ожидающую трубку для сбора.
    4. Снимите прозрачную пластиковую крышку, соединяющуюся с бутылкой LL в полке. Используя новый стерильный шприц на 50 мл, снимите поршень и подключите сопло к бутылке LL. Налейте стерильную фильтрованную воду в ствол шприца и введите её в бутылку LL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Безиголочные порты могут застрять во время процедуры стерилизации производителя, поэтому возможно, придётся несколько раз подключать и отсоединять шприц, чтобы разорвать уплотнение бутылки и успешно ввести содержимое. В качестве альтернативы можно использовать трубчатый сварочный аппарат, чтобы стерильно подключить исходную бутылку к сварной трубке.
    5. Используя ту же процедуру, наполните бутылку L 25 мл низкоглюкозного DMEM, не поддерживаемого FBS, бутылку R — 25 мл стерильного PBS, а бутылку RR — 8 мл раствора против прилизания. Используйте новый стерильный шприц для каждой жидкости.
    6. Повторяйте эту процедуру для столько расходников, сколько потребуется в эксперименте.
  2. Проведите самотестирование POD в каждом POD, используемом для этого эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самотестирование должно пройти без проблем; Если компонент самотеста не проходит, устраните сбой перед продолжением.
  3. Уберите кассеты для самотестирования в светозащитные мешки для хранения.
  4. Закрепите расходный материал к биореактору, как описано ниже.
    1. Снимите зелёную ленту с клапанов расходного материала и установите её в POD. Установите зажимы и убедитесь, что не слышно шипения газа или воздуха при выходе.
    2. Соедините линию датчика давления на белой шкале для бутылочной стойки, красную линию давления воздуха и синюю вакуумную линию между расходниками и базовой станцией/POD. Убедитесь, что боковой инжекционный отрез зажжен белым каплей-зажимом.
    3. Следуйте шагам программного обеспечения, чтобы начать новый эксперимент. Это завершается функцией автопрайма и калибровки, которая занимает ~4-5 часов и может работать всю ночь.
  5. Маркируйте каждую стойку с указанием её POD, чтобы было легко определить, в какой POD возвращать расходный материал после его извлечения из биореактора. Используйте цветную ленту для обозначения положения: Pod0 = красный, Pod1 = оранжевый, Pod2 = жёлтый, Pod3 = зелёный. Напишите название эксперимента и дату на кассете.
  6. Оставьте расходники на калибровку на ночь. Убедитесь, что среда может попасть в реактор и выйти в отходную трубу.
  7. Если планируете использовать клетки, хранящиеся в жидком азоте, разморозьте их и обмотайте так, чтобы у них было > 24 часа на восстановление после криохранения перед инъекцией.

2. Перекалибровка и подготовка микроносителей

  1. Убедитесь, что этапы автозапуска и калибровки выполнены успешно.
    1. Если калибровка не завершена успешно, выявите и устраните основные проблемы, а затем попробуйте повторную калибровку. Распространённые проблемы включают недостаточное снятие белого зажима для стойки для бутылок, недостаточное удаление зелёной ленты с расходника перед установкой в POD и недостаток объёма медиа в бутылке.
  2. Убедитесь, что датчики растворённого кислорода стабильны.
    1. Почти 10% расходных материалов после калибровки будут демонстрировать дрейф датчика в датчике DO. Выполните предпочтительное корректирующее действие — повторите полную калибровку. При необходимости выполните одну из следующих задач.
      1. Убедитесь, что в кассете нет воздуха, затем снимите галочку в разделе «Графики отображения », чтобы показать элементы управления, затем нажмите Autocalibrate DO и pH.
        1. Если воздух присутствовал в реакторе при необходимости перекалибровки, вернитесь на первую страницу панели управления MBS, нажав на синюю стрелку слева в левом верхнем углу окна для конкретного POD. Нажмите на кнопку , чтобы активировать ручные операции. Отметьте поле «Готовность трубки для отходов » и введите W в поле ввода текста, чтобы выбрать бутылку для отходов. Нажмите кнопку Eject-wash , затем нажмите Да в всплывающем окне. Это опустошает камеры реактора и заполняет их материалом из бутылки носителя.
  3. Подготовьте нужное количество микроносителей в конических трубках объёмом 15 мл — по одной для каждого состояния.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество микроносителя, площадь поверхности и плотность посева клеток зависят от вашего применения. Для этого протокола рекомендуется вводить абсолютное количество микроносителей, что даёт 75см² доступной площади роста микроносителей для сравнения с колбой T75.
  4. Дайте микроносителям оседать в трубке; Аспирировать как можно больше супернатантов без удаления микроносителей, чтобы освободить место для клеток и свежих сред.

3. Инъекция клеток и микроносителей

  1. Убедитесь, что функции автопрайма и калибровки успешно выполнены.
  2. Кликните в программное окно, как будто реактор инъекциируется согласно стандартному рабочему процессу подвесной ячейки.
  3. Введите пометку в всплывающее окно, чтобы показать, что на данном этапе введение клеток не произошло.
  4. Включите ручные операции, чтобы приостановить смешивание реакторов и добавьте белый C-образный зажим к линиям стеллажей для бутылок.
  5. Уберите каждый расходник и переведите в BSC. Удалите отходящую среду из бутылок с отходами и перфузией и выбросьте их.
    1. Обязательно удаляйте все отходы из большой бутылки для перфузии, а также из меньшей трубки объёмом 1,5 мл, содержащейся внутри бутылки, если планируете собирать кондиционированную среду в любом этапе исследования.
  6. Удалите растительный материал без сыворотки из бутылки L и выбросьте её. Прополосните флакон L ~20 мл стерильного PBS и выбросьте её. Добавьте 25 мл массовой среды с сывороткой в бутылку L.
  7. Верните расходники в соответствующие POD. Поставьте бутылки с медиа-источником на лёд на оставшуюся часть эксперимента. Обновляйте лёд каждый день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Влажный лёд можно дополнить морозильными пакетами для продления времени контроля температуры.
  8. Промыйте реакторы PBS и промите линии.
    1. Нажмите кнопку «Смыть бутылки », включить кнопку «Радио для бутылки L», выбрать «Вывод в отходы», затем «Начать промывку MSCserum».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит промить недавно добавленные HMSC носители через линию, чтобы больше не попадать в реактор материалы без FBS.
    2. Снова нажмите кнопку «Смыв бутылки », выберите кнопку «Радио для Bottle RR» и начинайте смывать. Это промывает раствор против прилипления через линию и обеспечивает его готовность к проникновению в реактор.
    3. В окне «Содержимое бутылки» укажите в программном обеспечении, что MSCserum находится в бутылке R, которая действительно содержит PBS.
    4. Перейдите к ручным операциям и проведите три цикла выброса-промывки на отходной бутылке.
  9. Добавьте раствор промывания против адхеренции в реактор.
    1. Вернитесь к окну «Содержимое бутылки» и укажите, что MSCserum находится в бутылке RR, которая на самом деле содержит раствор для промывания против прилипки.
    2. Перейдите в отдел ручных операций и проведите один цикл выброса-промывки бутылки для отходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бывшая промывка PBS предназначалась для предотвращения помех компонентов DMEM для анти-адхеренсной промывки; Теперь реактор должен быть заполнен раствором для промывания против прилияния с трассовым PBS.
  10. Через 30 минут при наличии антиадгеренного раствора прополосните расходник PBS.
    1. В окне «Содержимое бутылки» укажите в программном обеспечении, что MSCserum находится в бутылке R, которая действительно содержит PBS.
    2. Перейдите к ручным операциям и проведите три цикла выброса-промывки на отходной бутылке.
    3. Вернитесь в окно «Содержимое бутылки» и укажите в программном обеспечении, что MSCserum находится в бутылке L, где содержатся носители hmsc.
  11. Опустошите реактор, чтобы дождаться введения клетки и микроносителя. В панели ручных операций нажмите Reinoculate и оставьте систему на этапе, где приборная панель указывает на имокуляцию реактора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь термин «инокулят» просто означает инъекцию клеток, предназначенных для расширения в микробиореакторе.
  12. Добавьте дополнительные резисторы для модуляции скорости смешивания в соответствии с стандартным резистором R0.
  13. Поднимите клетки из фляжки и посчитайте их на гемоцитометре. Выполняйте все открытые операции в BSC для обеспечения стерильности.
    1. Аспирируйте среду, затем промой с 5-10 мл предварительно подогретого PBS. Аспирируйте PBS и добавьте 5 мл трипсина + ЭДТА в колбу.
    2. Инкубировать при 37 °C в течение 5 минут или пока все клетки не будут заметно подняты с поверхности колбы.
    3. Добавьте 10 мл предварительно нагретого HMSC среды для нейтрализации активности трипсина. Вынимите жидкое содержимое и поместите его в центрифугную трубку на 15 мл.
    4. Центрифугуйте ячейки при 300 x g на 5 минут. Сбросьте супернатант и снова подвесьте клеточную гранулу в соответствующем объёме среды hMSC для подсчёта. Для колбы T75 с полностью сливающимся размером обычно составляет 2-4 мл, что даёт концентрацию ячеек ~1-2E6 на мл.
    5. Смешайте образец вновь взвешенных клеток с равной частью красителя Trypan Blue и загрузите смесь в гемоцитометр для подсчёта. Считайте ячейки согласно инструкциям производителя.
  14. Рассчитайте объём раствора клетки, необходимый для достижения 150 000 клеток, и вместите это количество в ожидающую коническую трубку объёмом 15 мл с микроносителями для каждого состояния. Добавьте объём в пробирке от 2,2 до 2,5 мл свежими, тёплыми hMSC носителями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объём в каждом 15-мл коническом реакторе должен быть немного больше 2 мл, чтобы при впрыске реактор был слегка переполнен и не появлялся пузырьки, которые будут выравниваться на следующем этапе.
  15. Добавьте соответствующий объём ячеек в контроль колбы T75.
  16. Работая одновременно с одним-двумя расходниками, убирайте расходники из POD и переносите их в BSC.
  17. Извлекайте клетки и микроносители в шприце объемом 5 мл с помощью зелёных тупых игл диаметром 4 дюйма. Введите клетки и микроносители в реактор.
  18. Верните расходник на базовую станцию и повторяйте, пока все расходники не будут введены.
  19. Перейдите в окно программного обеспечения, чтобы показать, что прививка состоялась. Когда программа вернётся на обычную главную страницу, уберите белый зажим с выходных линий расходников.
  20. Входите в ручные операции и выполняйте функцию Eject Excess с выходным портом, установленным в P для перфузии. Включите режим статического микширования, используя 1680 с включённым и выключенным 120 секунд. Держите частоту сведения на уровне 5 Гц для статического микширования.
  21. Отключите измерение оптической плотности.
    1. Откройте клиент MBS и нажмите «Подключить». Введите следующую команду, содержащуюся в кавычках: «dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1"
    2. Нажмите «Отправить», дождитесь подтверждения успешной отправки команды и закройте клиент MBS.
  22. Через 24 часа отключите режим статического микширования и снова включите нормальное сведение. Уменьшите частоту сведения до 1,5 Гц.

4. Работа микробиореактора

  1. Ежедневно контролируйте микробиореактор, чтобы убедиться, что проблемы не мешают эксперименту. Убедитесь, что в бутылках носителя хранится >5 мл среды, чтобы реактор успешно проходил без проблем.
  2. Меняйте ведра со льдом по мере необходимости, чтобы поддерживать контроль температуры в бутылке с носителем. Оставьте светозащитное покрытие на передней части микробиореактора, чтобы предотвратить световое разрушение летучих компонентов среды.
  3. Убедитесь, что в реактор не попадают пузырьки. Не забывайте периодически менять носитель в контроле колбы TCPS.

5. Сбор микробиореакторов

  1. Убедитесь, что BSC стерилен и готов к работе.
    1. Для подогрева следующие необходимые реагенты в ванной или водяной бане до 37 °C: ~25 мл тёплой среды hMSC, 10 мл тёплого PBS и 1,5 мл 10 мг/мл Pronase для сбора урожая.
  2. Подготовьте полку для бутылок к сбору урожая.
    1. Включите ручной режим операций для каждого POD в программном обеспечении.
    2. Зажмите входные линии расходников белым C-образным зажимом вдоль прозрачной части линии.
    3. Уберите расходники в BSC. Удалите содержимое бутылки и выбросьте её.
    4. Промите бутылку с отходами ~20 мл PBS и выбросьте на него. Оцените оставшийся объём в бутылке носителя и при необходимости добавьте свежий (холодный) HMSC-носитель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь требуется > 4 мл среды для завершения трёх необходимых циклов выброса-промывки для сбора уборки.
    5. Выстилайте бутылку с отходами ~5 мл холодного HMSC-среды, чтобы смягчить собранную жидкость.
  3. Извлекать клетки из микробиореактора.
    1. Используя шприц на 1 мл, набрать в шприц 200 мкл 10 мг/мл Pronase и ~300-400 мкл воздуха.
    2. Открутите боковую крышку инжектора и распылите 70% этанола на разъём безигольного клапана. Снимите ленту, закрепляющую узловую боковую инжекционную линию порта, и развяжите узел. Отстегните белый зажим для капли.
    3. Подключите шприц объёмом 1 мл и аккуратно введите Pronase в реактор. Прогоняйте жидкость по линии впрыска воздухом, чтобы вся жидкость была доставлена в реактор.
    4. Заново включите зажим в форме слёзы и заново закройте боковую линию впрыска портов. Верните расходник в POD, подключите все линии, снимите белый C-образный зажим и возобновите смешивание.
    5. Убедитесь, что бутылка с отходами и бутылка с источником медиа хранятся на льду. Запустите таймер на 5 минут и дайте Pronase переварить микроносители внутри реактора.
    6. Через 5 минут проверьте, не деградировали ли микроносители, убедившись, что они больше не видимы в реакторе. Если микроносители всё ещё видны, дайте ещё одну минуту на переваривание. Если микроносителей не видно, продолжайте.
    7. Собирайте клетки. Включите режим ручных операций, установите # циклов на 3, а выходной порт — на W для отходов, и нажмите Eject Wash.
    8. После завершения циклов стирки вынесите расходник обратно в BSC и выведите содержимое бутылки с помощью шприца на 10 или 20 мл.
    9. Раздайте содержимое бутылки для отходов в коническую центрифугную трубку объёмом 15 мл. Центрифугуйте клетки при 300 x g в течение 5 минут, аспирируйте супернатант и оцените размер клеточной гранулы.
    10. Суспензировать клеточную гранулу в 1-5 мл среды роста (PBS) и подсчитать клетки на гемоцитометре. Повторите этот шаг для всех расходников.
  4. Собирайте состояние фляжки с помощью обычных протоколов клеточной культуры. Типичный протокол для MSC описан в версии 3.13.

6. Анализ ячеек из условий микробиореактора и колбы для дальнейшего применения

ПРИМЕЧАНИЕ: Аналитические методы, использованные для получения представленных результатов, приведены кратко ниже и подробно описаны в Krupczak, Farruggio и Van Vliet (2024)20.

  1. Контроль окружающей среды: используйте графический интерфейс, предоставляемый микробиореактором, для доступа и отображения данных с каждого интегрированного датчика расходного материала в течение периода культуры. Эти данные предоставляются в программном обеспечении Breez Explorer, которое устанавливается в ноутбуке с микробиореактором.
  2. Урожайность клеток: Собирайте MSC, как описано выше, и пеллетуйте клетки при 300 х г в течение 5 минут. Аккуратно удалите супернатант и тщательно ресуспензируйте клеточную гранулу в соответствующем объёме среды PBS или hMSC (1-2 мл). Возьмите образец смеси ресуспензированных клеток и смешайте с равным объёмом красителя Trypan Blue. Микропипетить окрашенный образец в чип гемоцитометра и измерить количество клеток и жизнеспособность на автоматическом или ручном гемоцитометре.
  3. Проверка экспрессии генов с помощью двухступенчатой обратной транскрипции количественной полимеразной цепной реакции, как описано ниже.
    1. Очистка РНК: используйте набор RNeasy Mini для выделения и очистки РНК из каждого образца согласно инструкциям производителя. Вкратце: лизировать клетки, перенести содержимое клетки в очистительную спиновую трубку и промыть образцы каждым буфером, чтобы удалить ненужные клеточные компоненты, нуклеиновые кислоты и белки, которые могут мешать последующему ПЦР.
    2. Преобразование cDNA: Используйте комплект для обратной транскрипции высокой ёмкости и термоциклер для преобразования очищенной РНК в комплементарную ДНК (cDNA) согласно инструкциям производителя. Короче говоря, разморозьте компоненты комплекта и создайте мастер-микс, комбинируя их в соответствующих объёмах для вашего количества сэмплов. Загрузить равные части очищенной РНК и подготовленной мастер-смеси (по 10 мкл каждая) в каждую ямку ПЦР-пластины, внимательно отслеживая местоположение идентичности каждого образца. Следуйте производственному протоколу в термоциклере, чтобы завершить реакцию обратной транскрипции.
    3. qPCR: Используя экзонно-специфические праймеры, проверенные для предотвращения праймер-димера, загрузите 384-яможную qPCR-пластину прямым праймером, обратным праймером, шаблонной cДНК, водой без нуклеазы и мастер-смесью в соответствующих объёмах (обычно 1 мкл, 1 мкл, 1 мкл, 7 мкл, 10 мкл соответственно) с использованием нескольких технических репликационных колодц для каждого гена и образца. При необходимости разделите содержимое на несколько пластин, чтобы захватить все генные мишени. Убедитесь, что все образцы для конкретной мишени гена загружаются на одну и ту же пластину, чтобы избежать вариативности результатов от пластины к пластине, а также чтобы каждая пластина имела соответствующий генический контроль и контроль без шаблонов. Измерять интенсивность флуоресценции на соответствующем аппарате qPCR и использовать метод ΔΔCt для относительной количественности для расчёта экспрессии генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микробиореактор позволял контролировать и регулировать факторы окружающей среды примерно в течение 10 дней в культуре. Факторы окружающей среды, включая pH (рисунок 2A), температуру (рисунок 2B), растворённый кислород (рисунок 2C) и углекислый газ (рисунок 2D), были точно измерены и поддерживались в условиях микробиореактора, но не в кол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается метод расширения, подбора и извлечения клеток с использованием подхода микроносителя и микробиореактора. Этот процесс позволяет клеткам, зависящим от якоря, таким как MSC, увеличивать количество клеток под превосходным биохимическим контролем платформы биореактора (по сравнению с обычными колбами TCPS) на настольных масштабах, что подходит для быстрой разработки процессов. Кроме того, показано, что производство МСК микроносителем и микробиореактором приводит ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы раскрывают соглашение о сотрудничестве с производителем микробиореакторов MilliporeSigma.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим центр Genomics Core (Weill Cornell Medicine) за консультации по qPCR-анализу и устранению неполадок. Мы с благодарностью выражаем помощь Эвана Гейтса и Эрика Шиуэ (MilliporeSigma) в технической поддержке микробиореактора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Раствор для промывания против прилипливанияТехнологии стволовых клеток7010
Кабинет биобезопасности
Микробиореактор BreezMilliporeSigma
Центрифуга
Коническая трубка, 15 мл
Коническая трубка, 50 мл
Dulbecco's Modified Eagle Medium, низкий уровень глюкозыGibco11885084
Этанол
Сыворотка плода для быкаGibcoA5670701
Гемоцитометр
Лабораторная лента
Микроносители
Микроцентрифугальная трубка, 1,5 мл
Микроскоп
Игла, тупая, 4", 18 калибраAmazonB0D663ZR6D
Фосфатно-буферный физиологический растворКорнинг21-040-CM
Проназа, от Streptomyces griseusMilliporeSigma10165921001
Серологический пипет, 10 млVWR75816-100
Стерильная деионизированная вода
Фильтр для шприца, 0,22 мм, стерильныйПродукты Celltreat Scientific229762
Шприц, 1 млBD309628
Шприц, 20 млBD302830
Шприц, 5 млBD309646
Шприц, 50 млBD309653
Колба полистирола для культуры тканей, T75Термо Фишер Сайентифик130190
Trypan BlueСигмаОлдрихT8154-100ML

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sin, W. X., et al. A high-density microfluidic bioreactor for the automated manufacturing of CAR T cells. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1571-1591 (2024).
  2. US Food and Drug Administration. FDA Approves First Mesenchymal Stromal Cell Therapy to Treat Steroid-refractory Acute Graft-versus-host Disease. , (2024).
  3. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. N Engl J Med. 377 (6), 562-572 (2017).
  4. Torres Acosta, M. A., Singer, B. D. Pathogenesis of COVID-19-induced ARDS: implications for an ageing population. Eur Respir J. 56 (3), 200249(2020).
  5. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 18(2019).
  6. Kidd, S., et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells. 27 (10), 2614-2623 (2009).
  7. Gnecchi, M., et al. Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection and functional improvement. FASEB J. 20 (6), 661-669 (2006).
  8. Doron, G., Temenoff, J. S. Culture Substrates for Improved Manufacture of Mesenchymal Stromal Cell Therapies. Adv Healthc Mater. 10 (15), e2100016(2021).
  9. Noronha, N. C., et al. Priming approaches to improve the efficacy of mesenchymal stromal cell-based therapies. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 131(2019).
  10. Hezam, K., et al. Superior protective effects of PGE2 priming mesenchymal stem cells against LPS-induced acute lung injury (ALI) through macrophage immunomodulation. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 48(2023).
  11. Zhang, X., et al. Mesenchymal stromal cells alleviate acute respiratory distress syndrome through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 307(2022).
  12. Full Prescribing Information - Ryoncil. , https://www.ryoncil.com/pdfs/prescribing-information.pdf (2024).
  13. Kumar, A., Starly, B. Large scale industrialized cell expansion: producing the critical raw material for biofabrication processes. Biofabrication. 7 (4), 044103(2015).
  14. Rennerfeldt, D. A., Raminhos, J. S., Leff, S. M., Manning, P., Van Vliet, K. J. Emergent heterogeneity in putative mesenchymal stem cell colonies: Single-cell time lapsed analysis. PLoS One. 14 (4), e0213452(2019).
  15. Mets, T., Verdonk, G. In Vitro Aging of Human Bone Marrow Derived Stromal Cells. Mech Ageing Dev. 16, 81-89 (1981).
  16. Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7841-7845 (2001).
  17. Tremain, N., et al. MicroSAGE Analysis of 2,353 Expressed Genes in a Single Cell-Derived Colony of Undifferentiated Human Mesenchymal Stem Cells Reveals mRNAs of Multiple Lineages. Stem Cells. 19 (5), 408-418 (2001).
  18. Klein, S. G., et al. A prevalent neglect of environmental control in mammalian cell culture calls for best practices. Nat Biomed Eng. 5 (8), 787-792 (2021).
  19. Bellani, C. F., et al. Scale-Up Technologies for the Manufacture of Adherent Cells. Front Nutr. 7, 575146(2020).
  20. Krupczak, B., Farruggio, C., Van Vliet, K. J. Manufacturing mesenchymal stromal cells in a microcarrier-microbioreactor platform can enhance cell yield and quality attributes: case study for acute respiratory distress syndrome. J Transl Med. 22 (1), 614(2024).
  21. Ng, E. X., et al. Dissolvable Gelatin-Based Microcarriers Generated through Droplet Microfluidics for Expansion and Culture of Mesenchymal Stromal Cells. Biotechnol J. 16 (3), e2000048(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Microbioreactor ProductionMesenchymal Stromal CellsAnchorage Dependent CellsCell Therapy ManufacturingGelatin MicrocarriersAcute Respiratory DistressEnvironmental MonitoringCell HarvestingCell Quality ControlBiochemical Environment Control

Похожие статьи