В этом протоколе описаны методы оценки роли MALAT1 в содействии эпителиально-мезенхимальному переходу при эпителиальном раке яичников посредством его регуляции оси miR-200c-3p/SNAI2.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
В этом протоколе описаны методы оценки роли MALAT1 в содействии эпителиально-мезенхимальному переходу при эпителиальном раке яичников посредством его регуляции оси miR-200c-3p/SNAI2.
Длинная некодирующая РНК MALAT1 регулирует эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и метастазирование при эпителиальном раке яичников (ЭОК) с помощью конкурирующего эндогенного механизма РНК (цеРНК), включающего модуляцию микроРНК. Это исследование было направлено на выяснение молекулярного пути, посредством которого MALAT1 влияет на EMT и метастатическое поведение через взаимодействие с miR-200c-3p и SNAI2. Экспрессия MALAT1 была генетически манипулирована в клеточной линии EOC SK-OV-3 либо сверхэкспрессией, либо нокдауном. Функциональное влияние на уровни белка, связанные с ЭМП, миграцию клеток и инвазию оценивали с помощью вестерн-блоттинга, заживления ран и трансвелл-анализов соответственно. Биоинформатический анализ определил miR-200c-3p в качестве общей мишени MALAT1 и SNAI2. Ось MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2 была дополнительно валидирована с помощью двухлюциферазного репортерного анализа и иммунофлуоресцентного окрашивания для подтверждения прямых молекулярных взаимодействий. Сверхэкспрессия MALAT1 усиливала миграцию клеток SK-OV-3 на 20% и инвазию на 5%, что сопровождалось значительным увеличением экспрессии SNAI2 (P < 0,01). И наоборот, нокдаун MALAT1 подавлял эти фенотипы. Анализ на двойную люциферазу подтвердил, что miR-200c-3p напрямую связывается как с MALAT1 , так и с SNAI2 (P < 0,001). Сверхэкспрессия miR-200c-3p снижала MALAT1-индуцированную EMT за счет подавления SNAI2 (P < 0,05), в то время как восстановление SNAI2 обращало вспять ингибирующие эффекты подавления MALAT1 на метастазирование. Этот протокол демонстрирует, что MALAT1 способствует ЭМП и метастазированию в EOC, функционируя как цеРНК, которая секвестрирует miR-200c-3p, что приводит к депрессии SNAI2. Полученные данные обеспечивают новое механистическое понимание и определяют ось MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2 в качестве потенциальной терапевтической мишени для ингибирования метастазирования рака яичников.
Рак яичников (OvCa) является очень коварным и поздно диагностируемым злокачественным новообразованием. Обычно он прогрессирует бессимптомно до достижения более поздних стадий, характеризуясь агрессивным ростом в первую очередь в брюшной полости. Этот патологический процесс обычно проявляется асцитом, снижением терапевтической реакции и плохим прогнозом1. Эпидемиологическая статистика за 2018 г. выявила около 295 000 новых случаев заболевания во всем мире, при этом 185 000 случаев смерти были зарегистрированы, что отражает устойчивую тенденцию к росту бремени болезней2. Несмотря на то, что современные протоколы лечения включают хирургическое вмешательство и фармакологические схемы, стойкие ограничения в раннем выявлении в сочетании с метастазированием и терапевтической резистентностью поддерживают долгосрочные показатели выживаемости ниже 45%3. Рецидив в течение 12-18 месяцев обычно наблюдается у многих пациентов с прогрессирующим заболеванием4. Эти клинические реалии подчеркивают настоятельную необходимость выявления клинически значимых диагностических маркеров и стратегий терапевтического мониторинга. Поэтому он ценен для выявления клинически значимых диагностических маркеров.
В настоящее время исследователи обнаружили, что значительная часть генома человека генерирует длинные некодирующие РНК (днРНК)5. Некодирующие белки не кодируют белки, существуют исключительно в форме РНК и играют регуляторную роль в различных биологических функциях клеток. Неконсервативные РНК демонстрируют неконсервацию и демонстрируют высокотканеспецифичные паттерны экспрессии6. Примечательно, что специфическая сверхэкспрессия некодирующих РНК наблюдалась во многих раковых тканях7. Механизм конкурирующей эндогенной РНК (цеРНК) выявил новый способ взаимодействия РНК. Хорошо известно, что микроРНК (микроРНК) могут подавлять гены посредством последовательно-специфических взаимодействий с 3'нетранслируемыми областями (UTR) мРНК. Между тем, некодирующие РНК (нРНК) могут конкурентно связываться с микроРНК, тем самым препятствуя их способности прикрепляться к генам-мишеням и влияяна экспрессию генов8. Механизм цеРНК в настоящее время является наиболее широко признанной гипотезой о регуляторной роли некодирующих РНК. Трехсторонняя перекрестная связь между кодирующими транскриптами, микроРНК и регуляторными РНК конструирует сложные молекулярные сети, которые влияют на инициацию и прогрессирование опухоли9.
Впервые обнаруженный в метастазах немелкоклеточного рака легкого, MALAT1 проявился как широко гиперэкспрессируемая некодирующая РНК при многочисленныхзлокачественных новообразованиях. В наших предыдущих исследованиях мы идентифицировали повышенную экспрессию MALAT1 в тканях OvCa, которая напрямую связана со стадией OvCa11. В данной работе мы представляем протокол генетической модуляции экспрессии MALAT1 в эпителиальной клеточной линии OvCa (EOC) SK-OV-3 и оцениваем его влияние на экспрессию белка, связанную с эпителиально-мезенхимальным переходом (EMT), миграционную способность и инвазивный потенциал с помощью молекулярных анализов, таких как кПЦР, вестерн-блоттинг, репортерные анализы с двойной люциферазой, и функциональные анализы, такие как анализы заживления ран и анализы Transwell. Цель работы состоит в том, чтобы выяснить молекулярный механизм, с помощью которого MALAT1 регулирует EMT и метастатическую диссеминацию в EOC посредством взаимодействия с miR-200c-3p и SNAI2.
Существующие методы изучения взаимодействий некодирующей РНК и микроРНК часто используют только инструменты прогнозирования in silico , которым может не хватать экспериментальной валидации. Для исследований регуляции ЭМП традиционные гистологические методы могут не дать подробного молекулярного понимания. Используя репортерные анализы с двойной люциферазой для экспериментальной валидации, наше исследование преодолевает эти ограничения, предлагая более надежное подтверждение прогнозируемых взаимодействий. Кроме того, сочетание нескольких функциональных анализов, таких как скретч-анализ и анализ Трансвелла, с молекулярными методами позволяет получить всестороннее понимание ЭМП как на клеточном, так и на молекулярном уровнях, превосходя глубину, обеспечиваемую подходами с одним анализом.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Культивирование и трансфекция клеток
Клеточную линию OvCa человека SK-OV-3 культивировали в стандартных условиях. Клетки содержали в питательной среде, содержащей 89% 5А McCoy's, 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% раствор пенициллин-стрептомицина, в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5%CO2. Среду заменяли каждые 2-3 дня, а клетки пропускали по достижении 80-90% конфлюенции с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА. Из коммерческих источников были получены лентивирусные конструкции для сверхэкспрессии MALAT1 и нокдауна MALAT1 (shRNA), а также мимика, ингибитора и негативного контроля miR-200c-3p, а также SNAI2-нацеленная миРНК и соответствующая контрольная миРНК. Для трансфекции клетки SK-OV-3 засеивали в 24-луночные планшеты плотностью 5 ×10 4 клеток/лунку в 500 мкл готовой среды и оставляли для прилипания в течение ночи. Трансфекцию проводили с использованием реагента для трансфекции на основе липидов (RRID: AB_2548650) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, нуклеиновые кислоты (имитаторы/ингибиторы микроРНК или миРНК) и реагент для трансфекции на основе липидов разводили в среде с восстановленным содержанием сыворотки отдельно, инкубировали в течение 5 минут, затем смешивали вместе и инкубировали еще 15 минут при комнатной температуре для обеспечения комплексообразования. Комплексы добавлялись по каплям в клетки. Через 6 ч среду заменяли на свежую полную среду. Клетки собирали через 24-48 ч после трансфекции для последующего анализа.
Флуоресцентная количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР)
Общую РНК экстрагировали из культивируемых клеток SK-OV-3 с использованием реагента для экстракции РНК в соответствии с инструкцией производителя. Вкратце, клетки лизировали в 1 мл реагента на лунку 6-луночного планшета, а РНК выделяли с помощью коммерческого набора для экстракции РНК в соответствии с предоставленным протоколом. Концентрацию и чистоту РНК определяли с помощью спектрофотометра, а образцы с соотношением A260/A280 от 1,8 до 2,0 использовали для последующих применений. Обратную транскрипцию проводили с использованием RT Master Mix (RRID: SCR_018597) с 500 нг общей РНК в реакционном объеме 20 мкл. Условия термоциклирования были следующими: 37 °C в течение 15 мин, затем 85 °C в течение 5 с для инактивации обратной транскриптазы. Полученную кДНК хранили при температуре −20 °C до использования. Количественная ПЦР в реальном времени проводилась с использованием коммерческого набора для обнаружения микроРНК qRT-PCR на приборе для ПЦР в реальном времени. Каждую реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащем 10 мкл 2x мастер-смеси для количественной ПЦР, 1 мкл специфических праймеров (прямых и обратных, 10 мкМ), 2 мкл матрицы кДНК и 7 мкл воды, не содержащей РНКазы. Условия термоциклирования были следующими: 95 °C в течение 10 мин, затем 40 циклов по 95 °C в течение 10 с и 60 °C в течение 30 с. Для проверки специфичности продукта был проведен анализ кривой плавления. Уровни экспрессии рассчитывали с помощью метода ΔΔCt, с GAPDH (для мРНК) или U6 (для микроРНК) в качестве внутреннего контроля. Все реакции были выполнены в трех экземплярах, а данные представлены в виде среднего ± SD.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент для экстракции РНК является опасным химическим веществом. Его следует обрабатывать в вытяжном шкафу, так как он вызывает коррозию и может вызвать раздражение кожи и глаз. Отходы, содержащие реагент, должны утилизироваться в соответствии с местными правилами утилизации опасных отходов.
Пробирный анализ на царапинах
Клетки SK-OV-3 засеивали в 24-луночные планшеты плотностью 5 × 104 клеток/лунку и культивировали до достижения ими примерно 90-100% конфлюенции, образуя однородный монослой. Затем стерильный наконечник пипетки объемом 10 мкл использовали для создания линейной царапины через монослой клетки в центре каждой лунки. Для обеспечения однородности во время пласта с нуля на всех скважинах применялся одинаковый угол и давление. После расчесывания добавлялся PBS для удаления оторвавшихся ячеек двумя аккуратными промывками. Затем клетки культивировали в бессывороточной среде McCoy's 5A для минимизации эффектов пролиферации. Изображения области царапины были получены немедленно (0 ч) и повторно через 24 ч и 48 ч с помощью инвертированного микроскопа с 10-кратным увеличением. Ширина царапины в каждой временной точке измерялась с помощью программного обеспечения ImageJ, а процент закрытия раны по сравнению с первоначальной шириной использовался для расчета скорости миграции.
Трансвелловый анализ
Клетки SK-OV-3 высевали в верхние камеры вкладышей Transwell (верхняя камера содержит 200 мкл 1% полной среды, нижняя камера содержит 1 мл 5% полной среды) в плотности 5 × 103 клеток на вставку, инкубировали при 37 °C, 5% CO2 увлажненной среды в течение 24 ч перед дальнейшим анализом. После инкубации в течение 24 ч вкладыши извлекали и 3 раза промывали PBS с последующей фиксацией в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 15 мин. После промывки PBS клетки окрашивали 1% раствором кристаллического фиалки. После окрашивания клетки промывали PBS и наблюдали под перевернутым микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллический фиолетовый является биологическим пятном и может быть вредным при попадании внутрь или контакте с кожей. С ним следует обращаться осторожно, а отходы утилизировать надлежащим образом в соответствии с местными правилами.
Репортерный анализ на двойную люциферазу
Трансфицированные клетки инкубируют в стандартных условиях культивирования (37 °C, 5%CO2 увлажненной среды) в течение 48 ч перед лизисом. После 48 ч инкубации клетки лизировали и центрифугировали при 5000 × г в течение 5 мин при 4 °C. 50 мкл аликвоты надосадочной жидкости переносили в 96-луночный планшет с последующим последовательным добавлением 100 мкл реагента люциферазы светлячка и 100 мкл реагента люциферазы Renilla в каждую лунку. Активность люциферазы Firefly и Renilla измеряли с помощью системы Dual-Luciferase Reporter Assay System на люминометре. Активность люциферазы Renilla нормализована до активности люциферазы Firefly для учета вариаций эффективности трансфекции.
Иммунофлуоресцентный анализ
Клетки SK-OV-3 фиксировали в 4% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем 3 раза промывали PBS. Для блокирования неспецифического связывания клетки инкубировали с 5% сывороткой крови коз в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. После блокирования клетки инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами против E-кадгерина (RRID: AB_2833860), N-кадгерина (RRID: AB_2837725) и виментина (RRID: AB_2835318), каждое из которых разбавлялось в соотношении 1:200. На следующий день клетки 3 раза промывали PBS и инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с флуорофорами [антимышиный IgG-FITC (RRID: AB_2843438) и антикроличий IgG-FITC (RRID: AB_2843439)], разведенными в соотношении 1:500 в течение 1 ч при 37 °C в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параформальдегид токсичен и является потенциальным канцерогеном. С ним следует обращаться осторожно, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как перчатки и очки. Отходы, содержащие ПФА, должны утилизироваться как опасные отходы.
Статистический анализ
Для сравнения между двумя группами использовался t-критерий, а для многогрупповых сравнений применялся ANOVA. Данные представлены в виде среднего значения ± SD. Статистическая значимость была установлена на уровне *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001. Все эксперименты проводились с тремя биологическими репликами (n = 3).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Миграционные и инвазивные способности клеток SK-OV-3, модулированных MALAT1
Экспериментальный рабочий процесс показан на рисунке 1. Чтобы исследовать роль MALAT1 в миграции и инвазии клеток OvCa, мы модулировали его экспрессию в клетках SK-OV-3. При нокдауне MALAT1 количественной ПЦР подтвердила достоверное подавление уровней MALAT1
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
OvCa, пятый по значимости гинекологический рак, остается серьезной проблемой для женского здоровья2. Тем не менее, большинство случаев выявляются на поздних стадиях, что значительно ограничивает эффективные варианты лечения, что приводит к минимальному улучшениюобщей выживаемости. Метастазирование рака выделяется как основной фактор смертности пациентов в EOC13. Новые данные указывают на то, что некодирующие РНК и ми...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Эта работа была поддержана проектом Фонда естественных наук провинции Фуцзянь (2021J011378).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,22 μ мембраны из ПВДФ м | Бейотим | FFP32 | |
| Универсальный набор для обнаружения микроРНК qRT-PCR | ФуленГен | КП115 | |
| Бычий сывороточный альбумин | Бейотим | СТ025 | |
| Хемилюминесцентный субстрат | Сучжоу Хайсин Биосайенс Ко., Лтд. | TCH-C335 | |
| Хемилюминесцентный субстрат | Многородность | WBKLS0100 | |
| Набор для анализа генов Dual Luciferase Reporter | Бейотим | РГ027 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Сучжоу Хайсин Биосайенс Ко., Лтд. | ФБП-К550 | |
| Козий антимышиный IgG FITC | Сходство | С0007 | |
| Козий антикролиачий IgG FITC | Сходство | С0008 | |
| Липофектамин 2500 | Гуанчжоу Инсинь Биотехнология Ко., Лтд. | SJ-LIP-2500 | |
| Интерференционный лентивирус MALAT1 | ШАНХАЙ ГЕНЕХЕМ Ко., Лтд. | LV-MALAT1-ш | |
| Сверхэкспрессия лентивируса MALAT1 | ШАНХАЙ ГЕНЕХЕМ Ко., Лтд. | LV-MALAT1-OE | |
| McCoy's 5A | Сучжоу Хайсин Биосайенс Ко., Лтд. | ГУМД-Б305 | |
| Имитатор miR-200c-3p | ШАНХАЙ ГЕНЕХЕМ Ко., Лтд. | МИК-ХАС-200К-3П | |
| Многофункциональный иммуноферментный анализатор | Перкин Элмер | Предвидение 2100 | |
| Раствор пенициллин-стрептомицина | Сучжоу Хайсин Биосайенс Ко., Лтд. | ГУСА-Р002 | |
| Коктейль ингибиторов фосфатазы | GSbioth | GS1439A | |
| Первичное антитело Е-кадгерин | Сходство | БФ0219 | |
| Первичное антитело N-кадгерин | Сходство | АФ5239 | |
| Первичное антитело Виментин | Сходство | АФ7013 | |
| Мастер-микс PrimeScript RT | Такара | РР036А | |
| Система обнаружения ПЦР в реальном времени | Био-Рад | КФХ96 | |
| Охлаждаемая центрифуга | Эппендорф | 5810Р | |
| Буфер для лизиса RIPA | GSbioth | GS504A | |
| SDS-полиакриламидные гели | Бейотим | Р0012А | |
| Вторичное антитело Goat Anti-mouse IgG FITC | Сходство | С0007 | |
| Вторичное антитело Goat Anti-rabbit IgG FITC | Сходство | С0008 | |
| МиРНК SNAI2 | Гуанчжоу Инсинь Биотехнология Ко., Лтд. | Си-хас-улитка2 | |
| База данных StarBase | Университет Сунь Ятсена | http://starbase.sysu.edu.cn | |
| Набор для анализа BCA | Dingguo Biotech | ВСА02 | |
| Инкубатор для клеточных культур | Герей | Гера клетка 150 | |
| Система анализа изображений | Био-Рад | ГЕЛЬ DOC 1000 | |
| Инвертированный микроскоп | Мшот | МИ152-Н | |
| Набор для экстракции РНК | ЭКОТОП | ЭК-1328-50Т | |
| Реагент ТРИзол | Гуанчжоу Инсинь Биотехнология Ко., Лтд. | T751379 | |
| Универсальный источник питания для электрофореза | wixscientific | ВИКС-ЭП600 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.