Повышение благополучия песчанок с помощью обучения положительному подкреплению в исследовательской среде

Краткое содержание

Дрессировка с помощью кликера служит положительным подкреплением для лабораторных песчанок. Этот метод направлен на снижение стресса и повышение эффективности обращения за счет положительного подкрепления, тем самым способствуя благополучию подопытных животных.

Аннотация

Улучшение условий содержания лабораторных животных за счет минимизации стресса и содействия обращению, соответствующему виду, является центральной целью современных биомедицинских исследований во всем мире. Дрессировка с помощью кликера, широко признанная форма дрессировки с положительным подкреплением, использует щелчок в качестве условного подкрепления для установления связи между желаемым поведением и вознаграждением, что позволяет животным учиться быстрее и с меньшим стрессом. Наша исследовательская группа ранее продемонстрировала, что обучение с помощью кликера функционирует как форма когнитивного обогащения у мышей и крыс. В настоящем исследовании мы успешно адаптировали этот подход к обучению для монгольских песчанок (Meriones unguiculatus), адаптировав протокол к видоспецифичным поведенческим характеристикам песчанок. Когорта из 43 инбредных песчанок (27 самок и 16 самцов) прошла стандартизированный 10-дневный протокол обучения кликеру, в ходе которого они научились добровольно приближаться и взаимодействовать с рукой экспериментатора в обмен на вознаграждение за еду. После периода обучения животные были подвергнуты поведенческой оценке, в том числе тесту в открытом поле и стандартизированному тесту взаимодействия с человеком, чтобы оценить влияние обучения на исследовательское поведение и взаимодействие человека с животным. Наши результаты показывают, что внедрение обучения с помощью кликера у песчанок происходит быстро, эффективно и хорошо переносится. Обученные животные, особенно самки, продемонстрировали повышенное добровольное взаимодействие с рукой экспериментатора и снижение тревожного поведения. Эти результаты свидетельствуют о том, что адаптированные к виду протоколы обучения кликеров могут способствовать развитию доверия между экспериментатором и животным, в конечном итоге снижая стресс и улучшая как благополучие животных, так и надежность экспериментальных результатов.

Введение

Совершенствование использования животных в биомедицинских исследованиях для снижения стресса и улучшения благополучия является широко признанной международной целью ^1,2,3. В 2022 году Европейская комиссия сообщила, что из 838 539 животных, используемых в Европейском союзе (Алурес), 3 440 были^{песчанками4}. В Германии в 2023 году в экспериментах на животных было использовано около 1,46 миллиона позвоночных и головоногих моллюсков в соответствии с разделом 7 (2) Закона о защите животных (TierSchG)⁵. В сочетании с животными, убитыми в научных целях, общее количество лабораторных животных, используемых в Германии в 2023 году, достигло примерно 2,1 миллиона⁶. Эти цифры подчеркивают актуальность использования песчанок в биомедицинских исследованиях, подчеркивая необходимость постоянного совершенствования протоколов по благополучию животных.

Поведенческие потребности лабораторных животных и важность стратегий управления, поддерживающих видоспецифичное благополучие, получили широкое признание в качестве важнейших элементов этической и научной практики⁷. Взаимодействие человека и животного в животноводстве часто ограничивается основной задачей перевода животных из грязных в чистые клетки, не способствуя установлению связи между проводником и животным. Этот недостаток социального взаимодействия может привести к стрессу, который негативно влияет на поведение и физиологию животных, в конечном итоге влияя^{на результаты} экспериментов. Неправильное обращение является хорошо известным источником изменчивости в исследовательских данных⁹. Например, поднятие мышей за хвост увеличивает тревогу и стресс, в то время как туннельные или открытые методы способствуют добровольному подходу и снижают тревожное поведение^10,11. Хендлинг даже используется в качестве стандартизированного острого стрессора в исследованиях мелких млекопитающих из-за его последовательного воздействия на физиологические маркеры, такие как уровень глюкокортикоидов¹². Эти результаты подчеркивают существенное влияние кратких человеческих взаимодействий и потребность в усовершенствованных методах работы с низким уровнем стресса¹³.

Совершенствование, основанное на дрессировке, получает все большее признание в качестве эффективного метода улучшения как благополучия животных, так и качества исследований^10,14. Одним из наиболее эффективных методов дрессировки, используемых в исследованиях на животных, является дрессировка с помощью кликера, которая часто сочетается с вознаграждением за еду^15,16. За последние десятилетия было опубликовано 34 исследования по обучению кликеров, что отражает растущий научный интерес к этому подходу к^{обучению17}. Исследования показывают, что чаще всего дрессируются собаки (47%) и лошади (30%), за ними следуют кошки, крупный рогатый скот, рыбы, козы и обезьяны (по 3%)¹⁷. Дрессированные животные могут добровольно участвовать в процедурах, снижая стресс и сводя к минимуму потребность в физическом сдерживании¹⁸.

Протоколы положительного подкрепления также применяются к мелким млекопитающим. Недавние исследования сообщают об успешном обучении кроликов процедурам содержания и песчанок поведенческим исследованиям^19,20. В некоторых предыдущих работах мы показали, что мыши, обученные кликерам, демонстрировали более частый контакт с экспериментаторами и меньшее количество поведенческих индикаторов, связанных со стрессом, таких как мочеиспускание, дефекация, вокализация и плавающее поведение 21,22,23. Это согласуется с открытиями в области ветеринарии, где было показано, что дрессировка мелких млекопитающих, таких как кролики, грызуны и хорьки, снижает реакцию страха и облегчает обращение с^{помощью методов} положительного подкрепления. Примечательно, что мы также наблюдали различия в эффективности тренировок по признаку пола: самки мышей показали большую мотивацию и более высокую частоту реакции, чем самцы, во время тренировок. Это говорит о том, что самки мышей могут с большей готовностью выполнять добровольные задачи по дрессировке в стандартизированных условиях^.

Несмотря на многообещающие перспективы, существующие подходы к дрессировке песчанок, как правило, привязаны к конкретным поведенческим парадигмам и не предназначены для общего использования в повседневном животноводстве^. Широко применимый, стандартизированный протокол для монгольских песчанок (Meriones unguiculatus) - независимый от конкретной экспериментальной установки - еще не создан. Чтобы восполнить этот пробел, настоящее исследование было направлено на разработку и валидацию простого протокола обучения кликера, адаптированного к видоспецифичным характеристикам песчанок. Протокол направлен на снижение стресса за счет бережного обращения и добровольного взаимодействия с экспериментатором. Мы предполагаем, что такой подход улучшит благополучие животных, установит более последовательные поведенческие основы и повысит надежность экспериментальных результатов. Благодаря своей простоте и гибкости он может быть легко реализован в самых разных лабораторных условиях.

Чтобы оценить эффективность и применимость предложенного протокола обучения, мы сформулировали следующие конкретные, поддающиеся проверке прогнозы:
Обученные песчанки будут надежно выполнять целевое поведение — добровольно сидеть на руке экспериментатора — в течение 10-дневного периода обучения.
Обученные животные демонстрировали повышенное добровольное взаимодействие с экспериментатором в стандартизированном тесте по сравнению с нетренированными контрольными группами.
Обученные животные будут демонстрировать поведенческие индикаторы, соответствующие сниженному тревожному поведению, в частности, проводя больше времени в центральной зоне открытого полевого испытания.
Самки песчанок могут демонстрировать более сильные поведенческие реакции на дрессировку, чем самцы, что потенциально отражает половые различия в адаптации к взаимодействию с человеком.
Эти прогнозы послужили основой для разработки поведенческих оценок и послужили основой для критериев оценки протокола.

Протокол

Обращение с песчанками и экспериментальные процедуры проводились в соответствии с европейскими, национальными и институциональными рекомендациями по уходу за животными. Утверждена лицензией местных властей G 21-1-100. Протокол включает в себя 10 дней тренировок (с понедельника по пятницу), с перерывами в выходные дни (суббота и воскресенье). Протокол может быть легко адаптирован к конкретным потребностям. Все необходимые материалы перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

1. Получить необходимое количество животных из питомника учреждения. Содержание животных в течение 12-часового цикла свет/темнота в открытой системе содержания.
2. Отлучите потомство от груди в возрасте 5 недель. После отъема животных наносят ушным биркам и размещают в однополых группах по 2-3 особи в клетке.
3. Задняя часть и размещение всех песчанок в клетках типа 4 (590 x 380 x 200 мм; 1,815 м²). Оборудуйте каждую клетку как минимум тремя туннелями и жуйте древесину для обогащения. Предоставляйте пищу и воду в неограниченном количестве (см. Таблицу материалов).
4. Случайным образом распределите животных по обученным (самкам: n=27; самцам: n=16) и необученным (самкам: n=16; самцам: n=5) группам, чтобы свести к минимуму систематическую ошибку отбора и обеспечить сопоставимые исходные условия при разных видах лечения. Приучайте животных как к пищевому вознаграждению, так и к руке экспериментатора в условиях клетка для разведения, как описано в шаге 2.2. протокола. В начале обучения животным (самкам и самцам) было примерно 8 недель.

2. Привыкание животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Если песчанки не перевозились, время привыкания может быть сокращено. Графический обзор протокола представлен на рисунке 1. У домашних животных период привыкания для молодых особей может быть значительно сокращен, если родительские животные хорошо приучены, и ручное приучение продолжается по крайней мере один раз в неделю с того момента, как щенки становятся мобильными. Этот подготовительный этап призван снизить неофобию и создать положительную ассоциацию при обращении с пищевыми продуктами, обеспечивая плавный переход к обучению на основе кликеров.

Рисунок 1: Обзор протокола приучения и дрессировки для животных, полученных от внешних источников и выращенных в домашних условиях: На этом рисунке представлена временная шкала и ключевые процедурные шаги протокола привыкания и дрессировки, используемого для песчанок, полученных от внешних источников, и песчанок, выведенных в домашних условиях. Протокол включает в себя начальное обращение, приучение к пище, знакомство с кликером и обучение с помощью кликера, корректируемое в зависимости от происхождения и предварительного воздействия животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Неделя 1: Привыкание к животным, полученным извне
   1. По приезду разместите песчанок в однополых группах по 2-3 животных в клетке. Добавьте материал для гнезда и подстилки из транспортировочного ящика, а также небольшое количество знакомых пищевых гранул для поддержки акклиматизации.
   2. Обеспечьте каждую клетку по крайней мере 3-4 туннелями (например, картонными трубками или пластиковыми укрытиями) и заполните подстилку на глубину примерно 8-10 см, чтобы обеспечить типичное для вида поведение при рытье.
   3. Не поднимайте песчанок за хвост, так как это может вызвать стресс и риск травмы хвоста²⁶. Вместо этого используйте чашеобразные ручки, чтобы аккуратно перемещать животных, когда это необходимо (см. рисунок 2A).
   4. Немедленно приучите к пище привычивание, рассыпав ~5 г тыквенных или подсолнечных семечек на подстилку (см. Таблицу материалов). Это побуждает копать и знакомит животных с наградой.
   5. На следующий день поместите в клетку одну руку, содержащую ~10 полезных семян, на 2-3 минуты. Если животные не берут семена напрямую, положите ~5 г семян в подстилку.
   6. Повторяйте эту процедуру один раз в день до тех пор, пока животные не возьмут еду с рук. Обычно на это уходит около недели. Если это удалось раньше, переходите к тренировке кликера (см. шаг 3).
   7. Во время привыкания оценивайте пищевые предпочтения, предлагая разные виды семян в руке и подсчитывая оставшиеся семена через 2-3 минуты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Давайте пищу небольшими порциями исключительно в качестве награды для подкрепления желаемого поведения. Убедитесь, что вознаграждение за питание соответствует рекомендациям по питанию для лабораторных животных. В то время как в этом протоколе используются тыквенные и подсолнечные семечки, могут быть использованы и другие подходящие награды, если они соответствуют гигиеническим требованиям учреждения. Коммерчески доступные лакомства, предназначенные для лабораторных животных, также приемлемы.
2. Неделя 1: Приучение к домашним животным
   1. Начните приучать к пищевому вознаграждению непосредственно в клетке для разведения, положив ~5 г тыквенных или подсолнечных семечек на подстилку, как описано в пункте 2.1.3. Этот шаг должен быть начат с племенной пары до родов, чтобы установить знакомство с вознаграждением.
   2. После того, как племенные животные надежно съедят семена с подстилки, предложите вознаграждение из руки экспериментатора, следуя процедуре, описанной в шаге 2.1.4. Позвольте животным исследовать и принимайте награду добровольно в течение 2-3 минут в день.
   3. После того, как самка родит, приостановите приучение руками минимум на 1 неделю. В течение этого времени продолжайте давать пищу прямо в подстилку клетки 1-5 раз в неделю, чтобы поддерживать контакт.
   4. Возобновите ручное приучение, как только щенки станут подвижными (примерно на 18-21 день после родов). Позвольте животным исследовать руку с вознаграждением в течение 2-3 минут за сеанс. Это способствует раннему ознакомлению потомства с контекстом обучения.
   5. В возрасте 5 недель отлучите птенцов от груди и разделите их на однополые группы по 2-3 животных в клетке. Продолжайте привыкание, положив награду за еду на новую подстилку в клетке в день перевода.
   6. На следующий день после отлучения от груди возобновите ручную доставку еды, как описано выше (шаги 2.1.4 и 2.1.5).
   7. Повторяйте эту процедуру один раз в день до тех пор, пока животные не возьмут еду с рук.
   8. После того, как подростки последовательно берут награду из руки, приступайте к протоколу дрессировки (см. шаг 3). Обычно на это уходит около 1 недели. Если это удалось раньше, переходите к тренировке кликера (см. шаг 3).

Рисунок 2: Обращение и приучение песчанки с помощью положительного подкрепления. (A) Чашеобразное обращение с песчанкой: песчанку осторожно зачерпывают обеими руками в чашеобразной манере, чтобы свести к минимуму стресс. (Б) Начало обучения: Рука экспериментатора кладется на пол клетки, а в ладони — вознаграждение за пищу. Песчанка получает награду, а клик используется для обозначения поведения. (В) Песчанка добровольно садится на руку экспериментатора, что свидетельствует об успешном обучении. Награда за еду находится на видном месте на ладони. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Обучение работе с кликером

ПРИМЕЧАНИЕ: Начинайте обучение только в том случае, если песчанка принимает пищу из рук экспериментатора. Если нет, продлите фазу привыкания к пище сверх срока, описанного в шаге 2.1. или 2.2.

1. Обзор тренинга
   1. Проводите одну тренировку на песчанку в день, каждая продолжительностью 4 минуты. Проводите дрессировку непосредственно в домашней клетке животного, чтобы снизить стресс и сохранить привычную обстановку. Нет необходимости удалять все предметы обогащения, но убедитесь, что в клетке остается по крайней мере одна трубка или туннель, а на полу клетки достаточно места для руки экспериментатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале обучение должно проводиться в специальной тихой комнате. Если это невозможно, можно использовать звукоизолированный шкаф в помещении для животных, при условии, что он эффективно снижает воздействие шума окружающей среды и помех.
   2. Чтобы слуховые сигналы не стали сбивающими с толку переменными, строго избегайте вербального общения или вокальных звуков во время тренировок. Ограничьте любое вокальное взаимодействие с животными периодами, выходящими за рамки тренировочного контекста.
   3. Используйте повторение целевого поведения (например, добровольное сидение на руке экспериментатора) в качестве практического показателя успешного привыкания и обучения во время обучения. Обучение считается успешным, если такое поведение наблюдается по крайней мере 5 раз за сеанс в течение трех дней подряд (см. шаг 3.4.4).
2. Подготовка к тренировкам
   1. Подготовьте все необходимые материалы: разрежьте семечки пополам или тыквенные семечки на три части в качестве награды. Предоставьте фут-кликер, приложение-таймер, которое использует цветовые подсказки (без звука) или любой другой бесшумный таймер (цифровой или аналоговый), а также чистую вторичную клетку (см. Таблицу материалов).
   2. Переместите домашнюю клетку в тихое, свободное от отвлекающих факторов место, где будет проходить дрессировка, чтобы свести к минимуму факторы стресса окружающей среды. Избегайте внезапных или громких звуков, таких как разговоры, хлопанье дверью или звуки оборудования во время сеанса, так как песчанки очень чувствительны к слуховым раздражителям.
   3. Удалите все предметы обогащения, кроме одного туннеля. Убедитесь, что оставшийся туннель не препятствует доступу к тренировочной зоне. Убедитесь, что в комнате достаточно места для размещения руки.
   4. Пересадите любое животное-компаньона в чистую вторичную клетку, включая небольшое количество подстилки для домашней клетки и обогащение, чтобы снизить стресс во время разлуки.
   5. Поместите ножной кликер (механическое устройство, которое издает щелкающий звук при нажатии ногой; см. Таблицу материалов) под столом или тренировочной поверхностью. Это позволяет дрессировщику отмечать желаемое поведение без использования рук, обеспечивая равномерное время, сохраняя обе руки доступными для взаимодействия с животным.
3. Тренировочный день 1-5: Введение в Clicker
   1. Запустите таймер: нажмите «Пуск» в приложении или нажмите кнопку на тихом таймере.
   2. Встаньте или сядьте перед клеткой. Положите пять штук выбранного семени на ладонь и положите руку на субстрат в одном из углов клетки.
   3. Щелкните в тот момент, когда песчанка берет семя из руки (рис. 2B). Если несколько семян взяты последовательно, щелкните после каждого из них. Используйте звук щелчка, чтобы связать вознаграждение за еду с поведением кормления с руки.
   4. Заканчивайте тренировку, когда животное выполнит нужное поведение 5 раз или когда таймер достигнет нуля (через 4 мин).
   5. Начиная с 3-го дня, в зависимости от поведения песчанки, начните предлагать семена по одному. Держите руку чуть выше пола клетки, чтобы побудить животное потянуться или совершить короткий контакт с его передними лапами (рисунок 2C). Это помогает постепенно формировать поведение и подготавливает животное к следующей фазе дрессировки (см. шаг 3.4).
4. Тренировочный день 6-10
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный совет по дрессировке: Если песчанка не хочет взбираться на руку, разбейте задачу на более мелкие, укрепляющие уверенность в себе. Во-первых, закрепите поведение прикосновения к руке, прежде чем ожидать, что животное будет карабкаться. Используйте эту стратегию формирования, чтобы снизить стресс и поддержать животных, которым требуется больше времени, чтобы привыкнуть к обращению.
   1. Предлагайте только одно семя за раз. Держите руку слегка приподнятой над субстратом, чтобы побудить песчанку полностью взобраться на руку, чтобы получить доступ к награде. Этот шаг основан на предыдущем процессе формирования и представляет собой переход к конечному целевому поведению.
   2. Как только песчанка будет последовательно взбираться на руку, нажмите, чтобы подкрепить поведение. Начните предлагать семена с помощью секундной руки (см. рисунок 3). Держите тренировочную руку над полом клетки так, чтобы песчанка должна была полностью забраться на него. Одной рукой держите семя между большим и указательным пальцами (рисунок 3А) или одной рукой преподнесите награду над ладонью другой руки, на которую животному предлагается забраться (рисунок 3В).
   3. Оценивайте успешность тренировки по тому, как песчанка добровольно садится на руку экспериментатора 5 раз за сеанс и получает награду либо из ладони, либо из вторых рук.
   4. Завершите тренировку максимум через 3 недели (5 дней в неделю) или когда тренировочная цель будет постоянно демонстрироваться в течение 3 дней подряд.
      Примечание: Несмотря на то, что протокол определяет структурированную фазу обучения продолжительностью до 3 недель, при необходимости сеансы подкрепления могут быть продолжены и после этого периода, особенно когда ожидается задержка между окончанием обучения и началом экспериментальных процедур. Постоянное положительное подкрепление может помочь сохранить выученное поведение и обеспечить надежность с течением времени. Мы рекомендуем продолжать подкрепление один раз в неделю после успешного завершения этапа обучения. Однако для обеспечения согласованности и сопоставимости между животными перед переходом к экспериментальным задачам должна быть задокументирована четкая конечная точка обучения, определяемая стабильным и повторяющимся выполнением целевого поведения.

Рисунок 3: Примеры положения рук во время вручения вознаграждения. (A) Вознаграждение удерживается между большим и указательным пальцами одной и той же руки, в то время как животное сидит на ладони. (В) Награда удерживается вторым и указательным пальцами, в то время как животное сидит на ладони другой руки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Проведение поведенческих тестов после тренировки (день 10+)

1. Тест взаимодействия
   Примечание: Зависимые переменные: Основной зависимой переменной является продолжительность произвольного взаимодействия между животным и рукой экспериментатора в течение второй минуты эксперимента. Взаимодействие определяется как прямой физический контакт, такой как обнюхивание, лазание или прикосновение к руке передними лапами^. Поведенческая оценка основана на видеозаписях и может быть выполнена вручную или с помощью программного обеспечения для поведенческого анализа.
   1. Расположите камеру, установленную на штативе, над столом, на котором будет проводиться тест взаимодействия.
   2. Если животные содержатся группами, пересадите животных в чистую вторичную клетку, содержащую горсть подстилки из домашней клетки.
   3. Уберите все туннели или укрытия из домашней клетки и поместите их в чистую клетку. Оставьте в тестовой клетке только подстилку (=домашнюю клетку). Поместите домашнюю клетку, в которой теперь только подстилку, под камеру.
   4. Осторожно верните подопытное животное в домашнюю клетку.
   5. Начните запись. Оставайтесь неподвижно перед клеткой в течение 1 минуты. Через 1 минуту поместите одну руку в перчатке внутрь клетки у переднего края еще на 1 минуту.
   6. Меняйте перчатки между животными разного пола.
2. Испытание в открытом поле
   Примечание: Зависимые переменные: Измеряемые переменные включают общее пройденное расстояние, время, проведенное в центральной зоне по сравнению с периферией, количество входов в центр и события выращивания. Эти показатели отражают общую локомоторную активность и тревожное поведение. Увеличение времени в центре внимания обычно интерпретируется как снижение тревожности. Поведение записывается на видео и анализируется с помощью автоматизированного программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
   1. Расположите камеру над ареной на открытом поле (100 см x 100 см x 40 см).
   2. Начните видеосъемку, затем аккуратно поместите животное в центр арены, используя чашеобразное обращение. Запишите поведение за 7 минут.
   3. После теста верните животное в домашнюю клетку. Очищайте ящик и стены открытого поля с 70% этанолом после каждого животного. Подождите, пока этанол полностью испарится, прежде чем помещать следующее животное на арену.

5. Статистический анализ

1. Несмотря на то, что полное ослепление экспериментатора было невозможно во время учебных занятий из-за характера прямого взаимодействия с животными, выполняйте анализ поведенческих данных слепым образом, чтобы уменьшить предвзятость наблюдателя.
2. Как для интерактивных, так и для полевых тестов записывайте все сеансы на видео. Собирайте зависимые переменные вручную обученными наблюдателями (тест взаимодействия) или автоматически с помощью программного обеспечения для поведенческого анализа (см. Таблицу материалов) для записей в открытом поле (время, проведенное в центральной зоне).
3. Перед статистическим анализом проверьте все данные на нормальное распределение с помощью теста Шапиро-Уилка. Выявляйте выбросы и исключайте их с помощью метода Robust Regression and Outlier Removal (ROUT) с коэффициентом ложных обнаружений (Q), равным 10%. Чтобы проанализировать влияние тренировок и секса на поведенческие результаты, проведите двустороннее повторное измерение ANOVA для теста взаимодействия и смешанное двустороннее ANOVA для оценки времени, проведенного в центре открытого полевого теста.
4. Классифицируйте тест взаимодействия и совокупное время, проведенное в центральной зоне открытого поля, в качестве основных зависимых переменных. Проведите апостериорные сравнения с использованием теста Тьюки на честную значимую разницу (HSD). p-значение < 0,05 было признано статистически значимым. Все статистические анализы проводились с использованием статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).

Результаты

Все обученные песчанки обучились поставленной задаче в течение 10 дней, продемонстрировав целесообразность дрессировки кликеров у этого вида. На рисунке 4 представлен успех дрессировки самок (n=27) и самцов (n=16) песчанок с 1-го по 10-й день. Повторные измерения ANOVA, анализирующие производительность в первый день обучения по сравнению с 10-м днем у самцов и самок песчанок, не выявили значимого эффекта взаимодействия между временем и полом (F_{(1, 41)} = 0,003; p = 0,955), что указывает на то, что улучшение с течением времени было одинаковым для обоих полов. Наблюдался весьма значимый эффект времени (F_{(1, 41}) = 38,83, p < 0,0001), показывающий, что песчанки обоих полов полностью выполнили протокол дрессировки к 10-му дню.

Тот факт, что дрессированные песчанки выполнили поставленную задачу в течение 10 дней, подтверждает эффективность методики дрессировки кликеров у этого вида. Этот показатель успеха согласуется с фундаментальными принципами оперантного обусловливания, где кликер функционирует как вторичное подкрепление, которое устраняет разрыв между желаемым поведением и основным вознаграждением (подсолнечными/тыквенными семечками). Кликер служит мостом между поведением и вознаграждением, позволяя тренеру отметить точный момент возникновения желаемого поведения с точным таймингом. Это помогает создать четкую и непосредственную связь между действием и его положительными последствиями.

Поведенческое тестирование проводилось после завершения протокола обучения, а именно после 10-го дня обучения. Двусторонний смешанный анализ ANOVA показал, что дрессированные песчанки увеличили добровольное взаимодействие с рукой экспериментатора (рис. 5A). Выявлен значимый эффект тренировки (F _{(1, 60)} = 22,89; p < 0,0001), при этом дрессированные животные чаще взаимодействуют с экспериментатором. Апостериорный анализ выявил специфические различия в дрессировке у самок (p < 0,0001, n = 27) и самцов (p = 0,049, n = 16). Полового эффекта не наблюдалось (F_{(1, 60)} = 0,621, p = 0,434), что позволяет предположить, что самцы и самки песчанок в целом показали одинаковые результаты. Анализ не выявил значимой взаимосвязи между полом и тренировками (F_{(1, 60)} = 0,078, p = 0,781).

Повышенное добровольное взаимодействие песчанок указывает на то, что дрессировка с помощью кликера эффективно снижает врожденные реакции страха за счет положительного подкрепления. Это может помочь свести к минимуму стресс во время обработки и экспериментальных процедур, улучшая как благополучие животных, так и качество данных.

Оценка тревожного поведения после тренировки проводилась с помощью теста Open Field Test. На рисунке 5B показана совокупная продолжительность пребывания в центральной зоне. Не наблюдалось взаимодействия между полом и тренировками в кумулятивной продолжительности в центральной зоне теста в открытом поле (F_{(1, 60)} = 0,101, p = 0,751). Кроме того, не было обнаружено значимого основного эффекта пола (F_{(1, 60)} = 0,001, p = 0,969. Наблюдался весьма значимый основной эффект тренировки (F_{(1, 60)} = 17,26, p < 0,0001; Тест HSD Тьюки: p = 0,003 и p = 0,052 у самок и самцов соответственно), что свидетельствует о том, что дрессированные песчанки проводили в центре значительно больше времени по сравнению с нетренированными. Эти результаты отражают поведенческие реакции, измеренные после того, как животные завершили 10-дневный период обучения.

OFT использует естественный конфликт приближения и избегания, который грызуны испытывают при исследовании новых сред²⁷. Песчанки могут балансировать между своим врожденным стремлением к исследованиям и своей естественной склонностью избегать потенциально опасных открытых пространств. Таким образом, тот факт, что дрессированные песчанки проводили больше времени в вызывающей тревогу центральной зоне, указывает на то, что дрессировка кликера повысила их общую поведенческую готовность к исследованию, что может указывать на улучшение общего благосостояния.

Рисунок 4: Валидация обучения кликера. Успешность тренировки в 1-й день по сравнению с 10-м днем для мужчин и женщин: Успешность тренировки оценивалась у самок (белые полосы, n = 27) и самцов (серые полосы, n = 16) песчанок в 1-й и 10-й дни тренировочного протокола. При двустороннем повторном измерении ANOVA выявлен значимый основной эффект тренировочного дня (p < 0,0001). Множественные сравнения с использованием теста HSD Тьюки показали значительное увеличение успешности тренировок с 1-го по 10-й день как у самок (p < 0,0001, n = 27), так и у самцов (p < 0,0001, n = 16). Данные представлены в виде среднего значения ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Поведенческая оценка. (А) Тест взаимодействия: Продолжительность взаимодействия с рукой экспериментатора (в s) измерялась у обученных (серые полосы) и необученных (белые полосы) самок и самцов песчанок после того, как животные завершили 10-дневный период обучения. Двусторонний смешанный ANOVA выявил значимый основной эффект обучения (p < 0,05) и значимый эффект взаимодействия (p < 0,05). Апостериорный анализ с использованием теста HSD Тьюки показал, что обученные мыши взаимодействовали значительно дольше с рукой экспериментатора по сравнению с нетренированными мышами (самки: p < 0,0001, самцы: p = 0,0497). Данные представлены в виде среднего ± SD. Обученные самки: n= 27; необученные самки: n = 16; обученные самцы: n = 16; Необученные самцы: n = 5. (B) Испытание в открытом поле: Испытание проводилось после завершения протокола обучения, а именно после 10-го дня обучения. Совокупная продолжительность пребывания в центральной зоне (зонах) измерялась у обученных (серые полосы) и необученных (белые полосы) самок и самцов песчанок. Для анализа влияния обучения на исследование центральной зоны был проведен двусторонний смешанный ANOVA. Многочисленные сравнения с использованием теста HSD Тьюки показали, что тренированные самки проводили значительно больше времени в центральной зоне по сравнению с нетренированными самками (p = 0,003). Данные представлены в виде среднего ± SD. Обученные самки: n= 27; необученные самки: n = 16; обученные самцы: n = 16; Необученные самцы: n = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Полученные данные показывают эффективность предложенного протокола для приучения песчанок к взаимодействию с человеком в экспериментальных условиях. Способность всех обученных животных выполнить желаемую задачу в течение 10 дней подчеркивает эффективность этого метода.

Одним из важнейших шагов в протоколе является постепенное привыкание к руке экспериментатора, гарантирующее, что песчанки ассоциируют человеческое взаимодействие с положительным стимулом. Использование видоспецифичных наград еще больше оптимизирует процесс обучения. Модификации, такие как корректировка продолжительности тренировочных сессий или изменение типа вознаграждения, могут еще больше адаптировать протокол к индивидуальным различиям среди песчанок и оптимизировать его для конкретных требований эксперимента.

Мы сосредоточимся на заметных видоспецифичных различиях в поведении и динамике обучения между мышами и монгольскими песчанками. Такие различия следует учитывать при разработке протоколов обучения. Например, мыши, как правило, более склонны к неофобию и стрессочувствительны, им часто требуется больше времени, чтобы привыкнуть к новой среде^{и взаимодействию с} человеком. В отличие от них, песчанки демонстрируют более высокий исследовательский инстинкт и социальное любопытство, что может способствовать более быстрому^{выполнению учебных задач}. В настоящем исследовании песчанки с готовностью приближались к руке экспериментатора и научились ассоциировать кликер с вознаграждением за меньшее количество сеансов, чем обычно сообщалось о мышах^21,22. Тем не менее, песчанки также показали большую индивидуальную изменчивость, особенно у самцов, что может отражать специфические для пола стрессовые или мотивационные факторы, которые менее выражены в моделях мышей. Эти различия подчеркивают важность адаптированных к виду стратегий дрессировки и предполагают, что песчанки могут извлечь пользу из более коротких, ориентированных на вознаграждение сессий с большим акцентом на добровольное взаимодействие, в то время как мышам может потребоваться более постепенная десенсибилизация и последовательное повторение. Понимание этих поведенческих и когнитивных различий имеет решающее значение для совершенствования протоколов дрессировки и максимизации их эффективности у разных видов.

Монгольские песчанки могут извлечь значительную пользу из неспецифической или обобщенной дрессировки с помощью кликера, которая фокусируется на позитивном взаимодействии человека и животных и базовом поведенческом обусловливании, а не на подготовке к конкретной экспериментальной установке. Такая обобщенная тренировка повышает толерантность к обращению, снижает уровень базального стресса и способствует более предсказуемым поведенческим базовым факторам, которые ценны в широком диапазоне экспериментальных^{контекстов.} Неспецифическая дрессировка способствует поведенческой гибкости и последовательному добровольному взаимодействию с экспериментатором, делая животных более приспособленными к различным средам, установкам или парадигмам тестирования 16,31,32. Это особенно полезно в долгосрочных исследованиях или многофазных экспериментах, где животные подвергаются различным процедурам. В настоящем исследовании, несмотря на то, что обучение не было напрямую связано с одним протоколом тестирования, песчанки показали улучшенное взаимодействие с экспериментатором и снижение поведения, связанного со стрессом, что подтверждает идею о том, что общее привыкание через положительное подкрепление может улучшить общую экспериментальную устойчивость и благополучие животных.

Помимо усиленного взаимодействия с экспериментатором, обученные самки животных проводили значительно больше времени в центральной зоне открытого полевого испытания. Этот поведенческий паттерн обычно интерпретируется как снижение тревожного поведения у грызунов, особенно в ответ на новую или слегка аверсивную^среду. Эти результаты свидетельствуют о том, что дрессировка с помощью кликера может способствовать снижению поведенческих индикаторов тревожности, тем самым повышая способность животных справляться с экспериментальными процедурами. Это подтверждает более широкий вывод о том, что протоколы привыкания, основанные на положительном подкреплении, могут улучшить стрессоустойчивость и поведенческую стабильность у лабораторных песчанок. Помимо снижения стресса, обучение с помощью кликера имеет более широкие последствия^{для экспериментальных} результатов. Обученные песчанки продемонстрировали большую терпимость к обращению, что сводит к минимуму вызванные стрессом физиологические вариации, которые могут исказить результаты исследований. Аналогичные результаты были получены и у других видов, включая лабораторных кроликов и мышей, у которых животные, обученные кликерам, демонстрировали повышенное взаимодействие с экспериментаторами и меньшее количество поведения, связанного с тревогой и депрессией, такого как снижение мочеиспускания, дефекации, вокализации и плавающее поведение^19,21.

Эти результаты подчеркивают потенциал дрессировки с помощью кликера для улучшения как благополучия животных, так и согласованности поведенческих данных за счет снижения вариабельности реакций, связанных со стрессом. Важно уточнить, что цель этого протокола не состоит в том, чтобы заставить животных ассоциировать изначально отвратительные процедуры, такие как забор крови, с положительными стимулами, такими как кликер. Скорее, цель состоит в том, чтобы снизить исходный стресс, приучить животных к общению с человеком и способствовать добровольному участию в нейтральных или умеренно сложных задачах. В то время как в некоторых исследованиях изучалось использование положительного подкрепления для подготовки животных к более инвазивным^{процедурам}, это требует тщательно структурированного процесса десенсибилизации и выходит за рамки текущего протокола. Неправильное применение кликеров в контекстах, связанных с дискомфортом, действительно может привести к непреднамеренным негативным ассоциациям. Тем не менее, при правильном применении, методы положительного подкрепления могут помочь животным справиться с потенциально отвратительными процедурами, повышая предсказуемость и обеспечивая определенную^{степень контроля.} Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, могут ли песчанки быть надежно обучены для таких условий, как это было успешно продемонстрировано на других видах, таких как собаки и нечеловекообразные приматы^.

Несмотря на свою успешность, метод имеет ограничения. Некоторым песчанкам требовались более длительные периоды привыкания, что указывает на индивидуальную изменчивость скорости обучения. Кроме того, относительно небольшое количество необученных самцов песчанок ограничивает статистическую мощность анализа, что затрудняет получение надежных выводов. Увеличение размера выборки в этой группе, вероятно, повысит надежность и интерпретируемость результатов. Дальнейшие исследования должны изучить потенциальные половые различия в реакциях на стресс и механизмах обучения.

Более широкие последствия этого исследования выходят за рамки снижения стресса. Внедрение структурированных протоколов обучения в рамках стандартного содержания может снизить вариабельность, вызванную стресс-индуцированными физиологическими реакциями, и повысить надежность экспериментальных результатов^39,40. Это особенно актуально в таких дисциплинах, как нейробиология или метаболические исследования, где стресс является критическим фактором. Тщательная отчетность и стандартизация процедур обучения имеют важное значение для предотвращения непреднамеренных эффектов обогащения.

В дальнейшем будущие исследования должны изучить альтернативные графики подкрепления, автоматизацию процедур обучения и долгосрочные эффекты для разных видов. С растущей научной поддержкой, обучение с помощью кликера представляет собой ценную стратегию совершенствования, которая может улучшить как качество данных, так и благополучие животных. Стандартизация протоколов обучения и обработки в лабораториях может помочь повысить воспроизводимость и способствовать более широкому внедрению гуманных и эффективных методов в биомедицинских исследованиях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клетки	Zoonlab GmbH	3010006	590 x 380 x 200 мм; 1.815 м2
Камера	Sony	HDR-CX240E	Цифровая HD видеокамера Рекордер
Пищевые гранулы	Ssniff	V1644-000	Art. Nr. i-Clicker-Blau
Foot Clicker		https://www.hundeschulen.com
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	https://www.graphpad.com/features	Версия 10 для окон
Открытое поле Ящик	Noldus	MXO1S-M001	опал 100 x 100 x 40 см
Тыквенные семечки	REWE	8820911	REWE Bio
Pylon Viewer	Basler	https://www.baslerweb.com/de-de/software/pylon/
подсолнечник,	Seeberger	4744292
Штатив	Manfrotto	GT- mkbfra4gtxp bh	Befree GT
туннели	Plexx	14179	152 x 76 x 3 мм