Разработка, определение характеристик и оценка ионных жидкостных систем на основе CAGE для трансдермальной доставки

Краткое содержание

В этом протоколе обсуждается стандартизация подготовки ионных жидкостных систем на основе CAGE для обеспечения воспроизводимости и оптимизации общего рабочего процесса в различных научных лабораториях.

Аннотация

Ионные жидкости в последнее время получили замечательное признание за их применение в доставке лекарств, в частности, их потенциал для обеспечения проникновения лекарств через кожу и улучшения проникновения лекарств. В дополнение к повышению барьерной проницаемости, ионные жидкости обладают отличными сольватационными свойствами, решая проблему растворения труднорастворимых лекарств. Из-за большой асимметрии между органическими катионами и анионами эти функциональные соли остаются жидкими при комнатной температуре. С точки зрения применения, ионные жидкости представляют собой многообещающий и легко настраиваемый подход для обслуживания различных терапевтических областей. Биосовместимая ионная жидкость, состоящая из холина и герановой кислоты (CAGE) в стехиометрическом соотношении ионов 1:2, обладает огромным потенциалом для трансдермальной доставки широкого спектра активных фармацевтических ингредиентов, включая малые молекулы, пептиды, белки и нуклеиновые кислоты. Это оказывает минимальное влияние на барьерную функцию кожи. В этой статье мы делимся нашими методами подготовки, определения характеристик и оценки CAGE. Представлены репрезентативные результаты для определения характеристик CAGE с помощью ЯМР-спектроскопии, дифференциальной сканирующей калориметрии, титрования по Карлу-Фишеру для анализа содержания воды и исследований взаимодействия барьеров ex vivo на коже свиней.

Введение

Кожа является самым большим и жизненно важным органом организма, служащим защитным барьером от вредных веществ, а также предотвращающим потерю воды¹. В то же время нанесение лекарств на кожу и через нее дает широкий спектр преимуществ. По сравнению с инъекционными препаратами и пероральным введением, кожное введение повышает комплаентность пациента и предотвращает метаболизм при первом прохождении в печени². Особенно при кожных заболеваниях препараты для кожного введения превосходно обеспечивают локализованный эффект, уменьшая системное воздействие³. Тем не менее, почти непроницаемый характер кожи значительно затрудняет успешное кожное родоразрешение⁴. Кожа человека состоит из трех различных слоев: эпидермиса, дермы и гиподермы⁴. Эпидермис является внешним слоем кожи и может быть разделен на различные подслои, при этом роговой слой является самым внешним слоем, состоящим в основном из кератиноцитов. Роговой слой действует как заметный проницаемый барьер для большинства молекул, препятствуя их транспортировке в более глубокие слои кожи⁵. Эта барьерная функция возникает из-за присутствия корнеоцитов, встроенных в плотно упакованную липидную структуру, состоящую в основном из фосфолипидов, стеринов и керамидов, часто называемую структурой кирпича и раствора^. Чтобы преодолеть этот кожный барьер, были развернуты химические усилители проникновения (CPE) для доставки макромолекул, поскольку они нарушают структуру рогового слоя, взаимодействуя с липидами и белками, присутствующими^{в нем.}

Ионные жидкости (ИЛ) стали ЦПЭ следующего поколения⁸. Они состоят из объемных органических катионов и анионов, расположенных асимметрично и координируемых слабыми, ненаправленными ионными^{взаимодействиями.} Из-за этих слабых межмолекулярных сил ИЛ существуют в виде жидкостей при температуре ниже 100 °C и не могут упаковываться в четко определенную^{кристаллическую} структуру. ИЛ обладают высокой способностью к перестройке, так как их эффективность в значительной степени зависит от выбора катионов или анионов и стехиометрического соотношения между этими ионами. Следовательно, они обладают высокой солюбилизирующей и стабилизирующей способностью к препаратам с различной гидрофобностью¹¹. ИЛ обладают уникальными свойствами как липидов, так и полимеров, обеспечивая пролонгированное высвобождение и инкапсуляцию макромолекул, соответственно¹².

Биосовместимые ИЛы на основе холина и герановой кислоты (CAGE), присутствующие в стехиометрическом молярном соотношении 1:2, имеют значительное применение в трансдермальной доставке как гидрофильных, так и гидрофобных соединений. Сообщалось, что CAGE значительно усиливает трансдермальную доставку белков (инсулина¹³) и нуклеиновых кислот (миРНК¹⁴). CAGE получают путем реакции метатезиса соли между бикарбонатом холина и герановой кислотой, с_CO2 в качестве побочного продукта¹⁵. Реакция метатезиса соли предлагает образование новых соединений путем ионного обмена в мягких условиях прямым, быстрым и высокоселективным образом. В целом, существует нехватка простых и понятных рабочих процессов для разработки и оценки CAGE IL. Таким образом, здесь мы представляем один из таких рабочих процессов, подробно описывая каждый этап подготовки CAGE, чтобы позволить исследователям из разных слоев общества войти в это исследовательское пространство.

Протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Директивой Европейского Союза 2010/63 и были одобрены Датским ветеринарным и продовольственным управлением (лицензия No. DK-13-oth-931833).

1. Подготовка КЕЙДЖА реакцией метатезиса соли

1. Рекристаллизация герановой кислоты (чистота 85%, моль 168,23 г/моль)
   1. Возьмите колбу с круглым дном объемом 500 мл и измерьте ее вес.
   2. Весить в колбе 40,0 г герановой кислоты. Это соответствует 0,2 моль герановой кислоты.
   3. Перекристаллизуйте герановую кислоту в 70:30% (масса) герановая кислота:ацетон: добавьте (40 г * 0,85 * 0,30) / (0,70 * 0,784 г/мл) = 18,42 мл ацетона в колбу с круглым дном.
   4. Возьмите стакан объемом 5 л и приготовьте примерно 0,5 л сухого льда и этанола.
   5. Поместите колбу с круглым дном в холодную смесь сухого льда и этанола, не переворачивая, чтобы обеспечить внешнее охлаждение. Сцедить ацетон и примеси из твердой/перекристаллизованной герановой кислоты, когда кристаллизация достигла равновесия (соответствующего примерно объему добавленного ацетона, обычно в течение 0,5-2 часов). Повторите этот шаг 5–6 раз, чтобы убедиться в достаточной чистоте.
   6. Удалите оставшийся ацетон путем ротационного выпаривания под вакуумом при 40 об/мин в течение не менее 20 минут или до тех пор, пока колба с круглым дном не перестанет казаться холодной при прикосновении к ней (давление пара составляет 240 мбар при 20 °C).
   7. Взвесьте и обратите внимание на массу колбы и перекристаллизованной герановой кислоты. Рассчитайте выход на основе исходного веса пустой колбы. Ожидаемый диапазон доходности составляет 60-80%.
2. Реакция метатезиса соли
   1. Для молярного соотношения герановая кислота:холин 2:1 рассчитают количество молей холина с учетом выхода рекристаллизации герановой кислоты. Например, при выходе 70% следует добавить 0,07 моль холина (0,2*70/100=0,14, 0,14/2=0,07).
   2. Бикарбонат холина имеет чистоту 80% и молекулярную массу 165,19 г/моль. Соответственно, добавьте 14,45 г (0,07 * 165,19 = 11,56 г; 100/80 * 11,56 г = 14,45 г) бикарбоната холина по каплям, чтобы предотвратить распространение.
   3. Перемешивайте образец в течение ночи со скоростью 300 об/мин (или соответствующей) при комнатной температуре (18 ± 3 ч) или до тех пор, пока испарение CO₂ не прекратится.
   4. Высушите образец путем ротационного выпаривания при 60 °C, 30 мбар в течение 40 минут. Сначала увеличьте температуру, затем медленно снижайте давление, чтобы избежать пенообразования.
   5. Разложите КЛЕТКУ по стеклянным флаконам в объемах, соответствующих предполагаемому применению (например, 2 мл КЛЕТИ в стеклянных флаконах по 4 мл).
   6. Просушите флаконы под вакуумом при 60 °C в течение 48 часов.

2. Характеристика CAGE

1. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР)
   1. Растворите CAGE до концентрации 25 мг/мл в дейтерированном диметилсульфоксиде (d-DMSO), обеспечив конечный объем не менее 500 μл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дейтерированные растворители необходимы в ЯМР, чтобы избежать интерференции атомов водорода в растворителе.
   2. Перелейте 500 мкл приготовленного раствора в чистую сухую ЯМР-пробирку (обычно диаметр 5 мм, в зависимости от прибора). Закройте пробирку крышкой, чтобы предотвратить испарение и загрязнение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте попадания пузырьков воздуха, так как они могут повлиять на однородность магнитного поля.
   3. Используйте ЯМР-спектрометр (например, 400 МГц) со следующими параметрами:
      -Количество сканирований: 8-16 для ¹ч ЯМР; 1,000-5,000 для ЯМР ¹³°C (в зависимости от концентрации и требуемого отношения сигнал/шум (S/N)).
      -Задержка релаксации (D1): 1-2 ^{с для 1}ч и ¹³С ЯМР.
   4. Обрабатывайте данные с помощью соответствующего программного обеспечения.
      1. Настройте оптимальную форму пиков с помощью коррекции фазы и базовой линии.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно это выполняется в программном обеспечении ЯМР на вкладке «Обработка» или «Коррекция » (в зависимости от используемого программного обеспечения), где доступны автоматические инструменты для регулировки фазы и коррекции базовой линии.
      2. В качестве эталона используйте пик остаточного растворителя (d-DMSO): ~ приблизительно 2,50 ppm для ¹H, ~ приблизительно 39,52 ppm для ¹³C NMR. Смотрите Fulmer et ^al.15для ссылок на примеси.
   5. Интегрируйте пики и назначьте их протонам в структуре (см. рис. 1).
2. Содержание воды по методу титрования по Карлу Фишеру
   1. Растворите 300 мг CAGE в 300 мкл метанола. Загрузите в шприц объемом 1 мл и взвесьте до и после инъекции.
   2. Определение содержания воды с помощью кулонометрического титратора по методу Карла Фишера в соответствии с инструкциями производителя.
      1. Введите образец в ячейку для титрования через перегородку с помощью шприца, введите массу пустого шприца и нажмите Enter. Результат будет отображаться как % w/w.
      2. Отрегулируйте содержание воды в метаноле, чтобы получить фактическое содержание воды в CAGE (обычно 1–2% по массе). (W_{образец} = W_{образец+разбавитель*}(m_{образец}+m_{разбавитель}) - (W_{разбавитель}*m_{разбавитель})/м_{образец}).
3. Термическая стабильность КЕЙДЖА с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)
   1. Поместите 3-5 мг каждого образца в алюминиевые кастрюли Tzero и закройте герметичной крышкой.
   2. Анализируют образцы с помощью ДСК в диапазоне температур от 80 °С до - 80 °С с 10 мин изотермическим периодом до охлаждения до -80°С.
   3. Используйте постоянную скорость нагрева/охлаждения 5 °C/мин и продувку азотом 50 мл/мин.
   4. Обрабатывайте данные с помощью соответствующего программного обеспечения.

3. Оценка взаимодействия кожного барьера ex vivo

1. Дерматомная обработка кожи свиньи
   1. Отрежьте пенополистирол (EPS) по размеру лезвия дерматома и оберните его прививочной лентой. Используйте кожу, собранную из области поясницы свиней, с помощью скальпеля. Здесь была получена кожа от 3,5-месячных самок свиней датского ландраса или йоркшира (30-40 кг).
   2. Удалите мышечную и жировую ткань. Чтобы облегчить дерматомирование тканей, важно обеспечить ровную и ровную базолатеральную сторону.
   3. Удалите как можно больше волос с кожи с помощью триммера для волос.
   4. Промойте кожу фосфатно-солевым буфером (PBS, pH 7,4), чтобы удалить кровь и выпавшие волосы.
   5. Нарежьте кожуру на более мелкие кусочки (5 см х 15 см) с помощью ножа, чтобы они подогнались к блокам из пенополистирола.
   6. Приложите кожу к блоку EPS с помощью игл.
   7. Установите дерматом на толщину 0,5 мм и разрежьте кожу.
   8. Храните дерматомированную кожу между двумя слоями графтирующей ленты и храните при температуре -70 °C.
2. Трансэпидермальная потеря воды (TEWL)
   1. Приготовьте PBS (pH 7,4), растворив 1 таблетку в 200 мл сверхчистой воды. Дегазировать в течение 20 минут в ультразвуковой ванне.
   2. Включите водяную баню, подключенную к диффузионным ячейкам Франца. Добавьте примерно 12 мл дегазированного PBS и магнитный шарик в каждую ячейку. Включите магнитное перемешивание (например, с частотой 600 об/мин), обеспечив равномерное распределение в рецепторной среде без создания турбулентности. Обратите внимание, что не все конфигурации камер Франца позволяют точно контролировать скорость перемешивания. Отрегулируйте источник нагрева так, чтобы он достиг температуры 37 °C в приемной среде.
   3. Разрежьте дерматомированную кожу на кусочки диаметром около 3 см (или подходящего размера) с помощью скальпеля и осторожно закрепите дерматомированную кожу на диффузионных клетках Франца с помощью зажимов и уплотнительных колец роговым слоем вверх.
   4. Затем полностью заполните рецепторные камеры PBS с помощью стеклянной пастеровской пипетки, убедившись, что они заполнены до отметки, которая указывает на известный объем рецепторной среды. Удалите пузырьки воздуха, осторожно перевернув ячейки. Гидратируйте в течение 30 минут.
   5. Включите устройство TEWL и уравновесьте в течение 20 минут до стабилизации в соответствии с рекомендациями производителя.
   6. Поместите зонд TEWL на каждую ячейку Франца и нажмите кнопку «Пуск » в программном обеспечении. Удерживайте его до тех пор, пока не отобразятся показания.
   7. Добавьте 300 μL образца поверх кожи (в трех экземплярах, n=3) и окклюзируйте, поместив графтирующую ленту поверх клетки Франца. Инкубировать в течение 24 ч при 37 °C (температура рецепторной среды).
   8. Извлеките образец, протерев салфетку безворсовыми салфетками. Оставить на 30 минут.
   9. Измерьте TEWL для каждой клетки, чтобы изучить влияние образцов на кожный барьер. Рассчитайте значения TEWL относительно значений до воздействия и отрегулируйте относительно контроля PBS (Relative TEWL = (TEWL _{post-TEWL-pre}/TEWL pre)/(TEWL(PBS)_post-TEWL(PBS) _pre/TEWL(PBS)_pre))*100.

Результаты

ЯМР-спектры
Целью данной методики является подтверждение успешного формирования CAGE путем анализа химических сред атомов водорода и углерода с помощью ЯМР-спектроскопии ¹Н и ¹³С. Полученные спектры обеспечивают характерные химические сдвиги, паттерны расщепления и значения интегрирования, которые отражают молекулярную структуру и состав синтезированного ИЛ. Спектр протонного ЯМР на рисунке 1 подтверждает молярное отношение герановой кислоты к холину...

Обсуждение

Метод получения КЕЙДЖА, описанный в данной работе, был заимствован из литературы¹⁵. Однако важно признать, что процесс синтеза чувствителен к различным внешним факторам, которые могут влиять на свойства конечного продукта. Таким образом, после подготовки система CAGE должна быть охарактеризована с использованием таких методов, как ЯМР-спектроскопия, чтобы подтвердить формирование CAGE.

Как показано на рисунке 1

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5-мм ЯМР-трубки	Сигма Олдрич	41121705
Ацетон	VWR	23L064039
Алюминиевые сковороды Tzero	TA Instruments	90,16,83,901
Устройство Aqua Flux	Системы Biox
Bruker Avance III ЯМР	Bruker		Прибор для ЯМР-спектроскопии
Холиновый бикарбонат	Сигма Олдрич	C7519
Дерматом	Циммер Биомет
Дифференциальный сканирующий калориметр	TA Instruments
Этанол	VWR	23J314009
Пенополистирола	Пенопласт
Диффузионные ячейки Франца	PermeGear
Герановая кислота	Сигма Олдрич	427764
Пришивка ленты	Парафильм
Карл Фишер Титратор	Меттлер Толедо	30252662
Метанол	VWR	85681.32
PBS	Fischer Scientific	10388739
Программное обеспечение для универсального анализа TA 2000 года	TA Instruments		Программное обеспечение для анализа данных DSC
TopSpin Software	Bruker		Программное обеспечение для анализа данных ЯМР