Декодирование естественного поведения с помощью нейроэтологического встраивания

Summary

Этот протокол представляет собой интегрированную структуру, основанную на передовых вычислительных нейроэтологических методах, для понимания кодирования мозга в натуралистических контекстах.

Abstract

Животные взаимодействуют с окружающей средой благодаря богатой и динамичной мозговой активности. Понимание того, как нейронная популяционная динамика кодирует натуралистическое поведение, остается фундаментальной проблемой системной нейробиологии. Последние достижения в области анализа поведения на основе глубокого обучения и миниатюрной флуоресцентной визуализации открыли новые возможности для изучения того, как мозг кодирует естественное поведение. В данном исследовании представлена интегрированная экспериментальная и вычислительная структура, которая сочетает в себе Атлас социального поведения (SBeA), миниатюрную двухфотонную микроскопию (mTPM) и последовательные EmBeddings многомерных записей с использованием вспомогательных переменных (CEBRA) для декодирования сложных поведенческих моделей из динамики мозга. В этом исследовании в качестве модельной системы используются натуралистические социальные взаимодействия между свободно движущимися мышами, что позволяет создавать поведенческие аннотации с высоким разрешением наряду с одновременной нейронной визуализацией. Эта структура включает в себя точную оценку поведенческой позы, синхронизированное отслеживание с помощью двух мышей, выравнивание нейронных встраиваний и декодирование поведенческих особенностей непосредственно из основных нейронных компонентов. Данное исследование демонстрирует, что такой подход позволяет достичь точности декодирования, равной 3. ± 1,5 пикселя для позы и 89 ± 6% точности для декодирования мотивов животных, подчеркивая его надежность и обобщаемость. Этот метод предоставляет мощный инструмент для изучения того, как активность мозга отражает структурированные поведенческие состояния, и закладывает основу для будущих исследований натуралистических принципов нейронного кодирования.

Introduction

Эта среда предназначена для захвата и декодирования поведенческих и нейровизуализационных данных свободно движущихся животных в естественных экспериментальных условиях. Он состоит из трех ключевых компонентов: методы оценки позы и классификации поведения на основе глубокого обучения, SBeA¹, методы миниатюрной флуоресцентной визуализации mTPM² и нейроэтологический алгоритм встраивания на основе контрастного обучения, CEBRA³. Последние исследования высветили сложность нейроэтологических процессов у свободно движущихся животных, которая превосходит наблюдаемые в экспериментальных парадигмах с фиксированной головой ^4,5. Тем не менее, технические ограничения и изменчивость препятствуют широкому применению этих подходов для более широких исследований естественного поведения. Этот протокол представляет собой стабильную и интегрированную структуру, которая обеспечивает доступность поведенческих и нейронных данных, собранных в натуралистических контекстах, для широкого круга исследовательских лабораторий.

Учитывая, что животные свободно передвигаются в естественной среде, эта структура включает в себя оценку поз на основе глубокого обучения для достижения точного отслеживания поз ^6,7. Традиционные методы слежения, основанные на обработке изображений, недостаточны для захвата мелкомасштабных движений, таких как динамика конечностей и лап, по сравнению с подходами, основанными на глубоком обучении⁸. Разнообразное и сложное поведение, демонстрируемое свободно передвигающимися животными, создает проблемы^{для методов классификации} контролируемого поведения, поскольку предопределенные поведенческие категории часто не охватывают весь спектр естественных поведенческих фенотипов^. Следовательно, методы классификации, основанные на неконтролируемом обучении, лучше подходят для анализа поведения в натуралистических условиях¹. Они могут всесторонне разложить непрерывное поведение на дискретные субсекундные мотивы в соответствии с их внутренним структурным сходством, а затем их согласованные определения задаются с помощью кластеров, управляемых данными.

Визуализация мозга свободно движущихся животных требует учета обширной изменчивости^{активности одного нейрона.} Электрофизиологические записи у свободно движущихся животных ограничены в своей способности обнаруживать нейроны с преимущественно подпороговой^{активностью11}. Кроме того, однофотонная микроскопия страдает от низкого разрешения и контрастности, что затрудняет поддержание постоянной идентичности нейронов во^{время сеансов} визуализации. mTPM обеспечивает превосходное разрешение и контрастность по сравнению с однофотонной микроскопией, что делает его более эффективным инструментом для исследования нейронного кодирования естественного поведения 2,13,14,15.

Установление надежного отображения между поведением и нейронными данными требует методов, способных выявить их общую^{информационную структуру}. Традиционные методы уменьшения размерности, такие как анализ главных компонент (PCA)¹⁷, t-распределенное стохастическое встраивание соседей (t-SNE)¹⁸ и равномерная аппроксимация и проекция многообразия (UMAP)¹⁹, не могут эффективно встраивать поведенческие и нейронные данные в общее пространство признаков. В отличие от этого, подходы к встраиванию на основе глубокого обучения, такие как CEBRA, позволяют интегрировать несколько модальностей данных как в контролируемых, так и в самоконтролируемых структурах, создавая высококачественные латентные представления³. Несмотря на то, что в последние годы появились различные альтернативные методы 20,21,22, эта предлагаемая структура отдает приоритет практическому применению, включая хорошо зарекомендовавшие себя методы, которые либо коммерчески доступны, либо поддерживаются всеобъемлющими учебными пособиями.

По сравнению с недавними исследованиями ^4,5, эта модель предлагает три ключевых достижения. Во-первых, это устраняет человеческую предвзятость в классификации поведения. Предыдущие исследования опирались на ручную маркировку поведения, которая трудоемка и подвержена несоответствиям, особенно когда аннотаторы испытывают усталость 23,24,25. В отличие от этого, эта модель использует классификацию поведения без учителя, которая сохраняет естественную структуру поведенческих паттернов путем объективной декомпозиции и кластеризации мотивов поведения перед присвоением определений^26,27. Во-вторых, использование mTPM позволяет захватывать более сложную нейронную динамику на уровне одного нейрона. Это методологическое преимущество расширяет применимость данной структуры для декодирования сложных естественных моделей поведения из различных нейронных популяций, включая те, которые участвуют в подпороговом кодировании²⁸. В-третьих, эта структура интегрирует поведенческие и нейронные данные в единое репрезентативное пространство, а не использует UMAP для встраивания каждой модальности по отдельности или использует методы опорных векторов для наложения жесткого отображения между нейронной активностью и поведением, игнорируя их^{внутреннюю динамику.} Такой подход к совместному встраиванию обеспечивает более полное и биологически значимое представление о взаимосвязи между поведением и активностью мозга.

Эта структура хорошо подходит для исследовательских проектов, которые включают в себя запись и декодирование поведенческих и нейронных данных свободно движущихся животных в естественных экспериментальных условиях. В то время как текущая реализация оптимизирована для исследований на мышах, ее адаптация к другим животным моделям может потребовать дополнительной доработки. Поскольку аппаратные компоненты, используемые в этой структуре, коммерчески доступны, с одной стороны, общая стоимость может быть относительно высокой. С другой стороны, такая коммерческая доступность значительно сокращает время, затрачиваемое на устранение логистических проблем, и обеспечивает получение стабильных и надежных результатов эффективным способом.

Этот протокол разработан таким образом, чтобы быть воспроизводимым и доступным для нейробиологических лабораторий, оборудованных для визуализации мелких животных и отслеживания поведения. Комплексная система включает в себя коммерчески доступное устройство mTPM с многоугольной настройкой поведенческого захвата. Типичные нейронные записи захватываются с частотой 4,84 Гц с разрешением 512 × 512 пикселей, а поведенческие данные захватываются с частотой 30 кадров в секунду. Синхронизация данных достигается за счет выравнивания импульсов TTL во время предварительной обработки. Обучение и декодирование могут выполняться на стандартной рабочей станции с графическим процессором (например, NVIDIA RTX 3090 или аналогичной), а для полного конвейера требуется примерно 100 ГБ хранилища для каждого эксперимента. В то время как текущая реализация оптимизирована для свободно движущихся мышей, модульная конструкция рабочего процесса позволяет адаптироваться к другим видам за счет регулировки параметров калибровки отслеживания и визуализации в зависимости от размера и подвижности животного. Эти практические детали поддерживают адаптивность и воспроизводимость протокола в различных экспериментальных условиях.

Protocol

Комитет по уходу за животными и их использованию в Шэньчжэньском институте передовых технологий Китайской академии наук одобрил все процедуры содержания и экспериментирования.

1. Создание платформы

ПРИМЕЧАНИЕ: Платформа состоит из двух основных компонентов: устройства mTPM и устройства 3D-поведения (рисунок 1A). Устройство mTPM обеспечивает синхронизацию изображений mTPM с поведенческими данными в режиме реального времени, тем самым обеспечивая эффективное, стабильное и непрерывное получение высококачественных данных от свободно движущихся животных. Устройство 3D-поведения оснащено четырьмя камерами для захвата полной сцены поведения животных и модулем автоматической калибровки для реконструкции 3D-поз животных. Оба устройства должны включать модули синхронизации в свои соответствующие версии.

1. Подключение устройства
   1. Снимите внешнюю оболочку устройства 3D-поведения. Поместите остальные части устройства 3D-моделирования, включая четыре камеры и модуль автоматической калибровки, в камеру регистрации поведения устройства mTPM.
   2. Подключите кабель универсальной последовательной шины (USB) модуля синхронизации устройства 3D-поведения к рабочей станции устройства 3D-поведения.
   3. Подключите модуль синхронизации устройства mTPM к контроллеру устройства mTPM с помощью одного кабеля SubMiniature версии A (SMA).
   4. Подключите выходной порт транзисторно-транзисторной логики (TTL) модуля синхронизации устройства 3D-поведения к входному порту TTL модуля синхронизации устройства mTPM через один преобразовательный кабель SMA-Bayonet Neill-Concelman (BNC).
2. Запись временных меток кадров mTPM
   1. Включите все источники питания устройства mTPM.
   2. Запустите программное обеспечение для записи mTPM и программное обеспечение для синхронизации mTPM.
   3. Задайте пути сохранения кадров mTPM и метки времени синхронизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте неанглийские буквы и специальные символы для именования путей.
   4. Задайте количество кадров записи в программном обеспечении для записи mTPM. Рекомендуемое количество кадров — 6000, чего достаточно для завершения этапа отладки синхронизации.
   5. Выберите каждый канал программного обеспечения для синхронизации mTPM.
   6. Запустите запись mTPM с помощью программного обеспечения для записи mTPM. Перед началом записи выключите все источники света в комнате, чтобы защитить mTPM от перегорания света. Программное обеспечение для синхронизации mTPM будет автоматически запущено, когда пользователь начнет запись.
   7. Проверьте, захватываются ли временные метки кадров mTPM программным обеспечением для синхронизации mTPM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Временные метки кадров mTPM, отображаемые в программном обеспечении синхронизации mTPM, являются четкими импульсами TTL. Каждый кадр изображения инициирует резкий импульс TTL, который по умолчанию составляет 4,84 Гц. Если импульс не отображается на панели программного обеспечения, есть 2 обычные проблемы. Первая заключается в том, что драйвер контроллера устройства mTPM не поддерживает захват временных меток. Улучшение версии драйвера для поддержки захвата временных меток может решить первую проблему. Второй – плохое соединение кабеля SMA. Убедитесь, что разъемы SMA надежно затянуты. Прежде чем проверять временные метки, вернитесь к версии 1.1.2, затем попробуйте шаг за шагом.
   8. Подождите, пока запись остановится. Проверьте, сохранен ли файл .tif кадров mTPM, один файл .tdms и один файл .tdms_index меток времени.
3. Запись временных меток четырех камер устройства 3D-поведения
   1. Задайте путь сохранения видео и временные метки поведения в настроенном скрипте синхронизации камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настраиваемый код синхронизации камеры находится на https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py.
   2. Запустите программное обеспечение для синхронизации mTPM. Задайте пути сохранения меток времени синхронизации mTPM.
   3. Запустите запись программного обеспечения для синхронизации mTPM. Запустите настроенный сценарий синхронизации камеры.
   4. Проверьте, фиксируются ли метки времени поведения программным обеспечением синхронизации mTPM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Временные метки поведения, отображаемые в программном обеспечении синхронизации mTPM, являются четкими импульсами TTL. Одна временная метка поведения отправляется в программное обеспечение синхронизации mTPM для каждых 30 кадров записи видеокадра поведения. Временные метки поведения также будут сохранены на рабочей станции устройства 3D-поведения.
   5. Проверьте, сохранены ли четыре .avi файла видеороликов о поведении, один файл .txt с временными метками поведения в устройстве 3D-поведения, а также один файл .tdms и один файл .tdms_index с временными метками поведения на рабочей станции mTPM.
4. Калибровка камеры устройства 3D-поведения
   1. Отрегулируйте угол съемки четырех камер. Четыре камеры должны полностью охватывать всю базу открытого поля, а также расширять свое поле зрения не менее чем на 20 см над самой дальней границей открытого поля, чтобы гарантировать полную съемку моментов подъема мыши.
   2. Поместите калибровочный модуль в центр зон съемки. Запустите программное обеспечение для калибровки камеры. Перед запуском программного обеспечения для калибровки камеры выключите все индикаторы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре камеры будут захватывать кадры движущейся контрольной доски, отображаемой экраном калибровки. Калибровка камеры основана на методе калибровки^{Чжана 29}.
   3. После запуска программного обеспечения для калибровки камеры будет сохранен один файл .mat, который содержит матрицу проекции камеры для 3D-реконструкции позы животного. Поскольку индексация данных о поведении на этапе синхронизации системы зависит от файла калибровки .mat, убедитесь, что этап калибровки камеры завершен до этапа синхронизации всей системы.
5. Синхронизация всей системы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этим шагом убедитесь, что временные метки из кадров mTPM и устройства 3D-поведения могут быть получены программным обеспечением синхронизации mTPM отдельно.
   1. Включите все источники питания устройства mTPM и устройства 3D-поведения.
   2. Запустите программное обеспечение для записи mTPM, программное обеспечение для синхронизации mTPM и настраиваемый сценарий синхронизации камеры.
   3. Задайте их путь и параметры, ориентируясь на шаг 1.3.1. Запустите запись mTPM с помощью программного обеспечения для записи mTPM.
   4. Запустите настроенный сценарий синхронизации камеры. Убедитесь, что запись кадров mTPM начинается раньше, чем запуск сценария записи поведения, чтобы программное обеспечение синхронизации mTPM могло получать метки времени от устройства 3D-поведения. Установите время окончания записи кадров mTPM более длительным, чем время записи поведения, чтобы программное обеспечение синхронизации mTPM могло захватывать метки времени поведения без потерь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое время записи кадров mTPM должно превышать 5 минут с момента записи поведения. Например, если пользователь хочет записать поведение в течение 15 минут, количество кадров mTPM должно быть установлено равным 4,84 x (15+5) x 60 = 5808 кадров.
   5. Дождитесь остановки записи. После записи в файл .tif остается один кадр mTPM, два файла TDMS для синхронизации mTPM, два файла .tdms_index, четыре файла видео .avi поведения и один файл метки времени .txt поведении.
   6. Запустите настраиваемый код синхронизации, чтобы выровнять кадр mTPM и видеоролики о поведении. Настраиваемый код синхронизации находится в https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m.
      1. Перед запуском этого скрипта вручную организуйте файлы следующим образом:
         ----\Root path # Путь для сохранения всех данных
         --------\behavior_all # Путь к сохранению данных о поведении
         ------------\A-B-C-D-E-caliParas.mat # Файл калибровки камеры
         ------------\A-B-C-D-E-camera-1.avi # поведение видео с камеры 1
         ------------\A-B-C-D-E-camera-2.avi # поведение видео с камеры 2
         ------------\A-B-C-D-E-camera-3.avi # поведение видео с камеры 3
         ------------\A-B-C-D-E-camera-4.avi # поведение видео с камеры 4
         ------------\A-B-C-D-E-event.txt # временная метка поведения от устройства 3D поведения
         ----\tpm_suite2p # Путь к сохранению данных mTPM
         --------\sep # Путь для сохранения кадров mTPM и временных меток
         ------------\A-B-C-D-E-event # Путь для выравнивания временных меток
         ----------------\beh.tdms # Файл .tdms канала поведения
         ----------------\beh.tdms_index #The файл канала .tdms_index поведения
         ----------------\tpm.tdms # Файл .tdms канала mTPM
         ----------------\tpm.tdms_index # Файл .tdms_index канала mTPM
         ------------\A-B-C-D-E-tpm # Путь для сохранения кадров mTPM
         ----------------\F.tif # Кадры mTPM каждой записи
         --------\process # Путь к извлечению нейронных следов
         ------------\C # Путь каждой мыши
         ----------------\F.tif # Кадры mTPM каждой мыши
         От A до G — определения полей имен, где
         А означает экспериментальные группы, например, свободные,
         B означает последовательность видеороликов, например, seg1,
         C означает идентичность животных, например, 1tpmss,
         D означает партнеров по взаимодействию, например, 1wt,
         E означает дату эксперимента, например, 20220226, а
         F означает блок кадра записи mTPM (5000 кадров на блок), например, social 1.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Частота кадров 3D-системы поведенческого слежения составляет 30 Гц, а mTPM — 4,84 Гц. Поскольку максимально достижимая точность синхронизации ограничена самой низкой частотой кадров (4,84 Гц), временное разрешение синхронизации составляет примерно 206 мс. Поведенческие временные метки служат в качестве эталона, и каждый кадр mTPM выравнивается по ближайшей поведенческой временной точке. Интервалы между последовательными кадрами mTPM по отношению к поведенческой временной шкале интерполируются с использованием пошагового подхода.

2. Регистрация нейроэтологических данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс записи нейроэтологических данных состоит из четырех ключевых этапов (рис. 1B).

1. Монтаж mTPM
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку детали подключения mTPM содержатся в руководстве по mTPM, здесь представлены только ключевые шаги.
   1. Подготовьте краниальное окно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка краниального окна в основном включает в себя инъекцию вируса, имплантацию покровного стекла и фиксацию металлической пластины. Поскольку места визуализации в разных исследованиях различны, детали подготовки краниального окна различны. В этом случае подготовку краниального окна выполняет аутсорсинговая служба. Областью визуализации мозга в данных примера является первичная соматосенсорная кора (S1).
   2. Закрепите удерживатель мыши на микроманипуляторе mTPM. Закрепите головку мыши к ограничителю через металлическую пластину.
   3. Найдите флуоресценцию с помощью mTPM. Выключите все индикаторы перед включением визуализации mTPM. Закрепите mTPM на держателе перед выполнением следующих действий.
      1. Добавьте одну каплю геля для глаз Carbomer в верхнюю часть черепного окна. Перемещайте мышь по движущейся платформе, когда краниальное окно выровнено под объективом mTPM.
      2. Переместите микроманипулятор вертикально, чтобы найти плоскость визуализации. Переместите микроманипулятор в плоскость, чтобы отцентрировать плоскость изображения.
   4. Закрепите верхнее основание на mTPM. Приклейте нижнее основание к верхнему основанию и окну черепа.
      1. Чтобы обеспечить структурную устойчивость, заполните зазор между двумя основаниями и металлической пластинчатой скобой, прикрепленной к голове мыши, и приклейте ее с помощью высокоэффективного акрилового конструкционного клея. Отверждите клей в течение 30 минут, прежде чем оценить стабильность соединения, осторожно прощупывая основание пинцетом. При необходимости наносится дополнительный клей до тех пор, пока не будет достигнута надежная фиксация.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Важно предотвратить любое прямое сцепление между основанием и самим mTPM. Верхнее и нижнее основания представляют собой небольшие алюминиевые рамы. Верхняя база изготовлена по индивидуальному заказу таким образом, чтобы плотно прилегать к нижнему контуру корпуса mTPM. Нижние основания с несколькими вариантами высоты используются для перекрытия зазора между верхним основанием и черепным окном. Все нижние основания имеют те же плоские размеры, что и верхнее, чтобы обеспечить механическую совместимость, различаясь только по высоте, чтобы соответствовать различным расстояниям от черепа до верхней базы.
   5. Добавьте одну каплю геля для глаз Carbomer внутрь базовой камеры. Проверьте флуоресценцию нейронов с помощью mTPM. Если флуоресценция нейронов не видна четко, удалите клей с помощью черепного сверла, позволяющего отделить основание, после чего вышеуказанную процедуру повторяют до тех пор, пока не будет достигнута прозрачность флуоресценции.
   6. Закрепите алюминиевую фольгу лентой между волокном mTPM и черепным окном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для поддержания надлежащей светозащиты на протяжении всего процесса записи. Использование алюминиевой фольги и клейкой ленты было сведено к минимуму для снижения общего веса.
   7. Включите свет в комнате и проверьте четкость кадров mTPM.
2. Высадка мыши в чистое поле
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг включает в себя размещение мыши в открытом поле с обеспечением правильного баланса веса волокна и mTPM.
   1. Надуйте не менее 10 гелиевых шаров и отдельно обвяжите их хлопчатобумажным шпагатом. Отсоедините металлическую пластину от ограничителя для мыши.
   2. Держите мышь за хвост одной рукой. Поддержите волокно mTPM другой рукой.
   3. Аккуратно расположите мышь в открытом поле. Подвесьте гелиевые шары с помощью хлопчатобумажного шпагата к волокну. Регулируйте количество воздушных шаров до тех пор, пока мышь не сможет свободно перемещаться и исследовать открытое поле без ограничений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное количество воздушных шаров определяется, когда мышь остается на земле, при этом ее передние конечности не поднимаются вверх за счет плавучести, но при этом в достаточной степени уравновешивают вес mTPM, чтобы позволить животному сохранять естественное положение головы и спонтанно вставать прямо. Хлопчатобумажный шпагат должен быть завязан на высоте над открытым полем, чтобы обеспечить достаточную длину волокна для неограниченного движения мыши. Хлопчатобумажный шпагат обвязывался на высоте оптического волокна, которое было примерно выровнено по верхнему краю камеры открытого поля. В приведенном примере, как только этот шаг завершен, необработанная мышь вводится в открытое поле, чтобы обеспечить свободное социальное взаимодействие.
   4. Закройте дверцу корпуса mTPM, чтобы свести к минимуму внешние помехи.
3. Включение записи mTPM.
   1. Запустите программное обеспечение для записи mTPM и программное обеспечение для синхронизации mTPM. Задайте их путь и параметры, ориентируясь на шаг создания платформы.
   2. Запустите запись mTPM с помощью программного обеспечения для записи mTPM. Проверьте наличие временных маркеров, соответствующих каждому двухфотонному кадру в программном обеспечении синхронизации.
   3. Оцените, остается ли контраст двухфотонных изображений неизменным, и убедитесь, что локомоция мыши не нарушает стабильность записанных кадров. При обнаружении каких-либо проблем повторяйте процедуру синхронизации и монтаж mTPM до тех пор, пока двухфотонное изображение не создаст четкие кадры с точно выровненными временными метками.
4. Включение записи поведения
   1. Запустите настроенный сценарий синхронизации камер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настраиваемый код синхронизации камеры находится на https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py.
   2. Задайте путь и параметры, относящиеся к шагу создания платформы.
   3. Начните запись поведения с помощью настроенного скрипта синхронизации камеры. Проверьте наличие маркеров времени, соответствующих каждым 30 кадрам поведения в программном обеспечении синхронизации mTPM.
   4. Проверьте, правильно ли синхронизированы четыре видеопотока с камер, а также проверьте параметры видеозахвата системы 3D-поведенческого слежения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенной выше конфигурации камеры используют разрешение кадров 640 × 480 пикселей, частоту кадров 30 кадров в секунду, RGB-кадры и автоматическую экспозицию. Автоматическая экспозиция позволяет камере динамически регулировать яркость в зависимости от условий окружающего освещения. Поскольку время экспозиции напрямую влияет на достижимую частоту кадров, особенно в условиях низкой освещенности, где требуется более длительная выдержка, частота кадров может снизиться. Чтобы обеспечить стабильное получение кадров с частотой 30 Гц, важно контролировать фоновую освещенность, чтобы свести к минимуму время экспозиции. Настройки усиления камеры и группирования сохраняются на значениях по умолчанию на протяжении всей записи.
   5. Запись поведения автоматически прекратится по достижении заданной продолжительности. После завершения поведенческой записи вручную выключите запись и синхронизацию mTPM. Следуя этим шагам, можно завершить одну попытку одновременного сбора нейронных и поведенческих данных.

3. Нейроэтологическая обработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Если все предыдущие шаги выполнены успешно, необходимо получить три категории файлов данных: двухфотонные кадры изображения (.tif), четыре поведенческие видеозаписи (.avi) вместе с файлом калибровки камеры (.mat) и два файла синхронизации временных меток (.tdms) для последующей предварительной обработки данных (рис. 1C). Эти данные должны быть вручную переименованы и помещены в папки, относящиеся к шагу 1.5.7.

1. Предварительная обработка данных mTPM
   1. Извлекайте траектории нейронных сигналов из кадров mTPM с помощью suite2p³⁰. Оставьте параметры suite2p на значениях по умолчанию, чтобы обеспечить воспроизводимость. Регулируйте частоту кадров только в соответствии с параметрами сбора данных mTPM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку последующие шаги включают обработку сигнала и контроль качества, на данном этапе нет необходимости в тщательной настройке параметров suite2p. Поддержание согласованности между наборами данных имеет большее значение.
   2. Запустите настраиваемый код, чтобы выровнять временные метки между кадрами mTPM и видеороликами о поведении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт сопоставляет временные метки поведенческих событий с соответствующими временами получения mTPM. Он генерирует и сохраняет сопоставления индексов для каждой записи, обеспечивая синхронный анализ поведения и нейронных данных. Этот настраиваемый код находится по адресу https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m.
   3. Запустите пользовательский код для преобразования формата данных из вывода suite2p.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт извлекает и реорганизует данные mTPM для отдельных животных, определяя и сопоставляя соответствующие индексы кадров. Он выбирает соответствующие следы нейронной активности и реструктурирует их в стандартизированный формат данных, что позволяет оптимизировать последующий анализ сегментированных записей. Этот настраиваемый код находится в https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step2_separate_tpm_data.m.
   4. Запустите пользовательский код для повторной дискретизации нейронных сигналов для согласования с кадрами поведения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот скрипт выполняет временную пересчет данных mTPM для выравнивания трасс нейронной активности с поведенческими временными метками. Он загружает ранее сегментированные нейронные данные и индексы синхронизации, извлекает повторно дискретизированные трассы и сохраняет выходные данные в стандартизированном формате для дальнейшей обработки сигнала. Методом временной передискретизации является ступенчатая интерполяция. Этот настраиваемый код находится в https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step3_resample_tpm_data.m.
   5. Запустите пользовательский код для уточнения нейронных траекторий.
      1. Поскольку ступенчатая интерполяция может привести к артефактам звона и высокочастотному шуму, разработайте эквипульсирующий фильтр нижних частот с частотой полосы пропускания 2 Гц и частотой полосы задержки 2,2 Гц, чтобы смягчить эти артефакты. Порядок фильтра — 61.
      2. После этого используйте метод шумоподавления Вэйцзянь Цзуна для уточнения повторно отобранных следов кальция mTPM¹³. Он оценивает локальные базовые показатели с использованием критериев процентиля и локальной дисперсии, а также вычисляет сигналы ΔF/F. ΔF/F — это безразмерная мера, представляющая собой относительное изменение интенсивности флуоресценции по сравнению с исходным уровнем, обычно используемая для количественной оценки нейронной активности при визуализации кальция. Поскольку и числитель (ΔF), и знаменатель (F) выражены в произвольных единицах флуоресценции, результирующее значение ΔF/F не имеет физической единицы измерения и выражается в виде отношения или процента. Ячейки с очень плоскими или насыщенными сигналами исключаются на основе пороговых значений дальности сигнала. Полученные высококачественные трассировки нейронной активности сохраняются для последующего анализа ( рис. 2A, рис. 3A и рис. 4A).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальный код доступен по адресу https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step4_filter_tpm_data.m.
2. Данные о поведении при предварительной обработке
   1. Извлекайте поведенческие позы из видеозаписей с помощью трекера поз с защитой от дрифта (ADPT)⁷.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ADPT решает проблему частого дрейфа точек, наблюдаемого в методах на основе сверточных нейронных сетей, таких как DeepLabCut⁶ и SLEAP²². ADPT особенно хорошо подходит для сценариев с использованием нейронных записывающих устройств, таких как визуализация mTPM у свободно движущихся животных, поскольку он эффективно снижает дрейф точек, вызванный движением волокна. Репозиторий ADPT находится по адресу https://github.com/tangguoling/ADPT.
      1. Учитывая, что в экспериментальной установке участвуют две мыши, а mTPM служит идентификатором для одной из них, обучите две независимые модели ADPT с одной мышью для оценки поз каждой мыши по отдельности.
      2. Для каждой модели вручную аннотируйте 16 ключевых точек^{1, 10, 15, 31}, включая нос, левое ухо, правое ухо, шею, левые и правые передние конечности, левую и правую задние лапы, левую и правую задние лапы, заднюю часть, основание хвоста, среднюю часть хвоста и кончик хвоста — примерно на 600 кадров, с 150 кадрами, вручную помеченными для каждого вида камеры для 15-минутного видео.
      3. Обучение моделей ADPT с использованием параметров по умолчанию. Подробная информация о параметрах обучения и прогнозирования находится в https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config.yaml и https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config_predict.yaml.
   2. Реконструкция 3D поз животных. После обучения примените две модели независимо друг от друга, чтобы предсказать позы каждой мыши из каждого видео, снятого разными камерами. Объедините полученные данные в единый файл таблицы для дальнейшей обработки.
   3. Выполните 3D-реконструкцию поведенческих траекторий с использованием триангуляции в сочетании с файлом калибровки камеры³². После реконструкции получите траектории движения мыши объекта (та, которая несет mTPM, рисунок 2B, рисунок 3B, рисунок 4B) и мыши-объекта (взаимодействующий сородич, рисунок 2C, рисунок 3C, рисунок 4C) для последующего анализа.
   4. В исследованиях социального взаимодействия межиндивидуальные расстояния служат важнейшими индикаторами социальной динамики³³. Вычислите относительные расстояния между двумя мышами, используя парные евклидовы расстояния между соответствующими точками тела, обеспечив количественные измерения для дальнейшего анализа социального поведения ( Рисунок 2D, Рисунок 3D, Рисунок 4D).
   5. Декомпозиция и классификация мотивов поведения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что предыдущие шаги дают детальные траектории поз, они еще не говорят нам, что делает животное. Поведение относится к тому, как животное движется в течение определенного периода, а присвоение поведения включает в себя присвоение каждому такому периоду значимого, интерпретируемого человеком ярлыка. Обычный способ — использовать человеческие аннотации.
      1. Поскольку поведенческие записи часто слишком длинные, чтобы их можно было пометить вручную целиком, используйте методы машинного обучения.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируемое обучение придерживается заранее определенных правил маркировки: аннотаторы-люди присваивают метки выбранным сегментам поведения, которые затем используются для обучения моделей машинного обучения или искусственного интеллекта прогнозированию меток по всему набору данных. Несмотря на то, что этот подход повышает эффективность классификации поведения, он остается ограниченным набором интерпретируемых человеком ярлыков, что является особенно существенным ограничением при работе со сложными, натуралистическими моделями поведения. Чтобы охватить богатую вариативность натуралистического поведения, были разработаны методы классификации поведения без учителя. Эти подходы выявляют внутренние сходства между поведенческими мотивами во времени и группируют их в низкоразмерных пространствах признаков, обеспечивая более эффективную и непредвзятую человеческую интерпретацию. По сути, контролируемая классификация опирается на предопределенные человеческие метки для распознавания поведения, в то время как неконтролируемая классификация раскрывает скрытые поведенческие структуры без предварительной маркировки, обеспечивая большую гибкость в захвате сложной натуралистической динамики.
      2. В рамках натуралистического поведения определите поведенческие мотивы двух мышей с помощью Атласа поведения (BeA)¹⁰ и Атласа социального поведения (SBeA)¹ ( Рисунок 2E, Рисунок 3E, Рисунок 4E), оба из которых представляют собой методы кластеризации без учителя, предназначенные для поведенческой сегментации. Эти методы декомпозируют и кластеризуют поведение животных на субсекундные мотивы на основе их внутренних динамических и иерархических структур³⁴, впоследствии связывая их с определенными поведенческими категориями.
   6. Извлекайте поведенческие мотивы отдельных мышей с помощью BeA.
      1. Чтобы уменьшить шум, примените медианный фильтр с временным окном 500 мс. Выполняйте выравнивание тела, используя ключевые точки основания спины и хвоста, чтобы облегчить разложение нелокомоторных движений, в то время как правая передняя конечность, левая передняя конечность, правая задняя конечность и ключевые точки левой задней конечности используются для нормализации размера тела.
      2. Для разложения поведения используйте 39 выровненных координат тела, в том числе: нос (x, y, z), левое ухо (x, y, z), правое ухо (x, y, z), шея (x, y, z), левая передняя конечность (x, y, z), правая передняя конечность (x, y, z), левая задняя конечность (x, y, z), правая задняя конечность (x, y, z), левая передняя лапа (x, y, z), правая передняя лапа (x, y, z), левая задняя лапа (x, y, z), правая задняя лапа (x, y, z), задняя (z) и основание хвоста (x, z).
      3. Установите индекс временного сокращения равным 5 с разрешением кластеризации 3. Для инициализации используйте спектральную кластеризацию, используя ядро Гаусса с сигма полосы пропускания 30. Установите минимальную и максимальную продолжительность сегментации на 500 мс и 2000 мс соответственно.
      4. Для встраивания поведенческих мотивов используйте UMAP с 30 ближайшими соседями и минимальным расстоянием 0,05. Кластеризуйте мотивы с помощью иерархической кластеризации с использованием связи Уорда и евклидова попарного расстояния для повышения стабильности классификации. Репозиторий BeA находится по адресу
      5. Определите социальные поведенческие мотивы с помощью SBeA. Параметры инициализации для SBeA приведены в соответствие с параметрами, используемыми в BeA, со следующими изменениями: медианный размер окна фильтра установлен на 1000 мс, минимальная длина сегментации увеличена до 2000 мс, а максимальная длина сегментации увеличена до 5000 мс для декомпозиции социального поведения.
      6. Для встраивания мотива примените ядро Гаусса с пропускной способностью сигма, равной 2. Итоговое число кластеров социального поведения колеблется от 16 (нижняя граница) до 280 (верхняя граница). В представленных примерах в демонстрационных целях используются только 16 самых крупных кластеров. Репозиторий SBeA находится по адресу https://github.com/YNCris/SBeA_release/blob/main/README_SBeA_mapper.md.

4. Нейроэтологическое картирование данных

1. Подготовка картографических наборов данных. После вышеупомянутой подготовки доступны семь наборов данных для нейроэтологического картирования, включая нейронную активность, позы субъекта, позы объекта, расстояния до тела, мотивы поведения субъекта, мотивы поведения объекта и мотивы социального поведения. Вручную организуйте эти файлы следующим образом:
   Путь к данным # Путь к сохранению всех данных
   ----\A-B-C-D-E-neu.mat # Активность нейронов
   ----\A-B-C-D-E-pose-tpm.mat # Позы объекта
   ----\A-B-C-D-E-pose-free.mat # Позы объекта
   ----\A-B-C-D-E-rel_dist.mat # Расстояния до тела
   ----\A-B-C-D-E-mov-tpm.mat # Мотивы поведения субъекта
   ----\A-B-C-D-E-mov-free.mat # Мотивы поведения объектов
   ----\A-B-C-D-E-sbea.mat # Мотивы социального поведения
   Определения полей A, B, C, D и E аналогичны 1.5.7. Демонстрационные данные для воспроизведения находятся по адресу https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29606795.v1.
2. Создание вложений сопоставления с помощью CEBRA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, что CEBRA интегрирует как гипотезологие, так и исследовательские подходы к построению вложений, он хорошо подходит для раскрытия нейронных представлений, связанных с различными вспомогательными переменными (рис. 5A).
   1. Чтобы обеспечить систематическое сравнение вложений в различных модальностях, стандартизируйте параметры моделей CEBRA. Архитектура модели использует 10 смещений с размером пакета 1024, коэффициентом обучения 0,0001 и температурным параметром 1.
   2. Установите выходной параметр равным 3 и проведите обучение не более 15 000 итераций. В качестве метрики подобия используется косинусное расстояние, а условная переменная определяется как дельта времени со смещением времени 10. Используйте данные об активности нейронов в качестве входных данных, а вспомогательные переменные — в качестве меток для создания совместных встраиваний.
3. Для самовстраивания нейронной активности применяйте те же параметры CEBRA, но используйте только данные о нейронной активности в качестве входных данных.

Results

Изучение естественного поведения представляет большую сложность по сравнению с экспериментами, основанными на испытаниях. Во-первых, в естественных условиях как нейронная активность, так и поведение не имеют фиксированной базовой линии. Эти активности являются рекуррентными, что означает, что на них влияют предыдущие состояния, и, таким образом, согласование начала конкретного поведения для сравнения нейронной активности не позволяет распутать эффекты предыдущих нейроэтологических состояний. Во-вторых, нейронное кодирование в естественном поведении в первую очередь происходит на популяционном уровне ^4,5. Изменчивость, наблюдаемая в отдельных нейронах, достаточно значительна, чтобы ее можно было рассматривать как шум. Чтобы убедиться в этом, в данной части был проведен корреляционный анализ между нейронной активностью и естественными поведенческими позами (рис. 2F, рис. 3F, рис. 4F). Полученные матрицы коэффициентов корреляции не выявили нейрон-специфичного соответствия со следами позы. В частности, коэффициенты корреляции между нейронными сигналами и позами объекта, позами объекта или расстояниями между телами находились в диапазоне от -0,3 до +0,3, что обычно рассматривается как слабая корреляция¹⁵ (рис. 2G, рис. 3G, рис. 4G). Эти результаты указывают на то, что в естественных условиях информация, связанная с позой, не кодируется специфическим для нейронов образом.

Учитывая эти факторы, данная модель предлагает объективный подход к сбору и картированию нейроэтологических данных на уровне нейронной популяции. Визуализация mTPM гарантирует, что вариабельность отдельных нейронов сохраняется в максимально возможной степени. Кроме того, использование оценки позы на основе глубокого обучения с помощью ADPT и методов декомпозиции неконтролируемого поведения, таких как BeA и SBeA, генерирует богатые вспомогательные переменные, что позволяет CEBRA эффективно интерпретировать изменчивость в нейронных популяциях.

Эти примеры демонстрируют, что совместные встраивания CEBRA присутствуют во всех вспомогательных переменных, включая позы субъекта, позы объекта, расстояния до тела, мотивы поведения субъекта, мотивы поведения объекта и мотивы социального поведения (рисунок 5A). Чтобы проверить согласованность поведенческих мотивов и нейронных встраиваний между сеансами или субъектами, анализ Прокруста³⁵ используется на трех парах мышей (рисунок 5B). Учитывая, что вложения CEBRA распределяются по единичной сфере, в прокрустовом анализе был включен только параметр вращения. Поскольку встраиваемые элементы CEBRA с естественным поведением не имеют четкой базовой линии, в этой части сначала была выполнена выборка выравнивания на основе меток для выравнивания, чтобы обеспечить согласованность опорных точек перед применением анализа Прокруста. Визуально эти встраивания CEBRA демонстрируют определенную степень внутренней согласованности, при этом расстояние до тела и социальные мотивы демонстрируют наивысшее выравнивание. Он подходит для количественной оценки RMSE до и после выравнивания Прокруста (рис. 5C). Затем сравнивается точность декодирования встраивания для поз (рисунок 5D) и мотивов (рисунок 5E). Несмотря на то, что их представления различаются, каждое из них можно расшифровать с высокой точностью. Хотя декодирование RMSE расстояния до тела значительно выше, чем позы объекта и объекта, оно не превышает точность слежения ADPT⁷.

Чтобы исследовать происхождение этих основанных на гипотезах встраиваний, с помощью CEBRA было сгенерировано самоорганизованное встраивание нейронной активности (рисунок 5A, правый столбец). Форма нейронного встраивания более сложная, чем у других совместных встраиваний, включающих в себя паттерны из различных совместных встраиваний. Кроме того, сходство между нейронными и совместными встраиваниями сравнивалось с помощью преобразования Прокруста, а затем сравнивалось их косинусное сходство (рис. 5F). Косинусное сходство получается в минуту между выровненными вложениями в соответствующих временных точках.

Совместное встраивание поз S1 было выбрано в качестве основы для сравнения сходства на основе хорошо установленной роли S1 в кодировании самоорганизованных соматосенсорных входов³⁶. Это встраивание служит биологически значимой точкой отсчета для оценки того, как другие переменные, такие как мотивы, связанные с объектами, представлены в том же нейронном пространстве. Такие сравнения позволяют нам оценить относительную силу кодирования для различных поведенческих измерений по отношению к самосвязанному соматосенсорному базовому уровню.

При сравнении косинусного сходства нейронных встраиваний с совместным встраиванием S1-субъекта в качестве базового уровня, в данном исследовании было обнаружено, что совместное встраивание для мотивов объектов значительно ниже. Это говорит о том, что в течение 15-минутного периода свободного социального взаимодействия в этом примере нейронная активность S1 испытуемой мыши в первую очередь кодирует как ее поведение, так и происходящие социальные взаимодействия. Хотя этот анализ служит наглядным примером, та же методологическая основа может быть легко применена к более детальным исследованиям, например, путем сравнения встраиваемых структур в различные временные эпохи для выявления динамических сдвигов в нейронном кодировании.

Рисунок 1: Процедура сбора нейроэтологических данных. (А) Интеграция устройств. (B) Операция по записи данных. (C) Извлечение нейронных сигналов, 2D-оценка позы и 3D-реконструкция траектории тела после записи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Предварительно обработанные данные мыши 1 для дальнейшего анализа. (А) Активность нейронов. (B) Позы субъекта. (c) Позы объекта. (D) Расстояние до тела. (E) Мотивы поведения. Сверху вниз расположены мотивы субъекта, объекта и социального поведения. (F) Матрицы коэффициентов корреляции между нейронной активностью и позами. Слева: коэффициенты корреляции между нейронной активностью и позами субъекта. Центр: коэффициенты корреляции между нейронной активностью и позами объекта. Справа: коэффициенты корреляции между нейронной активностью и расстоянием до тела. Коэффициенты корреляции относятся к каждому нейронному следу и каждому измерению позы. (G) Распределения коэффициентов корреляции F. Индексы нейронов отсортированы в соответствии с коэффициентами корреляции между нейронной активностью и позами объекта. Сокращения: N & S = нейронная активность и позы объекта, N & O = нейронная активность и позы объекта, N & B = нейронная активность и расстояния тела, CC = коэффициенты корреляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Предварительно обработанные данные мыши 2 для дальнейшего анализа. (А) Активность нейронов. (B) Позы субъекта. (c) Позы объекта. (D) Расстояние до тела. (E) Мотивы поведения. Сверху вниз расположены мотивы субъекта, объекта и социального поведения. (F) Матрицы коэффициентов корреляции между нейронной активностью и позами. Слева: коэффициенты корреляции между нейронной активностью и позами субъекта. Центр: коэффициенты корреляции между нейронной активностью и позами объекта. Справа: коэффициенты корреляции между нейронной активностью и расстоянием до тела. Коэффициенты корреляции относятся к каждому нейронному следу и каждому измерению позы. (G) Распределения коэффициентов корреляции F. Индексы нейронов отсортированы в соответствии с коэффициентами корреляции между нейронной активностью и позами объекта. Сокращения: N & S = нейронная активность и позы объекта, N & O = нейронная активность и позы объекта, N & B = нейронная активность и расстояния тела, CC = коэффициенты корреляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Предварительно обработанные данные мыши 3 для дальнейшего анализа. (A) Активность нейронов. (B) Позы субъекта. (c) Позы объекта. (D) Расстояние до тела. (E) Мотивы поведения. Сверху вниз расположены мотивы субъекта, объекта и социального поведения. (F) Матрицы коэффициентов корреляции между нейронной активностью и позами. Слева: коэффициенты корреляции между нейронной активностью и позами субъекта. Центр: коэффициенты корреляции между нейронной активностью и позами объекта. Справа: коэффициенты корреляции между нейронной активностью и расстоянием до тела. Коэффициенты корреляции относятся к каждому нейронному следу и каждому измерению позы. (G) Распределения коэффициентов корреляции F. Индексы нейронов отсортированы в соответствии с коэффициентами корреляции между нейронной активностью и позами объекта. Сокращения: N & S = нейронная активность и позы объекта, N & O = нейронная активность и позы объекта, N & B = нейронная активность и расстояния тела, CC = коэффициенты корреляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Анализ встраиваемых нейроэтологических данных CEBRA. (A) Встраиваемые CEBRA. Слева направо – совместное встраивание нейронной активности S1 и поз субъекта, совместное встраивание нейронной активности S1 и поз объекта, совместное встраивание нейронной активности S1 и расстояний тела между двумя животными, совместное встраивание мотивов нейронной активности и поведения субъекта S1, совместное встраивание мотивов нейронной активности S1 и поведения объектов, совместное встраивание нейронной активности S1 и мотивов социального поведения, а также нейронное встраивание S1. (B) Анализ Прокруста выравнивает вложения, указанные выше. Серые круги представляют собой пару мышей 1, служащую эталонной закладной. Зеленые знаки плюс обозначают пару мышей 2, а оранжевые крестики представляют пару мышей 3, выровненные по паре мышей 1. (C) Среднеквадратичная ошибка (RMSE) до (слева) и после (справа) выравнивания Прокруста (Paired t-критерий, n=3, среднее значение ± SEM). (D) СКО реконструкции позы из вложений CEBRA (односторонняя ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Тьюки, n=3, среднее значение ± SEM). (E) Точность реконструкции мотива по встраиваниям CEBRA (односторонняя ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Тьюки, n=3, среднее значение ± SEM). (F) Косинусное сходство между совместными встраиваниями и нейронными встраиваниями S1 (односторонний ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Даннетта, n=45, среднее значение ± SEM). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Нет.	Наблюдаемая проблема	Вероятная причина	Возможные решения
1	Нет временных меток поведения	(1) Неисправные кабели SMA или BNC	(1) Замените кабели SMA и BNC
		(2) Отсутствует драйвер USB-to-TTL	(2) Установите USB-драйвер Prolific PL2303
		(3) Неправильный выбор COM-порта	(3) Проверьте номер COM-порта в диспетчере устройств и обновите его как в программном обеспечении mTPM, так и в сценарии поведенческой камеры.
2	Отсутствие видимой флуоресценции во время монтажа mTPM	(1) Отсутствие вирусной экспрессии	(1) Используйте другую мышь
		(2) Неправильное поле зрения	(2) Отрегулируйте поле зрения
		(3) Недостаточная мощность лазера	(3) Постепенное увеличение мощности лазера
		(4) Высушенный карбомерный гель	(4) Повторно нанесите свежий гель Carbomer
3	Изображение mTPM показывает полностью белый экран	(1) Утечка света	(1) Оберните алюминиевую фольгу для надлежащего экранирования
		(2) Недостаточная мощность лазера	(2) Постепенно увеличивайте мощность лазера
		(3) Отсоединение волокна от головки mTPM	(3) Снова вставьте волокно в mTPM и затяните крепежный винт
4	Пропущенные кадры в поведенческом видео	(1) Слабое внешнее освещение	(1) Увеличьте фоновую освещенность
		(2) Неправильный USB-порт	(2) Используйте как минимум порты USB 3.0
		(3) Недостаточная производительность компьютера	(3) Используйте компьютер с процессором Intel i7-9700K или выше, двухканальной оперативной памятью и твердотельным накопителем.
5	Отсутствие локомоции у мышей, установленных на mTPM	(1) Многократное использование одной и той же мыши	(1) Избегайте повторного использования мышей в течение 3 дней
		(2) Чрезмерное использование алюминиевой фольги	(2) Используйте минимальное количество фольги, необходимое для легкого экранирования
		(3) Недостаточное количество или объем гелиевых шаров	(3) Отрегулируйте количество и надувание баллонов для поддержки волокна mTPM, обеспечивая при этом естественную осанку и движения мышей.
6	Неточная оценка 2D-позы	(1) Недостаточное количество кадров, помеченных вручную	(1) Добавляйте пошаговые аннотации не менее чем на 200 кадров
		(2) Недообученная модель ADPT	(2) Увеличение эпох обучения в файле config.yaml ADPT
7	Аномальная 3D-реконструкция позы	(1) Неправильная калибровка фотокамеры	(1) Улучшение контраста калибровки и угла наклона
		(2) Неточный ввод 2D-позы	(2) Увеличьте количество захватываемых рамок для шахматной доски
			(3) Сначала устраните проблемы с 2D-позой (см. Проблему 6)
8	Несоответствие между нейронными и поведенческими данными	(1) Неправильная последовательность инициализации программного обеспечения	(1) Всегда начинайте запись mTPM перед камерой поведения
		(2) Пропущенные поведенческие кадры	(2) Устранение проблем с пропуском кадров (см. Проблему 4)
			(3) Убедитесь, что на диске достаточно места
9	Переполнение памяти во время обработки BeA/SBeA	(1) Чрезмерная продолжительность записи	(1) Разделите записи на более короткие сегменты (5–60 минут), затем запустите BeA/SBeA
		(2) Ограниченная оперативная память системы	(2) Увеличить временный редукционный коэффициент (например, с 5 до 10) в BeA
			(3) Увеличьте объем оперативной памяти как минимум до 64 ГБ
10	CEBRA не работает на GPU	(1) Несоответствие между CUDA и драйвером графического процессора	(1) Не следуйте инструкциям по установке CUDA 11.3
		(2) Несовместимая версия PyTorch	(2) Проверьте модель графического процессора и версию драйвера (nvidia-smi)
			(3) Установите правильные версии CUDA и PyTorch соответственно, а затем установите CEBRA через pip

Таблица 1: Список устранения неполадок. Ниже приведен список из 10 ранее возникших нетривиальных проблем и возможных решений.

Discussion

Эта нейроэтологическая среда записи и декодирования основана на коммерчески доступных устройствах, что гарантирует, что большинство проблем по устранению неполадок могут быть решены соответствующими компаниями. Тем не менее, в этом исследовании представлен список часто встречающихся проблем, чтобы облегчить справку и упростить устранение неполадок (Таблица 1). Такая доступность делает фреймворк более удобным для новичков. Кроме того, фреймворк очень гибкий, с синхронизацией между нейронными и поведенческими записями на основе стандартных сигналов TTL. В результате при необходимости можно легко интегрировать в систему другие физиологические записывающие устройства. Последующие процедуры анализа также являются достаточно общими для поддержки полностью настраиваемых нейронных и поведенческих систем записи.

Стоимость, связанная с этой структурой, которая основана на коммерциализированных устройствах, относительно высока (~500 000 долларов США), что накладывает дополнительную финансовую нагрузку на лабораторию. В то время как последние инструменты с открытым исходным кодом, такие как MINI2P¹³ и Anipose³⁷ , могут помочь снизить материальные затраты, этот опыт показывает, что общие затраты останутся такими же при учете затрат на человеческие ресурсы, задействованных в отладке. Еще одно ограничение этой структуры заключается в интерпретируемости встраиваемых CEBRA. Как метод, основанный на искусственных нейронных сетях, он по своей сути сложен для интерпретации. Несмотря на то, что этот пример обеспечивает простой подход к объяснению внедрений, дальнейшие методы необходимо разрабатывать в каждом конкретном случае для различных проектов. Одним из возможных решений для дальнейшей интерпретации встраиваемых систем CEBRA является применение динамических систем³⁸. Кроме того, естественное поведение может быть разделено на отдельные фазы, такие как взаимодействия, когда две мыши находятся либо далеко, либо рядом. Различные научные вопросы могут потребовать разработки индивидуальных рабочих процессов анализа данных.

Несмотря на то, что текущая система mTPM + 3D-камер развернута в открытом поле, ее применение не ограничивается этим конкретным поведенческим контекстом. Основные ограничения возникают из-за физической привязки системы визуализации, которая ограничивает степень мобильности животных, и поля зрения 3D-камеры, которое ограничивает отслеживаемый объем. Эти факторы могут быть учтены в будущих итерациях путем включения модулей³⁹ беспроводной визуализации или матриц⁴⁰ камер-ловушек для создания более сложных и натуралистичных поведенческих парадигм. Примечательно, что как система mTPM, так и 3D-камера способны непрерывно собирать данные в течение 24 часов^10,41, что делает весь конвейер хорошо подходящим для долгосрочных исследований поведенческих и нейронных записей.

В этом исследовании используется полностью основанный на данных подход к изучению нейронного кодирования спонтанного поведения и, следовательно, намеренно воздерживается от присвоения предопределенных семантических меток кластеризованным поведенческим мотивам. Это решение основано на стремлении сохранить обобщаемость структуры нейронно-поведенческого отображения, позволяющей ей действовать независимо от поведенческих категорий, навязанных экспериментатором. Читатели, интересующиеся биологической интерпретируемостью и контролируемой классификацией поведенческих мотивов, могут обратиться к предыдущим работам ^1,10, а также к недавнему исследованию⁴², в котором систематически сравнивалась кластеризация неконтролируемых мотивов с ручно помеченным поведением с использованием той же базовой структуры Атласа поведения. Эти исследования также обеспечивают обширную визуализацию, включая 3D-последовательности поз, траектории и встраивания на уровне мотивов, доступные через общедоступные репозитории. Вместе эти ресурсы предлагают взаимодополняющее понимание семантической структуры поведения, поддерживая при этом принятый здесь гибкий, обобщаемый подход к нейронному декодированию.

Этот конвейер обработки данных был разработан с учетом модульности и гибкости, что позволяет адаптировать его к различным экспериментальным условиям и предпочтениям пользователей. Каждый основной компонент конвейера, начиная от 3D-оценки позы, кластеризации поведенческих мотивов без учителя, предварительной обработки нейронных сигналов и заканчивая совместным нейроэтологическим встраиванием, реализован в виде независимого модуля с четко определенными входными и выходными интерфейсами. Такая архитектура позволяет пользователям заменять альтернативные инструменты или алгоритмы на каждом этапе (например, различные структуры оценки положения ^6,22, алгоритмы кластеризации поведения^43,44 или нейронные декодеры^45,46) без нарушения общего рабочего процесса. Несмотря на то, что эти компоненты спроектированы так, чтобы быть совместимыми, в данном исследовании не были исчерпывающе проверены все возможные комбинации альтернативных методов, и пользователям может потребоваться выполнить дополнительную настройку для обеспечения совместимости в их конкретных приложениях. Такая модульность способствует как воспроизводимости, так и расширяемости, а также позволяет адаптировать фреймворк к видам, методам записи или поведенческим парадигмам, выходящим за рамки продемонстрированных здесь. Чтобы поддержать более широкое использование в сообществе, в этом исследовании представлен схематический обзор и сводная таблица (Рисунок 1, Таблица материалов).

Настройки параметров, используемые для SBeA и CEBRA в этом конвейере, основаны на комбинации значений по умолчанию и эмпирической настройки, специфичной для этого экспериментального контекста, свободно перемещающего мышей при естественном социальном взаимодействии. Эти параметры были проверены для воспроизведения всех результатов, представленных в данном исследовании, без необходимости дальнейшей корректировки. Несмотря на то, что пользователям может потребоваться тонкая настройка определенных параметров для адаптации к различным настройкам записи или поведенческим задачам, такие изменения не являются необходимыми для репликации этого конвейера. Для пользователей, работающих в других контекстах, рекомендуется обратиться к оригинальной документации и литературе по SBeA и CEBRA, где представлены диапазоны параметров и рекомендации по конкретным задачам. Эта реализация служит надежной эталонной конфигурацией, которую можно напрямую применять или адаптировать по мере необходимости.

Основное усовершенствование этой системы заключается в ее применении к свободно передвигающимся животным. Предыдущие исследования, проведенные с животными с фиксированной головой, могут быть адаптированы к свободно движущимся условиям в этих рамках. Например, такие задачи, как «Годен/Не годен» Задача⁴⁷ и Двухальтернативный принудительный выбор⁴⁸ , могут быть модифицированы и интегрированы в эту структуру на основе парадигм естественного поведения. Такой подход устраняет артефакты, вызванные ограничением головы, что позволяет изучать взаимосвязь между задачей и естественными поведенческими состояниями. Эта структура предоставляет животным большую автономию в принятии решений. Он также поддерживает исследования спинного мозга в натуралистическом контексте, сочетая метод регистрации спинного мозга mTPM⁴⁹. Кроме того, это облегчает изучение поведения свободной группы — феномена, который невозможен в установках с фиксированной головой. Рабочий процесс анализа данных позволяет интерпретировать активность нейронной популяции по нескольким переменным, используя встраивания для раскрытия сложности функции мозга, стоящей за нейронными популяциями.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Система 3D-записи поведения	БайONE Сайентифик	BA-3D-мышь	Встроенный модуль синхронизации
Воздушный шар	Алиэкспресс	Веб-сайт: https://tinyurl.com/3uex669s	Любой воздушный шар, который достаточно легкий, чтобы летать, когда наполнен гелием. Воздушные шары представляют собой шары из сферической фольги, диаметром около 45 см, оснащенные самогерметизирующимися клапанами. URL предоставляет пример воздушных шаров.
Карбомерный гель для глаз	Видисич	Смазывающий гель для глаз на основе карбомера 980	10г
Хлопковый шпагат	Алиэкспресс	Веб-сайт: https://tinyurl.com/ywu7u754	Толстые и легкие, диаметром 1-2 мм. В URL-адресе приведен пример хлопчатобумажного шпагата.
Дрель для черепа	Задний привод	78001	Сверло 0,8, 1,4 и 2,1 мм
Настраиваемый модуль камеры	Информация	RealSense D435	/
Высокоэффективный акриловый конструкционный клей	ХУИТЯНЬ	1320	490мл
Мышь для визуализации	TRANSCEND VIVOSCOPE	URL-адрес: https://en.tv-scope.com/	Самец мыши с фоном C57BL/6J (возрастом 10 недель) был помещен в 1 мышь на клетку под 12&тонким; h цикл свет-темнота в 22– 25  ° C с 40%– 70% влажности, и ему было разрешено иметь доступ к воде и пище в неограниченном количестве. Вирусы AAV9-CaMKII-GCaMP6s были введены в его первичную соматосенсорную кору (AP, − 0,60 мм; ML, − 2,40 мм; DV, 2,00 мм). В нашем исследовании мыши были подготовлены с помощью TRANSCEND VIVOSCOPE в рамках их профессиональной услуги по подготовке животных. Эта услуга включает в себя инъекцию вирусов, имплантацию черепных окон и установку опорной пластины, специально разработанной для их миниатюрной двухфотонной микроскопической системы.
Мышь для взаимодействия	БухтаONE LAC	URL-адрес: https://lac.bayonesci.com/	Самцы мышей с фоном C57BL/6J (в возрасте 10 недель) были размещены по 5 мышей в клетке под 12  h цикл свет-темнота в 22– 25  ° C с 40– 70% влажности и им было разрешено иметь доступ к воде и пище в неограниченном количестве. Все процедуры содержания и эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Шэньчжэньском институте передовых технологий Китайской академии наук.
Нейронная система записи mTPM	TRANSCEND VIVOSCOPE	СВЕРХНОВАЯ-600	SUPERNOVA-600 — это полностью интегрированная миниатюрная двухфотонная система визуализации свободно движущихся грызунов, включающая в себя все основные оптические и записывающие компоненты, за исключением устройств внешней стимуляции. Он должен содержать встроенный модуль синхронизации.