В данной работе мы представляем протокол для оценки кардиопротекторных эффектов передачи сигналов NRG1/ErbB4 на модели ишемии-реперфузионного повреждения у крыс путем оценки окислительного стресса и путей передачи сигналов апоптоза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
* These authors contributed equally
В данной работе мы представляем протокол для оценки кардиопротекторных эффектов передачи сигналов NRG1/ErbB4 на модели ишемии-реперфузионного повреждения у крыс путем оценки окислительного стресса и путей передачи сигналов апоптоза.
Ишемия-реперфузионное повреждение миокарда (MIRI) остается существенным препятствием для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Патофизиология MIRI сложна и включает в себя окислительный стресс, перегрузку кальцием, воспаление и апоптоз. Сигнальный путь NRG1/ErbB4 участвует в модуляции реакций на окислительный стресс в сердце, потенциально уменьшая повреждение клеток, вызванное свободными радикалами. Это исследование было направлено на выяснение молекулярных механизмов, с помощью которых путь NRG1/ErbB4 обеспечивает защиту в модели ишемии-реперфузионного повреждения миокарда (MIRI) у крыс. Была создана модель MIRI крыс с участием 30 взрослых самцов крыс Спрэга-Доули, случайным образом распределенных по пяти группам: контрольная, фиктивная операция, MIRI, рекомбинантная NRG1 и AG1478. Концентрации NRG1 в тканях сердца измеряли с помощью иммуноферментного анализа, в то время как уровни p-ErbB4 и общего белка ErbB4 оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Апоптоз кардиомиоцитов и уровни активных форм кислорода (АФК) оценивали с помощью проточной цитометрии. В группе MIRI уровни NRG1 были достоверно снижены по сравнению с контрольной и фиктивной операционными группами (p < 0,05). Лечение рекомбинантным NRG1 привело к заметному повышению уровня NRG1 в сердечной ткани, а также к увеличению соотношения экспрессии p-ErbB4/ErbB4 (p < 0,05). В группе AG1478 наблюдались более низкие уровни NRG1 и сниженное соотношение p-ErbB4/ErbB4 по сравнению с рекомбинантной группой NRG1 (p < 0,05). По показателям апоптоза и уровня АФК группа МИРИ показала достоверно более высокие показатели, чем контрольная группа и группа фиктивной операции (p < 0,05). Лечение рекомбинантным NRG1 значительно снижало апоптоз клеток миокарда и уровни АФК (p < 0,05), в то время как AG1478 также ослаблял эти эффекты, но в меньшей степени. Сигнальный путь NRG1/ErbB4 играет ключевую защитную роль в MIRI у крыс. Добавки с экзогенным NRG1 эффективно повышают уровень NRG1 в сердце, активируют сигнальный путь ErbB4, уменьшают апоптоз клеток миокарда и снижают уровень АФК, тем самым смягчая повреждение, вызванное MIRI.
Ишемия-реперфузионное повреждение миокарда (MIRI) представляет собой критическую проблему в лечении сердечно-сосудистых заболеваний1. Хотя восстановление притока крови к ишемизированному миокарду имеет важное значение для лечения инфаркта миокарда, сама реперфузия может усугубить повреждение сердечной ткани, тем самым ограничивая терапевтический эффект. Механизмы, лежащие в основе MIRI, сложны и включают в себя различные патофизиологические процессы, среди которых окислительный стресс, перегрузка кальцием, воспалительные реакции и апоптоз 2,3,4.
Фактор роста нервов 1 (NRG1) и его рецептор Erb-B2 рецептор тирозинкиназа 4 (ERBB4) играют ключевую роль в физиологии и патологии сердца. NRG1, внеклеточный лиганд, взаимодействует с рецептором ErbB4, активируя каскад сигнальных путей, которые имеют решающее значение для развития сердца, поддержания структурной целостности и реагирования на повреждениясердца. Новые данные подчеркивают роль, которую играет сигнальный путь NRG1/ErbB4 в развитии сердечно-сосудистых заболеваний. В условиях ишемии-реперфузии миокарда экспрессия и функция NRG1 могут быть изменены6. Предыдущие исследования показали, что NRG1 способствует выживанию клеток миокарда и подавляет чрезмерный апоптоз за счет активации ErbB4. Кроме того, сигнальный путь NRG1/ErbB4 может регулировать реакцию на окислительный стресс в сердце и смягчать повреждение клеток, вызванное свободными радикалами. Таким образом, выяснение функции сигнального пути NRG1/ErbB4 в MIRI имеет жизненно важное значение для понимания биологической основы этого повреждения и разработки новых терапевтических стратегий 7,8.
В этом исследовании предполагается, что сигнальный путь NRG1/ErbB4 играет защитную роль в MIRI. Поэтому в данном исследовании была построена модель ишемии-реперфузии миокарда на крысах для систематического изучения механизма сигнального пути NRG1/ErbB4 в MIRI. Регулируя концентрацию NRG1 и наблюдая за изменениями статуса активации ErbB4, скорости апоптоза клеток миокарда и уровня окислительного стресса. В этом исследовании предпринята попытка раскрыть молекулярный механизм, с помощью которого сигнальный путь NRG1/ErbB4 оказывает защитное действие в MIRI. Новизна данного исследования заключается в выявлении значимости сигнального пути NRG1/ErbB4 при ишемиально-реперфузионном повреждении миокарда, а также в предоставлении новых перспектив для стратегий лечения заболеваний сердца на основе этого пути.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Подопытные животные
Тридцать взрослых самцов крыс породы Спрэг-Доули (SD) в возрасте 8 недель и весом 180-200 г были получены от коммерческого поставщика. Эти крысы содержались в определенных условиях, свободных от патогенов, в течение 1 недели до экспериментов. Эксперименты получили одобрение Этического комитета Первой больницы Наньпина (No NPSY202208010).
Животные модели ишемии-реперфузионного повреждения миокарда
Крысам проводили обезболивание путем внутрибрюшинного введения 3% пентобарбитала натрия в дозе 50 мг/кг. После подтверждения отсутствия рефлексов животных укладывали в положение лежа на спине, а области шеи и груди брили и дезинфицировали 75% этанолом. Для обнажения трахеи был сделан разрез по средней линии шейки матки (~2 см) с последующей оральной интубацией с использованием катетера 16 G для поддержания проходимости дыхательных путей во время операции. Впоследствии левая большая грудная мышца была тщательно рассечена, чтобы обнажить третье и четвертое межреберные пространства. Была выполнена торакотомия путем разреза между этими пространствами, и перикард был открыт для полного обнажения сердца. Чтобы вызвать ишемию, левую переднюю нисходящую коронарную артерию (ПМЖ) лигировали с использованием 8-0 Нейлоновый шовный материал. Между ПМЖ и лигатурой была вставлена полиэтиленовая трубка (ПЭ-10) для обеспечения обратимой окклюзии. Ишемия сохранялась в течение 45 мин, что подтверждалось визуально побледнением миокарда и изменениями ЭКГ. Реперфузия начиналась путем высвобождения лигатуры, что позволяло возобновить кровоток в течение 3 часов. Лигирование было удалено через 45 минут.
Экспериментальная группировка
Крысы были случайным образом распределены по пяти группам (n = 6 в каждой). (1) Контрольная группа: крысы получали стандартную помощь без какого-либо хирургического вмешательства или лечения. (2) Фиктивная операционная группа: крысам выполняли торакотомию и наложение нитей на левую переднюю нисходящую коронарную артерию (ПМЖ) без лигирования, что служило хирургическим контролем. (3) Группа MIRI: крысам проводили индукцию ишемии-реперфузионного повреждения миокарда и вводили нормальный физиологический раствор внутрижелудочно в качестве контрольного средства. (4) Группа рекомбинантного NRG1: крысы получали внутривенную инъекцию рекомбинантного человеческого NRG1 (rh-NRG1) в дозе 5 мг/кг за 30 минут до торакотомии с последующей процедурой MIRI. (5) Группа AG1478: крысам вводили внутривенно rh-NRG1 (5 мг/кг) в сочетании с AG1478 (20 мг/кг), ингибитором рецепторов ErbB, за 30 минут до торакотомии, а затем проводили процедуру MIRI.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Животных усыпляли путем внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия (150 мг/кг). Ткани сердца собирали сразу после реперфузии и гомогенизировали на льду в соответствующем объеме ледяного PBS. Затем гомогенаты центрифугировали при 1200 x g в течение 10 мин при 4 °C для отделения надосадочной жидкости. Концентрацию NRG1 в надосадочной жидкости количественно определяли с помощью коммерчески доступного набора NRG1 ELISA, точно следуя инструкциям производителя. Вкратце, образцы и стандарты добавляли в лунки планшета ИФА, инкубировали при комнатной температуре в течение рекомендованного времени с последующей промывкой и добавлением антител для обнаружения. Поглощение измеряли на заданной длине волны с помощью считывателя микропланшетов, а уровни NRG1 рассчитывали на основе стандартной кривой. Объем образца составил 100 мкл, разведение антитела – 1:100, а длина волны для измерения поглощения была установлена на уровне 450 нм.
Вестерн-блоттинг
Сердечные ткани были вырезаны у крыс под наркозом и промыты в ледяном PBS для удаления остаточной крови. Для каждого сердца взвешивали примерно 0,5 г ткани левого желудочка и помещали в 500 мкл свежеприготовленного буфера для лизиса RIPA. Затем ткань гомогенизировали на льду с помощью механического измельчителя тканей до полного лизиса с последующей инкубацией на льду в течение 30 минут для обеспечения полной экстракции белка. Лизаты центрифугировали при 12 000 × г в течение 15 мин при 4 °C для удаления мусора. Концентрации белка определяли с помощью набора для анализа BCA. Равное количество общего белка (например, 30 мкг на дорожку) загружали и отделяли с помощью SDS-PAGE. Затем белки переносили на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) с помощью системы влажного переноса при напряжении 100 В в течение 90 минут. Мембраны блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в трис-буферном физрастворе с 0,1% Tween-20 (TBST) в течение 1 ч при комнатной температуре. Впоследствии мембраны инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами против фосфорилированного ErbB4 (p-ErbB4) и общего ErbB4, каждое из которых разбавлялось в соотношении 1:1000. После промывки мембраны инкубировали с конъюгированными вторичными антителами к пероксидазе хрена (HRP) в течение 1 ч при комнатной температуре. Белковые полосы визуализировали с использованием субстрата с усиленной хемилюминесценцией (ECL) и захватывали с помощью системы визуализации геля. Интенсивность полос была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ, а для оценки уровней фосфорилирования было рассчитано отношение p-ErbB4 к общему ErbB4.
Проточная цитометрия
Апоптоз миоцитов сердца оценивали с помощью проточной цитометрии. Ткани сердца мелко измельчали и ферментативно расщепляли с использованием смеси коллагеназы типа II (1 мг/мл) и протеазы (например, трипсина, 0,25%) при 37 °C с легким перемешиванием в течение 20-30 минут. Ферментативное переваривание прекращали добавлением равного объема фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клеточную суспензию фильтровали через нейлоновую сетку толщиной 70 мкм и центрифугировали при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C для сбора клеток. Клеточную таблетку ресуспендировали в связующем буфере, затем инкубировали с аннексином V-FITC и йодидом пропидия (PI) в соответствии с протоколом производителя. После инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте образцы сразу же анализировали с помощью проточной цитометрии. Ранние апоптотические клетки были идентифицированы как аннексин V-положительный и PI-отрицательный, в то время как поздние апоптотические или некротические клетки были положительными по обоим маркерам. Частота апоптоза была количественно определена и сравнена между экспериментальными группами. Стратегия литниковой компоновки предполагает настройку поперечных/прямоугольных ворот. При проведении детектирования на машине поперечный гейт был задан в виде пунктирной линии, а все параметры были применены для обеспечения согласованности скрининга данных. Скорость потока регулировалась в соответствии с концентрацией ячеек (поддерживалась на уровне 1000 клеток/с), а низкая скорость загрузки образца позволяет избежать засорения сопла.
Определение уровня активных форм кислорода (АФК)
Кардиомиоциты выделяли из тканей сердца с последующим центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин и двукратным промыванием фосфатно-солевым буфером (PBS). Затем клетки инкубировали с красителем 10 μM 2',7'-дихлорфлуоресцеина диацетата (DCFDA) при 37 °C в течение 30 минут в темноте, следуя инструкциям производителя. После окрашивания клетки дважды промывали PBS для удаления излишков несвязанного красителя. Внутриклеточные уровни АФК были немедленно измерены с помощью проточной цитометрии, определяющей интенсивность флуоресценции, излучаемой при окислении DCFDA. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) каждого образца была количественно определена с помощью программного обеспечения FlowJo для сравнения уровней АФК в экспериментальных группах. Стратегия стробирования описана выше (раздел проточной цитометрии).
Статистический анализ
Анализ данных проводился с помощью программного обеспечения SPSS, представленного в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Односторонний дисперсионный анализ с помощью апостериорного теста Тьюки был проведен для сравнения нескольких групп, а t-критерий Стьюдента был использован для парных сравнений. p-значение < 0,05 считалось статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
NRG1 оказывает защитное действие против MIRI-индуцированного апоптоза кардиомиоцитов
Проточный цитометрический анализ показал заметное повышение частоты апоптоза в группе MIRI по сравнению с контрольной и фиктивной группами (P < 0,05). Обе группы рекомбинантных NRG1 и AG1478 продемонстрировали значительно сниженную частоту апоптоза по сравнению с группой MIRI (P < 0,05). Напротив, в группе рекомбинантного NRG1 наблюдалась сниженная частота апоптоза по сравнению с группой AG1478 (P < 0,05) (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
MIRI продолжает представлять собой значительное препятствие в лечении сердечно-сосудистых заболеваний, учитывая, что восстановление перфузии ишемизированной сердечной ткани может парадоксальным образом усилить повреждение миокарда. Возникновение MIRI является многофакторным, включающим окислительный стресс, перегрузку кальцием, воспалительные реакции и митохондриальную дисфункцию 9,10.
NRG1, внеклеточн...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Эта работа была поддержана Фондом естественных наук провинции Фуцзянь (номер гранта 2024J011604,2023J011877) и Молодежным исследовательским проектом Комиссии по очагам провинции Фуцзянь (номер гранта 2019-9-25).
ВКЛАД АВТОРА:
Маочжи Хуан руководил концепцией и дизайном исследовательского проекта, планировал и детализировал протокол эксперимента, участвовал в ключевых экспериментах и написал первый черновик рукописи. Цзяньпин Чжэн внес равный вклад в общее исследование, включая дизайн, сбор данных и составление рукописи. Сяньлу Чэн внес свой вклад в разработку исследования, собрал образцы и проанализировал данные. Чаоцюнь Ю помогал в написании и структурировании рукописи. Цзыго Чэнь проверил данные и помог улучшить раздел методов и материалов. Лин Цзян обеспечивал академический контроль и руководство на протяжении всего исследовательского процесса. Шанхуа Сюй руководил общим направлением проекта, координировал ресурсы, а также проверял и редактировал окончательную рукопись.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| АГ1478 | Технология БиоЛаб | WD102925 | Интервенционный препарат AG1478 |
| Annexin V-FITC/PI Набор для обнаружения апоптоза | Meilune | МА0220 | Апоптоз проточной цитометрии |
| Набор для анализа белка BCA | Мейлунбио | МА0082-2 | Количественное определение белка WB |
| Система хемилюминесцентной визуализации | Bio-Rad (США) | ChemiDoc Touch | Вестерн-блоттинг |
| Циамемазина гидрохлорид | Здоровье животных Хуаму | 20220601 | Анестетик для моделирования животных |
| Комплект для обнаружения ECL | Мейлунбио | МА0186-1 | WB хемилюминесценция |
| ЭРбВ4 | Протеинтек | 19943-1-АП | Первичное антитело WB |
| Проточный цитометр | БД | FACSCalibur | Обнаружение апоптоза проточной цитометрии |
| ГАПДХ | Протеинтек | 60004-1-Иг | Антитела для контроля нагрузки ВБ |
| HRP-конъюгированный козий антимышиный IgG (H+L) | Протеинтек | SA00001-1 | Иммуногистохимия |
| HRP-конъюгированный козий антикроличий IgG (H+L) | Протеинтек | SA00001-2 | Иммуногистохимия |
| Считыватель микропланшетов | Термо | К3 | Обнаружение ИФА |
| Набор для приготовления геля PAGE 15% | Мейлунбио | МА0384 | Электрофорез ВБ |
| -ЭРбВ4 | Сходство | АФ3445 | Первичное антитело WB |
| Предварительно окрашенный белковый маркер | Мейлунбио | МА0342 | Электрофорез ВБ |
| Крысиный Нейрегулин-1 (НРГ-1) Набор для ИФА | Мэймиан | ММ-61434Р2 | Обнаружение ИФА |
| Набор для анализа активных форм кислорода (АФК) | Meilune | МА0219 | Анализ WB |
| рНРГ1 | Технология БиоЛаб | WD091127 | Интервенционный препарат NRG1 |
| Буфер для лизиса RIPA | Мейлунбио | MA0151 | Экстракция белка при вестерн-блоттинге |
| Буфер загрузки SDS-PAGE (5x) | Бейотим | П0015Л | Электрофорез ВБ |
| Додецилсульфат натрия | Сигма | 151-21-3 | Электрофорез ВБ |
| Су Тай 50 | Вирбак (Франция) | 8Х22А | Анестетик для моделирования животных |
| Система вертикального электрофореза белков | Bio-Rad (США) | ПАУЭР ПАК 200 | Вестерн-блоттинг электрофорез |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно