Методическая статья

Изучение белково-гликановых взаимодействий: достижения в области ядерного магнитного резонанса

853 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68674

⸱

26 августа 2025 г.

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол, основанный на ЯМР, исследует слабые белково-гликановые взаимодействия с использованием циановирина-N и D-маннозы. Комбинируя методы, детектируемые лигандами и белками, он картирует сайты связывания, обнаруживает аллостерические эффекты и идентифицирует комплексы встреч. Этот подход предусматривает подготовку образцов и анализ данных, предлагая структурную и динамическую информацию, ценную для диагностики и механизмов распознавания гликанов.

Аннотация

Белок-гликановые взаимодействия занимают центральное место во многих биологических процессах и все чаще признаются в качестве перспективных мишеней для диагностических стратегий при инфекционных, воспалительных и опухолевых заболеваниях. Тем не менее, характеристика этих взаимодействий, особенно когда они слабые и преходящие, остается технически сложной. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) обладает уникальными преимуществами для изучения таких взаимодействий в условиях, близких к физиологическим, обеспечивая понимание как структурных, так и динамических аспектов с атомным разрешением. В данном исследовании мы представляем интегрированный протокол ЯМР, предназначенный для изучения низкоаффинных белково-гликановых взаимодействий с использованием маннозоспецифичного лектина циановирина-N и моносахарида D-маннозы в качестве модельной системы. Протокол сочетает в себе подходы ЯМР на основе лигандов и белков для всестороннего картирования сайтов связывания и обнаружения тонких событий связывания, включая потенциальные аллостерические эффекты или комплексы контактов. Важнейшие этапы протокола включают тщательную подготовку образцов, точный контроль концентраций и стандартизацию спектра для обеспечения воспроизводимости и надежности данных. ЯМР в растворе позволяет обнаруживать переходные взаимодействия, которые часто недоступны с помощью других методов. Несмотря на то, что слабые взаимодействия необходимы для жизни, в литературе существует склонность в сторону высокоаффинных комплексов, хотя низкоаффинные комплексы важны для многих важных биологических функций, таких как передача сигналов и межклеточная коммуникация. Этот метод обеспечивает мощную платформу для исследования распознавания белка-гликана и может служить ценным инструментом для идентификации новых диагностических маркеров на основе гликан-специфических взаимодействий.

Введение

Белок-гликановые взаимодействия имеют основополагающее значение для широкого спектра биологических процессов, включая межклеточное распознавание, модуляцию иммунного ответа и взаимодействие патогена с хозяином 1,2. Эти молекулярные взаимодействия являются высокоспецифичными и динамичными и играют решающую роль как в физиологических, так и в патологических механизмах 3,4,5. Классическим примером такого взаимодействия является лектины, белки, которые специфически распознают и связываются с гликанами. Циановирин-Н (CVN), например, широко изучался в качестве экспериментальной модели из-за его способности взаимодействовать в условиях высокого сродства с олигосахаридами маннозы 5,6,7.

В дополнение к лектинам, многие гликозилированные белки, такие как интегрины, также играют важную роль в распознавании и передаче клеточной сигнализации. Интегрины представляют собой трансмембранные рецепторы, которые часто подвергаются гликозилированию своих субъединиц, что влияет на их стабильность и сродство к лигандам, включая гликаны 5,8,9,10. Тем не менее, структурная характеристика этих взаимодействий остается сложной задачей из-за внутренней гетерогенности и гибкости гликанов, что усложняет традиционные подходы структурной биологии. В этом контексте разработка передовых методологий, способных фиксировать эти взаимодействия в растворе, имеет большое значение для этой области, особенно для гликобиологии 11,12.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) стала мощным инструментом для исследования белково-лигандных взаимодействий на атомном уровне. В отличие от других методов, таких как рентгеновская кристаллография и криоэлектронная микроскопия, ЯМР позволяет изучать биомолекулярные взаимодействия в условиях, близких к физиологическим, что дает представление как о структуре, так и о динамике. Такая гибкость позволяет исследователям модулировать такие параметры окружающей среды, как pH (обычно в диапазоне 4,0-8,0), ионная сила (например, 0-500 мМ NaCl) и температура (обычно 273-330 K), тем самым адаптируя условия к специфике белково-гликановых комплексов. Кроме того, ЯМР особенно полезен для анализа переходных и слабых взаимодействий, которые часто характерны для событий узнавания белка-гликана13,14.

Для исследования белково-гликановых взаимодействий было использовано несколько методов ЯМР, использующих как белковые, так и лигандные подходы. С точки зрения белков, титрование с гетеронуклеарной одиночной квантовой когерентностью (HSQC) широко используется для картирования сайтов связывания путем мониторинга возмущений химического сдвига при присоединении лиганда. Эксперименты с релаксационной дисперсией позволяют обнаруживать конформационные и химические обменные процессы, происходящие в микро- и миллисекундном масштабе времени, что дает представление о динамических аспектах распознавания гликанов15,16. Эти методы на основе белка обычно требуют концентраций образца в диапазоне от 50 мкМ до 2 мМ, в зависимости от стабильности белка и эффективности мечения17,18.

Методы ЯМР на основе лигандов дают дополнительную информацию, фокусируясь на изменениях гликана во время связывания. Разница передачи насыщения (STD-NMR) особенно полезна для идентификации эпитопов гликанов, участвующих в распознавании, поскольку она избирательно насыщает сигналы ЯМР областей лиганда, находящихся в тесном контакте с белком19,20. Водные лиганды, наблюдаемые с помощью градиентной спектроскопии (WaterLOGSY)21,22 и спектроскопии с эффектом перенесенного ядерного Оверхаузера (Tr-NOESY), предоставляют дополнительные средства для оценки связывания лигандов и конформационных изменений во время взаимодействий23. Кроме того, эксперименты по релаксации Карра-Перселла-Мейбума-Гилла (CPMG) помогают идентифицировать слабые и переходные взаимодействия, которые трудно обнаружить с помощью традиционных методов24. Эксперименты на основе лигандов часто проводятся при концентрациях белка 10-50 мкМ и могут потребовать оптимизации времени смешивания и параметров насыщения25. Примечательно, что эти методы могут быть ограничены низкой растворимостью гликанов или плохим соотношением сигнал/шум при работе с малыми лигандами.

Вместе эти методы ЯМР обеспечивают всестороннюю основу для выяснения структурных и динамических свойств белково-гликановых взаимодействий. С продолжающимся прогрессом в стратегиях чувствительности и изотопного мечения, этот метод становится все более важным в гликобиологии, предлагая новые перспективы механизмов молекулярного распознавания с потенциальными применениями в разработке лекарств и открытии биомаркеров. Тем не менее, успех этих подходов зависит от таких факторов, как однородность образца, сложность гликана и наличие гибких или неупорядоченных областей, которые могут расширять сигналы ЯМР или затруднять интерпретацию. ЯМР является мощным методом изучения переходных процессов, что является серьезной проблемой в структурной биологии.

CVN распознает α(1,2)-связанные маннозильные остатки, присутствующие в олигосахаридах с высоким содержанием маннозы с наномолярным сродством 27,28,29. Однако он плохо распознает моносахарид D-маннозу. В настоящей работе мы изучили взаимодействие CVN с D-маннозой, чтобы проиллюстрировать, насколько ЯМР эффективен в понимании переходных взаимодействий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы, связанные с бактериальными культурами и буферными препаратами, в соответствии с институциональными протоколами биобезопасности. Используйте средства индивидуальной защиты (СИЗ) и, при работе с открытыми культурами или химическими веществами, работайте в шкафу биобезопасности или вытяжном шкафу для химикатов, если это необходимо.

1. Экспрессия циановирина-N

  1. Трансформируйте клетки E . coli BL21 с плазмидой, кодирующей ген CVN, вставленным в вектор pET26a.
  2. Культивируйте клетки в 1 л Super Broth (32 г триптона, 20 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на л) с добавлением канамицина (50 мкг/мл), 0,5% (w/v) глюкозы и 1,6 мМ MgSO4. Инкубировать при непрерывном перемешивании при ~250 об/мин при 37 °C.
  3. Для получения 15N-меченых CVN выращивают клетки в модифицированной среде с минимальным содержанием M9, используя 15NH4Cl в качестве единственного источника азота.
    1. Приготовьте 1 л минимальной среды M9, смешав 200 мл стерильного раствора 5x солей M9, содержащего 64 г/л Na2HPO4, 15 г/л KH2PO4, 2,5 г/л NaCl, 5 г/л NH4Cl.
    2. Добавьте 2 мл 1 М MgSO4 (0,22 мкм с фильтрацией), 0,1 мл 1 М CaCl2 (0,22 мкм с фильтрацией) и 4 г глюкозы (конечная концентрация 0,4%, растворенная в стерильной дистиллированной воде и 0,22 мкм стерилизованная с помощью фильтра).
    3. Доведите итоговый объем до 1 л стерильной дистиллированной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавки, такие как аминокислоты или витамины, могут быть добавлены по мере необходимости.
  4. Следите за культурой до тех пор, пока она не достигнет оптической плотности (OD600) примерно 1,2. Затем добавьте изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1,0 мМ, чтобы индуцировать экспрессию белка.
  5. Инкубировать в течение 20 ч после индукции при 37 °C.
  6. Соберите клетки центрифугированием при 7 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
  7. Выделяют периплазматическую фракцию следующим образом:
    1. Ресуспендируют клеточные гранулы в 0,4 объема 30 мМ трис-HCl буфера (pH 8,0), содержащего 20% сахарозы и 1 мМ ЭДТА и инкубируют при комнатной температуре с встряхиванием в течение 10 мин.
    2. Центрифуга при 10 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
    3. Полученные гранулы суспендировать в 0,4 объемах ледяной дистиллированной воды и инкубировать на льду с встряхиванием в течение 10 мин.
    4. Снова центрифугируйте при 10 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
    5. Соберите надосадочную жидкость, которая соответствует периплазматической фракции, для экстракции белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы должны содержать коктейль ингибиторов протеазы для предотвращения деградации белка.

2. ЯМР-эксперименты

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты были проведены при давлении 14,1 Т с использованием тройного резонансного зонда обратного детектирования 1H/15N/13C (см. Таблицу материалов) при 298 К.

  1. Эксперименты на основе лигандов
    1. Подготовка образцов
      1. Подготовьте два образца: один с CVN и один без CVN (контроль только лигандом). Каждый образец содержит 600 мкл 80 мкМ CVN в буфере фосфата натрия (pH 7,4), содержащем 50 мМ NaCl.
      2. Добавьте D-маннозу до конечной концентрации 4 мМ.
      3. Добавьте 5% (v/v) D2O к каждому образцу.
      4. Перенесите образец в ЯМР-трубку диаметром 5 мм.
      5. Используйте 50-кратный молярный избыток лиганда относительно белка.
        Примечание: Обычно рекомендуется избыток лиганда в диапазоне от 10 до 1000 раз, при этом более низкие избытки предпочтительны для небольших белков.
    2. Получение спектральных данных для присвоения D-маннозы
      1. Получение спектров 2D TOCSY и 2D 1 H-13C HMBC с использованием стандартных последовательностей импульсов:
        2D TOCSY: фазочувствительная суммарная корреляционная спектроскопия (TOCSY) с моделированием возбуждения для подавления воды (DIPSI2ESGPPH).
        2D HMBC: 1 H-13C Гетероядерная корреляция с множественными связями с градиентным выбором и несвязанной регистрацией (HMBCGPNDQF).
        Примечание: Эти эксперименты были проведены с целью отнесения D-маннозы, но не были показаны, так как назначение химического сдвига не входит в рамки данного исследования.
    3. Картирование связывания лиганда с помощью возмущения химического сдвига (CSP) лиганда
      1. Для подготовки образца и получения спектров ¹H-¹³C HSQC приготовьте 4 мМ раствор D-маннозы в буфере фосфата натрия (pH 7,4), с 50 мМ NaCl и 5%D2O. Разделите раствор на два образца: один с 80 мкМ CVN и один без CVN (эталонный лиганд).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эти спектры будут использоваться для определения CSP D-маннозы при взаимодействии с CVN.
      2. Для настройки параметров сбора данных 1 H-13C HSQC используйте стандартную последовательность импульсов HSQCETGPSI (выбор градиента и повышение чувствительности 1 H-13C HSQC). Задайте следующие параметры для инвайринга:
        Временная область (TD): 1024 × 128 комплексных точек (размеры ¹H × ¹³C)
        Спектральная ширина (SW): 10,0171 ppm (6009,615 Гц) для ¹H, 80 ppm (12069,106 Гц) для ¹³C
        Несущие частоты: 4,7 ppm для ¹H, 75 ppm для ¹³C
        - Количество сканирований: 448.
      3. Рассчитайте CSP с помощью следующей формулы:
        figure-protocol-1
        где figure-protocol-2 и figure-protocol-3 представляют различия химического сдвига между D-маннозой в присутствии CVN (рисунок 1A, помечен красным цветом) и свободной D-маннозой (рисунок 1B).
    4. Картирование связывания лиганда через разность переноса насыщения (STD)
      1. Создайте новый набор данных и настройте параметры для экспериментов STD-NMR. Могут быть применены две экспериментальные стратегии: (i) экранирование различных частот насыщения для оптимизации отношения сигнал/шум; (ii) фиксация частоты насыщения и изменение времени насыщения для оценки нарастания.
      2. Постановка экспериментов 1D ¹H NMR с использованием последовательности импульсов zgpr. Настройте спектрометр на ¹H, выполните шимминг и измерьте жесткий импульс 90° (например, ~10 мкс при затухании -10,6 дБ, что эквивалентно ~11,482 Вт).
      3. Центрируйте несущую частоту ¹H на уровне примерно 4,7 ppm, что соответствует сигналу воды.
      4. Выберите последовательность импульсов STDDIFFESGP.3 и настройте параметры сбора данных следующим образом:
        Установите спектральную ширину в соответствии с требованиями образца.
        Установите задержку между развертками (d1) на 4 с.
        Определите время насыщения (d20) в зависимости от желаемого эксперимента.
        Загрузите FQ2LIST, содержащий частоту внерезонансного насыщения (-40 ppm) и резонансные частоты, чтобы насытить только сигнал белка.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Резонансные частоты должны соответствовать белковым протонам и должны находиться на расстоянии не менее 1000 Гц от любого лигандного сигнала, чтобы избежать прямого насыщения.
      5. Для определения оптимальных условий протестируйте следующие резонансные частоты насыщения: -0,59 ppm, 0,73 ppm и 8,1 ppm (см. рисунок 2A).
        ПРИМЕЧАНИЕ: 0,73 ppm было выбрано в качестве резонансной частоты насыщения, так как она обеспечивает наилучшее соотношение сигнал/шум. Используя эту частоту, коэффициент усиления ЗППП (АППП) был количественно определен как функция времени насыщения. С этой целью спектры STD были получены в разное время насыщения (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 и 4 с) для построения кривой накопления STD (рис. 2B). Затем были построены соответствующие значенияA STD в зависимости от времени насыщения (рис. 2C), что позволяет оценить эффективность переноса насыщения, которая пропорциональна времени и близости водорода лиганда к белку. ФакторЗППП определяется как:
        figure-protocol-4
        ISTD — разница в интенсивности сигнала между включенным и выключенным резонансными спектрами, I0 — интенсивность сигнала в спектре внерезонансного спектра, [L]T — общая концентрация лиганда, [P] — концентрация белка. Эта нормализация учитывает эффекты концентрации и позволяет сравнивать различные экспериментальные условия. STD основан на спиновой диффузии и медленном молекулярном переворачивании для эффективной передачи насыщения от белка к связанному лиганду. Более крупные белки (медленное переворачивание) обеспечивают более эффективное насыщение и распространение намагниченности внутри белка 19,30,31,32.
      6. Установите количество сканирований (нс) равным 64 и усредните эксперимент l4 (цикл 4) раз.
      7. Рассчитайте общее количество сканирований следующим образом: Общее количество сканирований = нс × l4. Используйте 32 768 комплексных точек в прямом измерении (TD) со спектральной шириной (SW) 10,0171 ppm (6 009,615 Гц).
      8. Установите задержку между сканированиями (d1) равным 4 с и время сбора данных (AQ) равным 2,7262976 с. Общая задержка релаксации равна d1 + AQ.
      9. Настройте импульс насыщения следующим образом: длительность 50 мс; форма Гаусса (стр. 42); управляется с помощью фасонной программы 9 (SP9).
      10. Используйте вариант последовательности импульсов ЗППП, который включает фильтр T1ρ для подавления остаточных белковых сигналов. Установите время блокировки спина (d29) в зависимости от молекулярной массы белка. Для более крупных белков используйте меньшее время спин-синхронизации (~20 мс), а для более мелких белков — большее (> 40 мс).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Все спектры STD были получены на частоте 599,93 МГц (BF1). Коррекция d29 имеет решающее значение для минимизации белкового фона при сохранении целостности сигнала лиганда. При необходимости оптимизируйте этот параметр опытным путем.
    5. Картирование связывания лиганда с помощью 1H-R2
      1. Выберите программу CPMG_ESGP2D pulse из стандартной библиотеки Bruker. Эта последовательность основана на эксперименте Карра-Перселла-Мейбума-Гилла (CPMG), включающем скульптурирование возбуждения для подавления воды33.
      2. Задайте эксперимент в качестве 2D-сбора.
        Примечание: Это псевдо-2D эксперимент, в котором для получения информации о химическом сдвиге используется только прямое измерение.
      3. Настройте параметры сбора данных следующим образом:
        Временная область (TD): 32 768 комплексных точек в прямом измерении ¹H.
        (TD1): 2 очка.
        Спектральная ширина (SW): 7,9932 ppm (4,795,396 Гц).
        Задержка межразкана (d1): 4 с.
        Несущая частота (o1): 4,7 ppm (с центром на сигнале воды).
        Количество сканирований (нс): 8.
        Количество фиктивных сканирований (ds): 4.
        Задержка CPMG (d20): ≤1 мс (т.е. короче 1⁄3 J_HH).
        Количество средних значений (TDav): 200.
      4. Проведите эксперимент в течение 200 циклов по 8 сканирований в каждом, в результате чего общее количество сканирований составит 1 600. Настройте список счетчиков переменных (vclist) в соответствии с желаемым общим временем цикла CPMG (TCPMG). Здесь были выбраны 2 цикла для TCPMG=8 мс и 200 циклов для TCPMG=800 мс.
      5. Проведите два эксперимента 1H-CPMG, один для образца, содержащего белок (4 мМ D-манноза и 80 мкМ CVN), а другой для свободной D-маннозы (4 мМ D-маннозы).
      6. Построите спектры 1H для каждого TCPMGс помощью команды efp (экспоненциальное умножение с последующим преобразованием Фурье и фазовой коррекцией) или sinm (умножение синуса со сдвигом на 90°, SSB=2) с последующим fp (преобразование Фурье и фазовая коррекция). Настройте функцию окна в соответствии с наилучшей стратегией обработки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте использовались sinm и fp. 1-й последовательный — это спектры с TCPMG 8 мс (первый в vclist), а2-й последовательный — 800 мс (второй в vclist). Обработанные 1H-спектры представлены на рисунке 3.
      7. Рассчитайте коэффициент CPMG (Q) с помощью уравнения 3.
        ​figure-protocol-5
  2. Эксперименты на основе белка
    1. Подготовка образцов
      1. Приготовьте 600 мкл образца, содержащего 436 мкМ равномерно 15N-меченых CVN в буфере фосфата натрия (pH 7,4) с добавлением 50 мМ NaCl и 5% оксида дейтерия (D2O). Титруйте D-маннозу в образце до конечной концентрации 60 мМ. Для титрования используйте 5-миллиметровую ЯМР-трубку.
    2. Назначение резонанса (необязательный шаг проверки)
      1. Подтвердите присвоение свободного CVN в растворе, используя ранее сообщенные значения химического сдвига34. Получите следующие тройные резонансные спектры: HNCO, HNCA, HNCACB и CBCACONH 35,36,37.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эти эксперименты служат только для проверки назначения и не показаны, так как назначение химического сдвига не является основной целью данного протокола.
    3. Картирование связывания D-маннозы с CVN путем химического сдвига возмущения белка
      1. Получите 1 H-15N HSQC спектры 15N-меченых CVN при 298 K. Выполните титрование путем добавления D-маннозы для достижения следующих конечных концентраций: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 и 60 мМ.
      2. Настройте эксперимент 1 H-15N Fast-HSQC с использованием фазочувствительной последовательности импульсов FHSQCF3GPPH из стандартной библиотеки Bruker. Используйте следующие параметры:
        Временная область (TD): 1024 × 140 комплексных точек в измерениях 1H и 15N.
        Спектральная ширина (SW): 16,0274 ppm (9615,385 Гц) в измерении 1H и 34 ppm (2067,119 Гц) в измерении 15N.
        Несущая частота: 4,7 ppm (1H) и 119 ppm (15N).
        Количество сканирований: 128.
      3. Рассчитайте возмущение химического сдвига (Δδ) с помощью следующего уравнения:
        figure-protocol-6
        где figure-protocol-7 и figure-protocol-8 — различия между химическим сдвигом между CVN в присутствии и отсутствии D-маннозы (рис. 4A).
        Примечание: Коэффициент 10 учитывает разницу в спектральной ширине между размерами протона и азота.
      4. Рассчитайте константу диссоциации (KD) путем построения графика значений CSP для каждого остатка в зависимости от концентрации D-маннозы. Подгоните полученные данные к изотерме связывания с одним сайтом, используя следующее уравнение (5).
        figure-protocol-9Уравнение 5
        где [PT] – концентрация белка, используемого при титровании (CVN), [PT] – концентрация лиганда (D-манноза), а CSPmax – CSP при насыщенной концентрации лиганда и CSPmin в отсутствие лиганда.
    4. Картирование связывания D-маннозы с CVN через 15N-R2 положение белка.
      1. Измерьте значения 15N-R2 отдельных остатков CVN при отсутствии и присутствии 60 мМ D-маннозы. Проводите все эксперименты при 298 К.
      2. Постановка эксперимента 15N-R2 с использованием фазочувствительной последовательности импульсов на основе CPMG HSQCT2ETF3GPSI3D из стандартной библиотеки Bruker. Используйте следующие параметры:
        Временная область (TD): 1024 × 128 комплексных точек в измерениях 1H и 15N, с 8 точками в псевдоразмерности.
        Спектральная ширина (SW): 16,0274 ppm (1H; 9615,385 Гц) и 34 ppm (15N; 2067,119 Гц).
        Несущая частота: 4,7 ppm (1H) и 119 ppm (15N).
        Количество сканирований: 32. (v) Список переменных счетчиков: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 и 7, соответствующие задержкам релаксации (Trelax) 16,96, 135,68, 33,92, 101,76, 50,88, 84,96, 67,84 и 118,72 мс, соответственно.
      3. Обрабатывайте псевдо3D-спектры в виде серии HSQC-подобных спектров корреляции релаксации 1H/15N с помощью NMRPipe38, следуя учебному пособию (см. ссылку на учебное пособие в Таблице материалов ).
      4. Импортируйте обработанные спектры в подходящую платформу для анализа ЯМР (например, CCPNMR39). Выделите все спектры и примените инструмент «Следить за изменениями интенсивности». Построите график интенсивности каждого перекрестного пика как функциирелаксации T и подгоньте распад к моноэкспоненциальной функции, чтобы извлечь 15значений N-R2 для каждого остатка.
      5. Рассчитайте экспериментальную погрешность по отношению сигнал/шум HSQC-подобных спектров за 67,84 мс. Обработайте область спектра, содержащую только шум, и преобразуйте ее в текстовый файл с помощью следующей команды:
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. Определите стандартное отклонение области шума с помощью статистического программного обеспечения (например, Origin(Pro), Version 2021). Определите это значение как интенсивность шума Inoise.
      7. Рассчитаем экспериментальную ошибку для каждого остатка с помощью следующего уравнения:
        figure-protocol-10
        ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать экспериментальную ошибку, а не ошибку подгонки. Экспериментальная погрешность определяет пределы интерпретации при сравнении 15N-R2 при отсутствии и присутствии D-маннозы.

figure-protocol-11
Рисунок 1: Химический сдвиг возмущения D-маннозы в присутствии CVN. (A) 1 H-13C-HSQC спектр D-маннозы в присутствии CVN. (B) 1спектр H-13C-HSQC свободной D-маннозы. Метки в спектрах показывают каждое из назначений химического сдвига и соответствующую аномерную конфигурацию (α или β). Метки, выделенные красным цветом, предназначены для связанной конформации, а метки черного цвета — для свободной конформации. (C) Наложение спектров 1 H-13C-HSQC в присутствии (зеленый) и отсутствии (синий) CVN. (D) Химическая структура α- и β-D-маннозы, выделяющая наблюдаемую CSP, которая была рассчитана в соответствии с уравнением (1). Значения CSP отображаются под зелеными кругами. Красный круг представляет собой β-аномерный водород, который исчез в присутствии CVN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-12
Рисунок 2: Спектры разницы передачи насыщения (STD) D-маннозы в присутствии CVN. (A) STD получены при различных частотах насыщения: -0,59, 0,73 и 8,1 ppm. (В) ЗППП, полученный при разном времени насыщения: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 и 4 с. (В) Коэффициент усиления ЗППП (АППП) рассчитан в соответствии с уравнением 2 как функция времени насыщения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-13
Рисунок 3: 1H-R2 D-маннозы в присутствии и отсутствии CVN. (A) Представление ожидаемых спектров H-CPMG D-маннозы 1для связующего и несвязывающего веществ, полученных с временами релаксации R2 8 и 800 мс в отсутствие (внизу) и в присутствии (вверху) CVN. Q вычислялся по уравнению 3. При отсутствии взаимодействия (Q ≈ 1) интенсивности сигнала остаются одинаковыми в оба момента релаксации лиганда с белком или без него. При связывании (Q < 1) интенсивность сигнала уменьшается с увеличением релаксации для образца, содержащего белок. (B) Схематическое изображение химического обмена между свободным и связанным состояниями D-маннозы. В зависимости от относительных значений разности химического сдвига (Δω) и константы обменного курса (kex = kon + koff) система попадает в режимы медленного, промежуточного или быстрого обмена. (с)1H спектры ЯМР свободной D-маннозы и D-маннозы в присутствии CVN, показывающие различия в интенсивности сигнала при времени релаксации 8 мс и 800 мс. Показаны рассчитанные Q-факторы для конкретных атомов водорода (H6β, H3β, H5α, H4β), при этом более низкие значения Q указывают на более сильное взаимодействие с CVN и идентифицируют области сахара, участвующие в связывании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-14
Рисунок 4: Анализ химических возмущений сдвига (CSP) с выявлением остатков CVN, участвующих в связывании D-маннозы. (A) Гистограммы, показывающие амидные (15 N-1H) CSP основного состава CVN при титровании D-маннозой при концентрациях 10 мМ (вверху) и 60 мМ (внизу). Горизонтальными линиями обозначен средний CSP плюс одно или два стандартных отклонения (av + sd, av + 2 sd), которые использовались в качестве пороговых значений для выявления значительно возмущенных остатков. (B) Картирование значительно возмущенных остатков на структуру CVN, комплексную с дисахаридом Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40). Остатки с CSP выше порога av + 2 sd выделены красным цветом, а остатки между av + sd и av + 2 sd — синим. Молекулы дисахарида Manα1-2Manα обозначены оранжевым цветом для обозначения места их связывания. (C) Выбранные кривые связывания, представляющие CSP в зависимости от концентрации D-маннозы. Данные были подобраны в соответствии с уравнением 5 в качестве модели связывания с одним сайтом для оценки KD, что выявило диапазон аффинностей, при этом D44 демонстрирует самое сильное взаимодействие (KD = 1,1 ± 0,35 мМ), а E41 — самое слабое (KD = 35 ± 29 мМ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-15
Рисунок 5: Анализ 15N-R2 на наличие свободных и связанных с D-маннозой CVN. (А, Б) Скорости поперечной релаксации (15N-R2) измерены для каждого остатка CVN в его (A) свободном и (B) связанном с D-маннозой состояниях. (C) Разница в значениях R2 (ΔR2 = R2в свободном положении) для каждого остатка. Синяя и красная линии представляют одно и два стандартных отклонения от среднего значения (av ± sd и av ± 2 sd) соответственно. Остатки со значительными значениями ΔR2 маркируются. (D) Картирование значений ΔR2 для структуры CVN в комплексе с дисахаридом Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40). Остатки с ΔR2 выше или ниже av± 2 sd показаны красным цветом; Значения между AV± SD и AV± 2 SD показаны синим цветом. Молекулы D-маннозы отображаются оранжевым цветом, чтобы указать на место их связывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В настоящей работе мы представили эксперименты ЯМР по исследованию белок-гликановых взаимодействий. Молекулярное распознавание белок-гликанов лежит в основе многочисленных биологических процессов, связанных с внеклеточным матриксом (ВКМ), включая регуляцию клеточной адгезии, миграции, пролиферации и различных других форм клеточной коммуникации.

Здесь мы решили работать с моносахаридом D-маннозой, который описывается как слабосвязующее вещество. Цель состояла в том, чтобы описать методы измерен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ЯМР-спектроскопия представляет собой универсальный подход к исследованию белково-гликановых взаимодействий, в частности, из-за ее способности обнаруживать слабые и переходные взаимодействия, такие как те, которые наблюдаются между CVN и D-маннозой. Описанный здесь протокол сочетает в себе методы ЯМР на основе лигандов и белков, что позволяет более полно охарактеризовать интерфейс взаимодействия.

Важнейшие этапы протокола включают тщательную подготовку образцов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Благодарим Национальный центр магнетического ядерного сопротивления имени Иржи Йонаса (CNRMN) за использование ЯМР-спектрометров. Мы благодарны доктору Кэрол Бьюли за то, что она поделилась с нами информацией о химических сдвигах CVN в комплексе с Manα1-2Manα. Мы также благодарим финансирующие агентства FAPERJ и CNPq.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
13C глюкозаИзотопная лаборатория Камбриджа.КЛМ-481
15N хлорид аммонияИзотопная лаборатория Камбриджа.НЛМ-467
Хлорид кальцияСигма-ОлдричС4901
Кокетка ингибирует протеазуСигма-Олдрич4693159001
D2OИзотопная лаборатория Камбриджа.ДЛМ-4
D-маннозаСигма-ОлдричМ2069-5Г
Хлорид магнияСигма-ОлдричМ8266
NMRПипетьСсылка на учебное пособие по программному обеспечению: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
Хлорид калия (K2HPO4)Сигма-ОлдричП3786
Хлорид калия (KCl)Сигма-ОлдричП3911
Хлорид калия (KH2PO4)Сигма-ОлдричП0662
Трубка СигемиБрукерZ1Z10684A
Хлорид натрия (NaCl)Сигма-ОлдричС9625
Фосфат натрия (Na2HPO4)Сигма-Олдрич567545
Фосфат натрия (NaH2PO4)Сигма-ОлдричС97263
Спектрометр Bruker 600 МГцБрукер
Спектрометр Bruker 800 МГцБрукер
ТиаминСигма-ОлдричТ1270
Тройной резонансный преобразователь TXIБрукер
ТриптонСигма-Олдрич93657
Дрожжевой экстрактСигма-ОлдричY1625

Ссылки

  1. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  2. van Kooyk, Y., Rabinovich, G. A. Protein-glycan interactions in the control of innate and adaptive immune responses. Nat. Immunol. 9 (6), 593-601 (2008).
  3. Gagneux, P., Hennet, T., Varki, A. Biological functions of glycans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  5. He, M., Zhou, X., Wang, X. Glycosylation: Mechanisms, biological functions and clinical implications. Signal Transduct. Target. Ther. 9 (1), 194(2024).
  6. Maier, I., Kontaxis, G., Zimmermann, C., Steininger, C. Cyanovirin-N binding to N-acetyl-d-glucosamine requires carbohydrate-binding sites on two different protomers. Biochemistry. 63 (10), 1270-1277 (2024).
  7. Muñoz-Basagoiti, J., et al. Cyanovirin-N binds to select SARS-CoV-2 spike oligosaccharides outside of the receptor binding domain and blocks infection by SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 120 (10), e2214561120(2023).
  8. Margraf-Schönfeld, S., Böhm, C., Watzl, C. Glycosylation affects ligand binding and function of the activating natural killer cell receptor 2B4 (CD244) protein. J. Biol. Chem. 286 (27), 24142-24149 (2011).
  9. Thomas, D., Rathinavel, A. K., Radhakrishnan, P. Altered glycosylation in cancer: A promising target for biomarkers and therapeutics. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer. 1875 (1), 188464(2021).
  10. Vasconcelos, A. A., Estrada, J. C., David, V., Wermelinger, L. S., Almeida, F. C. L., Zingali, R. B. Structure-function relationship of the disintegrin family: Sequence signature and integrin interaction. Front. Mol. Biosci. 8 (December), 1-20 (2021).
  11. Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr. Opin. Struct. Biol. 62, 22-30 (2020).
  12. Haslam, S. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  13. Angulo, J., et al. NMR investigations of glycan conformation, dynamics, and interactions. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 144 - 145, 97-152 (2024).
  14. Bewley, C. A., Shahzad-Ul-Hussan, S. Characterizing carbohydrate-protein interactions by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biopolymers. 99 (10), 796-806 (2013).
  15. Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem. Soc. Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
  16. Pomin, V. H., Wang, X. Glycosaminoglycan-protein interactions by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Molecules. 23 (9), 2314(2018).
  17. Walinda, E., Morimoto, D., Sugase, K. Overview of relaxation dispersion NMR spectroscopy to study protein dynamics and protein-ligand interactions. Curr. Protoc. Protein Sci. 92 (1), e57(2018).
  18. Altincekic, N., et al. Large-scale recombinant production of the SARS-CoV-2 proteome for high-throughput and structural biology applications. Front. Mol. Biosci. 8, 89(2021).
  19. Mayer, M., Meyer, B. Characterization of ligand binding by saturation transfer difference NMR spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 38 (12), 1784-1788 (1999).
  20. Haselhorst, T., Lamerz, A. C., von Itzstein, M. Saturation transfer difference NMR spectroscopy as a technique to investigate protein-carbohydrate interactions in solution. Methods Mol. Biol. 534, 375-386 (2009).
  21. Dalvit, C., Fogliatto, G. P., Stewart, A., Veronesi, M., Stockman, B. WaterLOGSY as a method for primary NMR screening: Practical aspects and range of applicability. J. Biomol. NMR. 21 (4), 349-359 (2001).
  22. Dalvit, C., Fasolini, M., Flocco, M., Knapp, S., Pevarello, P., Veronesi, M. Spectroscopy experiments: Detection of high-affinity ligands. J. Med. Chem. 45, 2610-2614 (2002).
  23. Lucas, L. H., Yan, J., Larive, C. K., Zartler, E. R., Shapiro, M. J. Transferred nuclear Overhauser effect in nuclear magnetic resonance diffusion measurements of ligand-protein binding. Anal. Chem. 75 (3), 627-634 (2003).
  24. Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 121 (10), 2331-2332 (1999).
  25. Di Carluccio, C., et al. Investigation of protein-ligand complexes by ligand-based NMR methods. Carbohydr. Res. 503, 108313(2021).
  26. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Structural analysis of glycans. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2009).
  27. Driessen, N. N., et al. Cyanovirin-N inhibits mannose-dependent Mycobacterium-C-type lectin interactions but does not protect against murine tuberculosis. J. Immunol. 189 (7), 3585-3592 (2012).
  28. Botos, I., et al. Structures of the complexes of a potent anti-HIV protein cyanovirin-N and high mannose oligosaccharides. J. Biol. Chem. 277 (37), 34336-34342 (2002).
  29. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: Calorimetric and NMR characterization. Chem. Biol. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  30. Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J. Am. Chem. Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
  31. Meyer, B., Peters, T. NMR spectroscopy techniques for screening and identifying ligand binding to protein receptors. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (8), 864-890 (2003).
  32. Marchetti, R., et al. 34;Rules of engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. Chem. Open. 5 (4), 274-296 (2016).
  33. Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Phys. Rev. 94 (3), 630-638 (1954).
  34. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex: Structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  35. Weisemann, R., Rüterjans, H., Bermel, W. 3D triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N- and 13C-labelled proteins. J. Biomol. NMR. 3 (1), 113-120 (1993).
  36. Muhandiram, D. R., Kay, L. E. Gradient-enhanced triple-resonance three-dimensional NMR experiments with improved sensitivity. J. Magn. Reson. B. 103 (3), 203-216 (1994).
  37. Whitehead, B., Craven, C. J., Waltho, J. P. Double and triple resonance NMR methods for protein assignment. Methods Mol. Biol. 60, 29-52 (1997).
  38. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G. W., Zhu, G., Pfeifer, J., Bax, A. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  39. Skinner, S. P., et al. Structure calculation, refinement and validation using CcpNmr Analysis. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 1), 154-161 (2015).
  40. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  41. Sanches, K., Caruso, I. P., Almeida, F. C. L., Melo, F. A. The dynamics of free and phosphopeptide-bound Grb2-SH2 reveals two dynamically independent subdomains and an encounter complex with fuzzy interactions. Sci. Rep. 10 (1), 1-13 (2020).
  42. Almeida, F. C. L., Sanches, K., Caruso, I. P., Melo, F. A. NMR relaxation dispersion experiments to study phosphopeptide recognition by SH2 domains:the Grb2-SH2-phosphopeptide encounter complex. SH2 Domains. 2705, 135-151 (2023).
  43. Huang, R., Bonnichon, A., Claridge, T. D. W., Leung, I. K. H. Protein-ligand binding affinity determination by the WaterLOGSY method: An optimised approach considering ligand rebinding. Sci. Rep. 7 (March), 1-6 (2017).
  44. Caruso, I. P., et al. Insights into the specificity for the interaction of the promiscuous SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N-terminal domain with deoxyribonucleic acids. Int. J. Biol. Macromol. 203 (January), 466-480 (2022).
  45. Luna, R. E., Akabayov, S. R., Ziarek, J. J., Wagner, G. Examining weak protein-protein interactions in start codon recognition via NMR spectroscopy. FEBS J. 281 (8), 1965-1973 (2014).
  46. Qin, J., Gronenborn, A. M. Weak protein complexes: Challenging to study but essential for life. FEBS J. 281 (8), 1948-1949 (2014).
  47. Perkins, J. R., Diboun, I., Dessailly, B. H., Lees, J. G., Orengo, C. Transient protein-protein interactions: Structural, functional, and network properties. Structure. 18 (10), 1233-1243 (2010).
  48. Ross, J. L. The dark matter of biology. Biophys. J. 111 (5), 909-916 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DN

Похожие статьи