Method Article

Костезащитная роль буплевры в модели постменопаузального остеопороза у крыс

DOI:

10.3791/68675

⸱

August 22nd, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1YouJiang Medical University for Nationalities, 2Affiliated Hospital of YouJiang Medical University for Nationalities, 3ShenZhen International Travel Health Care Center (ShenZhen Customs Port Clinic)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы использовали овариэктомизированную модель постменопаузального остеопороза у крыс, чтобы продемонстрировать, что пероральная жидкость Bupleurum (Chai hu) улучшает микроструктуру костей за счет подавления провоспалительных факторов и усиления противовоспалительных. Это говорит о том, что его противовоспалительный механизм частично смягчает остеопороз, вызванный дефицитом эстрогена.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол направлен на изучение влияния введения Чайху на постменопаузальный остеопороз у овариэктомированных (OVX) крыс. Восьминедельным самкам крыс Sprague-Dawley была выполнена двусторонняя овариэктомия с использованием дорсального доступа для установления модели постменопаузального остеопороза. Различные дозы пероральной жидкости Chai hu вводились перорально в течение 12 недель подряд, после чего проводилась оценка микроструктуры костей и измерение уровня воспалительных цитокинов. Лечение Чайху средними и высокими дозами частично ингибировало потерю костной массы, снижало экспрессию провоспалительных цитокинов и повышало уровень противовоспалительных цитокинов у крыс OVX. Наблюдалось значительное снижение тяжести разрушения кости от низких до высоких доз, а также наблюдалось дозозависимое улучшение микроструктурной реконструкции кости. Chai hu смягчил вызванную дефицитом эстрогена потерю костной массы и микроструктурное ухудшение, тем самым подавляя прогрессирование OP в этой модели OVX. Вероятно, это было результатом противовоспалительного действия задействованных путей.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Остеопороз (ОП) является распространенным метаболическим заболеванием костей, характеризующимся снижением костной массы, снижением прочности костей и разрушением микроархитектуры кости1. ОП может проявляться как первичная или вторичная, а первичная ОП классифицируется как постменопаузальная ОП (ПМОП), старческая ОП и идиопатическая ОП (которая часто встречается у подростков). Среди них ПМОП I типа встречается преимущественно у женщин с ПМ, у которых отмечается заметное снижение плотности костной ткани после менопаузы из-за снижения циркулирующего уровня эстрогена2. Это системное метаболическое заболевание костей, которое приводит к повышению активности остеокластов и интенсивной дифференцировке3. Кроме того, интенсивность резорбции кости значительно превышает ее формацию, что приводит к уменьшению костной массы, а также к повышению хрупкости кости и риску переломов4.

Текущие исследования показали, что многие хронические воспалительные заболевания, такие как остеоартрит и пародонтит, связаны со значительной потерей костной массы, что позволяет предположить, что воспаление может быть тесно связано с OP5. С возрастом у женщин с ПМ, в дополнение к эндокринным изменениям, физиологические и иммунные функции снижаются, и организм остается в состоянии хронического воспаления в течение длительных периодов времени. Многие из этих факторов, способствующих воспалению, и цитокины, полученные из Т-клеток, играют важную роль в потере костной массы. Поэтому ПМОП также признан хроническим воспалительным заболеванием 6,7.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) имеет долгую историю и богатый клинический опыт в профилактике и лечении ПМОП, уделяя особое внимание целостному менеджменту и индивидуальной диагностике и лечению, и может регулировать эндокринную и иммунную системы одновременно, что является благословениемдля женщин в постменопаузе. Это позволяет значительной части женщин иметь доступ к медицинскому обслуживанию. Современные фармакологические исследования и клинические испытания показали, что ТКМ обладает такими преимуществами, как многоадресность, низкая токсичность и побочные эффекты, а также является дешевой. Риск осложнений может быть значительно снижен при лечении PMOP9 методом ТКМ.

Чай ху сам по себе обладает противовоспалительными свойствами10 и антидепрессантом11, а также может регулировать секрецию гормонов в организме12 , а также способствовать хорошему здоровью13. Чай ху является основным ингредиентом, который играет важную роль в составной формуле ТКМ, таблетках Сяояо, который успокаивает эмоции, способствует пищеварению и всасывается в желудке и кишечнике. Он также известен тем, что восполняет ци и энергию крови, а также регулирует симптомы менструального цикла и связанный с ним дискомфорт14. Основным компонентом Чай ху является сапонин Чай ху, который обладает сильной противовоспалительной активностью, в основном проявляющейся в подавлении экспрессии провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли α (TNF-α), интерлейкин 1β и IL-615. Кроме того, он усиливает экспрессию противовоспалительного цитокина, IL-10, тем самым облегчая воспаление, такое как колит, эндометрит и гепатит16.

По сравнению со стандартными методами лечения ОП (включая использование бисфосфонатов17, селективных модуляторов рецепторов эстрогена18 и деносумаба19), Чайху, как широко используемая ТКМ, имеет потенциальное преимущество многокомпонентного, многоцелевого механизма действия. Стандартные методы лечения обычно нацелены на специфические костные метаболические пути20 (ингибирование активности остеокластов), которые могут быть связаны с определенными побочными эффектами, такими как желудочно-кишечный дискомфорт, повышенный риск остеонекроза челюстей и гриппоподобные симптомы, а также высокая долгосрочнаястоимость лекарств.

Обзор соответствующей литературы показал, что использование Чай Ху для вмешательства в организм крыс с ПМ с ФП может иметь терапевтический смягчающий эффект22. Таким образом, основываясь на биоинформатике и фармакологическом анализе, а также на молекулярном моделировании докинга для прогнозирования сайтов докинга23, мы предположили, что Chai hu может вмешиваться в воспалительный процесс, модулировать иммунный статус организма и восстанавливать костный иммунный гомеостаз. Это будет способствовать стабильности состояния восстановления кости и достижению желаемого терапевтического эффекта облегчения ОП.

В этом исследовании использовали пероральный прием жидкости Чайху (концентрация: 1 г/мл) в течение 12 недель подряд. Режим дозирования был разработан на основе клинически распространенных доз в ТКМ и фармакокинетических исследованиях24.

Общей целью данного метода введения является создание стабильного и клинически значимого протокола дозирования, тем самым систематически оценивая устойчивый эффект вмешательства Чай ху в целевой модели (крысиная модель постменопаузального остеопороза). Такой подход к введению гарантирует, что препарат поддерживает эффективную концентрацию в плазме крови на протяжении всего экспериментального периода, обеспечивая надежную основу вмешательства для последующих оценок (таких как показатели метаболизма костей и уровни факторов воспаления). Кроме того, это помогает прояснить роль Чай Ху в родственных заболеваниях, а также его зависимость доза-эффект, предлагая эталонную парадигму для стандартизированного применения традиционных китайских лекарств в экспериментальных исследованиях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры с участием животных проводились в соответствии с Руководством NIH по уходу за лабораторными животными и их использованию (8-е издание) и были специально одобрены Комитетом по этике животных Медицинского университета Юцзян по национальностям (одобрение No 2024071001).

1. Анализ сетевой фармакологии

ПРИМЕЧАНИЕ: Киберфармакология – это подход, который сочетает в себе системную биологию, вычислительную биологию и фармакологию и направлен на понимание механизма действия лекарств и лекарственных взаимодействий путем анализа биомолекулярныхсетей.

  1. Проводите скрининг активных соединений с хорошей пероральной биодоступностью (OB) и лекарственным сходством (DL) с помощью таких инструментов, как Платформа фармакологии и анализа систем традиционной китайской медицины (TCMSP: http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php). Установите OB на ≥30%, а DL на ≥0.1826. Найдите Chai hu и нажмите Herb Details и загрузите все данные о соединениях. Назовите скачанный файл Chaihu.
  2. Получите целевое имя основного ингредиента путем вставки MOL ID основного ингредиента в базу данных TCMSP. Вставьте в пакетный поиск TCMSP и выберите «Прогноз целевого объекта», а затем нажмите кнопку «Отправить».
  3. Откройте базу данных UniProtsh, скопируйте столбец Target Name в поиск и найдите название белка, выделенное жирным шрифтом, которое точно совпадает со вставленным названием целевого белка. Найдя соответствующее название белка, соберите соответствующие названия генов в столбце после него.
  4. Отфильтруйте гены, связанные с остеопорозом, в базе данных GeneCards (https://www.genecards.org) в соответствии с оценкой релевантности ≥ 1 и получите все (5741) гены27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Причины выбора генов с оценкой релевантности ≥ 1 из базы данных GeneCards следующие: оценка ≥ 1 указывает на то, что ген имеет документально подтвержденные ассоциации с целевым заболеванием, четко отличая его от генов без зарегистрированных ассоциаций (оценка = 0). Этот порог обеспечивает сохранение генов с достоверной релевантностью для заболевания, избегая при этом чрезмерного вмешательства со стороны неродственных генов. Более низкий порог (<1) может включать гены без подтвержденных ассоциаций, что увеличивает количество ложноположительных результатов.
  5. Получение пересекающихся генов после объединения наборов генов, связанных с заболеванием, с мишенями для пересечения лекарств. Основываясь на взаимодействиях между мишенями болезней и активными ингредиентами лекарств, постройте сеть пересечения традиционной китайской медицины-активного ингредиента-мишени-болезни с помощью программного обеспечения Cytoscape.
  6. Получение информации о белок-белковом взаимодействии (PPI) с помощью строковой базы данных (https://cn.string-db.org/) и создание сети PPI. Откройте Cytoscape (https://www.cytoscape.org), загрузите загруженный TSV-файл в сеть загрузки, затем выберите «Рассчитать > TOP10 или TOP20» и нажмите «Отправить».
  7. Создайте две таблицы для импорта в Cytoscape. Создайте файл электронной таблицы с именем Network. В столбце А введите те же идентификаторы MOL (CH1, CH2...), которые были заменены аббревиатурой традиционной китайской медицины. Пометьте столбец B как MOL ID и отсортируйте его в порядке возрастания по MOL ID. Обозначьте столбец C в качестве условного обозначения. Скопируйте идентификаторы компонентов (MOL ID) и имена генов из файлов, связанных с Chaihu, в столбцы B и C соответственно. Затем удалите столбец B и переименуйте столбец A в MOL ID.
  8. Растяните таблицу до конца текста. В столбце «Символ» введите идентификаторы MOL (CH1, CH2...), замененные аббревиатурой традиционной китайской медицины. В столбце MOL ID введите аббревиатуру традиционной китайской медицины: CH. С помощью вышеуказанных шагов информационное дополнение и создание сети «Традиционная китайская медицина - компонент - мишень» завершено.
  9. Далее делаем вторую форму, файл TYPE. Создайте новую таблицу и назовите ее ТИП. Обозначьте столбец A как Term, а столбец B как TYPE. Скопируйте название гена в столбец term и присвойте ему атрибут gene в столбце type (цель — поиск гена; все названия генов будут выбраны, чтобы им было удобно работать). Введите ингредиенты в столбец Термин и присвойте ингредиенту атрибут drug1.
  10. Импорт в программу Cytoscape. Импорт сети для загрузки файла сети и импорт таблицы для загрузки файла типа. В окне поиска введите gene, нажмите Enter, чтобы все гены были выбраны, потяните выбранные гены влево, а затем нажмите Layout > Attribute() > Selected (выберите круглый или квадратный в скобках).
  11. Объединить результаты сетевого фармакологического анализа с экспериментальными данными для выявления ключевых соединений и молекулярных механизмов действия лекарственных средств.

2. Молекулярный докинг

Молекулярный докинг представляет собой вычислительный метод для прогнозирования оптимального режима связывания и аффинности между малой молекулой (лигандом) и белком-мишенью или биомолекулой28.

  1. Получение рецепторов и лигандов
    1. Источник рецептора (белка): Получите PDB-файл целевых белков из банка данных белков RCSB (https://www.rcsb.org). Выполните поиск 3Q4B (пример рецептора IL-6), нажмите Скачать файлы > формате PDB.
    2. Удалите кристаллографические молекулы воды, нажав «Правка» > «Удалить > воду», посторонние ионы и заменимые лиганды (сохраняют критические кофакторы, такие как ионы металлов), нажав «Правка» > «Удалить > гетероатомы». Добавьте недостающие атомы водорода, нажав кнопку Редактировать > Водород > Добавить. Сохраните как protein.pdbqt. нажав «Редактировать» > «Заряды» > «Вычислить гастейгер», затем «Сетка > макромолекулу» > выберите > «Сохранить как PDBQT».
    3. Источник лиганда (малых молекул): Загрузите структуру лиганда от PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Выполните поиск Saikosaponin A (CID:6443568), нажмите 3D Conformer > Загрузить SDF.
    4. Используйте программное обеспечение Open Babel для преобразования файла Saikosaponin A в формате SDF в файл формата PDB с низкоэнергетическими трехмерными конформациями и назовите его saikosaponinA.
  2. Настройка параметров стыковки (инструменты AutoDock)
    1. Загрузите файлы рецептора и лиганда. Импортируйте файл с малой молекулой saikosaponin A и сохраните его как файл PDBQT. Впоследствии загрузите рецептор и лиганд: нажмите Docking > Macromolecule > Открыть, выберите IL6_receptor.pdbqt; затем нажмите Docking > Ligand > Открыть, выберите saikosaponinA.pdbqt.
    2. Настройте сетку: нажмите Grid > Grid Box, отрегулируйте размер блока, чтобы он полностью охватывал активный сайт (используйте диск управления на левой панели для тонкой настройки), затем сохраните текущие настройки, нажав File > Close Saving Current и назовите файл grid.gpf.
    3. Настройте запущенную программу AutoGrid: нажмите Run AutoGrid, выберите файл grid.gpf, а затем нажмите Launch. Далее настройте параметры стыковки: Последовательно в меню «Стыковка» нажмите «Макромолекула » и выберите файл белка IL6_receptor.pdbqt; нажмите кнопку Лиганд и выберите файл с малой молекулой сайкосапонин A.pdbqt; установить генетический алгоритм и подтвердить его; отрегулируйте параметры стыковки и подтвердите их. Наконец, в разделе «Вывод» выберите алгоритм Ламарка (4,2), назовите файл dock.dpf и сохраните его.
    4. Запустите AutoGrid и сохраните результаты: нажмите «Запустить AutoDock», выберите файл dock.dpf и запустите моделирование. По завершении нажмите Write Complex, присвойте сложной структуре имя и сохраните ее в формате PDBQT.
  3. Анализ результатов с помощью PyMOL
    1. Конвертируйте файл формата PDBQT, полученный на предыдущем этапе молекулярного докинга, в формат PDB с помощью программного обеспечения Open Babel. Затем импортируйте файл формата PDB в программное обеспечение PyMOL для последующих операций визуализации.
    2. Найдите лиганд и разделите его по отдельности: После выбора лиганда измените его цвет, нажав кнопку «Селе », а затем выбрав «Цвет из цвета». В столбце Sele нажмите Extract Object в разделе Action, чтобы извлечь лиганд как новый независимый объект.
    3. Измерение расстояния между водородными связями: В столбце sele нажмите «Действие», найдите «Полярные контакты» и нажмите «К другим атомам в объекте»; Водородные связи будут отображаться желтыми линиями. Выберите параметр «Измерение » в столбце «Мастер», последовательно выберите «Атомы на обоих концах водородной связи », а затем нажмите «Готово », чтобы завершить измерение.
  4. Экспортируйте изображение: нажмите «Экспортировать изображение как PNG в файле». Если требуется рендеринг в высоком разрешении, введите Ray 300 (пиксели регулируются) и нажмите Enter.

3. Микрокомпьютерная томография

  1. Самкам крыс SD (32 недели, 320-350 г) внутрибрюшинно вводят пентобарбитал натрия (40 мг/кг) для глубокой анестезии, что подтверждается отсутствием роговичного рефлекса (не моргание при прикосновении ватной палочки) и болевого рефлекса (отсутствие сокращения задних конечностей при защемлении щипцами).
    1. Проведите операцию по изоляции задних конечностей. Усыпить крыс путем внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия в дозе, в 3-5 раз превышающей дозу хирургического анестетика (40 мг/кг), положить их в положение лежа и сделать поперечный разрез 3 см, на 1 см выше лобкового симфиза вдоль паховой связки. Тупо рассеките промежуток между грацилисной и сарториусной мышцами, чтобы обнажить бедренную артерию (пульсирующая трубчатая структура). Перевязать оба конца бедренной артерии с помощью швов 4-0, оставив между ними неперевязанный участок, перед тем как усечь сосуд офтальмологическими ножницами и пересечь его.
    2. Поверните нижнюю конечность внутрь, чтобы вывихнуть головку бедренной кости из вертлужной впадины и разрежьте суставную капсулу и круглую связку, сохранив целостность головки бедренной кости. Неповрежденную заднюю конечность погрузить в предварительно охлажденный физиологический раствор, затем зафиксировать в 4% растворе формальдегида на 24-48 ч.
  2. Настройка визуализации: Доставка неподвижной бедренной кости в учреждение для микрокомпьютерной томографии. Включите аппарат Micro-CT и выберите предустановленную программу сканирования костей мелких животных . Используйте следующие параметры сканирования: Рентгеновское напряжение = 90 кВ, Рентгеновский ток = 80 μА, Поле зрения (FOV) = 36 мм, Размер пикселя = 72,0 μм, Вращение = 360°, Продолжительность сканирования = 14 мин.
  3. Поместите бедренную кость левой ноги неподвижной крысы в держатель образца, зафиксируйте эпифиз бедренной кости, который нужно сфотографировать, запустите устройство и дождитесь завершения самотестирования машины. Запустите сканирование предварительного просмотра (быстрое сканирование с низким разрешением), чтобы убедиться, что образец центрирован, затем отрегулируйте область интереса, чтобы она охватывала всю бедренную кость.
  4. Когда сканирование и фотографирование будет завершено, источник рентгеновского света будет автоматически выключен. В это время величина излучения внутри машины превышает норму, и вынимать пробу без защитных средств категорически запрещено.
  5. Анализ изображений: Анализируйте параметры кости (минеральная плотность костной ткани [МПК], трабекулярное число) с помощью встроенного программного обеспечения сканера. Сохраняйте и экспортируйте восстановленные изображения для дальнейшей оценки.

4. Количественная ПЦР в реальном времени для экстракции РНК из костной ткани крысы

  1. Удалите сросшиеся мышцы и фасцию с правой бедренной кости. Нарежьте 100-200 мг костной ткани на мелкие кусочки. Добавьте 2-3 шлифовальных шарика и 500 μл буфера для экстракции РНК. Гомогенизируйте с помощью измельчителя тканей с частотой 70 Гц в течение 5 минут при 4 °C.
  2. Разделение фаз: После центрифугирования раствор разделяется на верхнюю водную фазу (содержит РНК) и нижний темный осадок (содержит белки, ДНК и полисахариды). Осторожно перенесите 500 мкл надосадочной жидкости в новую пробирку объемом 1,5 мл без РНКазы.
  3. Верхний раствор, полученный из выделения, обработать для выделения общей РНК в соответствии с инструкциями производителя.
  4. После добавления изопропанола в раствор для лизиса аккуратно переверните пробирку, чтобы перемешать раствор и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 10 минут. На этом этапе проведите визуальную проверку; если наблюдаются белые флокулянтные РНК-преципитаты (прилипшие к стенке трубки), это указывает на то, что РНК была эффективно осаждена.
  5. Используйте наконечник для дозатора объемом 200 мкл для аспирации остатков жидкости. Сохраните белую гранулу РНК на дне/стенке пробирки. Суспендируйте РНК в 50-100 мкл воды, не содержащей РНКазы, и храните при -80 °C.
  6. Смешайте 2 мкл РНК-матрицы, 10 мкл мастер-смеси, 2 мкл ДНКазы и 5 мкл воды без нуклеазы в пробирке, не содержащей нуклеаз. Аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
  7. Инкубировать при 37 °C в течение 2 минут, чтобы удалить загрязнение геномной ДНК. Выдерживать при температуре 55 °C в течение 15 минут. В конце реакции инкубируйте при температуре 85 °C в течение 5 минут, чтобы прервать реакцию.
  8. Настройте систему флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени, поместив обратно транскрибируемую ДНК на лед. Предварительно смешайте все компоненты: 10 μL qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox), по 0,4 μL Forward Primer и Reverse Primer, а также 8,2 μL воды, не содержащей РНКазы, разделите и добавьте 1 μL ДНК, обрабатывайте на льду и защищайте от света.
  9. Запустите программу количественной ПЦР следующим образом: предварительная денатурация при 95 °C в течение 5 минут, 1 цикл с последующей денатурацией при 95 °C в течение 10 с в течение 40 циклов. Выполнение отжига, растяжения, регистрации флуоресценции при 60 °C в течение 30 с в течение 40 циклов в канале SYBR Green. Получите кривую плавления для температуры от 65-95 °C с шагом 0,5 °C и 5 с/шаг. Используемые грунтовки приведены в таблице 1.

5. Подготовка животных

  1. Получить 48 самок нерожавших крыс SD (SPF-класса, возраст 8 недель, масса тела 200-220 г).
  2. Перед проведением экспериментальных процедур акклиматизируйте всех крыс с 7-дневным периодом карантина в изоляторе с SPF-классом и разместите в лабораторных условиях, контролируемых SPF (температура: 22-24 °C, влажность: 45%-55%).

6. Приготовление исследуемого препарата

  1. Приобретите жидкость для приема внутрь Chai hu (Национальное одобрение медицинской продукции Китая No Z41021539). Формула содержит Chai hu (северный источник) в качестве активного ингредиента, а также вспомогательные вещества, включая ароматизатор, сахарозу и пропиленгликоль. Каждый флакон объемом 10 мл содержит экстракт, эквивалентный 10 г сырой травы.

7. Подготовка овариэктомированной модели крысы

  1. Предоперационная подготовка: Быстрые крысы в течение 12 часов с ограниченным доступом к воде. Выполняйте стерилизацию инструментов путем автоклавирования всех хирургических инструментов.
  2. Анестезия и подготовка к ней: Введение пентобарбитала натрия путем внутрибрюшинного введения (40 мг/кг). Проверьте глубину анестезии, оценив отсутствие роговичного рефлекса (отсутствие моргания при прикосновении роговицы ватным тампоном) и отсутствие рефлекса защемления пальцев ног (отсутствие втягивания задних конечностей при зажиме). Через 15-20 мин поле операции побреть, продезинфицировать йодом, накрыть фенестрированной простыней. Применяйте глазную мазь с витамином А (содержащую 15 000 МЕ/г) во время операции, чтобы предотвратить высыхание глаз животного (Таблица 2).
  3. Овариэктомированная модель крысы: Выполняйте операцию в специальной стерильной операционной. Весь персонал был одет в полные изоляционные халаты. Перед операцией протрите столешницу и окружающее оборудование 75% этанолом (Таблица 2) и включите ультрафиолетовые лампы не менее чем на 30 минут, чтобы уничтожить микробы в воздухе и на поверхностях.
    1. Сделайте разрез 1 см на тыльной стороне кожи, тупо рассеките подкожную клетчатку, прищипните мышечный слой, а надрез сделайте на 1 см. Найдите жировую подушку и рассмотрите ее снаружи, чтобы определить яичник (ярко-красного цвета). Перевязать фаллопиеву трубу швом 4-0, иссечь ткань яичника и поместить ее в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 4% параформальдегида (табл. 2).
  4. Закрытие раны и дезинфекция: Перед наложением швов в рану насыпьте порошок пенициллина. Сшить мышечный слой нерассасывающимся швом No 6 и закрыть кожу швом No 2. Продезинфицируйте закрытый разрез йодом и нанесите местный порошок пенициллина.
  5. Послеоперационный уход: Поместите крыс в свежие клетки с бутылками с теплой водой и полотенцами для поддержания температуры тела. Животные голодают (разрешены водой) в течение 24 часов после операции для предотвращения кишечной непроходимости. Наносите порошок пенициллина на место разреза ежедневно в течение 3 дней подряд.
    1. Введите лидокаин (концентрация 1%-2%, максимум 5 мг/кг) вокруг хирургического разреза для уменьшения боли сразу после операции. Обеспечьте непрерывную анальгезию в течение 3-5 дней, постепенно снижая дозу в зависимости от тяжести боли, чтобы избежать резкого прекращения приема.
    2. Держите животное в боковом положении или положении головой вниз перед пробуждением, чтобы предотвратить выпадение языка и обструкцию дыхательных путей; Обеспечьте автономное удобное положение после пробуждения. Изолируйте послеоперационных животных от других животных до полного выздоровления, чтобы избежать борьбы или перекрестной инфекции (Рисунок 1).

8. Экспериментальная группировка и введение лекарственных препаратов

  1. Распределение по группам: Разделите в общей сложности 40 крыс SD на пять групп (n = 8 в группе), а именно: нормальный контроль, модельный контроль, Чайху с низкой концентрацией, Чай ху со средней концентрацией и Чай ху с высокой концентрацией.
  2. Для группы средних доз (5 мл/кг) выбирайте дозировку на основе рекомендаций, приведенных в 29,30. Соблюдайте соотношение градиента концентраций 1:2:4 для группы с низкой концентрацией: 2,5 мл/кг, для группы со средней концентрацией: 5 мл/кг и для группы с высокой концентрацией: 10 мл/кг.
  3. Способ применения препарата: Используйте пероральный зонд и вводите препарат один раз в день. Для нормальной контрольной группы и модельной контрольной группы (животные, подвергнутые двусторонней овариоэктомии) выполняют пероральный зонд с равным количеством физиологического раствора. Начните лечение на 1-й неделе после операции и продолжайте в течение 12 недель.

9. Анализ после эксперимента и сбор данных

  1. Проведение следующих анализов на пяти группах животных: микро-КТ структуры костей и определение экспрессии мРНК воспалительных цитокинов в бедренных тканях крыс.
  2. Сбор данных, которые включают визуализированные изображения трабекулярной микроструктуры бедренной кости; количественные параметры кости (в том числе минеральная плотность костной ткани, объемная доля кости, стандартное отклонение толщины трабекуляра, расстояние между трабекулярами, трабекулярное число и плотность связности); и относительные уровни экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-17) и противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10) в тканях бедренной кости.
  3. Выполняйте анализ данных с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 10.1.2 с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Статистическая значимость межгрупповых различий в средних значениях была определена как p < 0,05. Множественные сравнения post hoc были выполнены с использованием теста Тьюки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функция GO и анализ обогащения путей KEGG

Мы опирались на анализ обогащения GO и KEGG в биоинформатике для прогнозирования потенциального механизма действия Chai Hu на PMOP. Анализ обогащения GO генов-мишеней, пересекающихся с активными ингредиентами Chai hu для лечения заболеваний, дал 2138 значимых записей, и десять наиболее значимых результатов перечислены для каждой группы (рис. 2D). Что касается биологических...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПМОП является системным нарушением костного метаболизма, которое часто возникает у женщин с ПМ и вызвано недостатком эстрогена, что приводит к нарушению баланса остеобласт-остеокласт, что приводит к усилению резорбции костной ткани остеокластов и снижению продукции костной ткани остеобластов31. Растущее число исследований показало, что уровни воспалительных факторов в организме также влияют на дифференциацию между остеокластами и остеобластами, и что чрезмерная эк...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Программой научных исследований и развития технологий города Байсэ и Проектом по повышению базовых способностей учителей молодого и среднего возраста Университета Гуанси на 2025 год (Проект: 2025KY0549). Авторы благодарят доктора Дева Суранну из Имперского колледжа Лондона и YMUN за редактирование рукописи. ZY и LYR внесли равный вклад в эту работу.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,9% натрия хлорид для инъекций УаренфармацевтическаяХ1712059
1&раз; ПБС Термофишер10010023
75% алкоголя НанкингреагентC069156931
95% этанолНанкингреагентC0691520075
Безводный этанолМаклинE809056
Bupleurum chinense Хэнаньская аптека БайцюаньZ41021539
Решение для декальцинации СоларбиоЕ1171
эритромициновая мазь Гуанчжоу Байюньшань Фармацевтическая группа Компания Лимитед Байюньшань Хэцзигун Фармацевтическая фабрикаH44023088
Изопропиловый спирт Цзинань Цзиньрихэ Кемикал Ко.23727-29-9
пенициллин V калиевые капсулыСычуань ФармасьютикалH20103156
полиформальдегид (CH2O)nБейотимП0099
Дезинфицирующее средство повидон-йод Гуандун Хэнцзянь Фармасьютикал Ко.H44023924
Набор для флуоресцентной ПЦР в реальном времениЙозен Биотехнология11201ЭС03
Набор для экстракции РНКМонадбиотехMI20201S
Набор для обратной транскрипции РНКYuGongBiotechEG15123S
Пентобарбитал натрия Шанхайская биотехнологическая компания JixiangJX082085
Тризол Термофишер15596026КН

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. An, H., et al. Hyperoside alleviates postmenopausal osteoporosis via regulating mir-19a-5p/il-17a axis. Am J Reprod Immunol. 90 (1), e13709(2023).
  2. Wang, S., et al. Alginate oligosaccharide alleviates senile osteoporosis via the RANKL-RANK pathway in d-galactose-induced c57bl/6j mice. Chem Biol Drug Des. 99 (1), 46-55 (2021).
  3. Jiang, N., Qi, B., Li, G., Yao, L., Fan, X. Morin improves the bone histomorphology and biochemical markers in an animal model of ovariectomy-induced osteoporosis by suppressing autophagy and apoptosis. Food Sci Nutri. 12 (12), 10099-10109 (2024).
  4. Ramchand, S. K., Leder, B. Z. Sequential therapy for the long-term treatment of postmenopausal osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 109 (2), 303-311 (2024).
  5. Juluri, R., et al. Association of postmenopausal osteoporosis and periodontal disease: A double-blind case-control study. J Int Oral Health. 7 (9), 119-123 (2015).
  6. Zhang, C., et al. Oxidative stress: A common pathological state in a high-risk population for osteoporosis. Biomed Pharmacother. 163, 114834(2023).
  7. Mansoori, M. N., et al. IL-18bp is decreased in osteoporotic women: Prevents inflammasome-mediated IL-18 activation and reduces Th17 differentiation. Sci Rep. 6, 33680(2016).
  8. Shanshan, J., Baorong, H., Tianyuan, C., Xiaoqiang, H. Research progress of Chinese medicine in treating postmenopausal women with osteoporosis. Front Med Sci Res. 5 (10), 92-98 (2023).
  9. Faiella, E., et al. Percutaneous vertebroplasty: A minimally invasive procedure for the management of vertebral compression fractures. Osteology. 2 (4), 139-151 (2022).
  10. Yue, L. C., et al. Correction: Saikosaponin d exerts an antidepressant effect by regulating Homer1-mGluR5 and mTOR signaling in a rat model of chronic unpredictable mild stress. Chinese Med. 18 (1), 147-147 (2023).
  11. Yue, T., Ge, Z., Ruonan, S., Hanqing, W., Nan, Z. Saikosaponin a activates tet1/dll3/notch1 signalling and promotes hippocampal neurogenesis to improve depression-like behavior in mice. J ethnopharmacol. 319 (P3), 117289-117289 (2023).
  12. Xuedong, A. N., et al. Shugan jieyu capsule improve sleep and emotional disorder in coronavirus disease 2019 convalescence patients: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Tradit Chin Med. 42 (5), 803-809 (2022).
  13. Ying, H. S. H. Experience of professor huang ying in treating postmenopausal syndrome by chaihu guizhi decoction. J Trad Chinese Med. 38 (23), 4557-4560 (2023).
  14. Yang, Y. X., et al. Studies on the anti-inflammatory effect of xiaoyao pills in the treatment of postmenopausal osteoporosis in mice. J Vis Exp. (210), e67051(2024).
  15. Wu, S. J., Tam, K. W., Tsai, W. H., Chang, C. C., Chao, J. C. Curcumin and saikosaponin a inhibit chemical-induced liver inflammation and fibrosis in rats. Am J Chin Med. 38 (1), 99-111 (2010).
  16. Zhou, Q. R., Chen, M. Y., Wang, M. D. Treatment of chronic endometritis by penning granule: A clinical randomized controlled trial. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 36 (9), 1055-1060 (2016).
  17. Weibing, J., Yankun, D., Jinxin, Z., Suqin, D. Clinical efficacy and safety evaluation of calcitriol combined with bisphosphonates in the therapy of postmenopausal osteoporosis: Based on a retrospective cohort study. BioMed Res Int. 2022, 2711938-2711938 (2022).
  18. Hussain, I., Talaulikar, V. S. A systematic review of randomised clinical trials - the safety of vaginal hormones and selective estrogen receptor modulators for the treatment of genitourinary menopausal symptoms in breast cancer survivors. Post Reprod Health. 29 (4), 222-231 (2023).
  19. Anastasilakis, A. D., et al. Follistatins, activins and inhibins during osteoporosis therapy with denosumab or zoledronate and after their discontinuation. Diabetes Obesity Metab. 27 (4), 2288-2293 (2025).
  20. Si, Y., et al. Curcumin-encapsulated exosomes in bisphosphonate-modified hydrogel microspheres promote bone repair through macrophage polarization and DNA damage mitigation. Materials Today Bio. 32, 101874-101874 (2025).
  21. Shouguo, L. Clinical observation of qiangjin zhuangji decoction combined with denosumab in the treatment of postmenopausal osteoporosis. , (2024).
  22. Yeom, M., Kim, E. Y., Kim, J. H., Jung, H. S., Sohn, Y. High doses of bupleurum falcatum partially prevents estrogen deficiency-induced bone loss with anti-osteoclastogenic activity due to enhanced inos/no signaling. Front Pharmacol. 9, 1314(2018).
  23. Lu, L., Yinliang, X., Liu, Y., Zhenzhong, J., Xiaoyan, L. Analysis of the mechanism of action of euphorbia fischeriana steud on cirrhosis based on network pharmacology. Medicine. 102 (37), e35118(2023).
  24. Nan, L. S. HPLC-UV for the determination of plasma concentration of saikosaponin C in rats' serum. Info Trad Chin Med. 32 (02), 66-68 (2015).
  25. Sakle, N. S., More, S. A., Mokale, S. N. A network pharmacology-based approach to explore potential targets of caesalpinia pulcherima: An updated prototype in drug discovery. Sci Rep. 10 (1), 17217(2020).
  26. Ru, J., et al. Tcmsp: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminformatics. 6, 13(2014).
  27. Bowen, Y., Qiuwen, Z., Xiaodong, W., Jingxin, M., Shuqing, Z. Using network pharmacology and molecular docking verification to explore the mechanism of ursolic acid in the treatment of osteoporosis. Medicine. 101 (49), e32222(2022).
  28. Belghalia, E., et al. In silico research on new sulfonamide derivatives as brd4 inhibitors targeting acute myeloid leukemia using various computational techniques, including 3D-QSAR, HQSAR, molecular docking, ADME/Tox, and molecular dynamics. J Biomol Struct Dyn. 42 (17), 9201-9219 (2023).
  29. Chinese pharmacopoeia Commission. The Pharmacopeia of the People's Republic of China 2020 Edition: Volume I. , CHINA MEDICAL SCIENCE PRESS. (2020).
  30. Chinese pharmacopoeia Commission. The pharmacopoeia of the People's Republic of China 2020 edition: volume IV. , CHINA MEDICAL SCIENCE PRESS. (2020).
  31. Xu, S., et al. Material Basis and Mechanism of Erzhi Pill for Preventing Osteoporosis Based on Network Pharmacology. Chin Pharma J. 53 (22), 1913-1920 (2018).
  32. Lee, D. K., et al. Phospholipase c β4 promotes rankl-dependent osteoclastogenesis by interacting with mkk3 and p38 mapk. Exp Mol Med. 57 (2), 323-334 (2025).
  33. Huang, Q., et al. The effects of Ti and Ta particle surface chemistry on inflammation, osteogenesis, and osteoclastogenesis in vitro and in vivo. Colloid Interf Sci Commun. 54, 100716(2023).
  34. Zhao, M., et al. Comprehensive comparison on the anti-inflammation and gc-ms-based metabolomics discrimination between bupleuri chinense dc. And b. Scorzonerifolium willd. Front Pharmacol. 13, 1005011(2022).
  35. Bin, L., et al. Analysis of mutual-detoxication compatibility rules of "bupleuri radix decreaseing liver's yin essence" based on data mining. Chin Trad Herbal Drugs. 53 (14), 4428-4436 (2022).
  36. Ying, W., Xuefeng, Z., Minjing, L., Tingting, Z., Ping, L. Xiaochaihu decoction in diabetic kidney disease: A study based on network pharmacology and molecular docking technology. Integrat Med Nephrol Androl. 8 (1), 13-13 (2021).
  37. Sheng, Z., Hongcheng, L., Min, X. Identifying immune cell infiltration and effective diagnostic biomarkers in rheumatoid arthritis by bioinformatics analysis. Front Immunol. 12, 726747(2021).
  38. Menon, S. M. P., Elengoe, A. Evaluation of the role of kras gene in colon cancer pathway using string and cytoscape software. Biomed Res Ther. 7 (6), 3835-3842 (2020).
  39. Yang, J., et al. Bioinformatics identification based on causal association inference using multi-omics reveals the underlying mechanism of gui-zhi-shao-yao-zhi-mu decoction in modulating rheumatoid arthritis. Phytomed Int J Phytother Phytopharmacol. 136, 156332(2024).
  40. Yang, M., et al. Purification of harvested rainwater using gravity-driven ceramic membrane: A visualization study combining micro-CT and Comsol simulations. J Environ Manag. 373, 123333(2024).
  41. Jui-Ting, H., et al. A comparison of micro-CT and dental CT in assessing cortical bone morphology and trabecular bone microarchitecture. PloS one. 9 (9), e107545(2014).
  42. Yang, S. S., et al. Grem1 inhibits osteogenic differentiation of mbmscs in ovx rats through bmp/smad1/5 signaling pathway. Regenerat Ther. 28, 527-535 (2025).
  43. Huang, W., Zheng, X., Yang, X., Fan, S. Stimulation of osteogenic differentiation by saikosaponin-a in bone marrow stromal cells via wnt/β-catenin pathway. Calcified Tiss Int. 100 (4), 392-401 (2017).
  44. Hattori, T., et al. The fixed herbal drug composition "saikokaryukotsuboreito" prevents bone loss with an association of serum IL-6 reductions in the ovariectomized mouse model. Phytomedicine. 17 (3-4), 170-177 (2010).
  45. Wu, X., et al. Inhibition of lipopolysaccharide-induced inflammatory bone loss by saikosaponin d is associated with regulation of the rankl/rank pathway. Drug Des Dev Ther. 15, 4741-4757 (2021).
  46. Yu-Ting, H., et al. Effects of saikosaponin d on differentially expressed genes, Ctla-4, IL-10, and IL-17 in mice with autoimmune hepatitis. J Shanghai Jiaotong Uni. 40 (03), 303-309 (2020).
  47. Allergy, Z. C. F., et al. Sebocytes contribute to skin inflammation by promoting the differentiation of t helper 17 cells. Br J Dermatol. 178 (3), 722-730 (2018).
  48. Piao, C. H., Song, C. H., Lee, E. J., Chai, O. H. Saikosaponin a ameliorates nasal inflammation by suppressing il-6/ror-γt/STAT3/IL-17/nf-κb pathway in ova-induced allergic rhinitis. Chem Biol Interact. 315, 108874(2020).
  49. Zhimeng, L., et al. Il-17/il-17 receptor pathway-mediated inflammatory response in apostichopus japonicus supports the conserved functions of cytokines in invertebrates. J Immunol. 208 (2), 464-479 (2022).
  50. Wang, X., et al. Forsythiaside a repairs uvb-induced skin inflammatory damage by il-17 signaling pathway. Food Biosci. 64, 105845-105845 (2025).
  51. Ridvan, G., Emine, Y. Evaluation of the awareness and knowledge levels of dentists regarding bisphosphonates and bisphosphonate-related jaw necrosis. J Craniofac Surg. 36 (4), e376-e382 (2025).
  52. Lijuan, W., et al. An ultra-performance liquid chromatography photodiode array detection tandem mass spectrometric method for simultaneous determination of seven major bioactive constituents in Xiaochaihutang and its application to a fourteen-compound compatibility study. J Chromatograph Sci. 53 (9), 1570-1576 (2015).
  53. Wang, D. L., Fang, F. F., Liu, C. S., Su, J. C. expert consensus on integrated traditional chinese and western medicine diagnosis and treatment for osteoporotic fractures. Zhongguo gu shang China. J Orthopaed Traumatol. 37 (3), 242-250 (2024).
  54. Shimeng, L., et al. Antidepressant active components of bupleurum chinense dc-paeonia lactiflora pall herb pair: Pharmacological mechanisms. BioMed Res Int. 2022, 1024693-1024693 (2022).
  55. Ran, S., et al. Bupleurum in treatment of depression disorder: A comprehensive review. Pharmaceuticals (Basel). 17 (4), 512(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Postmenopausal OsteoporosisOvariectomized RatsBone MicrostructureChai Hu TreatmentBone Loss InhibitionInflammatory CytokinesAnti Inflammatory PathwaysEstrogen DeficiencyBone DestructionDose Response

Related Articles