Методическая статья

Анализ разведения FRET для анализа динамического обмена между белковыми сборками

DOI:

10.3791/68678

⸱

19 сентября 2025 г.

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается очистка и ковалентное мечение рефлектина А1, а также анализ разведения FRET для характеристики динамического обмена белка рефлектина между белковыми сборками в зависимости от возраста.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В качестве молекулярного фактора перестраиваемой радужности у головоногих моллюсков поведение настраиваемой фазы белка рефлектина А1 продолжает оставаться в центре внимания биоматериаловедения. Модулирование концентрации соли и чистой зарядовой плотности белка рефлектина A1 заставляет белок образовывать динамические ансамбли в качестве промежуточных продуктов для разделения жидкой и жидкой фаз. Рефлектиновые сборки, хотя и ограничены по размеру степенью нейтрализации заряда катионного белка, кулоновского отталкивания, первоначально находятся в динамическом обмене с мономерами или олигомерами из окружающего раствора. Новый метод флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) был использован в сочетании с анализами динамического рассеяния света (DLS) и концентрации белка для характеристики двустороннего потока белка между ассамблями рефлектина А1 и разбавленной фазой в зависимости от возраста сборки. Этот анализ разбавления FRET различает односторонний и двусторонний поток белка в белковые сборки и из них и, следовательно, может применяться во время формирования сборки. Дифференциация между динамическими и кинетически остановленными белковыми сборками имеет решающее значение для понимания их биофизического происхождения, и этот новый анализ разведения FRET может быть адаптирован для дополнения биофизических исследований других белковых сборок.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перестраиваемая радужность у кальмаров-лолигинид опосредована белками рефлектина в клетках иридоцитов 1,2,3. Иридоциты содержат обширные и регулярные мембранные инвагинации, которые образуют стопки плотных белками пластинок Брэгга, которые отражают свет в зависимости от угла и длины волны 1,4,5,6. Каскад сигналов, запускаемый ацетилхолином, завершается фосфорилированием катионных белков рефлектина 1,2,7, снижая внутри- и межбелковое электростатическое отталкивание и приводя к конденсации рефлектинов в брэгговских ламелях от частиц гидродинамического радиуса 10-50 нм до плотного жидкого конденсата 3,8,9. Рефлектин А1 in vitro образует стабильные по размеру сборки радиусом 10+ нм, размеры которых точно настроены плотностью чистого заряда белка 10,11,12, и это настраиваемое коллоидное поведение привлекло большой биоинженерный интерес при разработке перестраиваемых биофотонных материалов на основе рефлектина 13,14,15,16,17,18. Недавно было продемонстрировано, что NaCl приводит к отражению сборки А1 и LLPS (разделение жидкостно-жидкостных фаз) за счет энтропийного увеличения энергетического вклада гидрофобного эффекта и экранирования отталкивающих зарядов чередующихся катионных линкеров19.

Для жидкостных конденсатов с высоким содержанием белка динамический обмен между плотной фазой и разбавленной фазой может быть легко проанализирован с помощью цельнокапельного FRAP (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания)20; Необходим аналогичный анализ для белковых сборок нанометрового масштаба. Недавние сообщения о физиологически значимых белковых сборках в качестве промежуточных продуктов к LLPS 19,21,22 предполагают необходимость эквивалентных методов для изучения динамики сборки и динамического обмена между сборками и сосуществующей разбавленной фазой. Белковые кластеры могут включать кинетически остановленные стекловидные коллоиды, образующиеся в результате остановленного спинодального разложения, динамические равновесные сборки, которые обмениваются мономерами или олигомерами из разбавленной фазы, и метастабильные кластеры 23,24,25,26,27. Таким образом, возрастная динамика сборки белка является ключом к пониманию физических процессов, управляющих формированием белковых сборок в контексте более сложного фазового поведения.

Для характеристики динамики метастабильных белковых кластеров21 были использованы подходы, основанные на FRET, анализирующие взаимодействие между сборками донорного белка, меченного флуорофором, и сборками белка, меченного акцептором-флуорофором. При смешивании этих кластеров появление FRET демонстрирует обмен и транспортировку белка в кластеры21. Однако для некоторых белков, таких как рефлектин А1, кластеры непрерывно формируются и растут в течение всего эксперимента19. Для таких белков необходим подход, который деконволютирует односторонний транспорт белка в кластеры, как это может происходить при непрерывном образовании динамически остановленных кластеров, и двусторонний транспорт белка между сборками.

Подход с разведением FRET позволяет достичь этого с помощью разведения флуорофоров (рис. 1), при котором снижение FRET означает двусторонний транспорт белка между сборками. Получали белковые ансамбли белка рефлектина, которые содержали равное количество белка, меченного либо акцептором-флуорофором, либо донором-флуорофором. Эти меченые рефлектиновые сборки разбавляли раствором, содержащим немеченые рефлектиновые сборки, и анализировали динамический обмен белком между сборками в зависимости от возраста сборки. Этот метод отличает непрерывное образование кинетически остановленных белковых кластеров от динамических кластеров, включая, но не ограничиваясь метастабильными кластерами, кластерами, которые растут за счет созревания по Оствальду или аналогичными процессами укрупнения, кластерами, которые растут путем слияния, и кластерами, которые не являются промежуточными продуктами для LLPS. Он не только различает эти различные механизмы динамического обмена, для чего требуются ортогональные методы, такие как динамическое рассеяние света, анализ отслеживания наночастиц (NTA) и анализы Брэдфорда19,21. В данном протоколе описаны методы очистки рефантина А1 дикого типа и одиночного цистеинсодержащего мутанта A1-C232S, ковалентное мечение A1-C232S и анализ разведения FRET.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Очистка белка и ковалентное мечение

  1. Преобразование
    1. Клонирование генов рефлектина A1 и рефлектина A1 C232S (GenBank KF661517.1) в плазмиды pj411.
    2. Трансфектация клеток Rosetta 2 (DE3) плазмидами с использованием терапии тепловым шоком28.
    3. Планшет трансфицировал клетки на агар, содержащий 50 мкг/мл канамицина.
    4. Выберите изолированную колонию и добавьте к 5 мл TB (Terrific Broth), содержащего 50 мкг/мл канамицина, и инкубируйте при 37°C в шейкере при 250 об/мин в течение ночи.
    5. Изолируйте плазмиды с помощью протокола набора для выделения плазмид для секвенирования.
  2. Экспрессия белка, лизис и очищение организма при включении
    1. Добавьте 5 мл культуры к 1 л LB (бульон лизогении) с 50 мкг/мл канамицина и инкубируйте при 37°C во время встряхивания. При А600 0,6-0,7 индуцировать экспрессию путем добавления IPTG (изопропил-β-D-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 5 мМ.
    2. Через 16 ч грануляторы центрифугировали при 12 000 x g в течение 10 мин. Сцеживайте надосадочную жидкость и гранулы морозильной камеры в морозильной камере при температуре -80°C.
    3. Лизируйте клетки и очищайте тела включения с помощью реагента для очистки тел включения в соответствии с протоколом производителя, включая 20-минутную обработку 1 мкл (25-29 единиц) бензоназы и 3-5 KU лизоцима на мл реагента для очистки тел включения после первоначальной ресуспензии клеточной гранулы. Очищенные тела включения будут выглядеть как темно-коричневые гранулы.
  3. FPLC (быстрая белковая жидкостная хроматография)
    1. Приготовьте 2 л мочевины 8 М: 5% v/v раствор уксусной кислоты (буфер А) и 1 л 8 М гуанидиния гидрохлорида: 5% v/v раствор уксусной кислоты (буфер В). Отфильтруйте оба фильтра с помощью вакуумного фильтра 0,22 мкм.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте вдыхания, контакта с глазами и кожей гидрохлорида гуанидиния и надевайте надлежащие СИЗ (средства индивидуальной защиты) при обращении. Утилизируйте в специальный контейнер для отходов.
    2. Ресуспендируйте гранулы тела включения в 8 М мочевины: 5% раствор уксусной кислоты путем энергичного перемешивания с помощью магнитной мешалки. Раствор покажется мутным. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C, центрифугуйте при 18 000 x g при 4 °C в течение 70 минут и соберите надосадочную жидкость для FPLC. Надосадочная жидкость будет казаться коричневой и прозрачной.
    3. Используя скорость потока 2 мл/мин для всех последующих этапов, уравновесьте 10 мл катионобменной колонки с 5 объемами колонок (CV) 95% буфера А, 5% буфера В и загрузите образец. Промойте несвязанный образец 5 CV, затем выполните ступенчатый градиент: 5 CV 94% буфера A/6% буфера B, затем 5 CV 10% буфера B. Рефлектин A1 элюирует при 10% буфере B.
    4. Оцените чистоту дробей, соответствующую первоначальному шагу изменения на 10% буфера B с помощью SDS-PAGE и пула, если она аналогична. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C и сконцентрируйте фракции до конечного объема 4-5 мл с помощью центрифуги MWCO емкостью 15 мл 10 кДа.
  4. ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография)
    1. Приготовьте 2 л 18 мОм воды с 0,1% трифторуксусной кислотой (ТЖК) и 2 л ацетонитрила с 0,1% ТФК. Отфильтруйте оба фильтра с помощью вакуумного фильтра 0,22 мкм.
      ВНИМАНИЕ: ТЖК - это сильная дымящаяся кислота. Работать в вытяжном шкафу, надев соответствующие СИЗ, и переносить только с помощью стекла. Избегайте вдыхания, контакта с ацетонитрилом в глаза и на кожу и используйте надлежащие СИЗ при обращении. Утилизируйте в специальный контейнер для отходов.
    2. Используя скорость потока 1 мл/мин для всех последующих этапов, уравновесьте колонку C4 5 CV 85% воды 18 мОм, 0,1% TFA, и 15% ацетонитрила, 0,1% TFA.
    3. Начните подачу и введите образец. Протекает 2 CV, затем начинается постоянный градиент до 80% ацетонитрила, 0,1% TFA в течение 5 CV. Рефантин A1 обычно элюируется при 73% ацетонитриле.
    4. Фракции в скорлупе, содержащие белок рефлектин, в пробирках объемом 5 мл с использованием этанола и ванны с сухим льдом. Лиофилизировать, и хранить при температуре -80 °C. Белок проявится в виде тонких белых листов.
  5. Приготовление немеченого белкового бульона
    1. Приготовьте 4 л буфера pH 4, 25 мМ уксусной кислоты (21,05 мМ уксусной кислоты, 3,95 мМ тригидрата ацетата натрия) с использованием ледяной уксусной кислоты и тригидрата ацетата натрия. При необходимости отрегулируйте pH с помощью 4 М HCl или 4 М NaOH. Фильтруйте с помощью вакуумного фильтра 0,22 мкм.
      ВНИМАНИЕ: Работайте с сильными кислотами/основаниями в соответствующих СИЗ. Никогда не добавляйте воду в концентрированную сильную кислоту или основание.
    2. Разморозьте пробирку, содержащую лиофилизированный белок рефлектин, и с помощью пробирки на ледяной бане растворите с рН 4, 25 мМ буфер уксусной кислоты. Полностью растворимый раствор белка будет выглядеть бесцветным, без видимого помутнения или осадка.
      1. Используя диализную кассету с молекулярной массой 10 кДа, диализ резолибилизированный белок рефлектина в 1000-кратном объеме образца pH 4, 25 мМ буфер уксусной кислоты предварительно охлажден до 4 °C с использованием двух 12-часовых изменений при 4 °C.
    3. Разбавляют образец буфером уксусной кислоты pH 4,25 мМ до получения конечной концентрации белка 100 мкМ и конечного объема не менее 150 мкл. С помощью УФ-ВИД спектрометра измерьте поглощение на длине волны 280 нм и используйте молярный коэффициент поглощения29 рефантина А1 (123 685 М-1 см-1) для определения концентрации белка.
    4. Переложите запас белка рефлектина в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл с защелкивающейся крышкой и храните при температуре 4 °C до 7 дней. Непосредственно перед экспериментами центрифугируйте белковый запас рефлектина при температуре 4 °C в предварительно охлажденной микроцентрифуге при давлении 18 000 x g в течение 15 минут. Аналогично приготовьте рефлекторин А1 C232S, используя молярный коэффициент поглощения 123,540 М-1 см-1.
  6. Мечение белков
    1. Отдельно приготовьте запасы 10 мг/мл FMTS (флуоресцеин-метанитиосульфонат) и SRMT (сульфодаминметанитиосульфонат), добавив 1 мл сухого диметилсульфоксида (ДМСО) во флакон, содержащий 10 мг флуоресцентного зонда и смеси пипетки.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте ингаляций, контакта с реагентами метанетиосульфоната в глаза и на кожу.
    2. Добавьте 7,7 мкл 10 мг/мл FMTS или 10,4 мкл 10 мг/мл SRMT в буфер уксусной кислоты pH 4, 25 мМ до конечного объема 150 мкл и конечной концентрации 500 мкМ FMTS или SRMT. Раствор покажется мутным. Аликвотируйте и заморозьте оставшуюся часть запасов флуоресцентного зонда при температуре -80 °C.
    3. Смешайте со 150 мкл 100 мкМ белкового запаса рефлектина и тщательно перемешайте пипеткой. Конечная концентрация белка составляет 50 мкМ, а конечная концентрация флуоресцентного зонда — 500 мкМ. Помутнение раствора снизится.
    4. Заверните в фольгу и выдерживайте в вертикальном положении при осторожном орбитальном перемешивании при комнатной температуре в течение 4 часов, затем на ночь при 4 °C. Помутнение раствора не должно меняться.
    5. Если присутствует осадок, восстановите суспендию путем энергичного перемешивания пипетками. Раствор будет мутным. Концентрат рефлектина с помощью центробежного фильтра MWCO с током 10 000 кДа до целевого объема 100 мкл и концентрации 150 мкМ.
    6. Используйте тот же метод ВЭЖХ и лиофилизации, что и для очистки белка, чтобы удалить несвязанный флуоресцентный зонд и хранить белок при температуре -80 °C, завернутым в фольгу. Повторно растворите меченый белок, используя тот же метод для немеченого белка. Определите степень маркировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резолюбилизированный флуоресцентно меченый белок рефлекторина будет выглядеть желто-зеленым (C199-F) или темно-красным (C199-R) без мутности или осадков.
  7. Приготовление белкового сырья с совместной маркировкой
    1. Добавьте 27 мкл 100 мкМ белка A1 в микроцентрифугу объемом 0,5 мл с защелкивающейся крышкой.
    2. Добавьте 1,5 мкл меченого флуоресцеином рефлекторина A1-C232S (называемого C199-F для обозначения аминокислотного положения флуоресцеина) в ту же пробирку.
    3. Добавьте в ту же пробирку 1,5 мкл меченого сульфогодамином рефлектина A1-C232S (называемого C199-R для обозначения аминокислотного положения флуоресцеина). Конечные концентрации составляют 90 мкМ A1, 5 мкМ C199-F и 5 мкМ C199-R.
    4. Завернуть в фольгу и хранить при температуре 4 °C до 7 дней.

2. Временные ряды FRET

  1. Подготовка буферов и фильтрация
    1. Приготовьте 500 мл 25 мл буфера 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS). Отрегулируйте pH раствора до 7, медленно добавляя 4 М гидроксида натрия. Отфильтруйте 10 мл с помощью шприца объемом 10 мл и шприцевого фильтра 0,22 мкм.
  2. Центрифугирование белка
    1. Предварительно охладите настольную микроцентрифугу до 4 °C. Центрифуга без маркировки и с совместным мечением представляет запасы рефлектина А1 при 18 000 х г в течение 15 мин при 4°С.
  3. Подготовка помеченных сборок A1
    1. Чтобы приготовить три реплики, пипетку напижите 9,6 мкл буфера MOPS (pH 7, 25 мМ) в три микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл с защелкивающимися крышками.
    2. Добавьте 0,4 мкл меченого белкового сырья в каждую пробирку, уже содержащую 9,6 мкл буфера MOPS, до конечной концентрации белка 4 мкм. Медленно перемешайте пипетку дважды, отсасывая и дозируя весь объем образца.
    3. Сразу же заверните в жестяную фольгу и поместите в инкубатор при температуре 25 °C. Этот и все последующие растворы узлов не имеют видимого помутнения или осадка до или после инкубации.
  4. Подготовка сборок A1 без меток
    1. Чтобы приготовить три реплики, пипетку объемом 38,4 мкл буфера MOPS в три микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл с защелкивающимися крышками.
    2. Добавьте 1,6 мкл белкового запаса рефлектина А1 в каждую пробирку, уже содержащую 38,4 мкл буфера MOPS, до конечной концентрации белка 4 мкМ. Медленно перемешайте пипетку дважды, отсасывая и дозируя весь объем образца.
    3. Сразу же заверните в жестяную фольгу и поместите в инкубатор при температуре 25 °C.
  5. Синхронизация и смешивание сборок формата А1 с совмещенной и немаркированной маркировкой
    1. Порядок приготовления сборок следующий: одновременно и по отдельности подготовьте сборки из экспериментального одного совместно меченого рефлектина и экспериментального немеченого рефлектина. Повторите шаги 2.3 и 2.4.
    2. Перемешайте, добавив 40 мкл немаркированной сборки A1 экспериментальной к 10 мкл соответствующей экспериментальной модели с совмещенной меткой, и осторожно перемешайте пипеткой, дважды аспирируя и дозируя весь объем. Измерения будут выполнены через 24 часа после этого шага.
    3. Возрастом сборки является время между закачкой сборки рефантина А1 путем разбавления в буфер MOPS (pH 7, 25 мМ) и смешиванием меченых и немеченых сборок. Возраст сборок, использованный для этих данных: 0 мин, 1 мин, 10 мин, 30 мин, 60 мин, 120 мин, 180 мин, 540 мин, 1080 мин и 1620 мин.
  6. Рычаги управления
    1. Положительный контроль
      1. Из А1 и меченых белковых запасов приготовьте 20 мкл белкового запаса, который представляет собой 80 мкМ А1 и 20 мкМ совместно меченых белковых запасов.
      2. Добавьте 38,4 мкл буфера MOPS в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл с защелкивающейся крышкой, затем добавьте 1,6 мкл меченого белка 80 мкМ A1/20 μМ и дважды смешайте пипетки, медленно отсасывая и дозируя весь объем. Немедленно накрыть пленкой и поместить в инкубатор при температуре 25 °C. Повторите для получения в общей сложности 9 образцов.
    2. Негативный контроль
      1. Добавьте 0,4 мкл маркированного материала в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл с защелкивающейся крышкой, уже содержащую 9,6 мкл буфера MOPS. Медленно перемешайте пипетку дважды, отсасывая и дозируя весь объем образца.
      2. Добавьте 40 мкл буфера MOPS и дважды добавьте смесь для дозаторов, отсасывая и дозируя весь объем образца. Немедленно накрыть пленкой и поместить в инкубатор при температуре 25 °C. Повторите для получения в общей сложности 9 образцов.
  7. Заготовка кюветы и буфера
    1. Установите флуориметр на возбуждение на длине волны 488 нм и зарегистрируйте непрерывные спектры с длиной волны 520-700 нм.
    2. Заполните чистую кварцевую кювету субмикрофлуориметра 50 μл буфера MOPS (pH 7, 25 mM) и измерьте.
    3. Удалите буфер.
  8. Экспериментальная методика
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты должны быть зарегистрированы через 24 часа после смешивания совместно меченых и немеченных сборок рефлектина А1. Аккуратно нанесите пипеткой 50 мкл экспериментального раствора в кювету и отмерьте.
    1. Извлеките образец, промойте буфером 500 мкл уксусной кислоты, затем 500 мкл 0,22 мкм - отфильтрованной водой 18 мОм. Выполните очистку буфера.
  9. Рычаги управления
    1. Измеряйте через 1440 мин, 1960 мин и 3060 мин после подготовки элементов управления (что соответствует возрасту сборки 0 мин, 520 мин и 1620 мин). Эти измерения завершают экспериментальную часть протокола.

3. Анализ данных

  1. Вычтите спектры заготовки буфера из экспериментальных спектров.
  2. Определите соотношение Em588/Em520.
  3. Затем для каждой реплики определите среднее значение и стандартное отклонение каждой группы из трех реплик. График Em588/Em520 в зависимости от возраста сборки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После разбавления сборок рефлектора А1, содержащих как донорский флуорофор-меченый белок, так и акцепторный флуорофор-меченный белок, с немечеными рефлекторными ассамблями А1, наблюдалось первоначальное снижение эмиссии FRET на длине волны 588 нм по сравнению с неразбавленными сборками (рис. 2А). FRET для сборок возрастом 0 мин был аналогичен положительному контролю, а FRET для сборок с возрастом 1620 мин (время между формированием сборки и смешиванием немеченных и меченых рефлектиновых сбор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общей точкой потери белка во время очистки является неполная ресуспендия гранул тела включения на всех этапах протокола очистки тела включения, а также окончательная ресуспендия очищенных тел включения в 8 М мочевине 5% v/v уксусной кислоте. Ресолюбилизация тела включения может занять до 24 часов энергичного перемешивания с помощью небольшой магнитной мешалки в конической пробирке объемом 40 мл. Чтобы избежать значительных потерь белка в фильтрах, фильтрация, предшествующая FPLC и HPLC, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование было поддержано Институтом совместных биотехнологий в рамках грантов W911NF-19-2-0026 и W911NF-23-1-0330 от Исследовательского управления армии США. Содержание информации не обязательно отражает позицию или политику правительства, и не следует делать вывод об официальном одобрении.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 μ Емкость микропипетки L
2 μ Емкость микропипетки L
2-[(5-флуоресцеинил)аминокарбонил]этилметантиосульфонатСанта Крус БиотехнологииСК-216155CAS  351330-42-2
20 μ Емкость микропипетки L
200 μ Емкость микропипетки L
3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота, 4-морфолинпропансульфоновая кислотаСигма-ОлдричМ1254КАС 1132-61-2
Уксусная кислотаСигма-ОлдричА6283КАС 64-19-7
АцетонитрилСигма-Олдрич34851-1ЛКАС 75-05-8
Порошок агараКаролина Биджиал842133КАС 9002-18-0
Алюминиевая фольга
Центробежный фильтр Amicon Ultra, 10 кДа MWCOМиллипора СигмаUFC501008Емкость 0,5 мл
Центробежный фильтр Amicon Ultra, 10 кДа MWCOМиллипора СигмаUFC901008Емкость 15 мл
аналитические весы
БензоназаМиллипор-Сигма70664-3КАС 9025-65-4
BugBuster Реагент для экстракции белкаМиллипора Сигма70584-3
Флуоресцентный спектрометр Кэри ЭклипсКэри-Эклипс
Программное обеспечение Cary Eclipse
Центрифужные пробирки Corning 50 млМиллипор-СигмаCLS430829
Одноразовые шприцы, Luer-Lok 10 млКоул-ПармерUX-12915-02
ДМСОСигма-ОлдричД8418КАС 67-68-5
Сухой лед
Система FPLC с двумя насосами
Система ВЭЖХ с двумя насосами
ЭтанолМиллипора СигмаХХ0280-3КАС 64-17-5
Напольный ротор центрифуги емкостью флакона 500 мл
Напольная центрифуга 
Морозильная камера, -80° C
Вытяжной шкаф
Гидрохлорид гуанидинаТермо СайентиалAAA135430B50-01-1
Колонка катионитобменной хроматографии HiTrap SP HPЦитива17115101
Соляная кислотаСигма-Олдрич258148-25МЛКАС 7647-01-0
Инкубатор
Изопропил &бета;-D-1-тиогалактопиранозидСигма-ОлдричИ6758-1Г
Канамицина сульфатСигма-ОлдричК1637КАС 25389-94-0
Лиофилизатор
ЛизоцимТермо Сайентиал90082
Магнитная мешалка
Магнитная мешалка
Микро pH-электрод S7Метлер Толедо51343160
Микроцентрифуга с контролем температуры
Шприцевой фильтр Millex PVDFМногородностьSLGVR33RS0,22 μ m, диаметр 33 мм.
Фильтр Milli-Q MillipakМиллипора СигмаMPGP002A1
Система очистки воды Milli-Q UltraPureМиллипора Сигма
NaClТермо СайентиалAA12314A9КАС 7647-14-5
Бутылки для центрифуг Nalgene, модель 3120Миллипор-СигмаБ1283-4ЭАДля гранулирования бактерий
Орбитальная лаборатория  Шейкер с инкубатором
ПК
Чашки ПетриСигма-ОлдричП5731-500ЭА
Плазмида PJ411ДНК 2.0
Белок LoBind  Конические трубкиЭппендорфEP30108302Емкость 5 мл
Белок LoBind  Микроцентрифужные пробиркиЭппендорфEP022431102Емкость 0,5 мл
Колба Эрленмейера Pyrex с перегородками 1 000 млМиллипор-СигмаCLS44501Для инкубации бактериальных культур
Стаканы Pyrex Griffin 2 000 млМиллипор-СигмаCLS10002LДля всех буферов и приготовлений растворов;
Круглые бутылки для хранения носителей Pyrex 1 000 млМиллипор-СигмаCLS13951LДля хранения всего буфера и приготовленного раствора используйте вакуумные фильтры для колб
Qiaprep Spin Мини-набор для подготовкиЦягэн27104
Холодильник
Компетентные ячейки Rosetta 2(DE3)Новаген71397-3
Кассеты для диализа 10K MWCOТермо СайентиалPI66383Емкость 0,5 мл
Тригидрат ацетата натрияСигма-ОлдричС8625КАС 6131-90-4
Гидроксид натрияСигма-Олдрич567530-250ГМКАС 1310-73-2
Вакуумный фильтр Steritop с верхним флакономМиллипора СигмаS2GPT05RE0,22 μ m стерильный фильтр
Субмикрокювета, емкость 50 мклЯчейки Starna16.40F-Q-10/Z15
сульфогодамина метантиосульфонатСанта Крус БиотехнологииСК-220172CAS  386229-71-6
Трифторуксусная кислотаСигма-Олдрич106232-25ГКАС 407-25-0
ТриптонSpectrum Chemical Т1333
МочевинаТермо СайентиалAAA123600EКАС 57-13-6
УФ-ВИД спектрометр
Дрожжевой экстрактGibco211929

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeMartini, D. G., Izumi, M., Weaver, A. T., Pandolfi, E., Morse, D. E. Structures, organization, and function of reflectin proteins in dynamically tunable reflective cells. J Biol Chem. 290 (24), 15238-15249 (2015).
  2. Izumi, M., et al. Changes in reflectin protein phosphorylation are associated with dynamic iridescence in squid. J R Soc Interface. 7 (44), 549-560 (2010).
  3. Tao, A. R., et al. The role of protein assembly in dynamically tunable bio-optical tissues. Biomaterials. 31 (5), 793-801 (2010).
  4. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Optical parameters of the tunable Bragg reflectors in squid. J R Soc Interface. 10 (85), 20130386(2013).
  5. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Experimental determination of refractive index of condensed reflectin in squid iridocytes. J R Soc Interface. 11 (95), 20140106(2014).
  6. Ghoshal, A., Eck, E., Gordon, M., Morse, D. E. Wavelength-specific forward scattering of light by Bragg-reflective iridocytes in giant clams. J R Soc Interface. 13 (120), 20160285(2016).
  7. Mäthger, L. M., Collins, T. F. T., Lima, P. A. The role of muscarinic receptors and intracellular Ca2+ in the spectral reflectivity changes of squid iridophores. J Exp Biol. 207 (11), 1759-1769 (2004).
  8. Morse, D. E., Taxon, E. Reflectin needs its intensity amplifier: Realizing the potential of tunable structural biophotonics. Appl Phys Lett. 117 (22), 220501(2020).
  9. Hanlon, R. T., Cooper, K. M., Budelmann, B. U., Pappas, T. C. Physiological color change in squid iridophores. Cell Tissue Res. 259, 3-14 (1990).
  10. Levenson, R., et al. Calibration between trigger and color: Neutralization of a genetically encoded coulombic switch and dynamic arrest precisely tune reflectin assembly. J Biol Chem. 294 (45), 16804-16815 (2019).
  11. Levenson, R., Bracken, C., Bush, N., Morse, D. E. Cyclable condensation and hierarchical assembly of metastable reflectin proteins, the drivers of tunable biophotonics. J Biol Chem. 291 (8), 4058-4068 (2016).
  12. Levenson, R., et al. Protein charge neutralization is the proximate driver dynamically tuning a nanoscale Bragg reflector. bioRxiv. 9, (2021).
  13. Tobin, C. M., et al. Reversible and size-controlled assembly of reflectin proteins using a charged azobenzene photoswitch. Chem Sci. 15, 13279-13289 (2024).
  14. Loke, J. J., Hoon, S., Miserez, A. Cephalopod-mimetic tunable photonic coatings assembled from quasi-monodispersed reflectin protein nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 14 (18), 21436-21452 (2022).
  15. Kramer, R. M., Crookes-Goodson, W. J., Naik, R. R. The self-organizing properties of squid reflectin protein. Nat Mater. 6 (7), 533-538 (2007).
  16. Xu, C., Stiubianu, G. T., Gorodetsky, A. A. Adaptive infrared-reflecting systems inspired by cephalopods. Science. 359 (6383), 1495-1500 (2018).
  17. Ordinario, D. D., et al. Bulk protonic conductivity in a cephalopod structural protein. Nat Chem. 6 (7), 596-602 (2014).
  18. Ordinario, D. D., et al. Protochromic devices from a cephalopod structural protein. Adv Opt Mater. 5 (20), 1600751(2017).
  19. Gordon, R., et al. Charge screening and hydrophobicity drive progressive assembly and liquid-liquid phase separation of reflectin protein. J Biol Chem. 301 (3), 108277(2025).
  20. Bracha, D., Walls, M. T., Brangwynne, C. P. Probing and engineering liquid-phase organelles. Nat Biotechnol. 37 (12), 1435-1445 (2019).
  21. Kar, M., et al. Phase separating RNA binding proteins form heterogeneous distributions of clusters in subsaturated solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2202222119(2022).
  22. Lan, C., et al. Quantitative real-time in-cell imaging reveals heterogeneous clusters of proteins prior to condensation. Nat Commun. 14 (1), 4831(2023).
  23. Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346(2010).
  24. Gibaud, T., Schurtenberger, P. A closer look at arrested spinodal decomposition in protein solutions. J Phys Condens Matter. 21 (32), 322201(2009).
  25. Cardinaux, F., Gibaud, T., Stradner, A., Schurtenberger, P. Interplay between spinodal decomposition and glass formation in proteins exhibiting short-range attractions. Phys Rev Lett. 99 (11), 118301(2007).
  26. Sciortino, F., Mossa, S., Zaccarelli, E., Tartaglia, P. Equilibrium cluster phases and low-density arrested disordered states: The role of short-range attraction and long-range repulsion. Phys Rev Lett. 93 (5), 055701(2004).
  27. Segrè, P., Prasad, V., Schofield, A., Weitz, D. Glass-like kinetic arrest at the colloidal-gelation transition. Phys Rev Lett. 86 (26), 6042-6045 (2001).
  28. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  29. Gill, S. C., Von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
  30. Lychko, I., Soares, C. L., Dias, A. M. G. C., Roque, A. C. A. A scalable method to purify reflectins from inclusion bodies. Sep Purif Technol. 315, 123736(2023).
  31. Berliner, L. J., Grunwald, J., Hankovszky, H. O., Hideg, K. A novel reversible thiol-specific spin label: Papain active site labeling and inhibition. Anal Biochem. 119 (2), 450-455 (1982).
  32. Kenyon, G. L., Bruice, T. W. Novel sulfhydryl reagents. Methods Enzymol. 47, 407-430 (1977).
  33. Renault, K., Fredy, J. W., Renard, P. Y., Sabot, C. Covalent modification of biomolecules through maleimide-based labeling strategies. Bioconjug Chem. 29 (8), 2497-2513 (2018).
  34. Northrop, B. H., Frayne, S. H., Choudhary, U. Thiol-maleimide "click" chemistry: Evaluating the influence of solvent, initiator, and thiol on the reaction mechanism, kinetics, and selectivity. Polym Chem. 6 (18), 3415-3430 (2015).
  35. Stauffer, D. A., Karlin, A. Electrostatic potential of the acetylcholine binding sites in the nicotinic receptor probed by reactions of binding-site cysteines with charged methanethiosulfonates. Biochemistry. 33 (22), 6840-6849 (1994).
  36. Bressloff, P. C. Active suppression of Ostwald ripening: Beyond mean-field theory. Phys Rev E. 101 (4), 042804(2020).
  37. Berry, J., Brangwynne, C. P., Haataja, M. Physical principles of intracellular organization via active and passive phase transitions. Rep Prog Phys. 81 (4), 046601(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

A1

Похожие статьи