Методическая статья

Мышиная мезентериальная лимфаденэктомия для селективного нарушения лимфатической коммуникации с регионально-специфическим кишечником

DOI:

10.3791/68696

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Section of Rheumatology, Yale University, 4Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает процедуру выживаемости при безопасной и хорошо переносимой мышиной мезентериальной лимфаденэктомии на каждой из четырёх станций вдоль цепи брыжейковых лимфатических узлов. Эта процедура адаптируется для селективного нарушения лимфатической коммуникации с дистальной кишкой, проксимальной кишкой и/или тонкой кишкой.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунонадзор против толерантности к антигенам — это тонкий баланс в микросреде кишечника, в ходе которого критически важная роль циркулирующего Т-клеточного прайминга в локальных лимфатических узлах хорошо известна. После прайминга Т-клеток недавняя литература начала демонстрировать уникальную, неизбыточную роль нециркулирующих Т-клеток, проживающих в дренирующем лимфатическом узле органа. Это особенно характерно для кишечника, где лимфодренаж известен своей высокой специфичностью. Однако, чтобы по-настоящему понять уникальное влияние этих локальных клеток по сравнению с системной функциональной избыточностью, научному сообществу необходима хорошо описанная процедура по выделению и селективному воздействию этих узлов. Здесь описана процедура выживаемости при безопасной и хорошо переносимой мышиной мезентериальной лимфаденэктомии на каждой из четырёх станций цепи брыжейковых лимфатических узлов. Эта процедура адаптируется для селективного нарушения лимфатической коммуникации с дистальной кишкой, проксимальной кишкой и/или тонкой кишкой. Включены подробные инструкции, наглядные пособия, полезные советы для улучшения успеха и устранение неполадок при неоптимальном выживании. Удаленные лимфатические узлы немедленно готовы к дальнейшей обработке, если это необходимо. Эта техника лучше всего подходит для исследований, требующих селективного нарушения лимфодренажа из дистального отдела толстой кишки, проксимальной кишки и/или тонкого кишечника.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Т-клетки являются одним из основных типов эффекторных клеток адаптивного иммунитета, с описанными ролями в различных категориях заболеваний, включая инфекции, аутоиммунность излокачественность 1,2,3. Критическим шагом для функционирования Т-клеток является трёхфазное прайминг антиген-презентирующими клетками внутри вторичных лимфатических органов, таких как локальныелимфатические узлы 4. В современной медицине основой правильной онкологической резекции в нескольких органах является определённая степень локального отбора проб или резекция лимфатических узловв блоке 5,6,7,8. Например, при раке толстой кишки консенсусные рекомендации рекомендуют удалять и обследовать 12 лимфатических узлов с целью лечебной резекции из-за явной корреляции с улучшением долгосрочнойвыживаемости 6,7. Однако можно ли действительно безнаказанно резецировать локальные лимфатические узлы? Недавние исследования на мышах показали, что лимфатический узел с дренажем опухоли содержит резервуар прекурсоров противоопухолевых Т-клеток, которые могут быть защищены от терминальной дифференцировки и истощения Т-клеток, возникающих в микросредеопухоли 9,10,11. Это указывает на то, что удаление такой критической популяции может ослабить возможности иммунного надзора.

У мышей известно, что паттерн дренажа кишечника лимфы довольно специализирован вдоль цепи брыжейных лимфатических узлов; например, проксимальная кишка почти исключительно дренируется первым лимфатическим узлом, тонкий кишечник — второй/третьей станцией, а дистальная кишка преимущественно четвёртой лимфатическойстанцией 12 (рисунок 1, дополнительный рисунок 1). Таким образом, прямая связь между сегментами кишечника и лимфатических органов может быть нарушена при целенаправленной абляции этих узлов. Для блокировки трафика между лимфатическими узлами и тканями часто используются агонисты рецепторов S1P, такие как FTY720, а также блокада интегрина; Однако эти препараты в целом подавляют трафик и поэтому не могут быть использованы для изучения вклада специфических лимфатическихузлов 13,14. Однако возможности широкого научного сообщества изучать локальное влияние иммунных взаимодействий внутри лимфатических узлов кишечника ограничены отсутствием хорошо описанной хирургической резекции для каждой станции. С учётом этого пробела была разработана процедура выживаемости при мышиной мезентериальной лимфаденэктомии на каждой узловой станции, которая описана здесь. Общая цель этой процедуры — обеспечить безопасное и надёжное удаление мезентериальных лимфатических узлов у мышей с высокой выживаемостью и толерантностью после операции.

Эта процедура была протестирована и легко выполняется у молодых и взрослых мышей по нескольким штаммам (например, Balb/c, C57BL/6J, 129S4), но ограничена необходимостью доступных и легко идентифицируемых лимфатических узлов. Поэтому его может быть неудобно сочетать с мышиными моделями или генотипами с меньшими или незаметными лимфатическими узлами (например, мыши с дефицитом лимфотоксина альфа)15. Кроме того, у пожилых мышей (>15 недель) обычно более висцеральная жирность, что усложняет идентификацию и изоляцию лимфоузлов, и хотя это не является противопоказанием, оно может ограничивать успех или процедуру. Помимо этих ограничений, мезентериальная лимфаденэктомия обеспечивает строго контролируемое и избирательное возмущение лимфатических узлов. Эта процедура лучше всего подходит для выявления вопросов о локальном воздействии лимфатических узлов и связанных с ними иммунных клеток, а также взаимодействиях на сегменты кишечника (например, проксимальная кишка, дистальная часть толстой кишки, тонкий кишечник).

figure-introduction-1
Рис. 1: Анатомические ориентиры станций в цепи мезентериальных лимфатических узлов. (A) Немаркированное и (B) помеченное изображение четырёх основных мезентерических лимфатических узлов in situ. Проксимальный дренаж кишки преимущественно осуществляется через станцию 1, тонкий кишечник преимущественно занимает позицию 2/3, а дистальный отдел кишки — преимущественно станцию 4. (DC= дистальная кишка, ICV= илеоколические сосуды, PC= проксимальная кишка, CEC= кекума, IV/JV= подвздошные сосуды/еюнальные сосуды, SI= тонкий кишечник). Масштабные полосы: 1,5 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры выполняются в соответствии с протоколами Комитета по уходу и использованию животных Йельского института. Для разработки этой процедуры использовались 8-12-недельный штам C57BL/6, дикие мыши и фальшивые контрольные методы с сопоставлением возраста/пола/генотипов. Были включены как самцы, так и самки мышей. Вес тела варьировался от 18 до 25 г. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка инструментов, животных и операционной

  1. Стерилизуйте все хирургические инструменты. Убедитесь, что рабочая поверхность и носовой конус анестетика очищены 70% этанолом.
  2. Настройте аппарат для испаривания с ингаляционным анестетиком с носовым конусом и отсасыванием для избыточного удаления анестетика. Создайте рабочую поверхность с теплой водой для поддержания температуры тела и запасов животных в удобном, стерильном месте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура не требует операционного микроскопа; однако рассмотрите возможность включения этого инструмента для улучшения визуализации.
  3. Индуцировать анестезию путём введения 2%-3% ингаляционного изофлурана с потоком кислорода 2 л/мин через носовой конус из ингаляционного анестетика-вапорайзера (согласно утверждённым институциональными протоколами).
    1. Убедите соответствующую плоскость анестезии, подтвердив частоту дыхания примерно 30-40 вдохов в минуту и отсутствие реакции на защемление задней стопы. Периодически проверяйте подходящую плоскость анестезии и соответственно корректируйте расход изофлурана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы также подходит инъекционный анестетик.
  4. Следуйте рекомендациям института по адекватному обезболиванию и местной анестезии. Например, введите длительное действие обезболивающего, например 3,25 мг/кг бупренорфина XR, подкожно, и введите до 0,04 мл/5 г раствора лидокаина с массой тела 1 мг/мл в запланированном разрезе.
  5. Подготовьте животное к процедуре, расположив лежащее на спине, нанеся смазку для глаз, выщипьте или обрезайте брюшную шерсть и стерилизуйте брюшную полость раствором повидона/йода, затем введите 70% этанола (рисунок 2A).
  6. Используйте стерильные перчатки и наденьте стерильные шторы на животное с окном в операционное поле. Сохраняйте стерильность на протяжении всей процедуры.

figure-protocol-1
Рис. 2: Репрезентативные изображения основных процедурных этапов в мезентериальной лимфаденэктомии. (A) Выщипнутое и стерилизованное брюшное окно. (B) Разрез 0,5 см через кожу и linea alba. (C) Обнажение цепочки мезентериального лимфатического узла путём ориентации подвздошной части вправо, проксимальной толстой кишки влево, а слепой кельмы — внизу. Первый мезентериальный лимфатический узел расположен вдоль илеоколической артерии (белая стрелка). (D) Удален мезентериальный лимфатический узел (выцветшая стрела). Полосы чешуи: 0,5 см (E) Экс виво мезентериальный лимфатический узел (белая стрелка; 2,5 мм x 3 мм). Тики = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Подготовка к мезентериальной лимфаденэктомии

  1. Сделайте разрез по центральной линии 0,5-1 см через кожу. Грубо рассеките кожу от брюшной стенки и определите linea alba. Сделайте разрез 0,5–1 см через linea alba, чтобы получить доступ к брюшной полости (рисунок 4B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы улучшить доступ к узлам станции 2/3/4, рассмотрите возможность удлинения разреза, но не превзойдя хрящевую ксифовидную отросток.
  2. Введите 1 мл стерильного физиологического раствора по температуре тела в брюшинную полость с помощью тупой игли с наконечником и увлажните стерильные шторы в подготовке к позиционированию кишечника. Используйте стерильные, увлажнённые палочки с ватным наконечником, чтобы определить и выпотрошить грудь через разрез.
    1. Избегайте использования острых инструментов для работы с кишечником, так как это может привести к травмам. Периодически увлажняйте шторы и кишечник, чтобы предотвратить высыхание повреждений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиный слепой мозг обычно находится в левом нижнем квадранте брюшка, но может находиться в любом квадранте.
  3. Уточните целевую станцию мезентериального лимфатического узла для резекции и следуйте конкретным инструкциям ниже (например, 3.1-3.4). См. рисунок 1A,B для анатомических ориентиров и идентификации.

3. Диссекция и удаление медитерических лимфатических узлов

  1. Первая станция лимфатических узлов (дренаж проксимальной толстой кишки; Дополнительный рисунок 1A, B').
    1. Ориентируйте экстерьерный кишечник на увлажнённые шторы, сверху сверху, проксимальную кишку сверху, а терминальную подвздошную сторону справа хирурга (левая сторона животного; Рисунок 1A, рисунок 2C).
    2. Определите цепь мезентериального лимфатического узла, которая проходит продоль толстой кишки. Используя наклонные щипцы с тонкими концами, грубо разрезайте первую станцию лимфатического узла от илеоколических сосудов, поместив закрытые щипцы между ними и позволяя щипцам мягко открыться.
      1. Снимите щипцы и повторите этот манёвр 2-3 раза или пока не создадётся достаточный плоский для безопасного удаления. Избегайте повреждения основных сосудов толстой кишки (рисунок 3A,B).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается значительное кровотечение, прервите процедуру и гуманно усыпите животное (согласно утверждённым институциональными протоколами).
    3. ПО ЖЕЛАНИЮ: Чтобы снизить теоретический риск появления сопутствующих узлов, выполните необязательное перевязывание швами с одинарными прерванными швами вдоль цепи лимфатического узла (один 1 мм дистально и один 1 мм проксимально от первого лимфатического узла) с использованием 9-0 чёрного монофиламентного нейлонового шва и тонко наконечных щипцов для пробивания иглы (рисунок 3C,D).
    4. Аккуратно оттяните лигированный лимфатический вузел и с помощью тонких ножниц вырезать целевую лимфатическую станцию от головного к хвосту (рисунок 3E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Часто у мышей есть небольшой, но видимый кормовой сосуд, отходящий от илеоколической артерии в заднюю часть лимфатического узла. Кровотечение из этого сосуда можно контролировать мягким давлением ватным тампоном до достижения гемостаза.

figure-protocol-2
Рис. 3: Аннотированные кадры и комментарии по мезентериальной лимфаденэктомии (первая станция). (A) Правильная ориентация кишечника обнажает первую станцию брыжейного лимфатического узла (белая стрелка). (B) Между илеоколической артерией (голубой стрелой) и узлом образуется плоскость. (C) Швовое перевязывание питательных сосудов, входящих в вершину лимфатического узла (синяя стрелка), выполняется при исключении илеоколических сосудов путем выхода из пространства между этими структурами (белая стрелка). (D) Выполняется швовое перевязывание основания лимфатического узла, снова отмечая и избегая дистальных ветвей илеоколической артерии. (E) Узел вырезается вдоль ранее сформированной тканевой плоскости, остаётся высоко к лимфатическому узлу и оставляет швные перевязки (чёрные стрелки). (F) Гемостаз подтверждается, наблюдаются дистальные ветви илеоколической артерии для обеспечения правильного кровотока, а пустое пространство (выцветшая стрелка), где ранее жил узел, отмечено как свободное от остаточного узла. Масштабные полосы: 0,5 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Вторая станция лимфатических узлов (средне-дистальный дренаж тонкого кишечника)
    1. Аккуратно выпотрошите тонкий кишечник. Ориентируйте наружное кишечник на увлажнённые шторы, при этом сверху сверху — проксимальная кишка, а тонкий кишечник — справа от хирурга (левая сторона животного; Рисунок 1A).
    2. Определите цепь мезентериального лимфатического узла, которая проходит продоль толстой кишки. Вторая станция начинается в месте слияния илеальных/жеюнальных сосудов (рисунок 1B).
      1. Используя наклонные щипцы с тонкими концами, грубо разрезайте второй лимфатический узел в стороне от сосудов толстой кишки, поместив закрытые щипцы в промежутке между этими структурами и позволяя щипцам мягко открыться.
      2. Снимите щипцы и повторите этот манёвр 2-3 раза или пока не создадётся достаточный плоский для безопасного удаления. Избегайте повреждения основных сосудов толстой кишки. Также обратите особое внимание на подвздочечные и еюнальные сосуды, которые будут вредны при повреждении.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается значительное кровотечение, прервите процедуру и гуманно усыпьте животное.
    3. ПО ЖЕЛАНИЮ: Чтобы снизить теоретический риск появления сопутствующих узлов, выполните необязательное перевязывание швами с одноразовыми прерывистыми швами вдоль цепи лимфатического узла (один 1 мм дистально, другой 1 мм проксимально от второго лимфатического узла) с использованием чёрного монофиламентного нейлонового шва 9-0 и тонко наконечных щипцев для введения иглы (Дополнительный рисунок 2A).
    4. Аккуратно оттяните перевязанный лимфатический узел и с помощью тонких ножниц вырезать целевую лимфатическую станцию от головного узла к хвосту (дополнительный рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Часто у мышей есть небольшой, но видимый кормовой сосуд, отходящий от илеоколической артерии в заднюю часть лимфатического узла. Кровотечение из этого сосуда можно контролировать мягким давлением ватным тампоном до достижения гемостаза.
  2. Второй и третий лимфатические узлы (прокс-средне-дистальный дренаж тонкого кишечника; Дополнительная рисунок 1C,D'
    1. Аккуратно выпотрошить всю тонкую кишку до точки заднего привязывания (связка Трейца). Ориентируйте наружное кишечник на увлажнённые шторы, при этом сверху сверху — проксимальная кишка, а тонкий кишечник — справа от хирурга (левая сторона животного; Рисунок 1A).
    2. Определите цепь мезентериального лимфатического узла, которая проходит продоль толстой кишки. Вторая станция начинается в месте слияния илеальных/жеюнальных сосудов (рисунок 1B).
      1. Используя наклонные щипцы с тонким концем, тупо разрезайте второй и третий лимфатические узлы от сосудов толстой кишки, размещая закрытые щипцы между ними и позволяя им мягко открываться.
      2. Снимите щипцы и повторите этот манёвр 2-3 раза или пока не создадётся достаточный плоский для безопасного удаления. Избегайте повреждения основных сосудов толстой кишки. Также обратите особое внимание на подвздочечные и еюнальные сосуды, которые будут вредны при повреждении.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается значительное кровотечение, прервите процедуру и гуманно усыпьте животное.
    3. ПО ЖЕЛАНИЮ: Чтобы снизить теоретический риск появления коллатеральных узлов, выполните дополнительную перевязку швами с одинарными прерванными швами вдоль цепи лимфатического узла (обычно один 1 мм дистальной, два 1 мм латерально и один 1 мм проксимально к второй/третьей лимфоузловой станции) с использованием 9-0 чёрного монофиламентного нейлона и тонко наконечных щипцов для вращения иглы (Дополнительная рисунок 3B, C).
      1. Обратите внимание на афферентные лимфатические тракты, которые расположены поверхностно по отношению к подвздошно-еюнальным сосудистым пучкам (дополнительный рисунок 3B). Будьте осторожны при том, чтобы швы перевязывались глубоко в лимфатические органы и поверхностно проходили к крупным сосудистым структурам, так как повреждение подвздошных/еюнальных сосудистых пучков будет негативным.
    4. Аккуратно оттяните перевязанные лимфатические станции в голове и, используя тонкие или сверхтонкие наконечные ножницы, вырезайте целевые станции лимфатических узлов от хвоста до головы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тем как продолжить, убедитесь, что тонкий кишечник остаётся розовым и хорошо пропущенным. Случайное перевязывание подвздошных/джеюнальных сосудов приводит к ишемической тонкой кишке.
  3. Четвёртая лимфатическая станция (дистальный дренаж толстой кишки; Дополнительный рисунок 1E,F')
    1. Аккуратно выпотрошить всю тонкую кишку до точки заднего привязывания (связка Трейца). Ориентируйте наружное кишечник на увлажнённые шторы, при этом сверху сверху — проксимальная кишка, а тонкий кишечник — справа от хирурга (левая сторона животного; Рисунок 1A).
    2. Определите цепь мезентериального лимфатического узла, которая проходит продоль толстой кишки. Четвёртая станция расположена чуть ближе к дистальной толстой кишке и латерально от третьей станции (рисунок 1B, рисунок 4A).
      1. Используя наклонные тонкие щипцы или сверхтонкие ножницы, грубо разрезайте четвёртую лимфатическую станцию от сосудов толстой кишки и окружающего жира, поместив закрытые щипцы/ножницы между этими структурами и позволяя пинцетам мягко открываться.
      2. Уберите щипцы/ножницы и повторите этот манёвр 2-3 раза или пока не будет создана достаточная плоскость для безопасного вырезания. Избегайте повреждения основных сосудов толстой кишки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается значительное кровотечение, прервите процедуру и гуманно усыпьте животное.
    3. ПО ЖЕЛАНИЮ: Чтобы снизить теоретический риск появления сопутствующих узлов, выполните необязательное перевязывание швами с одинарными прерванными швами на каждом идентифицируемом лимфатическом узле (обычно в 1 мм от узла) с использованием чёрного монофиламентного нейлона 9-0 и тонкоконечных щипцов для введения иглы (рисунок 4B - D).
    4. Аккуратно оттяните перевязанные лимфатические станции в голове и, используя сверхтонкие ножницы, вырезать целевую лимфатическую станцию от хвоста до головного узла (рисунок 4D,E).

figure-protocol-3
Рис. 4: Аннотированные кадры и комментарии по мезентериальной лимфаденэктомии (четвёртая станция). (A) Правильная ориентация кишечника обнажает четвёртую шмезентериальную лимфатическую станцию (белые стрелки) медиально от дистальной толстой кишки и латерально от третьей станции. (B,C) После тупого вскрытия узловой станции на каждом идентифицируемом узле выполняется швовое перевязывание (чёрная стрелка), обеспечивая включение всех сосудов для питания лимфатических узлов (синие стрелки). (D) Узел удаляется по ранее созданной тканевой плоскости, оставаясь высоко ближе к лимфатическим узлам и оставляя за собой швы (чёрные стрелки). (E) После удаления узловой станции (белые стрелки) подтверждается гемостаз, видны швы (чёрные стрелки), а пустое пространство (выцветшие стрелки), где ранее находился узел, отмечается как свободное от остаточного узла. Масштабные полосы: 0,2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Завершение мезентериальной лимфаденэктомии

  1. Наблюдайте за дистальными ветвями илеоколических сосудов, подвздошных сосудов и/или еюнальных сосудов, чтобы обеспечить целое кровоснабжение. Хорошо пропущенное кишечник ярко-розовый с видимыми пульсациями.
    1. Используя мазки с ватным наконечником, возвращайте содержимое брюшной полости в брюшинную полость. Перед возвращением удалите все осколки хлопка, ворса, драпира или шва из кишечника, так как это может привести к дополнительному хирургическому воспалению.
    2. Убедитесь, что кишечник не скручивается на брыжей, убедившись, что он остаётся ярким/розовым (с перфузией), а не тусклой/серой/фиолетовой (ишемический).
  2. Введите 1 мл стерильного физиологического раствора при температуре тела непосредственно перед закрытием живота, чтобы восполнить нечувствительную потерю/испарение жидкости. Закройте брюшко в два слоя (брюшную стенку и кожу) монофиламентным полипропиленовым швом 6-0 в беговом порядке.
  3. Нанесите стерильный хирургический клей на рану.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы для закрытия кожи можно использовать прерванные швы или зажимы для ран.

5. Послеоперационный уход

  1. Переместите животное в чистую клетку, которая наполовину на тёплой воде с доступом к корму и воде.
  2. Дайте животному восстановиться после анестезии и внимательно следите за признаками дискомфорта. Если животные не восстанавливаются своевременно после наркоза с соответствующими поведениями (например, учащённой частотой дыхания, самовосстановление, ходьба, уход), гуманно усыпьте животное.
  3. Когда все животные восстановятся после анестезии, возвращайте клетки в центр ухода за животными с доступом к воде, еде, подстилкам и материалам для обогащения ad libium.
  4. Оценивайте мышей после операции каждые 12 часов в течение 3 дней на наличие признаков боли или дискомфорта (например, сутулость, снижение активности, снижение вовлечённости, плохой уход). Гуманно усыплять мышей с признаками стресса.
  5. Если используете постоянный шов (например, монофиламентный полипропилен 6-0), осмотрите разрезы на 10-й день после операции и удалите остатки швов.

6. Обработка лимфатических узлов

  1. Немедленно проведите тест на плавучость, поместив удаленную ткань в микроцентрифугную пробирку объемом 1,5 мл с 500 мкл фосфат-буферного физиологического раствора (PBS). Подтвердите удаление лимфатического узла, наблюдая опускание ткани в PBS по сравнению с случайно резецированным жиром, который будет плавать (рисунок 5A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Станции с удаленными лимфатическими узлами немедленно готовы к дальнейшей обработке.
  2. Для техники с живыми клетками помещайте удаленные лимфатические узлы в среду для клеточной культуры (например, DMEM, RPMI) или PBS на льду. Для планируемой гистологии поместите вырезанные лимфатические узлы в фиксационный режим (например, 10% нейтрально буферированный формалин, 4% параформальдегид).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для подтверждения точности этой процедуры были проведены мезентериальные лимфаденэктомии на одиннадцати 4-6 недельных, возрастных, половых и генотипных родственников из штамма C57BL/6J. Время процедуры составляло от 5 до 15 минут на мышь. Все мыши хорошо переносили процедуру, обеспечивая 100% периоперационную выживаемость. Вырезанные образцы были помещены в PBS на льду. Все образцы сразу же погрузились, что подтвердило низкое содержание жира. Вырезанные образцы (и четыре отдельных висцер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описана процедура выживаемости при безопасной и хорошо переносимой мышиной мезентериальной лимфаденэктомии на каждой из четырёх узловых станций. Основным ограничением этой процедуры является косвенная связь между воздействием и прогрессированием лимфатических узлов вдоль брыжейной цепи. Первая станция лимфатических узлов легко и легко обнажается полностью. Вторая станция лимфатических узлов часто видна, а воздействие на 2–4-й станции можно улучшить, удлинив ра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Р.А.Ф. является советником компаний GlaxoSmithKline, Plythera Inc. и Ventus Therapeutics. Все остальные авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы выражаем признательность Дж. Олдерману, Б. Кадугану, Э. Хьюз-Пикару и Дж. Хорроксу за административную помощь, а также К. Хьюзу за управление колониями мышей. H.N.B. является стипендиатом Программы подготовки хирургов Йельского университета, которая частично финансировала и поддерживала этот проект. Эта работа также была профинансирована Медицинским институтом Говарда Хьюза (к R.A.F.) и Премией ординаторов Американского колледжа хирургов (H.N.B.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анестезиологический контурЛюбойИли инъекционный анестетик
Проточный цитометр BD LSRII (или его эквивалент)BD BiosciencesОснащён программным обеспечением FACS Diva (для проточной цитометрии) и nbsp;
Бупренорфин XRЛюбойДля обезболивающей
Среда клеточной культуры Любой(для техники живых клеток; то есть DMEM или RPMI)
DAPIБиолегенда422801Рабочая концентрация: 15 мкг/мл
Этанол (70% в воде)ЛюбойДля уборки
FITC-конъюгированный антимышиный CD45.2 (104)Биолегенда109806Рабочая концентрация: 5 мкг/мл
Щипцы: щипцы с углом с мелким концомРобозRS-5058Материал: Дюдоксель; Узор #5, угол 45 градусов; размер наконечника 0,1 x 0,06 мм
Щипцы: щипцы с тонким наконечникомРобозRS-4960Материал: Dumostar; Выкройка #1; Размер наконечника: 0,20 x 0,12 мм
Щипцы: щипцы с тонким наконечникомРобозRS-4966Материал: Dumostar, совет по биологии; Выкройка #3; Размер наконечника: 0,08 x 0,04 мм
ЛидокаинЛюбойДля обезболивающей
Металлическая вводная иглаЛюбойМногоразовая игла с прямой ротовой вводной иглой калибра 20/22, нержавеющая сталь.
Игольчатые драйверыРобозRS-6410Держатель для игл Castroviejo; Стрейт
OPTIONAL:      Двойные/двойные светодиодные лампы с микроскопом с гусиной шеейЛюбой
OPTIONAL: Evans Blue красительSigmaE2129-10GДля опционального трассировки лимфы.
OPTIONAL: Рабочий микроскопLeicaMZ9.5Стереоголовочный микроскоп Leica Mz9.5
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Любой
Раствор повидона/йодаЛюбойДля подготовки/стерилизации кожи
Ножницы: Очень тонкие ножницыРобозRS-5605Макферсон-Ваннас; 3 мм режущей кромки; изогнутый (для узлов 3/4 станции)
Ножницы: Ножницы с тонким наконечникомРобозRS-5650SCSurecut Castroviejo scissors (для узлов станции 1/2/3)
Ножницы: средние ножницыРобозRS-5676Нойес; режущая кромка 13 мм; Прямая
Хирургический клейЛюбойКлей для тканей 3M Vetbond
Шов: 6-0 синий монофиламент полипропиленексЛюбой
Шв: чёрный монофиламентный нейлоновый шов 9-0Любой(по выбору) Можно также использовать чуть более крупный 8-0 Размер шва.
Фиксатор тканейЛюбой(для планируемой гистологии; то есть 10% нейтрального буферизованного формалина или 4% параформальдегида)
Тепловодная циркуляционная грелкаЛюбой

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chopp, L., Redmond, C., O'shea, J. J., Schwartz, D. M. From thymus to tissues and tumor: A review of T cell biology. J Allergy Clin Immunol. 151 (1), 81-97 (2023).
  2. Rouiz-Argüelles, A. Autoimmunity: From bench to bedside. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).
  3. Crespo, J., Sun, H., Welling, T. H., Tian, Z., Zou, W. T cell anergy, exhaustion, senescence, and stemness in the tumor microenvironment. Curr Opin Immunol. 25 (2), 214-221 (2013).
  4. Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
  5. Divi, V., et al. Lymph node count from neck dissection predicts mortality in head and neck cancer. J Clin Oncol. 34 (32), 3892-3897 (2016).
  6. Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: Systematic review. JNCI. 99 (6), 433-441 (2007).
  7. Simoes, P., et al. Lymph node yield in the pathological staging of resected nonmetastatic colon cancer: The more the better. Surg Oncol. 43, 101806(2022).
  8. Resio, B. J., et al. Commission on cancer standards for lymph node sampling and oncologic outcomes after lung resection. Ann Thorac Surg. 119 (2), 308-315 (2025).
  9. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like CD8 T cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836(2021).
  10. Saddawi-Konefka, R., et al. Lymphatic-preserving treatment sequencing with immune checkpoint inhibition unleashes cdc1-dependent antitumor immunity in HNSCC. Nat Commun. 13, 4298(2022).
  11. Saddawi-Konefka, R., Schokrpur, S., Gutkind, J. S. Let it be: Preserving tumor-draining lymph nodes in the era of immuno-oncology. Cancer Cell. 42 (6), 930-933 (2024).
  12. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  13. Brinkmann, V., Pinschewer, D., Chiba, K., Feng, L. Fty720: A novel transplantation drug that modulates lymphocyte traffic rather than activation. Trends Pharmacol Sci. 21 (2), 49-52 (2000).
  14. Mehandru, S., Colombel, J. -F., Juarez, J., Bugni, J., Lindsay, J. O. Understanding the molecular mechanisms of anti-trafficking therapies and their clinical relevance in inflammatory bowel disease. Mucosal Immunol. 16 (6), 859-870 (2023).
  15. Mariathasan, S., et al. Absence of lymph nodes in lymphotoxin-alpha (lt alpha)-deficient mice is due to abnormal organ development, not defective lymphocyte migration. J Inflam. 45 (1), 72-78 (1995).
  16. Kwon, S., Agollah, G. D., Wu, G., Sevick-Muraca, E. M. Spatio-temporal changes of lymphatic contractility and drainage patterns following lymphadenectomy in mice. PLoS One. 9 (8), e106034(2014).
  17. Blum, K. S., Proulx, S. T., Luciani, P., Leroux, J. -C., Detmar, M. Dynamics of lymphatic regeneration and flow patterns after lymph node dissection. Breast Cancer Res Treat. 139 (1), 81-86 (2013).
  18. Shaikh, H., et al. Mesenteric lymph node transplantation in mice to study immune responses of the gastrointestinal tract. Front Immunol. 12, 689896(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD45

Похожие статьи