Здесь мы представляем метод сбора большого объема крови у свиней с помощью чрескожной внутрисердечной канюляции, подключенной к вакуумному насосу, в качестве терминальной процедуры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Забор крови у свиней в больших объемах для применения in vitro : использование внутрисердечной канюляции и вакуумного насоса в качестве терминальной процедуры
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Рутинный забор крови требуется во многих фундаментальных и прикладных исследованиях. Хорошо описаны различные методы сбора крови свиней. К ним относятся использование ушных вен для сбора небольших объемов крови, а яремных вен или полой вены черепа — для сбора больших объемов крови. Некоторые эксперименты требуют больших объемов крови от одного отдельного животного за один раз для анализа или использования в первичных клеточных культурах, что лучше всего может быть достигнуто путем обескровливания. Кровь, собранная для первичной клеточной культуры, должна быть свежей и тщательно обработанной для поддержания клеточной целостности. Мы описываем метод асептического забора крови у свиней под хирургической плоскостью анестезии с использованием большого внутрисосудистого катетера стилета, вводимого чрескожно в сердце, и вакуумного насоса, который эффективен, обеспечивает большой выход и сводит к минимуму лизис клеток. Эта техника выполняется один раз на животном, в хирургической плоскости анестезии, в качестве терминальной процедуры, обеспечивая минимальный риск боли или дистресса.
Введение
Свиньи использовались в исследованиях, начиная от сердечно-сосудистых исследований и заканчивая заживлением ран и токсикологией, а также исследованиями в области сельского хозяйства, иммунологии и болезней1. Кровь, собранная в ходе исследований, может быть использована для изучения заболеваний, фармакологии, генетики, исследований иммунной системы и открытия биомаркеров. Культивирование клеток является одной из самых основных процедур в исследованиях и позволяет исследователям изучать поведение и функции клеток, а также модели заболеванийи разработку вакцин. Культивирование болезнетворных патогенов, таких как вирус африканской чумы свиней, часто проводится в заранее определенной питательной среде в строгих асептических лабораторных условиях. Размножение болезни может происходить путем инвазии, распространения или прикрепления, для чего требуются здоровые, стабильные клетки3. Изученные патогены могут иметь специфический клеточный тропизм, в котором они могут размножаться, а наличие большого объема крови дает большее количество клеток для использования.
Для достижения высокого выхода клеток от отдельного животного, для клеточной дифференцировки необходимо аккуратно собрать большой объем крови для поддержания целостности клеток до разделения клеток. У свиней общий объем крови может быть рассчитан на уровне 65 мл/кг 4,5. По нашему опыту при сборе большого объема, можно восстановить около половины общего объема крови животного. Поэтому у крупных взрослых свиней, весом до 600 фунтов (273 кг), возможен выход 6-8 л. У свиней большие объемы крови могут быть собраны чрескожно из черепной полой вены, наружной яремной вены, подкожной вены через канюляцию или сердца 4,5,6. Тем не менее, забор внутрисердечной крови с помощью канюли большого диаметра позволяет эффективно собрать наибольший объем крови с минимальным риском лизиса клеток. В качестве терминальной процедуры это должно быть выполнено под хирургической плоскостью анестезии5. В данной статье описан способ использования вакуумного насоса для сбора нескольких литров крови у свиней с использованием чрескожного доступа к сердцу с помощью большого катетера для внутривенного введения, соединенного с вакуумным насосом 7,8.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию Midwest Veterinary Services Inc. Поскольку основным методом эвтаназии во время этой процедуры является обескровливание, ожидается, что у некоторых свиней произойдет остановка сердца из-за потери крови. Когда это происходит, проводится вторичный метод эвтаназии, такой как двусторонняя торакотомия. После того, как собран необходимый объем крови, если есть пальпируемое сердцебиение, шприц с раствором эвтаназии присоединяют к стилету и вводят внутрисердечно в качестве первичного метода эвтаназии, за которым следует вторичный физический метод. Свиньи содержатся в соответствии с Руководством по уходу за сельскохозяйственными животными и их использованию в научных исследованиях и обучении, Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию и Законом о защите животных, в зависимости от обстоятельств.
1. Подготовка материалов и животных (Таблица материалов и Рисунок 1А-В)
- Соберите трубку на соломинку из нержавеющей стали и прикрепите конец шланга к пузырьковой трубке.
- Прикрепите трубку к роликовой бутылке с помощью резиновой пробки с двумя неровными металлическими соломинками и стеклянной бутылки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стекло препятствует разрушению контейнера, создаваемому вакуумным насосом, но можно использовать любой материал, который не разрушается под давлением. - Асептически закапывайте 10 мл гепарина натрия (1000 USP/мл) через аспирационную трубку и катетерный стилет для предотвращения свертывания. Асептически добавьте 50 мл гепарина натрия (1000 USP/мл) в каждый флакон с роликом для достижения конечной концентрации 50 МЕ/мл в каждом литре крови и предотвращения свертывания крови во время сбора. Убедитесь, что вакуумный насос настроен на потребление не более 7 фунтов, чтобы предотвратить повреждение элементов.
2. Анестезия и позиционирование животного
- Взвесьте животное не более чем за 24 ч до начала процедуры, чтобы рассчитать необходимую дозу анестезиологического комбинированного препарата.
- Введите телазол (3,0-5,0 мг/кг), кетамин (8-12 мг/кг) и ксилазин (4,0-6,0 мг/кг) внутримышечно в шею или другие крупные мышцы живота (например, эпаксиальные мышцы) с помощью набора удлинителей 30 дюймов и иглы 18 г x 1,5 дюйма, чтобы вызвать глубокую анестезию.
ПРИМЕЧАНИЕ: У крупных свиней максимальный рекомендуемый объем внутримышечной инъекции составляет 10 мл, поэтомуможет потребоваться смена места после каждых 10 мл введения. Хотя мы выбрали этот коктейль, эта процедура может быть выполнена в соответствии с любым одобренным IACUC протоколом анестезии, который создает хирургическую плоскость анестезии. - Как только будет подтверждено, что животное находится в хирургической плоскости анестезии (~5-8 мин), не проявляя пальпебрального рефлекса, слабого тонуса челюсти и реакции на болевые стимулы, поместите свинью на подъемный стол, пол или другую плоскую поверхность в правом боковом положении лежа.
- Подстригите волосы на грудной клетке, расположенной над сердцем, при необходимости, возле четвертого и пятого межреберья, как раз каудально до точки локтя.
- Если это возможно, используйте ультразвуковое исследование (рисунок 2A) для определения левого желудочка. При отсутствии возможности левый желудочек располагается ближе всего к четвертому или пятому межреберному пространству медиально к точке максимального импульса8.
- Асептически протрите область марлевыми губками размером 4 x 4 дюйма, смоченными в 2% хлоргексидиновом скрабе, и марлевыми губками размером 4 x 4 дюйма, смоченными в 70% изопропиловом спирте. Подготовьте кожу, скрабируя круговым способом, начиная с точки инъекции и вращаясь наружу, минимум 3 раза, чередуя два дезинфицирующих средства.
3. Забор внутрисердечной крови
- Убедитесь, что животное осталось в хирургической плоскости анестезии, проверив пальпебральный рефлекс, тонус челюсти и педальный рефлекс.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверяйте глубину анестезии, а также частоту сердечных сокращений и дыхания на протяжении всей процедуры, чтобы убедиться, что животное остается в хирургической плоскости анестезии. - Извлеките стилет из внутривенного катетера. Поместите стилет на левый желудочек и продвинуте его перпендикулярно коже, чтобы ввести стилет в левый желудочек (рисунок 2B). Когда кровь начнет пульсировать из стилета, прикрепите его к концевому соединителю шланга из пузырьковой трубки, который прикреплен к роликовой бутылке, а затем включите вакуумный насос (Рисунок 1A и Рисунок 2C).
- Убедитесь, что кровь течет ровным потоком. По мере того, как кровь втягивается в роликовый флакон, осторожно поворачивайте флакон, чтобы кровь могла смешаться с антикоагулянтом и предотвратить образование тромбов.
- После того, как будет собран 1 л крови, с помощью гемостатика, зажмите пузырьковую трубку рядом с роликовым флаконом. Отсоедините резиновую пробку и приложите ее к следующей бутылке с роликом. Снимите кровоостанавливающее средство и дайте крови свободно течь, осторожно вращая роликовый флакон.
- Продолжайте этот процесс до тех пор, пока не будет собрана необходимая кровь. После этого зажмите трубку, чтобы предотвратить избыток крови, и выключите насос.
- Снимите соединитель трубки со стилета катетера и прикрепите к стилету натриевый пентобарбитальный шприц. Оттяните шприц назад, чтобы убедиться в наличии вспышки крови, затем введите раствор для эвтаназии. Подтвердить смерть можно по отсутствию сердцебиения, дыхания, мышечного тонуса и рефлексов. Как только смерть подтвердится, извлеките иглу из сердца и поместите в контейнер для острых предметов.
- Выбросьте пузырьковые трубки в контейнер для биологических отходов. Удалите грубую кровь с остальных предметов из нержавеющей стали (например, соломинок из нержавеющей стали, соединителей на концах шлангов) с помощью трубчатой щетки, а затем автоклав для использования в будущем.
- Поместите очищенные резиновые пробки, соломинки, концевые соединители шланга и гемостатики в новый автоклавный пакет и простерилизуйте перед следующим использованием.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Перед забором крови свиноматки подвергали предварительному скринингу на Mycoplasma hyopneumoniae, аденовирус свиней, парвовирус свиней, коронавирусы свиней (трансмиссивный гастроэнтерит, эпидемическая диарея свиней), гемоагглютинирующий энцефаломиелит свиней, репродуктивный и респираторный синдром свиней, грипп группы А, цирковирус 1 и 2 и вирус сенеки А. Мы повторяли эту процедуру несколько раз на самках йоркширских свиноматок весом 300-600 фунтов. Забор крови составил от 3 л у...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Описанная здесь методика представляет собой комбинацию катетер-стилет и вакуумного насоса для сбора единовременного большого объема крови из сердца свиноматок. Из-за потенциальной боли и стресса эту процедуру следует выполнять только у животных, которые находятся в хирургической плоскости анестезии. Неподвижность от наркоза позволяет освоить эту процедуру новичкам и быстро освоить. Для сбора крови у животных можно использовать несколько вен. Наиболее распространенными и доступными путями...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Мы хотим особенно поблагодарить отделение ресурсов для животных Центра болезней животных острова Плам, как Animal Health Techs, так и Animal Care за отличную техническую помощь. Финансирование проекта в контрактной исследовательской организации было предоставлено USDA, ARS, Animal Resources Unit в NBAF.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1/8 HP Lab Model Diaphragm pump – 115 переменного тока, максимум 60 psi | Базовый центр снабжения | 80058845 | |
| 10 G x 6 в катетере над иглой | Covetrus North American Veterinary Supplies | 024616 | |
| Шприц 50 мл, замок Luer и bbsp; | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
| Aquasonic 100 ультразвуковой гель синий и bbsp; | Midwest Veterinary Supply | 001.02109.2 | |
| Аргильская пузырчатая трубка, непроводящая (¼ ") | Fisher Scientific | NC2282605 (Каталог поставщика # 8888280412) | |
| Хлоргексидин Q-скраб 2% | Midwest Veterinary Supply | 562.30804.3 | |
| одноразовые роликовые бутылки Corning. | Fisher Scientific | 06-413 | |
| Corning PYREX узко-горло для прочного стекла Erlenmeyer или аналогичное создавающее всасывание | Fisher Scientific | 10-040F | |
| Нейлоновая щётка для пробирок Eisco | Fisher Scientific | S13962 | |
| Двухотверсные резиновые пробки Fisherbrand | Fisher Scientific | Зависит от размера | |
| Кетамин (10 мг/мл) | Midwest Veterinary Supply | 275.22100.3 | |
| MLL до конца шланга 6 мм (нержавеющая сталь) | Cadence Science | 6547IND | |
| MLL до конца шланга 8 мм (нержавеющая сталь) | Cadence Science | 6549IND | |
| MVet марлевая губка не тканая 4 x 4 4 ply | Midwest Veterinary Supply | 000.30156.2 | |
| MVet изопропиловый спирт 70% | Midwest Veterinary Supply | 000.50054.3 | |
| MVet Kelly гемостатические щипцы прямые 5.5" | Midwest Veterinary Supply | 000.36800.2 | |
| Гепарин натрия (1000 U/mL) | Midwest Veterinary Supply | 191.46701.3 | |
| Пентобарбитал натрия (390 мг/мл) | Midwest Veterinary Supply | 749.20000.3 | |
| Трубочки из нержавеющей стали | Hobby Lobby | 1893635 | |
| Телазол (100 мг/мл) | Midwest Veterinary Supply | 275.40000.3 | |
| Ксилазин (100 мг/мл) | Midwest Veterinary Supply | 310.01150.3 |
Ссылки
- Almond, G. W. Research applications using pigs. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 12 (3), 707-716 (1996).
- Sageritz, C. P., Vallier, L. Cell culture. Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , 151-172 (2017).
- Mothes, W., Sherer, N. M., Jin, J., Zhong, P. Virus cell-to-cell transmission. Virol. J. 84 (17), 8360-8368 (2010).
- Stærk, K., Langhorn, L., Palarasah, Y., Andersen, T. E. A method for collecting high numbers of blood samples in standard vacuum tubes from non-heparinized pigs. Lab Anim. 57 (3), 336-340 (2023).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Schwartz, W. L., Smallwood, J. E. Collection of blood from swine. N Z Vet J. 25 (9), 237-238 (1977).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. J Vis Exp. (130), e55852(2017).
- Calvert, G. D., Scott, P. J., Sharpe, D. N. Percutaneous cardiac puncture in domestic pigs. Aust Vet J. 53 (7), 337-339 (1977).
- Costea, R., Ioana, E., Pavel, E. Pig sedation and anesthesia for medical research. J Animals. 13 (24), 3807(2023).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3: Appendix 3B. , (2001).
- Veterinary ergonomic guidelines. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/veterinary-ergonomic-guidelines (2025).
- Velazquez-Salinas, L., et al. Confirming the absence of parental African swine fever virus as a potential contaminant of recombinant live attenuated ASF vaccines. Biologicals. 83, 101685(2023).
- Soleimani, S. A review of the establishment of the seed lot system in the production of biological products and its importance. Arch Razi Inst. 77 (6), 2023-2035 (2022).
- Anil, M. H., Whittington, P. E., McKinstry, J. L. The effect of the sticking method on the welfare of slaughter pigs. Meat Sci. 55 (3), 315-319 (2000).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
