Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Неинвазивное эндотрахеальное введение липополисахарида для индуцирования острого поражения лёгких у грызунов

771 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68700

⸱

5 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pharmacology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), Ghaziabad-201002, India

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании неинвазивная эндотрахеальная инстилляция показала форму ALI у крыс с использованием базового ларингоскопа для обеспечения точной доставки LPS в лёгкие. ЛПС вводится через эндотрахеальную трубку с помощью ларингоскопа. Степень повреждения лёгких оценивается в нескольких временных точках.

Аннотация

Острая травма лёгких (ALI) — это угрожающее жизни воспалительное состояние, характеризующееся артериальной гипоксемией, альвеолярным отёком, нарушением целостности эпителиально-эндотелиального капиллярного барьера, а затем инфильтрацией воспалительных клеток в ткань лёгких, часто переходящим в более тяжёлую форму — острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), который часто заканчивается острой дыхательной недостаточностью. Модели мышей ALI, в основном индуцированные липополисахаридом (LPS), являются ключевым инструментом в исследованиях, направленных на понимание механизмов воспаления лёгких и его терапевтических средств. Прямые и косвенные модели поражения лёгких у грызунов имеют как преимущества, так и ограничения, особенно в плане выживаемости, продолжительности фазы воспаления и устранения, риска хирургических травм и инфекций. В настоящем исследовании была использована неинвазивная техника эндотрахеальной инстилляции для разработки прямой модели ALI у крыс. Эта техника обеспечивает целенаправленную доставку ЛПС или тестового материала в лёгкие через эндотрахеальный канал с помощью базового ларингоскопа. Процедура начинается с анестезии крысы и её положения в полулежащее положение. Затем раствор LPS вводится возле отверстия трахеи с помощью шприца, прикреплённого к эндотрахеальной трубке крысы. В момент завершения эксперимента собираются образцы лёгких или промывания для оценки параметров воспалительных веществ и архитектуры лёгких. Эта техника превосходит другие модели по скорости, специфичности и надёжности, обеспечивая специфическое нацеление с минимальным повреждением тканей, низким риском смертности и незначительным воспалением вне участка. Этот метод особенно ценен в доклинических исследованиях ALI, ОРДС и связанных с ними состояний, таких как анафилаксия или остановка сердца. По сравнению с этим, этот метод больше интегрируется с современными методами визуализации, такими как интравитальная микроскопия, для мониторинга распределения лекарств и прогрессирования заболевания в реальном времени.

Введение

Острое поражение лёгких (ALI) — это угрожающее жизни воспалительное состояние, характеризующееся артериальной гипоксемией, отёком лёгких, нарушением целостности эндотелиально-эпителиального барьера и массивной инфильтрацией иммунных клеток влегкие 1. Патофизиология ALI сложна и включает взаимодействие и нарушение множества перекрывающихся и взаимодействующих путей, таких как свертываемость, повреждение тканей, а также воспаление лёгочных и системных. Своевременное подавление этого воспалительного ответа крайне важно для восстановления гомеостаза тканей. Если не лечить, это быстро прогрессирующее заболевание часто переходит в острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) — более тяжёлое состояние, характеризующееся рефрактерной гипоксемией. Патогенез ALI связан с повреждением лёгких, повреждением или гибелью эпителиальных клеток альвеолярных и микроваскулярных эндотелиальныхклеток 1,2,3,4.

Этиология, ответственная за ALI/ARDS, включает широкий спектр инфекционных и неинфекционных агентов, возникающих как из прямых, так и косвенных источников поврежденийлегких 5. Прямые причины включаютпневмонию 6, близкую кутоплению 7, аспирациюжелудка 8, вдыхание токсинов, таких какхлорный газ 9, бактериальнуюинфекцию 10 и вирусную инфекцию, например SARS-CoV-2 11,12,13,14. Косвенные причины происходят из системных процессов, которые вторично влияют на лёгкие, включаясепсис 15,травму 16, панкреатит17, передозировку препаратами и переливаниякрови 18.

Основная цель этого метода — создать воспроизводимую и неинвазивную модель ALI у грызунов посредством эндотрахеального введения эндотоксина. Обоснование разработки этой техники связано с ограничениями традиционных методов доставки. Эта техника была продемонстрирована с целью достижения точной прямой доставки в альвеолы лёгких, минимизации системного воздействия и превращения в перспективу для будущих целевых лёгочных терапий. Интраназальная инстилляция представляет ряд проблем, некоторые из которых могут существенно повлиять на результаты исследования, такие как плохое таргетирование глубоких областей лёгких и дыхательная вариабельность среди животных19. Другие факторы, такие как ограниченный объём дозы и возможное раздражение носа, менее критичны, но могут влиять на консистенцию. Для сравнения, введение эндотрахея обеспечивает более точную и прямую доставку в нижние дыхательные пути, обеспечивая лучшее нацеливание лёгких и равномерность дозировки с минимальной вариабельностью между животными, делая этот путь более эффективным и надёжным при воздействиилёгких 20. Ингаляционный путь имеет клиническую значимость благодаря своей неинвазивной природе, но также связан с определёнными ограничениями в доклинических исследованиях, такими как потеря препаратов в верхних дыхательных путях и снижение эффективности в поражении дистальных областей лёгких. Эти ограничения становятся более выраженными в тяжелых моделях, включая травмы от двойного удара или генетически модифицированных моделей с мышами, которые выбиваются или выбиваются из строя. В отличие от этого, эндотрахеальное введение обеспечивает большую согласованность прямой доставки препарата в нижние дыхательные пути, минимизируя потерю и обеспечивая эффективное таргетирование в сложных доклиническихмоделях 21. Ещё одним важным методом введения, используемым в доклинических исследованиях, является инвазивная внутритрахеальная доставка. Хотя это эффективно, оно связано с риском хирургического стресса, инфекции, изменений показаний и необходимостью поддержаниятемпературы 22. В отличие от этого, эндотрахеальный метод предлагает надёжную неинвазивную альтернативу, что делает его идеальным для исследований с повторными оценками в течение длительного наблюдения.

Этот метод можно применять на животных моделях, выходящих за пределы ALI, включая астму, лёгочный фиброз, ХОБЛ, пневмонию и инфекционные заболевания лёгких. Он также актуален в доклинических исследованиях, таких как анафилаксия, остановка сердца и сердечные аритмии. Стоит отметить, что эндотрахеальный метод уже установлен в клинической практике для введения определённых препаратов, в зависимости от срочности и клиническогосценария 23,24,25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все институциональные и CPCSEA рекомендации по уходу и использованию животных соблюдались. После процедуры животных постоянно контролировали для обеспечения их благополучия и соблюдения этических норм CSIR-Индийского института интегративной медицины, Джамму, под номером одобрения Институционального комитета по этике животных (IAEC): 468/87/8/2025. Этот протокол описывает неинвазивную эндотрахеальную инстилляцию липополисахарида (ЛПС) с использованием прямого визуального метода, как было показано ранее, с некоторыми методологическими улучшениями, введёнными в текущемисследовании 26,27,28. Техника оптимизирована для контролируемой и последовательной индуцации ALI, обеспечивая устойчивые результаты экспериментов при сохранении высоких стандартов ухода за животными. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Анестезия и подготовка к ЛПС

  1. Измерение массы животных и расчёт дозы LPS
    1. Взвесьте каждое животное с помощью калиброванного веса для точного расчёта дозы LPS. Для исследования выберите крыс Wistar весом от 140 до 160 г.
    2. Приготовьте раствор LPS, разбавляя лиофилизированный Escherichia coli LPS в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) для достижения желаемой концентрации. Используется свежеприготовленный раствор LPS (5 мкг/г массы тела) 29,30.
  2. Индукция анестезией и критическое время
    1. Анестезируйте животных с помощью внутрибрюшнической инъекции свежеприготовленного коктейля кетамина и ксилазина (кетамин: 75 мг/кг и ксилазин: 10 мг/кг) с использованием шприца объёмом 1 мл. После инъекции дайте примерно 2-5 минут, чтобы анестезия подействовала, не беспокоя животных.
    2. Подтвердите адекватную анестезию, убедившись в отсутствии спонтанных движений и отрицательном рефлексе сжатия пальца ног. ЛПС проводится через эндотрахеальную инстилляцию через 5–8 минут после анестезиологической индукции. В день окончания эксперимента выполните такие процедуры, как трахеотомия и торакотомия через 4-7 минут после анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная глубина анестезии критически важна для успешной эндотрахеальной инстилляции. Чрезмерная анестезия может подавлять рвотный рефлекс, а недоанестезия — вызывать дискомфорт или движение во время процедуры. Используйте свежеприготовленные LPS для поддержания стабильности между экспериментами. Внимательно следите за животными во время и после процедуры, чтобы обеспечить надлежащее благополучие.

2. Эндотрахеальная инстилляция ЛПС

  1. Оценка адекватности анестезии: После введения анестезиологического коктейля оцените глубину анестезии с помощью лёгкого щипания лапой. После подтверждения анестезионного состояния приступайте к протоколу инстилляции. Поставьте мышь в полулежащее положение, подвешенное резцами на твёрдой опорной платформе.
  2. Визуализация трахеи: Откройте рот анестезируемого животного, аккуратно захватите язык щипцами и аккуратно введите ларингоскоп, точно выравнивая его для оптимального визуализации отверстия трахеи. Убедитесь, что свет правильно направлен для освещения гортани, обеспечивая беспрепятственный доступ.
  3. Манипуляция языком: Используйте изогнутые, тупые концы щипцы для аккуратного захвата языка и аккуратного втягивания его вверх и вбок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ручные увеличители для повышения прозрачности анатомии гортани и обеспечения тщательного выравнивания инстилляционного аппарата для повышения точности.
  4. Введение ЛПС: Внимать 100 мкл раствора ЛПС в шприц и подключить его к эндотрахеальной трубке крыс объёмом 16 G; Введите раствор LPS возле отверстия трахеи. Сразу после инстилляции аккуратно закройте ноздри на 2-4 секунды с помощью тупых щипцов, чтобы стимулировать аспирацию раствора LPS в лёгкие через трахею. Постоянно следите за доставкой с помощью ларингоскопа с источником света, чтобы подтвердить точное и полное введение.
  5. Постпроцедурный мониторинг: Аккуратно переместите язык в его нормальную анатомическую ориентацию после успешного ЛПС. Перенесите животное в клетку и внимательно следите за признаками затруднения дыхания или удушья не менее 1 минуты.
  6. Ключевые аспекты
    1. Острота зрения: обеспечьте оптимальное выравнивание ларингоскопа для точной подачи LPS. Используйте инструменты увеличения для повышения точности и эффективности.
    2. Аккуратно держите язык и прижимайте его к нижней челюсти или краю рта, чтобы стабилизировать его.

3. Сбор образцов

  1. Проведите бронхоальвеолярную промывку (BAL), как описано в предыдущих исследованиях, с незначительными изменениями 31,32,33. После трахеотомии аккуратно введите 2 мл холодного PBS в лёгкие и заберите жидкость.
  2. Центрифугуйте собранную жидкость для промыва при 5000 г в течение 5 минут при 4 °C и используйте супернатант для обнаружения воспалительных маркеров. Собирайте лёгкие для гистопатологического исследования или гомогенизуйте на активность миелопероксидазы (MPO). Сохраняйте образцы на льду во время сбора для сохранения их целостности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Модель была подтверждена путём измерения воспалительных маркеров, включая уровни IL-1β, активность MPO, общее содержание белка и гистопатологию через 24 и 120 часов после инстилляции LPS. В исследование участвовали три экспериментальные группы: контрольная группа (нелеченная) и две группы, подвергшиеся инстилляции ЛПС, одна была эвтаназирована через 24 часа, а другая — через 120 часа (согласно утверждённым институциональными протоколами).

По с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод эндотрахеальной инстилляции обеспечивает неинвазивный, воспроизводимый и целенаправленный подход к легочному введению, эффективно обходя необходимость хирургического вмешательства. Этот метод значительно снижает риски, связанные с хирургической травмой, такой как повреждение тканей, а также минимизирует риск послеоперационных инфекций и непреднамеренного повреждения органов, которые могут возникнуть в результате инвазивных процедур. Доставляя препараты непосредственно в лёгкие, энд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Автор-корреспондент, SR, признаёт финансовую поддержку от стипендии Ramalingaswami (Ref. No. BT/RLF/Возвращение/13/2019), Департамент биотехнологий, Правительство Индии. Авторы выражают благодарность доктору Говинду Ядаву, доктору Рамаджаяну Пандиану и сотрудникам ветеринарного дома CSIR-IIIM за их поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  Призма 8Graphpadhttps://www.graphpad.com/features
Bradford Reagent Himedia, ИндияML106-500 ML         
DL-дитиотрейтолHimedia, Индия  RM525-25G
Eosin Лоба Чеми, Индия3660
Уксусная кислота этилендиамина тетра (ЭДТА)Лоба Чеми, Индия6381926
Щипцы -
Формалин 10% Sigma Aldrich, USA HT501320
ГематоксилинSDFCL74108G05
HEPESHimedia, ИндияMB016
Перекись водорода   Авра, Индия7722841
Кетамин Neon Laboratories Ltd, Индия- 
ЛарингоскопMedical Sources Co., Ltd., Китай  MS-LA500FV 
Липополисахарид из Escherichia coli O55:B5         Sigma Aldrich, СШАL2880         
o-дианизидин дигидрохлорид Sigma Aldrich, СШАD3252-5G 
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) Invitrogen, США3002
Ортофосфат калия дигидрогенHimedia, ИндияIN26185530500
Коктейль ингибиторов белкаСигма ОлдричP8340
Rat IL-1β ELISA Kit Термофишер, СШАBMS630
Хлорид натрияHimedia, ИндияTC046M
Фторид натрияHimedia, ИндияGRM7502
Ортованадат натрияSigma Aldrich, СШАS6508
Пирофосфат натрияMerck, СШАMA3M722243
Серная кислотаSigma Aldrich, США339741
Triton X-100Термофишер, СШАT8787
Ксилазин Indian Immunologicals Ltd, Индия-

Ссылки

  1. Rayees, S., et al. Macrophage TLR4 and PAR2 signaling: Role in regulating vascular inflammatory injury and repair. Front Immunol. 18 (11), 2091(2020).
  2. Bernard, G. R., et al. The American-European Consensus Conference on ARDS. Definitions, mechanisms, relevant outcomes, and clinical trial coordination. Am J Respir Crit Care Med. 149 (3), 818-824 (1994).
  3. Banavasi, H., Nguyen, P., Osman, H., Soubani, A. O. Management of ARDS - What works and what does not. Am J Med Sci. 362 (1), 13-23 (2021).
  4. Bellani, G., et al. Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries. JAMA. 315 (8), 788-800 (2016).
  5. Rubenfeld, G. D., et al. Incidence and outcomes of acute lung injury. N Engl J Med. 353 (16), 1685-1693 (2005).
  6. Aliberti, S., Dela Cruz, C. S., Amati, F., Sotgiu, G., Restrepo, M. I. Community-acquired pneumonia. Lancet. 398 (10303), 906-919 (2021).
  7. Gregorakos, L., et al. Near-drowning: clinical course of lung injury in adults. Lung. 187 (2), 93-97 (2009).
  8. Hu, X., Lee, J. S., Pianosi, P. T., Ryu, J. H. Aspiration-related pulmonary syndromes. Chest. 147 (3), 815-823 (2015).
  9. Wang, L., Wu, D., Wang, J. Chlorine gas inhalation manifesting with severe acute respiratory distress syndrome successfully treated by high-volume hemofiltration: A case report. Medicine. 97 (30), e11708(2018).
  10. Sung, P. S., Peng, Y. C., Yang, S. P., Chiu, C. H., Hsieh, S. L. CLEC5A is critical in Pseudomonas aeruginosa-induced NET formation and acute lung injury. JCI Insight. 7 (18), e156613(2022).
  11. Al-Kuraishy, H. M., Al-Gareeb, A. I., Alblihed, M., Cruz-Martins, N., Batiha, G. E. COVID-19 and risk of acute ischemic stroke and acute lung injury in patients with type II diabetes mellitus: The anti-inflammatory role of metformin. Frontiers Med. 19 (8), 644295(2021).
  12. Al-Kuraishy, H. M., Al-Gareeb, A. I., Al-Niemi, M. S., Alexiou, A., Batiha, G. E. Calprotectin: The link between acute lung injury and gastrointestinal injury in Covid-19: Ban or boon. Curr Protein Peptide Sci. 23 (5), 310-320 (2022).
  13. Al-Kuraishy, H. M., et al. COVID-19 and phosphodiesterase enzyme type 5 inhibitors. J Micros Ultrastruc. 8 (4), 141-145 (2020).
  14. Al-Kuraishy, H. M., Al-Gareeb, A. I., Qusty, N., Alexiou, A., Batiha, G. E. Impact of sitagliptin on non-diabetic COVID-19 patients. Current Mol Pharmacol. 15 (4), 683-692 (2022).
  15. Yu, X., et al. Loss of PADI2 and PADI4 ameliorates sepsis-induced acute lung injury by suppressing NLRP3+ macrophages. JCI Insight. 9 (22), e181686(2024).
  16. Calfee, C. S., et al. Acute respiratory distress syndrome network, national heart, lung, and blood institute. Trauma-associated lung injury differs clinically and biologically from acute lung injury due to other clinical disorders. Crit Care Med. 35 (10), 2243-2250 (2007).
  17. Zhou, M. T., Chen, C. S., Chen, B. C., Zhang, Q. Y., Andersson, R. Acute lung injury and ARDS in acute pancreatitis: mechanisms and potential intervention. World J Gastroenterol. 16 (17), 2094-2099 (2010).
  18. Roubinian, N. TACO and TRALI: biology, risk factors, and prevention strategies. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 1, 585-594 (2018).
  19. Fernandes, C. A., Vanbever, R. Pre-clinical models for pulmonary drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 6 (11), 1231-1245 (2010).
  20. Yu, P., et al. Non-invasive intratracheal lipopolysaccharide instillation in mice. J Vis Exp. (193), e65151(2023).
  21. Price, D. N., Muttil, P. Delivery of therapeutics to the lung. Methods Mol Biol. 1809, 415-429 (2018).
  22. Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55 (1), 24-35 (2000).
  23. Hendrix, J. M., Regunath, H. Intubation endotracheal tube medications. [Updated 2025 Jan 19]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2025).
  24. DeMasi, S. C., Casey, J. D., Semler, M. W. Evidence-based emergency tracheal intubation. Am J Respir Crit Care Med. 211 (7), 1156-1164 (2025).
  25. Greenberg, M. I. The use of endotracheal medication in cardiac emergencies. Resuscitation. 12 (3), 155-165 (1984).
  26. Rayees, S., et al. PAR2-Mediated cAMP generation suppresses TRPV4-dependent Ca2+ signaling in alveolar macrophages to resolve TLR4-induced inflammation. Cell Rep. 27 (3), 793-805 (2019).
  27. Arfath, Y., et al. TRPV4 facilitates the reprogramming of inflamed macrophages by regulating IL-10 production via CREB. Inflamm Res. 73 (10), 1687-1697 (2024).
  28. Rochford, I., et al. Evidence for reprogramming of monocytes into reparative alveolar macrophages in vivo by targeting PDE4b. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (4), L686-L702 (2021).
  29. Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 8 (304), 158-166 (2013).
  30. Hagawane, T. N., Gaikwad, R. V., Kshirsagar, N. A. Dual hit lipopolysaccharide and oleic acid combination induced rat model of acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. J Med Res. 143 (5), 624-632 (2016).
  31. Rayees, S., et al. Protease-activated receptor 2 promotes clearance of Pseudomonas aeruginosa infection by inducing cAMP-Rac1 signaling in alveolar macrophages. Front Pharmacol. 20 (13), 874197(2022).
  32. Rayees, S., et al. Therapeutic effects of R8, a semi-synthetic analogue of Vasicine, on a murine model of allergic airway inflammation via STAT6 inhibition. Int Immunopharmacol. 26 (1), 246-256 (2015).
  33. Joshi, J. C., et al. SPHK2-Generated S1P in CD11b+ Macrophages blocks STING to suppress the inflammatory function of alveolar macrophages. Cell Rep. 30 (12), 4096-4109 (2020).
  34. Balzer, C., Cleveland, W. J., Jinka, T. R., Riess, M. L. Video laryngoscopic oral intubation in rats: A simple and effective method. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (5), L1032-L1035 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Введение липополисахаридаэндотрахеальная инстилляциямодель легких грызуновнеинвазивная доставкабронхоальвеолярный лаважмаркеры воспалениягистопатология легкихактивность миелопероксидазытаргетная доставка лекарственных средств
Неинвазивное эндотрахеальное введение липополисахарида для индуцирования острого поражения лёгких у грызунов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.