Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

3D Flipwell Engineering для разработки асинхронных систем токсикологической и иммуномодулирующей терапии бактериальных, кишечных и иммунных клеток

649 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68701

⸱

17 октября 2025 г.

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье представлен подробный протокол с ключевыми шагами для руководства проектированием и использованием 3D Flipwell. Мы описываем и показываем, как собирать стеки вкладышей для совместной культуры и использовать их для совместного культивирования стратифицированных слоев кишечных бактерий, кишечного эпителия и макрофагов для моделирования среды слизистой оболочки кишечника.

Аннотация

Для изучения роли бактериального секретома в поляризации иммунных клеток и гомеостазе слизистой оболочки кишечника мы разработали трехмерную модель ко-культуры с использованием коммерчески доступных вставок в формате «друг за другом». Мы назвали эту систему 3D Flipwells и успешно совместно культивировали бактерии, эпителиальные и иммунные клетки толстой кишки в стратифицированных слоях, чтобы повторить микроокружение слизистой оболочки кишечника. Эта система совместного культивирования позволяет засеивать эпителиальные клетки толстой кишки с одной стороны мембраны и недифференцированные неадгезивные моноциты с другой, обеспечивая синхронное прогрессирование поляризации эпителия толстой кишки, образование слизи, а также дифференцировку и поляризацию моноцитарно-макрофагов в пределах одной кокультуры без необходимости отделения и повторного покрытия предварительно дифференцированных макрофагов. Эта система проста в изготовлении и требует всего нескольких легкодоступных материалов и инструментов. Мы проверили его полезность, проанализировав реакцию компонентов кокультуры на сепиаптерин (SEP), эндогенный предшественник BH4 (тетрагидробиоптерин) – кофактор синтазы оксида азота (NOS). Мы продемонстрировали, что обработка SEP 3D Flipwell индуцирует образование биопленки кишечными бактериями, продукцию слизи эпителием толстой кишки и проиммуногенную поляризацию макрофагов. Это указывает на то, что SEP запускает активацию защитного механизма слизистой оболочки через перекрестные помехи между различными клеточными компонентами. Необходимы дальнейшие эксперименты для изучения роли коммуникаций слизистых оболочек, которые приводят к перепрограммированию иммунных клеток, и для оценки полезности этой системы совместного культивирования для скрининга новых иммуномодулирующих терапий.

Введение

Перекрестные связи между иммунными клетками и микробиомом кишечника сильно влияют на эффективность различных методов лечения заболеваний. Такие перекрестные помехи заметно изменяются под воздействием внешних стимулов, включая, помимо прочего, метаболические аномалии хозяина, изменения в рационе питания, проявления заболевания и фармакологическое лечение. Эти изменения могут привести к дисбалансу в составе микрофлоры, состоянию, называемому дисбактериозом 1,2,3.

Чтобы лучше понять взаимодействие между микробами и иммунными клетками хозяина в кишечнике, различными группами были разработаны сложные системы совместного культивирования в попытке повторить среду слизистой оболочки кишечника. Начиная с системы «кишечник-на-чипе», разработанной Kim et al.4 , и заканчивая более сложной сборкой с использованием специализированного абсорбирующего субстрата5, эти системы совместного культивирования не просты в создании и не способны удерживать полный спектр секретируемых компонентов из-за их поглощения субстратом совместного культивирования. Таким образом, Noel et al. разработали альтернативную систему совместного культивирования для моделирования слизистой оболочки кишечника, которую относительно легчеизготовить. В этой новой системе используется одна культуральная вставка с эпителиальными клетками толстой кишки, засеянными на одной стороне мембраны, и предварительно дифференцированными макрофагами на другой стороне6. Однако посев предифференцированных макрофагов требует их предварительной дифференцировки в другом месте, а также их диссоциации и превращения в кокультуру, что потенциально влияет на их клеточную целостность и жизнеспособность.

Включив усовершенствования в эти предыдущие системы, мы разработали новую трехмерную (3D) многоуровневую систему совместной культуры, которую мы назвали 3D-системой Flipwell 7,8. Эта система состоит из вставок клеточных культур, уложенных друг за другом, что обеспечивает синхронное прогрессирование поляризации эпителия толстой кишки, образования слизи, дифференцировки макрофагов и поляризации в рамках одной сокультуры. Эта система позволяет нам изучать изменения в слизистой оболочке кишечника и взаимодействие между кишечными бактериями, эпителиальными клетками и иммунными клетками. Кроме того, эта система может быть использована для изучения воздействия внешних раздражителей, включая бактериальные метаболиты, токсины, пищевые питательные вещества и фармацевтические препараты, на слизистую оболочку кишечника и остальную часть организма 7,8.

Используя новую систему ко-культурных вставок, мы изучили реакцию различных клеточных компонентов на сепиаптерин (SEP), эндогенный предшественник BH4 (тетрагидробиоптерина) – кофактора синтазы оксида азота (NOS). Ранее мы показали, что SEP проявляет проиммуногенную активность в микроокружении опухоли молочной железы путем перепрограммирования опухолеассоциированных макрофагов в проиммуногенный тип 9,10,11,12. Мы продемонстрировали, что SEP индуцирует синхронные события образования биопленки кишечными бактериями, продукцию слизи эпителием толстой кишки и проиммуногенную поляризацию макрофагов в кокультурах, что указывает на активацию защитного механизма слизистой оболочки7. Эти результаты подтверждают полезность этой новой системы совместного культивирования для моделирования микроокружения слизистой оболочки кишечника7.

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы предоставить пошаговые инструкции по созданию этой новой совместной культуры кишечных бактерий, кишечного эпителия, слизи и иммунных клеток для моделирования среды слизистой оболочки кишечника. Мы также демонстрируем, как мы можем визуализировать перекрестные помехи ко-культивируемых клеток под воздействием внешнего раздражителя, например, лечения SEP. Дальнейшие исследования с использованием этой системы ко-культивирования необходимы для определения секретируемых клеточных компонентов, которые облегчают взаимодействие между различными клетками в ко-культуре, а также для проверки полезности этой модели ко-культуры для высокопроизводительного скрининга новых терапевтических средств. Кроме того, для достижения физиологического состояния среды слизистой оболочки кишечника эта система совместного культивирования потребует дальнейших модификаций. Например, для совместного культивирования аэробных клеток млекопитающих с анаэробными бактериями эти бактерии должны быть отдельно культивированы в анаэробных средах, которые удаляют кислород, или покрыты жидким парафином, предотвращающим поступление кислорода, как сообщалось в другом месте. Такая продвинутая полезность и применение этой системы совместной культуры заслуживают дальнейшего изучения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. 3D Флипвелл Инжиниринг

  1. Все работы должны проводиться внутри шкафа для клеточных культур. Поместите все принадлежности внутрь шкафа.
  2. Откройте чашку Петри, накройте крышкой и отложите в сторону. Откройте лезвие скальпеля из защитного кожуха и положите его на край дна чашки Петри. Обеспечьте стерильность.
    ВНИМАНИЕ: Требуется осторожное обращение с лезвием скальпеля. Используйте устойчивые к порезам перчатки, армированные волокном, чтобы защитить руки при необходимости.
  3. Откройте стерильную защитную упаковку 12-луночного коммерческого вкладыша. Обеспечьте стерильность. Возьмите набор стерильных пинцетов. Аккуратно возьмитесь за вкладыш и достаньте его из упаковки.
  4. Удерживайте вставку так, чтобы ее дно было обращено вверх. Другой рукой возьмите стерильное лезвие скальпеля и поднесите его к вставке.
  5. С помощью С-образных движений проткните мембрану по краю и аккуратно проведите лезвием скальпеля по нижней части вставки, оставаясь близко к пластиковой стенке.
  6. Вырежьте ПЭТ-мембрану и используйте второй набор пинцетов, чтобы удалить мембрану. Выбросьте мембрану.
  7. С помощью лезвия скальпеля соскребите белую мембранную стружку, чтобы очистить край и ободок вставки. Осторожно поместите только что подготовленный вкладыш обратно в исходную стерильную упаковку.
  8. Далее возьмите тюбик с силиконовым клеем и отрежьте лезвием скальпеля кончик насадки, чтобы сделать отверстие. Ширина этого отверстия должна составлять 3 мм.
  9. Проверьте размер бусины, выдавив клей с бумажного полотенца. Толщина борта должна составлять 2-3 мм. Отрегулируйте насадку, если борт меньше 2 мм и его трудно выдавить из трубки.
    1. Еще один способ нанесения и распределения клеевого шарика — использовать наконечник пипетки объемом 200 мкл с отрезанным кончиком. Обрежьте ножницами 3-4 мм и с помощью шпателя распределите клей по ободку вставки.
  10. Снимите защитный чехол со второго вкладыша и отложите в сторону. Возьмите в руки стерильные щипцы, возьмите второй вкладыш из упаковки мембраной вверх.
  11. Аккуратно распределите тонкую силиконовую бусину толщиной 2-3 мм по всему дну вставки, стараясь не касаться мембраны.
  12. Возьмите в руки второй комплект стерильных щипцов и осторожно извлеките первый вкладыш (без мембраны) из защитного пакета.
  13. Соедините две вставки снизу вниз так, чтобы нижние обода совпадали. Излишки клея могут быть вытеснены из шва. Дайте клею высохнуть. Его можно срезать после полного высыхания клея (24-72 ч). Это необязательно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный стек Flipwell Co-culture Insert (FCI) должен иметь только одну мембрану из ПЭТ посередине. Лучше всего, чтобы L-образные ручки коммерческих вставок располагались таким образом, чтобы они располагались на расстоянии 180° друг от друга (в положениях «3 часа» и «6 часов»). Следуйте рекомендациям производителя силиконового клея по времени высыхания, которое может составлять 24-72 часа в зависимости от марки. Для большинства клеев на силиконовой основе предпочтительно время высыхания 72 часа. Клей также можно сушить всего 24 часа с помощью УФ-стерилизации.
  14. Когда стопка FCI будет склеена, поместите ее внутрь оригинальной стерильной упаковки для просушки или в глубокую чашку Петри. Используйте крышку от указанных чашек Петри, чтобы накрыть стек в сборе.
  15. Чтобы простерилизовать сборки, откройте крышку чашки Петри. С помощью стерильных щипцов поместите стопку FCI на край указанного глубокого обода чашки Петри.
  16. Закройте стеклянную створку шкафа BSC. Включите ультрафиолетовый свет. Отойдите от шкафа для безопасности и простерилизуйте каждую сторону мембраны в течение 30 мин-1 ч. Выключайте ультрафиолетовое излучение после завершения каждого цикла стерилизации.
  17. Наденьте крышку чашки Петри (как указано) на чашку Петри с помощью стопок вкладышей и отложите в сторону.

2. Тестирование на утечку перед нанесением коллагенового покрытия

  1. Снимите крышку чашки Петри. Добавьте 500 мкл стерильного PBS или стерильной деионизированной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве наглядного пособия DMEM использовался для визуализации целостности стеков FCI.
  2. Накройте чашку Петри крышкой. Дайте ему отдохнуть на ночь. Проверьте целостность FCI утром. Выбросьте FCI при обнаружении утечки. При необходимости создавайте новые стопки вставок.
  3. Аспирируйте жидкость (PBS или воду), используемую для тестирования. Накрываем чашку Петри крышкой.
  4. Дайте штабелям высохнуть (1-2 часа) внутри BSC. Храните FCI в BSC до тех пор, пока они не будут готовы к использованию, или покройте их коллагеном для посева адгезивных клеток.

3. Коллагеновое покрытие мембраны Flipwell

  1. Приготовьте рабочую массу коллагенового раствора путем разбавления коллагенового раствора, поданного в концентрации 3 мг/мл, до разведения в соотношении 1:30 со скоростью 100 мкг/мл. Добавьте 33 мкл коммерчески изготовленного раствора коллагена в 1 мл стерильной деионизированной воды в микроцентрифужной пробирке. Перемешайте путем вортексинга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для большего объема увеличьте масштаб и используйте коническую трубку объемом 15 мл в зависимости от количества стеков вкладышей, которые должны быть покрыты с обеих сторон мембраны. Каждый раз делайте это свежим. Не используйте оборотный запас повторно.
  2. Откройте крышку чашки Петри. Пусть Flipwell висит на краю чашки Петри. Осторожно добавьте 200 мкл коллагенового раствора на одну сторону стопки вкладыша.
  3. Оставьте на 1 час. Аспирируйте раствор коллагена. Добавьте 200 мкл стерильного PBS. Аспират PBS.
  4. Накройте чашку Петри крышкой и дайте мембране высохнуть в течение 60 минут внутри шкафа. Когда мембрана высохнет, возьмите стерильные щипцы/пинцет и переверните Flipwell на противоположную сторону, чтобы он свисал с края чашки Петри.
  5. Добавьте 200 μL раствора коллагена на непокрытую (теперь верхнюю) сторону мембраны. Оставьте на 1 час.
  6. Аспирируйте раствор коллагена. Добавьте 200 мкл стерильного PBS. Аспират PBS. Накройте чашку Петри крышкой и дайте мембране высохнуть в течение 60 минут внутри шкафа. Дайте штабелю FCI высохнуть в течение ночи или посейте семена в тот же день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целостность коллагенового покрытия не проверялась в условиях длительного хранения. После того, как флипвеллы будут покрыты, их необходимо использовать в течение 24 часов.

4. Конструкция бактериальной вставки для бактериальных культур

  1. Поместите два комплекта стерильных щипцов и 24-луночные вкладыши внутрь BSC. Осторожно откройте вкладыши и оставьте их в стерильной упаковке.
  2. Стерильным пинцетом извлеките вкладыш из стерильной упаковки. С помощью второго набора пинцетов/щипцов отломите маленькие пластиковые ножки в нижней части вставки.
  3. Проверьте 24-луночный вкладыш, установив его внутрь одного из стерильных стеков FCI или оригинальных 12-луночных вкладышей.
  4. Если вставка не скользит в лунку, используйте пинцет еще раз, чтобы отколоть больше пластикового материала от обода, где обод и ножки соприкасаются.
  5. Проверьте посадку еще раз до тех пор, пока 24-луночный вкладыш не сможет скользить внутрь 12-луночного отверстия. Поместите вкладыш либо в стерильную упаковку, либо в стерильную чашку Петри.
  6. УФ-стерилизация вкладыша или этанолом (по желанию). Накройте упаковку обратно вверх или накройте крышкой чашки Петри до готовности.

5. Игольчатая конструкция

  1. Принесите инструменты и все принадлежности внутрь BSC. Осторожно придерживайте иглу плоскогубцами для носа.
  2. Измерьте расположение каждого изгиба на игле с помощью линейки. Вторым набором плоскогубцев для носа возьмитесь за иглу в выбранном месте и согните иглу.
  3. Создадим второй сгиб. Чтобы скрутить иглу, захватите иглу плоскогубцами у основания и на-образном изгибе и поверните в обратном направлении, чтобы получилась закрутка на 4-5 мм. Этот шаг имеет решающее значение для легкого введения иглы внутрь Flipwell для удаления пузырьков воздуха.
  4. Прикрепите иглу к стерильному шприцу диаметром 3 или 5 мм. Простерилизуйте иглу и основание шприца в 20 мл 70%-95% этанола внутри конической пробирки объемом 50 мл.
  5. Протяните этанол через иглу и шприц, чтобы убедиться, что игла и основание шприца стерилизованы.
  6. Извлеките шприц и иглу из конической трубки с этанолом и дайте воздуху высохнуть, положив его на чашку Петри. Продуйте иглу воздухом для просушки и дайте ей высохнуть на несколько минут.

6. Посев эпителиальных линий толстой кишки Caco-2:HT29-MTX-E12

  1. Начинайте культивирование клеточных линий Caco-2 и HT29-MTX за 2-3 недели до начала эксперимента в отдельных 100-мм чашках, покрытых TC, в соответствующих питательных средах.
    1. Для сред HT-29-MTX используйте 440 мл DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) и 1% (v:v) глутамаксных сред с 50 мл 10% (v:v) термоинактивированного FBS, 5 мл 1% (v:v) Pen Strep и 5 мл HEPES 10 mM конечной концентрации.
    2. Для сред Caco-2 используйте 440 мл DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) и 1% (v:v) глутамаксных сред с 50 мл 10% (v:v) термоинактивированного FBS, 5 мл 1% (v:v) Pen Strep и 5 мл заменимых аминокислот.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите плотность посева для клеточной линии Caco-2 с помощью 12-луночных планшетов, покрытых тканевой культурой. Рассчитайте количество дней до 100% слияния в зависимости от начальной плотности посева. В качестве ориентира мы указываем плотность посева; однако это будет варьироваться в зависимости от состава питательной среды, поставщика и используемой FBS. Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения монослоя для эпителиальной стороны кишечника Flipwell после того, как клетки THP-1 были покрыты и проведено бактериальное/SEP-лечение.
  2. Для прохождения клеток Caco-2 и HT-29 необходимо аспирировать питательную среду. Умойтесь 10 мл PBS.
  3. Трипсинизируйте клетки, добавив 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА. Инкубировать 5-10 минут при 37 °C с 5% CO2.
  4. Добавьте в планшеты 7 мл подходящей для клеток питательной среды. Пересадите клетки в отдельные стерильные конические пробирки объемом 15 мл.
  5. Гранулы путем центрифугирования в течение 5 мин при 500 х г при комнатной температуре. Отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу.
  6. Ресуспендируйте гранулу в 1 мл предварительно подогретого фильтрующего материала HT-29 на основе DMEM. Подсчитайте клетки с помощью гемацитометра или счетчика клеток.
  7. Объедините два типа клеток Caco-2:HT-29 с соотношением 9:1 в новую коническую пробирку объемом 15 мл или 50 мл, в зависимости от количества клеток, необходимых для желаемого количества флипвеллов.
  8. Используйте флипвеллы с коллагеновым покрытием для выполнения следующих шагов. Повесьте стеки FCI с коллагеновым покрытием на край глубокой чашки Петри.
  9. Затравка 500 мкл 7,5 x 104 клеток на см2 (2,6 x 105 клеток/12 лунок вставка) на апикальную сторону Flipwell. Рассчитайте начальное количество ячеек на основе количества используемых стеков. Это будет включать оба типа клеток в соотношении 9:1.
  10. Накройте сборки крышкой чашки Петри. Инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 в течение ночи до прикрепления клеток. Клетки начинают вырабатывать слизь примерно через 7-10 дней в культуре. Меняйте носители через день, чтобы поддерживать культуру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество дней в культуре с обработками должно быть рассчитано заранее. От этой продолжительности будет зависеть плотность переворота и начального посева.

7. Переворачивание 3D Flipwell при подготовке к посеву ячеек THP-1

  1. Когда клетки Caco-2:HT-29 прикрепляются и начинают пролиферировать (точное слияние необходимо оценивать на основе используемой среды/FBS и продолжительности культивирования), но не достигают 100% конфлюенции, переверните Flipwell для посева клеток THP-1 на другой стороне мембраны.
    Примечание: К этому моменту клетки THP-1 должны быть расширены в отдельной культуре, и точное количество необходимых клеток будет оценено на основе количества используемых стеков FCI.
  2. Откройте крышку чашки Петри и аспирируйте среду DMEM с апикальной (кишечной эпителиальной) стороны стека FCI.
  3. С помощью стерильных щипцов осторожно возьмите Flipwell за крючок и поверните на 180°. С помощью второго набора стерильных щипцов возьмитесь за другой крючок, который теперь обращен вверх.
  4. Опустите сборку обратно в чашку Петри и повесьте крючок на край чашки Петри. Если вы не готовы засеять клетки THP-1, добавьте достаточное количество среды в глубокую чашку Петри, чтобы поднять уровень среды до верхней части мембраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флипвелл должен быть устойчив в этом положении, и следует сразу же рассмотреть возможность засева с элементами THP-1 и добавлением среды. Эти действия выполняются быстро. Клетки THP-1 должны быть подсчитаны и готовы к нанесению на пластины. Элементы THP1 были засеяны первыми, чтобы утяжелить стек FCI для большей стабильности и конечного веса. Затем в глубокую чашку Петри добавляли фильтрующий материал DMEM, чтобы довести уровень фильтрующего материала до нижней стороны мембраны. Затем изготовленная на заказ игла использовалась для удаления пузырьков воздуха, что еще больше стабилизировало стек FCI и позволило выполнить окончательную регулировку объема.
  5. С помощью иглы удалите пузырьки воздуха, как описано в следующем шаге.

8. Удаление пузырьков воздуха

  1. Перед использованием иглу и шприц предварительно простерилизовать в этаноле и высушить на воздухе (см. шаг 5). Погрузите поршень шприца.
  2. Держите стек FCI за руку с помощью стерильных щипцов. Осторожно опустите иглу внутрь и под узел вкладыша и очень аккуратно поместите мягкий кончик иглы гаважа вверх к воздушному пузырю.
  3. Осторожно и очень медленно потяните поршень шприца вверх и наблюдайте, как пузырьки воздуха медленно исчезают. Остановитесь, когда пузырь воздуха достигнет около 2 мм в диаметре, чего достаточно для сохранения хорошего покрытия DMEM для эпителиальных клеток толстой кишки.
  4. Осторожно извлеките иглу и шприц из Flipwell. Приступаем к другой сборке вставки в глубокой чашке Петри.

9. Посев ТГП-1 и обработка ПМА

  1. Приготовьте среду THP1 с 420 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 50 мл 10% (v:v) термоинактивированного FBS, 5 мл Glutamax 1% (v:v), 5 мл HEPES (10 мл конечной концентрации), 11 мл глюкозы (4,5 г/л конечной концентрации) и 5 мл Pen-Strep (1% v:v).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки THP-1 необходимо выращивать в питательной среде на основе RPMI в течение нескольких дней перед посевом во вкладыши. Выполняйте расчеты количества ячеек перед начальным заполнением и увеличивайте масштаб в зависимости от количества используемых стеков FCI.
  2. Приготовьте клеточную суспензию из расчета объемом 500 мкл и из расчета 0,5 х 106 клеток на 500 мкл среды ТГП-1. Если необходимо использовать PMA для дифференцировки и поляризации, добавьте его в среду RPMI в концентрации 100 нг/мкл.
    1. Для изготовления ПМА восстановите 5 мг форболмиристата ацетата (ФМА) в 1 мл ДМСО с получением исходного раствора 5 мг/мл. Перемешайте путем вортексинга. Разложите по микроцентрифужным пробиркам по 20 мкл каждая и храните при температуре -20 °C.
    2. Чтобы использовать PMA, сделайте рабочую массу при концентрации 50 мкг/мл, разбавив 1 мкл 5 мг/мл в 99 мкл (1:100) полной питательной среды. Добавьте 1 л рабочего состава на 500 μл среды, или 20 л рабочей массы на 10 мл среды.
  3. Центрифугируйте ячейки THP-1 при 94 х г в течение 5 мин при RT до гранулирования. Ресуспендировать в 5-10 мл среды RPMI. Подсчитайте ячейки THP-1 любым предпочитаемым методом подсчета.
  4. Снова центрифугировать при 94 x g в течение 5 мин при RT. Повторно суспендировать при 0,5 x 106 клеток на 500 мкл среды THP-1.
  5. Добавьте 500 мкл клеточной суспензии THP-1 на апикальную сторону стека вставок для совместной культуры. Отрегулируйте среду HT-29 для эпителиальных клеток толстой кишки, добавив среду в глубокую чашку Петри.
  6. При необходимости удалите пузырьки воздуха с помощью иглы для зондажа в соответствии с шагом 8. Культивируйте оба типа клеток в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37°C, 5%CO2, 100% влажности до тех пор, пока клетки THP-1 не прикрепятся (на ночь) и не начнут размножаться в течение 1-2 дней.
  7. Подготовьтесь либо к лечению SEP или другими препаратами, либо подготовьтесь к бактериальным вставкам (см. шаг 4). Начните культивировать бактерии за 1 день до следующего переворачивания стека FCI.

10. Второй Flipwell Flip и удаление пузырьков воздуха для SEP и бактериальных вставок

  1. Откройте крышку чашки Петри. Отсасывайте медиа RPMI с апикальной стороны. Возьмите Flipwell за руку стерильным пинцетом и поднимите стопку.
  2. Переверните стопку вверх ногами. С помощью второго набора пинцетов удерживаем стек сборки за имеющийся рычаг.
  3. Опустите стопку в новую стерильную глубокую чашку Петри и подвесьте над ободком. Добавьте 500 мкл среды DMEM на эпикальную/кишечную эпителиальную сторону.
  4. Добавьте достаточное количество фильтрующего материала RPMI в глубокую чашку Петри, пока фильтрующий материал не достигнет верхней части мембраны. Объем RPMI оценивался примерно в 40-55 мл, но он будет меняться в зависимости от количества стеков FCI, используемых на глубокую чашку Петри.
  5. Удалите пузырь воздуха с помощью шага 8, оставив пузырь 2-3 мм. При необходимости отрегулируйте носитель RPMI. Накройте тарелку.
  6. Культивируйте до тех пор, пока эпителиальные клетки толстой кишки не начнут вырабатывать слизь. Частично меняйте носители через день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эпителиальные клетки толстой кишки культивировались достаточно долго и уже продуцировали слизь, они могут приступить к бактериальному введению или лечению. Не допускайте, чтобы фильтрующий материал в нижнем отсеке опускался ниже нижней стороны мембраны вставки. Добавьте больше фильтрующего материала DMEM, чтобы поддерживать уровень фильтрующего материала на мембране. Идеальным методом замены среды является удаление половины среды из базолатерального отсека и оставление небольшого объема среды в апикальном отсеке для предотвращения инфильтрации воздуха.
  7. Для обработки SEP добавляйте SEP до конечной концентрации 100 мкМ в лунки в это время, если бактериальная культура не используется. Если используется бактериальный посев и вкладыш, добавьте SEP к бактериальной культуре. Бактериологическое исследование см. в шаге 11.
    1. Чтобы получить SEP, добавьте 100 мг L-сепиаптерина к 84,3 мл ДМСО и перемешайте с помощью вортексинга. Разложите по микроцентрифужным пробиркам по 100 мкл каждая. Хранить при температуре -20 °C. Используйте аликвоты SEP в концентрации 1 мкл на 500 мкл среды на сборку вставки (конечная концентрация 100 мкМ).

11. Начало бактериологического исследования (по желанию)

  1. Чтобы изучить влияние бактериальных метаболитов на иммунные клетки, слизь и эпителий толстой кишки, добавьте бактериальный вкладыш на апикальную сторону вкладыша. Для создания бактериальной вставки выполните шаг 4. Мы культивировали Bacillus subtilis за день до использования бактериальной вставки.
  2. Изготовьте и автоклавируйте Miller LB за 2 дня до использования бактериальной вставки. Чтобы приготовить LB, смешайте 6,25 г Miller LB с 250 мл деионизированной воды в стеклянной колбе объемом 500 мл. Накрыть алюминиевой фольгой. Автоклав, остыть до RT. Может хранить стерильный LB при температуре 4 °C или RT.
  3. Начните выращивать бактерии Bacillus subtilis из запасов глицерина за день до использования бактериальной вставки.
  4. Чтобы начать бактериологическое исследование, инокулируйте 10 мл Miller LB с Bacillus subtilis из замороженного глицеринового запаса в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Не допускайте оттаивания глицеринового бульона.
  5. С помощью стерильного наконечника объемом 200 мкл выберите небольшое количество бактерий из запасов глицерина. Извлеките наконечник в 10 мл LB в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл.
  6. При использовании SEP начните обработку с 20 μL исходного материала SEP (конечная концентрация должна быть 100 μM). Добавьте непосредственно к бактериальной культуре объемом 10 мл в закваске из конической пробирки объемом 50 мл.
  7. Культуру Bacillus subtilis в течение 8 ч в встряхивающем инкубаторе при 220 об/мин и 37 °С. Добавьте вторую обработку SEP в конце дня - добавьте 20 μL SEP до конечной концентрации 100 μM к 10 мл LB с бактериями.
  8. Культивирование в течение ночи при 220 об/мин, 37 °C. Добавьте третью обработку 20 мкл SEP к 10 мл LB с Bacillus subtilis на следующее утро и продолжайте встряхивать, пока не будете готовы к введению бактерий.

12. Добавление бактериальной вставки к Flipwell (опционально)

  1. Выполните создание бактериальной вставки, как описано в шаге 4. Проведите бактериальное культивирование, как описано в шаге 11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если имеется отдельный шкаф для клеточных культур, он будет работать лучше всего. В противном случае разделите рабочую зону внутри шкафа для клеточных культур пополам. Держите бактериальные и клеточные культуры на расстоянии. Клеточные культуры не следует возвращать в инкубатор для клеточных культур. BSC необходимо стерилизовать и подвергнуть воздействию ультрафиолета в течение 24 часов или дольше после выполнения этого метода.
  2. Используйте две пары стерильных щипцов для выполнения описанных ниже действий. Все нижеперечисленные шаги должны быть выполнены в ССП.
  3. С помощью щипцов извлеките из упаковки готовый стерильный вкладыш на 24 лунки. Установите вкладыш внутрь стерильной чашки Петри и накройте крышкой.
  4. Повторите для необходимого количества бактериальных вставок. Переложите чашку Петри с флипвеллерами из инкубатора в BSC и отложите на противоположную сторону чашки с бактериальными вставками.
  5. Извлеките 300 мкл среды DMEM с апикальной (верхней) стороны Flipwell, чтобы освободить бактериальную вставку. Оставьте около 200 мкл на верхней стороне стека FCI. Накройте вставные узлы крышкой чашки Петри.
  6. Добавьте 50-100 мкл культуры B.subtilis в 24-луночные бактериальные вставки. Следите за тем, чтобы не пролить или не загрязнить внешнюю стенку и ободок бактериальной вставки. OD600 можно принимать для контроля фазы роста культуры.
  7. Стерильными щипцами поднимите бактериальный вкладыш с культурой и осторожно введите его внутрь верхней стороны Flipwell. Поверните кронштейн и повесьте его на край стека FCI. Удерживайте стопку вторым комплектом стерильных щипцов.
  8. Повторите то же самое для остальных стеков FCI. Накройте чашку Петри крышкой и отдохните внутри BSC 3 часа. Не заносите внутрь инкубатор.
  9. Через 3 ч с помощью стерильных щипцов удалите бактериальный вкладыш из Flipwell. Повторите эти действия для остальных сборок вставки. Выбросьте бактериальные вставки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбрасывайте бактерии и бактериальные вкладыши в соответствии с политикой учреждения по утилизации биологически опасных отходов и рекомендациями по технике безопасности и охране здоровья. Бактериальные компоненты или сама бактерия не исследовались.
  10. Для анализа изменений слизистой, эпителиальных и иммунных клеточных компартментов приступают к промывке мембран и подготовке их к визуализации.
  11. Отсасывайте среду DMEM из верхней части Flipwell. Вымойте 500 μL стерильного PBS. С помощью щипцов поднимите стек FCI из чашки Петри и перенесите его в новую чашку Петри.
  12. Переверните Flipwell и повесьте его на край чашки Петри. Промойте мембрану 500 мкл стерильного PBS.
  13. Если требуется хранение, храните стеки FCI в течение короткого времени (30 минут на ночь) в стерильном PBS внутри конической пробирки объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно определить, какой метод визуализации будет использоваться следующим и будет ли мембрана разрезана пополам как для электронной микроскопии, так и для мечения флуоресцентными антителами.

13. Разборка Flipwell для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)

Примечание: Для изучения морфологических изменений в эпителиальных клетках толстой кишки и макрофагах после лечения SEP/бактерий мы зафиксировали мембраны в фиксирующем буфере, а затем разобрали Flipwell для сканирующей электронной микроскопии (SEM). ПФА использовали в качестве фиксатора; Тем не менее, можно использовать и глутаральдегид. Важно проконсультироваться с микроскопическим центром о предпочтительном буфере для фиксации, конкретных этапах дегидратации и начальных концентрациях в буфере для фиксации. Мембраны могут храниться в фиксирующем буфере, если это необходимо. Работа может быть выполнена за пределами ССП. Если ядро визуализации будет приклеивать мембрану, его можно разрезать пополам и расположить так, чтобы изображение с обеих сторон было отдельно.

  1. Используя устойчивый к растворителям маркер, пометьте пластиковые стороны стека FCI символом, кодирующим тип используемой ячейки. В качестве альтернативы можно пометить мембрану непосредственно точкой, галочкой или крестиком, чтобы обозначить тип используемой клетки.
  2. Поместите флипвелл в коническую пробирку объемом 50 мл без разборки. Добавьте 4% PFA достаточно, чтобы погрузить стопку. Держите в 4% PFA в течение ночи.
    1. Чтобы получить 4% PFA (без метанола), растворите 40 г параформальдегида в 800 мл 1x PBS. Чтобы получить 0,4% PFA, растворите 4 г параформальдегида в 800 мл 1x PBS или разбавьте 4% PFA 1:10 с 1x PBS, добавив 100 мл 4% PFA к 900 мл 1x PBS.
  3. Обменяйте PFA на 0,4% для более длительного хранения. Обратитесь к микроскопическому керну за информацией о продолжительности хранения и буферах.
  4. Чтобы разобрать Flipwell, придерживайте его обеими руками и откручивайте каждую склеенную часть стопки. Стек будет разобран на две части: в одной части будет мембрана, а в другой будет вкладыш без мембраны. Выбросьте вставку без мембраны.
  5. Поверните вставку с мембраной и опустите ее мембраной вверх. Можно пометить мембрану маленькой точкой или крестиком по краю мембраны, чтобы знать, с какой стороны находится какой тип клеток.
  6. Держите вставку у стены щипцами. Аккуратно вырежьте мембрану лезвием скальпеля и поместите ее внутрь пробирки объемом 1,7 мл или небольшого стеклянного флакона с 500 мкл-1 мл 0,4%-4% раствора PFA.
  7. Отправьте на микроскопию для этапов обезвоживания и визуализации. Этапы обезвоживания описаны в Beamer et al7.
  8. Выбросьте PFA или другие фиксаторы в соответствии с предписанной организацией политикой утилизации опасных отходов и рекомендациями по охране труда и технике безопасности.

14. Метод с крупными каплями для разбора Flipwell для конфокальной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Был создан новый метод окрашивания и получения изображений мембран. Стек ко-культуральных вкладышей оставался нетронутым с начальной фиксацией, пермеабилизацией и блокировкой, выполненными внутри конической пробирки объемом 50 мл. Иммунофлуоресцентное мечение и конфокальная микроскопия были использованы для визуализации обеих сторон мембраны. Новый метод 12-луночных планшетов использовался для этапов ночной инкубации, а метод с крупными каплями использовался для окрашивания дна разобранной вставки. Конфокальный Z-стек использовался для визуализации обеих сторон мембраны. Окрашенные мембраны были зажаты между двумя круглыми стеклянными покровными стеклами, а многослойная сборка была помещена посередине между двумя металлическими кольцами коммерчески изготовленной круглой камеры для изображения. Многофотонный лазерный сканирующий конфокальный микроскоп использовался с коммерческим программным обеспечением для визуализации.

  1. Чтобы промыть мембрану, поместите вставку ко-культуры непосредственно в коническую пробирку объемом 50 мл и добавьте 15 мл стерильного PBS или промойте каждую сторону отдельно (описано ниже).
  2. Отсадите DMEM и добавьте 300 μL стерильного PBS на апикальную сторону. Отсадите PBS и осторожно снимите стопку с чашки Петри.
  3. Переверните Flipwell и добавьте 300 μL PBS к направленному вверх RPMI стека FCI. Аспирация PBS.
  4. Используйте устойчивый к растворителям маркер на верхней и нижней сторонах стопки, чтобы знать, на какой стороне находится какой тип ячейки.
  5. Поместите Flipwell в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте 15 мл стерильного 4% PFA в качестве исходного фиксирующего буфера на 10 минут. Если необходима ночная инкубация, обменяйте на 15 мл 0,4% PFA в PBS, накройте крышкой и оставьте на ночь.
  6. Чтобы приступить к иммуноокрашиванию, выделите место на скамейке для метода с крупными каплями.
    Оторвите куски полиэтиленовой пленки размером 10 х 14 дюймов и прикрепите ее к скамейке по углам, чтобы создать гладкую поверхность.
  7. С помощью пипетки объемом 200 мкл создайте крупную каплю с 200 мкл PBS. Скрутите вставку в сборе, чтобы она разделилась на вставки.
  8. Используя устойчивый к растворителям маркер, поместите маленькую точку близко к краю одной из сторон мембраны, чтобы узнать, какой тип клеток используется для окрашивания и визуализации.
  9. Удалите остатки силиконовой прокладки со вставки-дна, если на вставке с мембраной все еще остались остатки клея. Это делается для того, чтобы вкладыш оставался в вертикальном положении при выполнении описанных ниже действий.
  10. Осторожно расположите блок FCI (с элементами THP-1) поверх большой капли PBS объемом 200 мкл. Добавьте 200 μл буфера для пермеабилизации на верхнюю сторону с эпителиальными клетками толстой кишки и настаивайте 10 минут.
    1. Для приготовления пермеабилизационного буфера используйте 0,1% v/v Triton-X100 в PBS.
  11. Отсадите и добавьте 200 мкл PBS. Повторите эту стирку 2 раза. Создайте новую каплю с 250 мкл блокирующего буфера.
    1. Чтобы сделать блокирующий буфер, добавьте 250 μL обычной козьей сыворотки в 5 мл 1x PBS (финальная 5% сыворотка). Добавьте 15 μL Triton-X100 (итоговые 0,3% v:v). Хорошо перемешайте и храните при температуре 4 °C в течение 1-2 дней.
  12. Поместите вставку поверх блокирующего буфера. Заблокировать на 30 минут при комнатной температуре. Аспирируйте PBS с апикальной стороны и добавьте 200 мкл блокирующего буфера в верхнюю часть вставки. Теперь обе стороны мембраны готовы к окрашиванию антителами в течение ночи.

15. Иммунофлуоресцентное (ПЧ) окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание производится в течение ночи методом 12-луночных планшетов или на стенде методом крупных капель.

  1. Подготовьте необходимые антитела для окрашивания обеих сторон мембраны в течение ночи при 4 °C или на стенде в режиме ОТ. Разведите все антитела 1:100 в 1% BSA в PBS. В качестве альтернативы следуйте рекомендациям производителя и оптимизируйте окрашивание, чтобы определить идеальные концентрации и буфер для разведения антител.
  2. Метод с крупными каплями
    1. Создайте большой прямоугольник с помощью полиэтиленовой пленки поверх скамейки и заклейте углы скотчем. Пипетку 200 мкл антитела разводят поверх пластика до создания крупной капли. Поместите вставную мембрану вниз поверх крупной капли.
    2. Добавьте 200 μL первичного Ab в верхнюю часть вставки. Инкубировать при RT в течение 2 ч.
  3. 12-луночный планшетный метод
    1. При использовании метода с 12-луночными планшетами в течение ночи добавьте 300 мкл первичного антитела в верхнюю часть вкладыша.
    2. Добавьте 300 мкл первичного антитела в лунку 12-луночного планшета. Поместите вставку внутрь 12-луночной пластины в лунку сверху капли. Накройте тарелку крышкой и поставьте ее при температуре 4 °C на ночь.
  4. Когда окрашивание будет завершено, промойте обе стороны мембраны PBS. С помощью пипетки и наконечника объемом 200 мкл тщательно промойте нижнюю сторону вкладыша 3 раза 200 мкл PBS. Верхнюю часть вкладыша промыть, добавив 200 μL PBS в верхнюю часть, отсасывая и повторяя стирку 3 раза.
  5. Приготовьте все вторичные антитела (см. Таблицу материалов для конкретных используемых антител) в соответствии с рекомендациями производителя или разбавьте 1:1000 в 1% BSA в PBS или другими. Окрашивание вторичными антителами необходимо проводить в темноте; Используйте картонную коробку или ящик шкафа для создания среды, свободной от света.
  6. Используя метод крупных капель или метод 12-луночных планшетов, подготовьте новую стерильную пластину. Инкубировать в течение 2 ч при РТ в темноте. Стирайте, как описано в пункте 15.4.

16: Подготовка к конфокальной визуализации

  1. Если мембрана еще не помечена, как описано в шаге 14, пометьте ее, чтобы узнать местоположение типа клетки. Поставьте маленькую отметку (точка, х, галочка и т. д.) маркером, устойчивым к растворителям, в любом месте (предпочтительно по краю).
  2. Осторожно извлеките круглые крышки из контейнера для хранения и аккуратно установите их на поверхность скамейки.
  3. Разбавьте DAPI в PBS при разведении 1:100. Для дозирования DAPI с помощью дозатора капель добавьте 1-3 капли в середину покровного листа. В противном случае пипеткой заправьте 1-3 капли DAPI в середину покровного стекла.
  4. Удерживайте вкладыш щипцами. Аккуратно вырежьте мембрану лезвием скальпеля круговыми движениями по всему краю/краю. Не допускайте, чтобы мембрана упала на скамейку. Положите пластиковый вкладыш на скамью и удерживайте мембрану щипцами, одновременно отрезая последние волокна лезвием скальпеля.
  5. Поместите вставку вниз на верхнюю часть DAPI. Нанесите 1-3 капли DAPI (в соотношении 1:100) на верхнюю часть мембраны так, чтобы на обеих сторонах мембраны был DAPI.
  6. Поднимите вверх крышку второго раунда пальцами (надевайте СИЗ). Не используйте щипцы, так как покровное слип очень хрупкое.
  7. Совместите второе защитное стекло с первым покровным стеклом и осторожно опустите его поверх мембраны.
  8. Используя устойчивый к растворителям маркер, при необходимости тщательно промаркируйте сторону скольжения крышки, чтобы указать тип/ориентацию ячейки (необязательно). Если на мембране была нанесена маркировка, пропустите этот шаг.
  9. В зависимости от количества покровных крышек, которые необходимо сфотографировать, и количества доступных металлических колец, либо установите покровные стекла между коммерчески изготовленными металлическими кольцами, чтобы удерживать круглые покровные стекла вместе для визуализации, либо храните их в темноте до получения изображения.
  10. Для получения изображения закрепите защитное стекло с мембраной между металлическими кольцами камеры клетки и поместите его в держатель конфокального микроскопа. Прежде чем обратиться к керну конфокальной микроскопии, чтобы узнать, какой держатель может потребоваться для визуализации круглых защитных колпачков.
  11. Когда все будет готово к изображению, заверните каждый бутерброд в алюминиевую фольгу и отнесите его на объект.
  12. Используя функцию Z-стека, сканируйте каждую сторону мембраны по отдельности, используя правильную длину волны в зависимости от используемых флуорофоров. Отразите и изобразите вторую сторону. Для хранения покровных стекол храните их в темноте при температуре 4 °C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы определить биологическую значимость кокультур Flipwell кишечных бактерий, эпителия толстой кишки и макрофагов, мы обрабатывали сокультуры сепиаптерином (SEP), модулятором метаболизма аргинина, чтобы стимулировать продукцию оксида азота 9,10,11 по сравнению с контрольным ДМСО. Мы определили влияние лечения SEP на каждый компонент кокультур с помощью иммунофлуоресцентной (ИФ) микроскопии и с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Чтобы воссоздать архитектуру слизистой оболочки кишечника in vitro, мы разработали простую систему совместного культивирования, которая включает в себя стратифицированные слои кишечных бактерий, эпителиальные клетки толстой кишки, продуцирующие слизь, и макрофаги. Эта мультикультуральная система позволила нам изучить влияние перекрестных помех между бактериальным секретомом, эпителием кишечника и макрофагами на индуцирование иммуногенного перепрограммирования и защитных механизм...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящим авторы отказываются от всех гарантий, явных или подразумеваемых, в максимальной степени, разрешенной законом. Ни при каких обстоятельствах авторы не несут ответственности, будь то по какому-либо закону, контракту, деликту или любой другой правовой теории, за какие-либо специальные, случайные, косвенные, штрафные, множественные или косвенные убытки, возникающие в результате или связанные с использованием инструментов при создании Flipwells, использованием реагентов BSL, клеточных линий, бактериальных культур, использованием системы Flipwell в анаэробной среде в анаэробной камере. Данное ограничение ответственности включает, помимо прочего, любой неопределенный способ использования Flipwell, прямо не описанный в настоящем документе.

Благодарности

Основной автор выражает искреннюю благодарность доктору Саори Фурута за ее превосходные навыки наставничества, постоянное руководство и поддержку на больших расстояниях, а также умелое и непрерывное проектирование проектов, которые создают фантастические возможности для обучения. Авторы также благодарят доктора Вандану Шарму за опыт и руководство в области микробиологии и доктора Веани Р. Фернандо за получение макрофагов THP-1.  Кроме того, авторы благодарят докторов Эндрю Кляйнхенца и Уильяма Т. Ганнинга из Центра электронной микроскопии, а также Кассандру Замору и Кристин Киршбаум из Центра приборостроения в Университете Толедо за конструктивные предложения по электромагнитной визуализации. Эта работа была поддержана стартап-фондом из кампуса медицинских наук Университета Толедо, Колледжа медицины и наук о жизни, факультета биологии рака в Сан-Франциско; Грант на повторное исследование рака в Огайо (Проект #: 5017) для S.F; Премия Общества медицинских исследований (Фонд Толедо, #206298) С.Ф.; Грант Американского общества по борьбе с раком (RSG-18-238-01-CSM) для S.F; и исследовательский грант Национального института рака (R01CA248304) для SF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,4% PFA (см. рецепт в разделе Реагенты и растворы)описано в тексте
10-мл серологическая пипеткаКорнинг4488
12-скважинная TC Plate   CostarКорнинг3513
Конические трубки объемом 15 мл, SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 и микро; l чаевые США Scientific1111-1700
24-ядровые вставки — вставка для посевов для пластин с 24 лунками, PET 0.4 и micro; m BrandTech Scientific782710
3D Flipwells готовые, стерилизованные по ультрафиолету и bbsp;Сделайте в лаборатории
4% PFA (см. рецепт в разделе «Реагенты и растворы»)описано в тексте
50 мМ бульи Сепиаптерина (SEP, см. рецепт в разделе «Реагенты и раствор»).Карьера в Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Конические трубки объемом 50 млGreiner Bio-One227261
5-мл серологическая пипеткаКорнинг4487
70-95% этанол (этиловый спирт)Decon Labs04-355-151
Алюминиевая фольгаFisher Scientific01-213-100
Иглы для кормления животных, 20 гейдж 1,5" длина, одноразовое использование Fisher Scientific01-208-87
Буфер разбавления антител (см. рецепт в разделе «Реагенты и растворы»)описано в тексте
Камера аттофторных клеток  ThermoFisher ScientificA7816
Лента автоклаваFisher Scientific15-901-111
Штаммы Bacillus subtilis wt (3A1T) в глицериловом запасе ()Центр генетического запаса бацилл (https:// bgsc. org/
Перчатки BioGrip Pink Pink Nitrile без пудры без латексаПроизводство высочайшего качестваP2810
Блокирующий буфер (см. рецепт в разделе «Реагенты и растворы — 10% нормальная козья сыворотка» в PBS)описано в тексте
Блокирующий буфер (см. рецепт в разделе Реагенты и решения)описано в тексте
Микроскоп Brightfield (Nikon или аналог) Eclipse Ts2NikonTS2
Клетки Caco-2ATCCHTB-37
Инкубатор клеточной культуры, 37°; C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)Эппендорф6734010015
Центрифуга (Eppendorf, центрифуга 5804/5804 R или эквивалентЭппендорф22622501
Центрифугные трубки 50 мл SpectraTubeAlkali ScientificC2750
Вставка для 12-луночных пластин, ПЭТ, 0,4 и микро; m, стерильнаяBrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT782730
Монтажная среда DAPI VectaShieldVector LaboratoriesH-1000
Глубокие дно чашки Петри, 100 x 25 мм Deep Polystyrroll Stackable Петри Тарелка, стерильная и nbsp;США Scientific8609-0625
Drummond Pipet Aid XPDrummond 4-000-101
Центрифуга Eppendorf 5804 с вращающимся ротором для конических трубок объемом 50 млЭппендорф22622501
Щипцы, нержавеющая сталь, стерильный автоклав, 2 комплектаVWR82027-438
Щипцы, нержавеющая сталь, стерильный автоклав, 2 комплекта, Sample PinpsVWR82027-438
Стеклянная колба 500 млCorning 4980-500
Гемацитометр (Нойбауэр с прикрытиями)Термо Фишер Сайентифик50-312-90
Клетки HT-29-MTX-E12Миллипор Сигма12040401
ImmunoPen (опционально)Fisher Scientific4021761EA
Перчатки на основе кевлара или другие устойчивые к порезу перчатки (опционально)Хозяйственный магазин или Amazon
Лабораторная лента или транспортная лентаFisher Scientific 159015R
Ламинарный потоковый капюшок 1300 серии A2 BSC класс IIThermoFisher Scientific1375
Ламинарный капюшон с ультрафиолетовой лампой SterilGARDКомпания BakerSG403A-HE
Доказательство растворителя маркеровVWR52877-310 или 95042-566
Среда для клеток Caco-2 (на основе DMEM с высоким содержанием глюкозы, см. рецепт в разделе «Реагенты и растворы»)описано в  СМС
Среда для клеток HT-29 (DMEM High Glucose, см. рецепт в Reagents and Solutions)описано в тексте
Среда для клеток THP-1 (RPMI, см. рецепт в Reagents and Solutions)описано в тексте
Трубка для микроцентрифуга, 1,7 мл, стерильная и bbsp;Alkali ScientificC3017-ST
Микроцентрифугальные трубкиТермо Фишер3451
Медиа Miller LB (см. рецепт в разделе «Реагенты и растворы»)Сигма-Олдрич  L3522
Плоскогубцы с игольчатыми носами, 2 комплектаХозяйственный магазин или Amazon
Перчатки без нитриловой пудры без латекса Aurelia AmazingMidSci92885
Крышки чашки Петри, стерильные чашки Falcon Petri Bowl, стерильный стиль 100x15 ммКорнинг Инк.351029
Фосфорол-миристатный ацетат (ПМА) (100 нг/&м; l, см. рецепт в разделе Реагенты и растворы) InvivoGenTlrl-pma
Наконечники пипетов (10 и микро; l, 200 и микро; l, 1000 и микро; l) PurePoint или эквивалентAlkali Scientific ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Пищевая плёнкаПродуктовый магазин
Рабочий раствор коллагеназы Purecol (100 µ g/mL)Advanced BioMatrix5005-100МЛ
Круглые крышки #1 1 унция (Corning Float Glass или Fisherbrand)Корнинг или Фишербранд50143822 или 12-546-2 25CIR-2
Лезвия скальпеля, стерильные, одноразовые и nbsp;Mopec или Feather #10AJ136 или 2975#10
Сепиаптерин (SEP, 100 и микро; М, см. рецепт в разделе Реагенты и раствор)Карьера в Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Встряхивающий инкубатор настроен на 220 об/мин 37&°; CЭппендорф, Нью-Брансуик СайентификM12990080
Силиконовый клей Loctite Clear Silicone IDH или 3M Marine Grade Silicone Sealant Clear с носовым наконечникомLoctite или 3M1745658 или PN08019
Одноканальная пипета Eppendorf Research Plus, 200 µ lЭппендорф
Одноканальные пипетки (10 и микро; l, 200 и микро; l, 1000 и микро; l)Эппендорф2231001122
Спектрофотометр NanoDropOneCТермо Фишер Сайентифик13-400-519
Стерильная деионизированная вода   
Стерильный фосфатный буферный серин (PBS) без кальция и магнияFisher Scientific  BSS-PBS-1X6
Шприц 3 мл или 5 мл с наконечником Luer-LokBD309585 или 309603
Ячейки THP-1ATCCTIB-202
Трансферные пипетки, стерильныеФишербранд13-711-20
Triton X-100Миллипор СигмаX100
Раствор Trypan BlueVWR97063-702
Трипсин-ЭДТА 0,25%Термо Фишер Сайентифик25200-056
Салфетки Kimwipes Professional с LintGuard Anti-Stat PolyshieldКимберли-Кларк34120
<сильные>первичные антитела: 
Античеловеческий CD163Abcam156769
Античеловеческий CD68Novus BiologicalsNB100-683-0,1 мг
Античеловеческий CD80, E3Q9VТехнологии сотовой сигнализации15416
Античеловеческий CK20 Жизненные технологииPA5-82875
Античеловеческий MUC2 (996/1)ThermoFisherMA5-12345
<сильные>вторичные антитела:
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (для CD80 и CK20)ThermoFisherA11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (для MUC2 и CD68 или CD163)ThermoFisherA11005
<сильные>реагенты и растворы:   
<Сильный>Како-2 Средний:
DMEM с высоким уровнем глюкозы (4,5 г/л) и 1% (v:v) GlutaMax Термо Фишер Сайентифик35050061
FBS 10% (v:v) инактивирован тепломСигмаF2242-500ML
Незаменительные аминокислоты — 1% для среды Caco-2Термо Фишер Сайентифик11140076
Пен-стрептокок 1% (v:v)СигмаF2242-500ML
<сильный>HT-29-MTX средний
DMEM с высоким уровнем глюкозы (4,5 г/л) и 1% (v:v) GlutaMax Термо Фишер Сайентифик35050061
FBS 10% (v:v) инактивирован тепломСигмаF2242-500ML
HEPES (итоговая концентрация 10 мм)Термо Фишер Сайентифик15630080
Пен-стрептокок 1% (v:v)СигмаF2242-500ML
<сильный>THP-1 Средний:
FBS (10% v:v) сыворотка плода бычьего скота с инактивированной теплойSigma F2242-500ML
Глюкоза (конечная концентрация 4,5 г/л)Термо Фишер СайентификA249001
GlutaMax 1% (v:v)  Итоговая концентрация 2 мМТермо Фишер Сайентифик35050061
HEPES (итоговая концентрация 10 мм)Термо Фишер Сайентифик15630080
Пен-стрептокок 1% (v:v)СигмаF2242-500ML
Мемориальный институт Росвелл-Парк (RPMI) — средний 1640 годТермо Фишер Сайентифик11875119
Пируват натрия (конечная концентрация 1 мм)Термо Фишер Сайентифик11360070
<сильный>Purecol рабочий раствор коллагеназы (разбавление до 1:30 100 & микро; g/ml):
Purecol 3 мг/мл 1:30–100 и микро; g/ml Advanced BioMatrix5005-100МЛ
стерильная деионизированная вода
<сильный>L-Сепиаптерин стоковый раствор (50 мМ):
L-Сепиаптерин (SEP)Карьера в Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
<сильный>Форбол миристатный ацетатный раствор (PMA, 5 мг/мл)InvivoGenTlrl-pma
BSA 1% бычий сывороточный альбумин Сигма-Олдрич5470
DMSO Sigma D2650
Миллер ЛБСигма-Олдрич  L3522
Нормальная сыворотка того же вида, что и вторичное антителоSigma NS02L-1ML
ПараформальдегидСигма-Олдрич441244

Ссылки

  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al. Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer. PLoS One. 9 (1), e83744(2014).
  3. Yoo, J. Y., Groer, M., Dutra, S. V. O., Sarkar, A., McSkimming, D. I. Gut Microbiota and Immune System Interactions. Microorganisms. 8 (10), 1587(2020).
  4. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E7-E15 (2016).
  5. Donkers, J. M., Eslami Amirabadi, H., van de Steeg, E. Intestine-on-a-chip: Next level in vitro research model of the human intestine. Curr Opinion Toxicol. 25, 6-14 (2021).
  6. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Sci Rep. 7, 45270(2017).
  7. Beamer, M. A., et al. Novel 3D Flipwell system that models gut mucosal microenvironment for studying interactions between gut microbiota, epithelia and immunity. Sci Rep. 13 (1), 870(2023).
  8. Beamer, M. A., Furuta, S. Redefining Cell Culture Using a 3D Flipwell Co-culture System: A Mimetic for Gut Architecture and Dynamics In Vitro. Curr Protoc. 5 (2), e70107(2025).
  9. Fernando, V., et al. Reprogramming of breast tumor-associated macrophages with modulation of arginine metabolism. Life Sci Alliance. 7 (11), e202302339(2024).
  10. Sharma, V., et al. Immunogenic shift of arginine metabolism triggers systemic metabolic and immunological reprogramming to suppress HER2 + breast cancer. Cancer Metab. 13 (1), 15(2025).
  11. Zheng, X., et al. Correction of arginine metabolism with sepiapterin-the precursor of nitric oxide synthase cofactor BH(4)-induces immunostimulatory-shift of breast cancer. Biochem Pharmacol. 176, 113887(2020).
  12. Ren, G., et al. Reduced Basal Nitric Oxide Production Induces Precancerous Mammary Lesions via ERBB2 and TGFβ. Sci Rep. 9 (1), 6688(2019).
  13. Trejo, M., et al. Elasticity and wrinkled morphology of Bacillus subtilis pellicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (6), 2011-2016 (2013).
  14. Sadaghian Sadabad, M., et al. A simple coculture system shows mutualism between anaerobic faecalibacteria and epithelial Caco-2 cells. Sci Rep. 5, 17906(2015).
  15. Umehara, Y., Aoyagi, H. Development of a simple cultured cell-anaerobic microbial co-culture system using liquid paraffin. J Biosci Bioeng. 135 (6), 487-492 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3D-сокультивированиемодель слизистой оболочки кишечникабактериальный секретомполяризация иммунных клетокэпителиальные клетки толстой кишкиполяризация макрофаговформирование биопленокобработка сепиаптериномиммунофлуоресцентное окрашивание
3D Flipwell Engineering для разработки асинхронных систем токсикологической и иммуномодулирующей терапии бактериальных, кишечных и иммунных клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.