3D Flipwell Engineering для разработки асинхронных систем токсикологической и иммуномодулирующей терапии бактериальных, кишечных и иммунных клеток

Maria A. Beamer; Saori Furuta

doi:10.3791/68701

Method Article

3D Flipwell Engineering для разработки асинхронных систем токсикологической и иммуномодулирующей терапии бактериальных, кишечных и иммунных клеток

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

Maria A. Beamer¹ , Saori Furuta²

¹Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, ²MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье представлен подробный протокол с ключевыми шагами для руководства проектированием и использованием 3D Flipwell. Мы описываем и показываем, как собирать стеки вкладышей для совместной культуры и использовать их для совместного культивирования стратифицированных слоев кишечных бактерий, кишечного эпителия и макрофагов для моделирования среды слизистой оболочки кишечника.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения роли бактериального секретома в поляризации иммунных клеток и гомеостазе слизистой оболочки кишечника мы разработали трехмерную модель ко-культуры с использованием коммерчески доступных вставок в формате «друг за другом». Мы назвали эту систему 3D Flipwells и успешно совместно культивировали бактерии, эпителиальные и иммунные клетки толстой кишки в стратифицированных слоях, чтобы повторить микроокружение слизистой оболочки кишечника. Эта система совместного культивирования позволяет засеивать эпителиальные клетки толстой кишки с одной стороны мембраны и недифференцированные неадгезивные моноциты с другой, обеспечивая синхронное прогрессирование поляризации эпителия толстой кишки, образование слизи, а также дифференцировку и поляризацию моноцитарно-макрофагов в пределах одной кокультуры без необходимости отделения и повторного покрытия предварительно дифференцированных макрофагов. Эта система проста в изготовлении и требует всего нескольких легкодоступных материалов и инструментов. Мы проверили его полезность, проанализировав реакцию компонентов кокультуры на сепиаптерин (SEP), эндогенный предшественник BH₄ (тетрагидробиоптерин) – кофактор синтазы оксида азота (NOS). Мы продемонстрировали, что обработка SEP 3D Flipwell индуцирует образование биопленки кишечными бактериями, продукцию слизи эпителием толстой кишки и проиммуногенную поляризацию макрофагов. Это указывает на то, что SEP запускает активацию защитного механизма слизистой оболочки через перекрестные помехи между различными клеточными компонентами. Необходимы дальнейшие эксперименты для изучения роли коммуникаций слизистых оболочек, которые приводят к перепрограммированию иммунных клеток, и для оценки полезности этой системы совместного культивирования для скрининга новых иммуномодулирующих терапий.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перекрестные связи между иммунными клетками и микробиомом кишечника сильно влияют на эффективность различных методов лечения заболеваний. Такие перекрестные помехи заметно изменяются под воздействием внешних стимулов, включая, помимо прочего, метаболические аномалии хозяина, изменения в рационе питания, проявления заболевания и фармакологическое лечение. Эти изменения могут привести к дисбалансу в составе микрофлоры, состоянию, называемому дисбактериозом ^1,2,3.

Чтобы лучше понять взаимодействие между микробами и им....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3D Флипвелл Инжиниринг

Все работы должны проводиться внутри шкафа для клеточных культур. Поместите все принадлежности внутрь шкафа.
Откройте чашку Петри, накройте крышкой и отложите в сторону. Откройте лезвие скальпеля из защитного кожуха и положите его на край дна чашки Петри. Обеспечьте стерильность.
ВНИМАНИЕ: Требуется осторожное обращение с лезвием скальпеля. Используйте устойчивые к порезам перчатки, армированные волокном, чтобы защитить руки при необходимости.
Откройте стерильную защитную упаковку 12-луночного коммерческого вкладыша. Обеспечьте стерильность. Возьмите набор с....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы определить биологическую значимость кокультур Flipwell кишечных бактерий, эпителия толстой кишки и макрофагов, мы обрабатывали сокультуры сепиаптерином (SEP), модулятором метаболизма аргинина, чтобы стимулировать продукцию оксида азота ^9,10,11 по сравнению с контрольным ДМСО. Мы определили влияние лечения SEP на каждый компонент кокультур с помощью иммунофлуоресцентной (ИФ) микроскопии и с.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы воссоздать архитектуру слизистой оболочки кишечника in vitro, мы разработали простую систему совместного культивирования, которая включает в себя стратифицированные слои кишечных бактерий, эпителиальные клетки толстой кишки, продуцирующие слизь, и макрофаги. Эта мультикультуральная система позволила нам изучить влияние перекрестных помех между бактериальным секретомом, эпителием кишечника и макрофагами на индуцирование иммуногенного перепрограммирования и защитных механизм.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Настоящим авторы отказываются от всех гарантий, явных или подразумеваемых, в максимальной степени, разрешенной законом. Ни при каких обстоятельствах авторы не несут ответственности, будь то по какому-либо закону, контракту, деликту или любой другой правовой теории, за какие-либо специальные, случайные, косвенные, штрафные, множественные или косвенные убытки, возникающие в результате или связанные с использованием инструментов при создании Flipwells, использованием реагентов BSL, клеточных линий, бактериальных культур, использованием системы Flipwell в анаэробной среде в анаэробной камере. Данное ограничение ответственности включает, помимо прочего, любой неопределенный способ использования Flipwell, прямо не описанный в настоящем документе.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основной автор выражает искреннюю благодарность доктору Саори Фурута за ее превосходные навыки наставничества, постоянное руководство и поддержку на больших расстояниях, а также умелое и непрерывное проектирование проектов, которые создают фантастические возможности для обучения. Авторы также благодарят доктора Вандану Шарму за опыт и руководство в области микробиологии и доктора Веани Р. Фернандо за получение макрофагов THP-1. Кроме того, авторы благодарят докторов Эндрю Кляйнхенца и Уильяма Т. Ганнинга из Центра электронной микроскопии, а также Кассандру Замору и Кристин Киршбаум из Центра приборостроения в Университете Толедо за к....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
0,4% PFA (см. рецепт в разделе Реагенты и растворы)	описано в тексте
10-мл серологическая пипетка	Корнинг	4488
12-скважинная TC Plate Costar	Корнинг	3513
Конические трубки объемом 15 мл, SpectraTube	Alkali Scientific	C2715
200 и микро; l чаевые	США Scientific	1111-1700
24-ядровые вставки — вставка для посевов для пластин с 24 лунками, PET 0.4 и micro; m	BrandTech Scientific	782710
3D Flipwells готовые, стерилизованные по ультрафиолету и bbsp;	Сделайте в лаборатории
4% PFA (см. рецепт в разделе «Реагенты и растворы»)	описано в тексте
50 мМ бульи Сепиаптерина (SEP, см. рецепт в разделе «Реагенты и раствор»).	Карьера в Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Конические трубки объемом 50 мл	Greiner Bio-One	227261
5-мл серологическая пипетка	Корнинг	4487
70-95% этанол (этиловый спирт)	Decon Labs	04-355-151
Алюминиевая фольга	Fisher Scientific	01-213-100
Иглы для кормления животных, 20 гейдж 1,5" длина, одноразовое использование	Fisher Scientific	01-208-87
Буфер разбавления антител (см. рецепт в разделе «Реагенты и растворы»)	описано в тексте
Камера аттофторных клеток	ThermoFisher Scientific	A7816
Лента автоклава	Fisher Scientific	15-901-111
Штаммы Bacillus subtilis wt (3A1T) в глицериловом запасе ()	Центр генетического запаса бацилл (https:// bgsc. org/
Перчатки BioGrip Pink Pink Nitrile без пудры без латекса	Производство высочайшего качества	P2810
Блокирующий буфер (см. рецепт в разделе «Реагенты и растворы — 10% нормальная козья сыворотка» в PBS)	описано в тексте
Блокирующий буфер (см. рецепт в разделе Реагенты и решения)	описано в тексте
Микроскоп Brightfield (Nikon или аналог) Eclipse Ts2	Nikon	TS2
Клетки Caco-2	ATCC	HTB-37
Инкубатор клеточной культуры, 37°; C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)	Эппендорф	6734010015
Центрифуга (Eppendorf, центрифуга 5804/5804 R или эквивалент	Эппендорф	22622501
Центрифугные трубки 50 мл SpectraTube	Alkali Scientific	C2750
Вставка для 12-луночных пластин, ПЭТ, 0,4 и микро; m, стерильная	BrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT	782730
Монтажная среда DAPI VectaShield	Vector Laboratories	H-1000
Глубокие дно чашки Петри, 100 x 25 мм Deep Polystyrroll Stackable Петри Тарелка, стерильная и nbsp;	США Scientific	8609-0625
Drummond Pipet Aid XP	Drummond	4-000-101
Центрифуга Eppendorf 5804 с вращающимся ротором для конических трубок объемом 50 мл	Эппендорф	22622501
Щипцы, нержавеющая сталь, стерильный автоклав, 2 комплекта	VWR	82027-438
Щипцы, нержавеющая сталь, стерильный автоклав, 2 комплекта, Sample Pinps	VWR	82027-438
Стеклянная колба 500 мл	Corning	4980-500
Гемацитометр (Нойбауэр с прикрытиями)	Термо Фишер Сайентифик	50-312-90
Клетки HT-29-MTX-E12	Миллипор Сигма	12040401
ImmunoPen (опционально)	Fisher Scientific	4021761EA
Перчатки на основе кевлара или другие устойчивые к порезу перчатки (опционально)	Хозяйственный магазин или Amazon
Лабораторная лента или транспортная лента	Fisher Scientific	159015R
Ламинарный потоковый капюшок 1300 серии A2 BSC класс II	ThermoFisher Scientific	1375
Ламинарный капюшон с ультрафиолетовой лампой SterilGARD	Компания Baker	SG403A-HE
Доказательство растворителя маркеров	VWR	52877-310 или 95042-566
Среда для клеток Caco-2 (на основе DMEM с высоким содержанием глюкозы, см. рецепт в разделе «Реагенты и растворы»)	описано в СМС
Среда для клеток HT-29 (DMEM High Glucose, см. рецепт в Reagents and Solutions)	описано в тексте
Среда для клеток THP-1 (RPMI, см. рецепт в Reagents and Solutions)	описано в тексте
Трубка для микроцентрифуга, 1,7 мл, стерильная и bbsp;	Alkali Scientific	C3017-ST
Микроцентрифугальные трубки	Термо Фишер	3451
Медиа Miller LB (см. рецепт в разделе «Реагенты и растворы»)	Сигма-Олдрич	L3522
Плоскогубцы с игольчатыми носами, 2 комплекта	Хозяйственный магазин или Amazon
Перчатки без нитриловой пудры без латекса Aurelia Amazing	MidSci	92885
Крышки чашки Петри, стерильные чашки Falcon Petri Bowl, стерильный стиль 100x15 мм	Корнинг Инк.	351029
Фосфорол-миристатный ацетат (ПМА) (100 нг/&м; l, см. рецепт в разделе Реагенты и растворы)	InvivoGen	Tlrl-pma
Наконечники пипетов (10 и микро; l, 200 и микро; l, 1000 и микро; l) PurePoint или эквивалент	Alkali Scientific	ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Пищевая плёнка	Продуктовый магазин
Рабочий раствор коллагеназы Purecol (100 µ g/mL)	Advanced BioMatrix	5005-100МЛ
Круглые крышки #1 1 унция (Corning Float Glass или Fisherbrand)	Корнинг или Фишербранд	50143822 или 12-546-2 25CIR-2
Лезвия скальпеля, стерильные, одноразовые и nbsp;	Mopec или Feather #10	AJ136 или 2975#10
Сепиаптерин (SEP, 100 и микро; М, см. рецепт в разделе Реагенты и раствор)	Карьера в Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Встряхивающий инкубатор настроен на 220 об/мин 37&°; C	Эппендорф, Нью-Брансуик Сайентифик	M12990080
Силиконовый клей Loctite Clear Silicone IDH или 3M Marine Grade Silicone Sealant Clear с носовым наконечником	Loctite или 3M	1745658 или PN08019
Одноканальная пипета Eppendorf Research Plus, 200 µ l	Эппендорф
Одноканальные пипетки (10 и микро; l, 200 и микро; l, 1000 и микро; l)	Эппендорф	2231001122
Спектрофотометр NanoDropOneC	Термо Фишер Сайентифик	13-400-519
Стерильная деионизированная вода
Стерильный фосфатный буферный серин (PBS) без кальция и магния	Fisher Scientific	BSS-PBS-1X6
Шприц 3 мл или 5 мл с наконечником Luer-Lok	BD	309585 или 309603
Ячейки THP-1	ATCC	TIB-202
Трансферные пипетки, стерильные	Фишербранд	13-711-20
Triton X-100	Миллипор Сигма	X100
Раствор Trypan Blue	VWR	97063-702
Трипсин-ЭДТА 0,25%	Термо Фишер Сайентифик	25200-056
Салфетки Kimwipes Professional с LintGuard Anti-Stat Polyshield	Кимберли-Кларк	34120
<сильные>первичные антитела:
Античеловеческий CD163	Abcam	156769
Античеловеческий CD68	Novus Biologicals	NB100-683-0,1 мг
Античеловеческий CD80, E3Q9V	Технологии сотовой сигнализации	15416
Античеловеческий CK20	Жизненные технологии	PA5-82875
Античеловеческий MUC2 (996/1)	ThermoFisher	MA5-12345
<сильные>вторичные антитела:
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (для CD80 и CK20)	ThermoFisher	A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (для MUC2 и CD68 или CD163)	ThermoFisher	A11005
<сильные>реагенты и растворы:
<Сильный>Како-2 Средний:
DMEM с высоким уровнем глюкозы (4,5 г/л) и 1% (v:v) GlutaMax	Термо Фишер Сайентифик	35050061
FBS 10% (v:v) инактивирован теплом	Сигма	F2242-500ML
Незаменительные аминокислоты — 1% для среды Caco-2	Термо Фишер Сайентифик	11140076
Пен-стрептокок 1% (v:v)	Сигма	F2242-500ML
<сильный>HT-29-MTX средний
DMEM с высоким уровнем глюкозы (4,5 г/л) и 1% (v:v) GlutaMax	Термо Фишер Сайентифик	35050061
FBS 10% (v:v) инактивирован теплом	Сигма	F2242-500ML
HEPES (итоговая концентрация 10 мм)	Термо Фишер Сайентифик	15630080
Пен-стрептокок 1% (v:v)	Сигма	F2242-500ML
<сильный>THP-1 Средний:
FBS (10% v:v) сыворотка плода бычьего скота с инактивированной теплой	Sigma	F2242-500ML
Глюкоза (конечная концентрация 4,5 г/л)	Термо Фишер Сайентифик	A249001
GlutaMax 1% (v:v) Итоговая концентрация 2 мМ	Термо Фишер Сайентифик	35050061
HEPES (итоговая концентрация 10 мм)	Термо Фишер Сайентифик	15630080
Пен-стрептокок 1% (v:v)	Сигма	F2242-500ML
Мемориальный институт Росвелл-Парк (RPMI) — средний 1640 год	Термо Фишер Сайентифик	11875119
Пируват натрия (конечная концентрация 1 мм)	Термо Фишер Сайентифик	11360070
<сильный>Purecol рабочий раствор коллагеназы (разбавление до 1:30 100 & микро; g/ml):
Purecol 3 мг/мл 1:30–100 и микро; g/ml	Advanced BioMatrix	5005-100МЛ
стерильная деионизированная вода
<сильный>L-Сепиаптерин стоковый раствор (50 мМ):
L-Сепиаптерин (SEP)	Карьера в Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
<сильный>Форбол миристатный ацетатный раствор (PMA, 5 мг/мл)	InvivoGen	Tlrl-pma
BSA 1% бычий сывороточный альбумин	Сигма-Олдрич	5470
DMSO	Sigma	D2650
Миллер ЛБ	Сигма-Олдрич	L3522
Нормальная сыворотка того же вида, что и вторичное антитело	Sigma	NS02L-1ML
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
Xuan, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

3D Flipwell Engineering для разработки асинхронных систем токсикологической и иммуномодулирующей терапии бактериальных, кишечных и иммунных клеток

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles