Методическая статья

Улучшенное редактирование генома с помощью метода электропорации in vivo на основе доставки нуклеиновых кислот яйцевода для генерации мышей с нокаутом

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68704

⸱

26 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

В этой статье

Краткое содержание

Эффективность метода «Улучшенное редактирование генома с помощью доставки нуклеиновых кислот яйцевода» (I-GONAD) сопоставима с традиционной микроинъекцией, которая требует сбора зиготы у самок-доноров и переноса их псевдобеременным самкам. Этот протокол демонстрирует свою эффективность путем введения мутаций, индуцированных CRISPR/Cas9, в локус ROSA26 на хромосоме 6.

Аннотация

Методы создания мышей с нокаутом обычно включают в себя три основных этапа: (1) сбор эмбрионов от самок-доноров, (2) микровведение генетических конструкций в зиготы ex vivo и (3) хирургический перенос их в яйцевод псевдобеременных самок. Этот процесс требует значительного количества животных, так как в нем участвуют не только самки-доноры, но и вазэктомированные самцы и псевдобеременные самки. Кроме того, микроинъекции в цитоплазму или пронуклеус зигот мыши сопряжены с такими проблемами, как закупорка иглой, проблемы с проницаемостью мембран из-за высокой эластичности и потенциальная гибель эмбриона. Разработка передовых электропораторов, таких как Nepa21, предоставляет уникальную возможность создавать мышей с целевыми нокаутами генов за один шаг с помощью метода, известного как улучшенное редактирование генома с помощью доставки яйцеводных нуклеиновых кислот (I-GONAD). Этот метод включает в себя микроинъекцию компонентов CRISPR-Cas (белок Cas9 и направляющая РНК) в яйцеводы беременных самок через 0,7 дня после зачатия с последующей электропорацией in vivo для доставки этих компонентов непосредственно в зиготы. После процедуры I-GONAD беременная мышь вынашивает и рожает детенышей с нокаутом целевого гена. В этой статье представлен подробный пошаговый протокол реализации метода I-GONAD на мышах, предлагающий более эффективную и доступную альтернативу традиционным методам генерации мышей с нокаутом.

Введение

Понимание генетической основы заболеваний имеет решающее значение для выявления молекулярных механизмов, лежащих в основе их этиологии и патогенеза. Ключевым этапом в этом исследовании является разработка животных моделей с целевыми нокаутами генов, которые имитируют заболевания человека. Мыши особенно ценны для этих исследований из-за их общего геномного сходства с человеком, небольшого размера, короткой продолжительности жизни и высокой фертильности. Модели мышей важны как для фундаментальных исследований, так и для доклинических испытаний1.

Чтобы создать нокаутную мышь с использованием системы CRISPR-Cas9, исследователи обычно вводят комплекс направляющей РНК и нуклеазы Cas9 в зиготу, вызывая двухцепочечный разрыв в целевой ДНК и тем самым активируя систему восстановления клетки, чтобы вызвать мутацию в месте разрыва 1,2. Микроинъекция в зиготы остается золотым стандартом для этой цели. Однако этот метод требует нескольких этапов: выделение эмбрионов от самок-доноров, выполнение микроинъекций генетических конструкций в зиготы и хирургический перенос их в яйцеводы псевдобеременных самок. В связи с этим необходимо содержать большое количество животных, включая самок-доноров, вазэктомированных самцов и псевдобеременных самок. Кроме того, выделение зигот обуславливает необходимость эвтаназии самок-доноров. Поэтому предпочтительны протоколы, которые сводят к минимуму использование животных, в соответствии с принципами 3R (Замена, Сокращение, Уточнение)3.

Достижения в технологии электропорации, такие как использование системы Nepa21, предоставляют уникальную возможность создавать мышей с нокаутом генов за один шаг с использованием метода, известного как улучшенное редактирование генома с помощью доставки яйцеводных нуклеиновых кислот (I-GONAD)4. В суперэлектропораторе NEPA21 Type II используется 4-ступенчатая многоимпульсная система электропорации, обеспечивающая высокую эффективность электропорации при сохранении высокой жизнеспособности эмбрионов. I-GONAD включает микроинъекцию компонентов CRISPR-Cas (белок Cas9 (500-600 нг/мкл) и направляющую РНК (80-100 нг/мкл)) в яйцеводы беременных мышей через 0,7 дня после зачатия с последующей электропорацией in vivo для доставки этих компонентов непосредственно в зиготы5. После процедуры I-GONAD у беременной мыши рождаются детеныши с нокаутом целевого гена 6,7,8. Эффективность этого метода варьируется в зависимости от желаемой мишени, но сопоставима со стандартными методами на основе микроинъекций (около 50%)9,10. Кроме того, I-GONAD потенциально может быть адаптирован для редактирования генома у других видов.

В данной статье представлен пошаговый протокол реализации метода I-GONAD для генерации нокаутных мышей. Например, его эффективность была продемонстрирована путем нацеливания на локус генома ROSA26 на 6-й хромосоме мыши. Этот локус был выбран в связи с тем, что он подвергается конститутивной транскрипции без последующей трансляции. Поэтому внесение мутации в этот локус вряд ли окажет негативное влияние на здоровье образовавшихся детенышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования на животных были одобрены Комитетом по этике исследований на животных Санкт-Петербургского государственного университета (Одобрение No 131-03-5 от 11 октября 2022 г.). Все процедуры строго соблюдались в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных. Мышей общего лабораторного аутбредного штамма CD1 получены из Центра коллективного пользования Института физиологически активных соединений Российской академии наук (ИПХА РАН). Самки мышей CD1 в возрасте 2-3 месяцев (средний вес 27-30 г) использовались для спаривания с самцами мышей CD1 в возрасте 2,5-4 месяцев (средний вес 35-37 г). Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Конструирование однонаправляющей РНК (sgRNA) и ее подготовка к трансфекции

  1. Используйте инструменты вычислительного анализа, такие как CHOPCHOP, SYNTHEGO Knockout Guide Design или CRISPOR, для выявления потенциальных последовательностей sgРНК, нацеленных на выбранный ген, представляющий интерес.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение может идентифицировать потенциальные последовательности sgРНК по всему гену и предлагает несколько вариантов на выходе. Эти инструменты подскажут наиболее оптимальные варианты sgRNA и позволят пользователю при необходимости выбирать среди всех выявленных вариантов. При выборе учитывайте следующие критерии:
    1. Близость экзонов: Выбирайте последовательности, расположенные в экзонах, которые находятся как можно ближе к желаемой точке мутации. Для получения лучших результатов рассмотрите альтернативные изоформы сплайсинга и выберите целевую последовательность, которая присутствует в большинстве изоформ. Рассмотрите браузеры генома (например, Ensembl) для точного выбора экзонов.
    2. Нецелевые факторы: Проанализируйте потенциальные нецелевые эффекты с помощью системы оценки инструмента, выбирая последовательности, которые демонстрируют наименьшую прогнозируемую нецелевую активность.
      Примечание: Вычислительные инструменты, такие как CHOPCHOP или Synthego, очень эффективны для оценки близости экзонов и эффектов вне мишени, помогая определить оптимальные последовательности sgRNA для точного редактирования генома. При проектировании направляющих РНК важно учитывать конкретную последовательность интересующего гена в используемом штамме мыши. Для некоторых линий мышей (например, C57Bl, CBA, C3H) доступна полная геномная последовательность. Если такие данные недоступны, может быть целесообразно провести предварительное секвенирование целевого гена в планируемой области редактирования. Одиночные несоответствия в направляющей РНК, вызванные полиморфизмами, могут поставить под угрозу эффективность редактирования. Локус мышиного генома ROSA 26 был нацелен на последовательность sgRNA: 5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAAGA-3'.
  2. Закажите набор праймеров для ПЦР-амплификации матрицы sgRNA, как описано в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: гРНК может быть упорядочена в другом месте, либо как sgRNA, либо как дуплекс crRNA:tracrRNA.
  3. Изготовьте линейный шаблон дцДНК.
    1. Приготовьте мастер-микс, как указано в таблице 1. Добавьте полимеразу в конце и держите основную смесь на льду для поддержания стабильности.
    2. ПЦР проводят при следующих условиях: Начальная денатурация: 30 с при 95 °C; 30 циклов: 20 с при 95 °C (денатурация), 20 с при 55 °C (отжиг), 15 с при 72 °C (растяжение); Окончательное удлинение: 2 мин при 72 °C; Держите при температуре 4 °C.
  4. Используйте реакционную смесь ПЦР в дальнейшей реакции транскрипции in vitro (IVT).
    1. Приготовьте мастер-смесь IVT, как указано в таблице 2 , и инкубируйте в течение 1,5 ч при 37 °C. Используйте амплификатор для постоянного контроля температуры.
    2. Добавьте 2 мкл ДНКазы I и инкубируйте еще 30 мин при 37 °C, чтобы удалить матрицу ДНК.
    3. Инактивировать ДНКазу I путем инкубации реакционной смеси при 75 °C в течение 5 мин.
    4. Очистите РНК с помощью реагента ТРИЗОЛ в соответствии с протоколом производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизация реагента ТРИЗОЛ и ДНКазы1, его растворов или любых побочных продуктов должна быть помещена в специальные контейнеры для химических отходов.
    5. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра (типичный выход одной реакции составляет 3-5 мкг). Проверьте передаточные числа A260/ A280 и A260/A230. Соотношение A260/A280 должно быть не менее 2,0, а соотношение A260/A230 также должно быть не менее 2,0 (что означает отсутствие загрязнения белками или органическими растворителями). Храните sgРНК при температуре -80 °C до использования.
  5. Подготовка смеси РНП к трансфекции
    1. Трансфекционная смесь состоит из комплекса РНП, который представляет собой смесь белка Cas9 и sgРНК. Выполните следующие действия для приготовления смеси РНП:
    2. Разбавьте 1 М Трис-HCl (pH 7,5) буфер до 100 мМ в воде, не содержащей нуклеаз, и отфильтруйте с помощью шприцевого фильтра с размером пор 0,022 μM, аликвотой в порциях 10 μL и храните при температуре 4 °C до использования.
    3. В безнуклеазной пробирке готовят трансфекционную смесь из следующих компонентов в конечных концентрациях: 500 нг/мкл нуклеазы spCas9, 80 нг/мкл sgРНК, 10 мМ Tris-HCl, разбавленной водой, обработанной DEPC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие концентрации компонентов смеси РНП необходимы для обеспечения надлежащей эффективности протокола.
    4. Инкубируйте трансфекционную смесь при 37 °C в течение 10 минут, чтобы обеспечить образование комплекса РНП.
    5. Разложите смесь на небольшие объемы (2 μл), подходящие для одного сеанса I-GONAD.
    6. Поддерживайте аликвоты при температуре 4 °C во время сеанса I-GONAD. Смесь готовится свежей для каждого сеанса электропорации I-GONAD для поддержания стабильности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь RNP должна быть приготовлена свежей для каждого сеанса I-GONAD, чтобы обеспечить оптимальную активность и эффективность.

2. Подготовка самок мышей к редактированию генома с помощью доставки нуклеиновых кислот из яйцеводов

  1. Спаривание и отбор самок мышей: Спаривание самок мышей CD1 с самцами CD1, содержащимися в одном доме, на ночь. Утром проверьте наличие копулятивных пробок у самок мышей. Выберите самок с копулятивными пробками и пересадите их в новую клетку для дальнейших процедур.
    Примечание: Чтобы свести к минимуму генетический мозаицизм, оптимальное время для доставки генетической конструкции составляет 0,7 дня после спаривания на10-й стадии одиночной клетки (зиготы). Это примерно соответствует 16:00 в день, когда была обнаружена пробка копуляции. На этой стадии вскрытие яйцевода показывает, что зиготы имеют меньше кучевых клеток, хотя они остаются в ампуле. Примечательно, что кумулюсные клетки также могут поглощать экзогенные нуклеиновые кислоты или белки во время электропорации. Если процедура проводится раньше, например, через 10 ч после спаривания, кумулюсные клетки все еще плотно окружают зиготы, что может препятствовать эффективной электрофоретической доставке нуклеиновых кислот в зиготы. Не используйте гормонально стимулированных мышей, так как они могут дать чрезмерное количество ооцитов, и это может привести к выкидышу.
  2. Подготовка хирургических инструментов: Автоклав всех хирургических инструментов из нержавеющей стали для обеспечения стерильности.
  3. Анестезия и подготовка мышей: Взвесьте выбранных самок мышей и обезболите их с помощью внутрибрюшинной инъекции с использованием смеси кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
    1. Наблюдайте за мышами на предмет потери рефлекса щипкового рефлекса на пальце ноги, чтобы подтвердить адекватную анестезию. Поместите мышь под наркозом на грелку, чтобы поддерживать температуру тела во время процедуры. Защитите глаза мыши от сухости во время анестезии, нанеся ветеринарную мазь.

3. Хирургическое вмешательство

  1. Продезинфицируйте тыльную (заднюю) область мыши, используя 70% этанол.
  2. Сделайте продольный разрез кожи на 0,7 см в нижней части спины.
  3. Протрите место разреза ватным диском, смоченным в 70% этаноле, и удалите все волосы вокруг разреза.
  4. Удлините разрез до 1,3 см, надавливая в сторону слегка приоткрытыми кончиками ножниц.
  5. Аккуратно сделайте небольшой разрез (0,7 см) в брюшине для доступа к брюшной полости.
  6. Удлините разрез до 1,1 см, надавливая в сторону слегка приоткрытыми кончиками ножниц.
  7. Найдите жировую подушку, прикрепленную к яичнику, и аккуратно вытяните ее с помощью щипцов, пока яичник, яйцевод и матка не станут хорошо видны.
  8. Закрепите салфетную подушку на месте с помощью зажима для сосудов.
  9. Визуализируйте яйцевод под стереоскопическим микроскопом для точной манипуляции (рис. 1).
  10. Загрузите 2 мкл инъекционной смеси в пластиковый капилляр с помощью Stripper Pipettor.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стриппер-пипеттор с пластиковыми капиллярами, первоначально разработанный для манипуляций с эмбрионами в клиниках ЭКО, может поддерживать множество применений, включая перенос эмбрионов и доставку конструкций CRISPR/Cas9 в процедурах I-GONAD. Пипетка функционирует как прецизионный дозатор жидкости; В сочетании с одноразовыми гибкими капиллярами он обеспечивает стерильность и предотвращает перекрестное загрязнение. Пластиковые капилляры предпочтительнее стеклянных для введения смеси РНП для трансфекции в яйцевод, так как они менее травматичны для нежных тканей. В отличие от стеклянных капилляров, одноразовые пластиковые не требуют пламенной полировки для сглаживания острых краев перед введением, что сокращает время подготовки и риск повреждения.
  11. С помощью микроножниц сделайте небольшой надрез (0,2 см) в стенке яйцевода в нескольких миллиметрах от ампулы.
  12. Осторожно введите пипетку Stripper с пластиковым капилляром в разрез и выведите инъекционную смесь в яйцевод.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы воздух не попадал в яйцевод, так как это может повлиять на эффективность электропорации.
    Чтобы предотвратить это, заполните инъекционный пластиковый капилляр большим количеством инъекционной смеси, чем необходимо, и избегайте полного впрыска. Пластиковые капилляры подходят как для переноса инфундибулума, так и для прямого рассечения стенки яйцевода между инфундибулумом и ампулой. Метод прямого рассечения стенки яйцевода может быть менее травматичным, чем перенос инфундибулума, поскольку последний требует первоначального разреза через тонкую мембрану бурсы, покрывающую яйцевод и инфундибулум. У мышей CD1 эта мембрана сильно васкуляризирована, и ее разрезание может вызвать незначительное кровотечение, которое может затруднить видимость и затруднить микроинъекцию смеси РНП.
  13. Аккуратно удалите пластиковый капилляр из яйцевода.

4. Электропорация и наложение швов

  1. Включите электропоратор, нажав на переключатель на передней панели.
  2. Заданные параметры электропорации: Импульс поры: Напряжение: 50 В, Длина импульса: 5 м, Интервал импульсов: 50 мс, Количество импульсов: 3, Скорость затухания - 10%, Полярность: +/-; Импульс передачи: Напряжение: 10 В, Длительность импульса: 50 мс, Интервал между импульсами: 50 мс, Количество импульсов: 3, Скорость затухания - 40%, Полярность: +/-; Лимит тока: in vivo.
  3. С помощью электродов типа пинцетров осторожно возьмитесь за яйцевод и проверьте величину сопротивления, нажав кнопку kΩ на электропораторе. Убедитесь, что электроды достаточно сжаты, чтобы сопротивление оставалось в оптимальном диапазоне 350-400 Ω.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть достигнуто путем регулировки расстояния между двумя электродами, когда неповрежденный яйцевод зажат между ними.
    1. Сразу после измерения сопротивления нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать электропорацию. Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения эффективной доставки компонентов CRISPR-Cas в зиготы4. Подождите, пока кнопка Ω отобразит сигнал «окончание». Запишите значения, отображаемые в рамке Измерения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение импеданса должно составлять примерно 250-400 Ω/150-250 мА от значения напряжения для обеспечения оптимального баланса между жизнеспособностью и эффективностью передачи. Чтобы сохранить этот баланс, избегайте покрытия областей яйцевода листом влажной бумаги, смоченной в модифицированном фосфатно-солевом буфере (DPBS) Дульбекко, рекомендованном в некоторых протоколах, так как этот шаг может значительно снизить резистентность за пределы оптимального диапазона. Снижение сопротивления может поднять напряжение до более чем 250 мА, что приведет к гибели клетки.
  4. После завершения электропорации на одном яйцеводе осторожно поместите репродуктивный тракт обратно в брюшную полость. Сшить разрез с помощью хирургического шва 4-0 полигликолевой кислоты.
  5. Повторите операцию и электропорацию на втором яйцеводе. После завершения верните репродуктивный тракт в брюшную полость и зашите разрез, как описано выше.
  6. Мониторинг после процедуры: поместите мышь в теплую (37 °C), очистите клетку для восстановления и наблюдайте до тех пор, пока она полностью не восстановится после анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После операции поместите мышей в клетки по две мыши в каждой. Если только одна мышь перенесла операцию, предоставьте ей самку мыши-компаньона. Эта практика помогает уменьшить ненужный стресс для хирургических мышей и способствует созданию более естественной социальной среды.

5. Генотипирование

  1. Дизайн грунтовки
    1. Для генотипирования разработайте праймеры для амплификации продукта ПЦР длиной от 300 до 600.о. Праймеры должны иметь длину 18-21 нуклеотид и температуру плавления (Tm) примерно 60 °C.
    2. Избегайте последовательностей, которые образуют вторичные структуры или димеры грунтовки. Используйте программные инструменты, такие как PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 или аналогичные, чтобы обеспечить качество праймера.
    3. Выполните поиск BLAST в базе данных генома мыши для подтверждения специфичности праймеров и предотвращения неспецифической амплификации11.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для генотипирования последовательности-мишени были разработаны следующие праймеры: Прямой праймер: 5'-CTCTCCCAAAGTCGCTGA-3'; Обратный праймер: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3', ожидаемая длина продукта ПЦР: 320.о., Tm 62°C. Для секвенирования по Сэнгеру разработайте праймер для секвенирования, который отжигает на расстоянии 150-200.о. от места резки Cas9.
  2. Провести экстракцию ДНК. Для быстрой экстракции ДНК самым простым является протокол выделения Hotshot12 .
    1. С помощью ушного прокола соберите небольшой фрагмент ткани (примерно 2 мм) из уха мыши.
    2. Добавьте 100 мкл буфера для лизиса (25 мМ NaOH, 0,2 мМ ЭДТА, pH = 12).
    3. Выдерживать при температуре 95 °C в течение 60 минут, перемешивая смесь каждые 20 минут.
    4. Добавьте 100 мкл нейтрализующего буфера (40 мМ Tris-HCl, pH = 5) и тщательно перемешайте.
    5. Используйте 1-5 μЛ конечного препарата для ПЦР.
  3. ПЦР-амплификация и секвенирование. Приготовьте мастер-смесь для ПЦР, как указано в таблице 3. Используйте корректуру ДНК-полимеразы для обеспечения высокой точности. Аликвотируем мастер-микс в необходимое количество пробирок и добавляем геномную ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда включайте образец ДНК дикого типа в качестве контроля для анализа секвенирования.
  4. Запустите ПЦР для генотипирования ROSA26 . Использовались следующие условия: начальная денатурация: 30 с при 95 °C; 28 циклов: 20 с при 95 °C (денатурация), 20 с при 62 °C (отжиг), 20 с при 72 °C (растяжение); Окончательное удлинение: 2 мин при 72 °C; Держите при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный протокол является точным для амплификации фрагмента локуса ROSA26 (предполагаемый размер 320.о.) с использованием праймеров из шага 1.1.2. Для более конкретного и точного усиления ограничьте количество циклов усиления до 28-30.
  5. Секвенирование и анализ
    1. Провести секвенирование по Сэнгеру полученных фрагментов ПЦР (шаг 5.4).
    2. Анализ результатов секвенирования
      Примечание: Успешная трансфекция приведет к образованию мозаичных животных, идентифицируемых по появлению дополнительных последовательностей ДНК вблизи места разреза нуклеазы на секвенционирующей хроматограмме. Используйте вычислительные инструменты, такие как EditCo ICE Analysis или TIDE13 , для идентификации и количественной оценки точных инделов в геноме.
      1. Чтобы использовать ICE Analysis, просто загрузите полученные файлы секвенирования по Сэнгеру (контрольный файл .ab1 для последовательности продукта ПЦР мыши wt без редактирования и экспериментальный файл .ab1 для последовательности продукта ПЦР для эксперимента на мыши), введите направляющую последовательность РНК и выберите нуклеазу, используемую в эксперименте CRISPR.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент анализа ICE рассчитает общую эффективность редактирования, а также определит профили и относительное количество всех различных типов редактирования, присутствующих в образце.
      2. Чтобы использовать TIDE, введите последовательность направляющей РНК, загрузите полученные файлы секвенирования по Сэнгеру (контрольный файл .ab1 для последовательности продукта wt mouse PCR без редактирования и файл эксперимента .ab1 для последовательности продукта ПЦР для эксперимента на мыши) и проверьте Параметры (в некоторых случаях Расширенные настройки могут помочь найти инделы размером более 10.о.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Если электропорация прошла успешно, подопытные мыши: (1) родят несколько детенышей и (2) у некоторых животных будут другие инделы в геноме. Если праймеры генотипирования хорошо спроектированы, а программа ПЦР оптимальна, то продукт ПЦР будет присутствовать на агарозном геле в виде одной прозрачной полосы нужного размера. Если нуклеаза успешно разрезает целевую ДНК, то полученные животные, скорее всего, будут мозаичными и иметь ряд инделов в геноме. Вычислительные инструменты, такие как E...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эффективность генерации нокаутных мышей методом I-GONAD сопоставима с эффективностью традиционных методик микроинъекций. Однако традиционные методы включают в себя выделение зигот от самок-доноров, выполнение микроинъекций и трансплантацию эмбрионов в яйцеводы псевдобеременных самок. В отличие от этого, метод I-GONAD упрощает этот процесс, доставляя компоненты для редактирования генома непосредственно в яйцеводы беременных самок, устраняя необходимость в выделении зиготы и трансплантации...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Научному парку Санкт-Петербургского университета, Центру молекулярных и клеточных технологий. Секвенирование проводилось с помощью генетического анализатора ABI 3500 xL (Thermo Fisher Scientific, США) в Ресурсном центре молекулярных и клеточных технологий Научного парка Санкт-Петербургского государственного университета. Авторы выражают благодарность Марии Рубель за помощь в редактировании и подаче документов. Исследование выполнено при финансовой поддержке Санкт-Петербургского государственного университета, проект ID: 129658320, а Луйбов Шкоденко – при поддержке Российского научного фонда (проект 25-26-00247).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.5– 5 мкЛ пипетка Thermo Scientific4642020
Трубка объёмом 1,5 млАптака1003/G
100–1000 мкЛ пипетка Thermo Scientific4642090
Трубка 200 мклAxygenPCR-02-C
20-200 мкЛ пипетка Thermo Scientific4642080
2-20 мкЛ пипетка Thermo Scientific4642060
Краситель с гелевой нагрузкой 4xBiolabmixD-3002
АгарозеAppliChemA8963,0500
ДНКаза I, свободная от РНазы (1 U/μ L)Термо ФишерEN0521
Набор dNTP, решение 100 мМThermo ScientificR0181
DreamTaq Green DNA полимераза (5 U/μ L)Thermo ScientificEP0713
Дульбекко Модифицированный фосфат-буферный физиологический растворСигма ОлдричD8537
EditCo Анализ ICEhttps://ice.editco.bio/#/Дата обращения: 04.06.2025
Раствор EDTA 0,5M, pH = 8AppliChemA4892,0500
Ensembl  https://www.ensembl.org/index.htmlДата обращения: 09.06.2025
Этидий бромидBiolabmixEtBr-10
Капли геля для глаз Офтагель»URSAPHARM204604
Гелевая система документирования ChemiDoc XRS+Био-Рад1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr  Дата обращения: 09.06.2025
Интегрированные ДНК-технологии https://eu.idtdna.comДата обращения: 09.06.2025
Микрохирургические ножницыМедин УРАЛM124
Электропоратор NEPA21Непа ДжинNEPA21С электродом CUY652P2.5x4
Набор NTP, раствор на 100 ммThermo ScientificR0481
ОлигонуклеотидыЕврогенпрямой порядок, стандартная очистка с обезсолью
Редуцированная сывороточная среда Opti-MEM IТермо Фишер31985070
PerlPrimerhttps://perlprimer.sourceforge.netВерсия 1.1.21.
Полимераза ДНК-полимераза высокой точности Phusion (2 U/μ L)Thermo ScientificF530L
Наконечники пипетки 10 мклUlplastHT-10-960
Наконечники пипетки 1000 мклUlplastHT-1000-576
Наконечники пипетки 200 мклUlplastHT-200-960
Источник питания» Эльф-4"ДНК-технологияPS-400 NEW
Вода без РНК/ДНКИнвитроген10977049
Солевый растворPanEcoP011n
Горизонтальная электрофорезная система SE-1ГеликонSE-1
Гидроксид натрияСигма-ОлдричS5881-500G
Лестница ДНК Step100BiolabmixS-8100
Стереомикроскоп SMZ1000Nikon5-363376
Микропипеттер-стрипперCooperSurgicalMXL3-STR
Советы для стриптизёршейОРИДЖИОMXL3-125
Хирургическая игла и bbsp;KMIZ4A1 — 0,6 раз; 20
Зашивание щипцовМедин УРАЛM302.2
Зашивание щипцовМедин УРАЛM303
Швейная резьба POLYCON Nfigure-materials-10Tonzos 95234
Дизайн руководства по нокаутированию SYNTHEGO https://design.synthego.com/#/Дата обращения: 09.06.2025
Усилитель T100BioRad10014822
T7 РНК-полимераза Thermo ScientificEP0111
TBE 10x буферBiolabmixTBE-500
Tide https://tide.nki.nl/дата обращения: 04.06.2025 
ТрисгидрохлоридНаука Сучжоу ЯкуSYS-S0005-0.5
Раствор гидрохлорида ТризмыСигма ОлдричT2663
Реагент TRIzolИнвитроген15596026
Белок TrueCut Cas9ИнвитрогенA36499
Универсальные ножницыМедин УРАЛM147
КсилазинInterchemie Werken de AdelaarIX2
ЗолетильЛаборатория Virbac2000443714739.00

Ссылки

  1. Fujihara, Y., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection. Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).
  2. Zuo, E., et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).
  3. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
  4. Kobayashi, Y., et al. Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain. Cells. 9 (4), 957(2020).
  5. Takabayashi, S., et al. Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein. Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).
  6. Sato, M., et al. Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice. Cells. 9 (3), 546(2020).
  7. Kessler, S., et al. A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest. Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).
  8. Kaneko, T., Tanaka, S. Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts. Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).
  9. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  10. Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol. 19 (1), 25(2018).
  11. Marshall, O. J. PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).
  12. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  13. Brinkman, E. K., Van Steensel, B. Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER. CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).
  14. Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method. Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).
  15. Iwata, S., et al. Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation. Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).
  16. Abe, M., et al. A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes. Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).
  17. Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo. STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPR Cas9

Похожие статьи