Оптимизация и оценка ручного волочения и мокрого прядения для производства рекомбинантного волокна паучьего шелка

Краткое содержание

Представленный протокол обеспечивает универсальный набор методов для оптимизации солюбилизации рекомбинантных белков шелка для прядения; проверка прядильности путем ручного волочения; производство длинных непрерывных волокон с помощью автоматизированного мокрого прядения; и сравнительно оценить морфологию, молекулярное выравнивание, механическое поведение и вторичное структурное содержание белка в волокнах или внутри них.

Аннотация

Паучий шелк известен своими механическими свойствами, характеризующимися высокой прочностью, высокой растяжимостью или их комбинацией, что приводит к высокой ударной вязкости. Типичная самка паука, плетущего шары, производит семь различных видов шелка, каждый из которых обычно прядется из специфических белков и механически приспособлен для выполнения определенной функции выживания. Рекомбинантное производство паучьего шелка обеспечивает многообещающий путь для получения этих материалов, обходя проблемы с получением большого количества натурального шелка и обеспечивая преимущества в возможности персонализации белка, например, путем локально-направленного мутагенеза или синтезированного построения белка.

В представленном протоколе мы излагаем методологию оценки пригодности белка для прядения с помощью подходов как ручного рисования, так и мокрого прядения. Начиная с достаточно очищенного лиофилизированного белкового порошка, подробно описаны методы оптимизации начального состояния солюбилизированного белка для получения состояния «вращающегося дурмана» с высокой концентрацией. Затем сравниваются подходы к ручному рисованию и мокрому прядению, включая обсуждение методов модуляции поведения волокна с использованием вытягивания после отжима как части процесса прядения. Затем подробно описывается типичный рабочий процесс для определения характеристик полученных шелковых волокон и принятия решения о том, какие условия прядения с наибольшей вероятностью будут плодотворными, включая оптическую микроскопию для оценки диаметра волокна и его однородности; микроскопия поляризованным светом для оценки степени (над)молекулярного выравнивания, достигаемого внутри волокна; испытание на растяжение для оценки прочности, растяжимости, модуля Юнга и ударной вязкости; и инфракрасная спектромикроскопия с преобразованием Фурье (FTIR) для оценки вторичной структуры белка в волокне.

Этот протокол оказался пригодным для нескольких различных рекомбинантных белков паучьего шелка, основанных на повторяющихся и неповторяющихся доменах ациниформного (обертывающего) шелка; пириформный шелк; и гибридные белки, содержащие ациниформный, пириформный и/или большой ампуллатный (драглайн) шелк. Более широкая применимость обеспечивается за счет нескольких выделенных этапов, на которых условия и параметры могут быть изменены в соответствии с поведением отдельного белка и для достижения различий в функциональном результате.

Введение

Пауки производят шелк для различных специализированных задач, включая создание паутины, захват добычи^{и защиту яиц}. Паучий шелк обладает выдающимися механическими свойствами, превосходящими свойства большинства известных природных и синтетических^{материалов2}, что побуждает к значительным усилиям по производству инженерных и усовершенствованных материалов из паучьего шелка для различных промышленных и биомедицинских применений. Спидроин, белок, из которого состоит паучий шелк, состоит из относительно большого повторяющегося домена, ограниченного неповторяющимися N-концевыми и С-концевыми доменами³, при этом уникальные механические свойства некоторых типов шелка связаны с повторением коротких мотивов в повторяющемся домене ^4,5,6. В отличие от коммерчески культивируемого тутового шелкопряда (Bombyx mori), который производит большое количество шелка в виде кокона, пригодного для сбора урожая, пауки по своей природе являются каннибальскими и территориальными организмами, которые производят шелк в ограниченных количествах, тем самым создавая проблему для сельскохозяйственного производства и сбора^.. Учитывая эти ограничения, рекомбинантное производство паучьего шелка было разработано в качестве более осуществимой и устойчивой альтернативы для контролируемого получения достаточного количества паучьего шелка для применения.

Производство рекомбинантного паучьего шелка требует выбора подходящего хозяина для экспрессии белка. Паучий шелк экспрессируется в различных системах хозяина, включая бактерии ^8,9, дрожжи^10,11, клетки насекомых¹², растения^13,14 и клетки млекопитающих^15,16, при этом Escherichia coli является наиболее часто используемой системой хозяина. Высокая молекулярная масса спидроинов, которая может достигать 700 кДа⁷, создает значительные проблемы для экспрессии полноразмерных конструкций. Для получения рекомбинантного паучьего шелка с сопоставимыми или улучшенными свойствами по сравнению с свойствами натурального паучьего шелка, основной стратегией является выражение усеченных вариантов, таких как конструкции с ограниченным числом повторяющихся единиц (с неповторяющимися доменами или без них), химеры, состоящие из комбинаций различных типов шелка, и гибридные шелка, слитые с нешелковыми белками. Например, рекомбинантный большой ампуллатный спидроин (284,9 кДа) был успешно экспрессирован в метаболически модифицированной кишечной палочке, и полученный шелк продемонстрировал механические свойства, сравнимые с механическими свойствами натурального основного ампуллатного шелка⁹. Кроме того, сконструированное шелковое волокно, состоящее из двух повторяющихся звеньев пириформного спидроина и двух повторяющихся звеньев ациниформного спидроина, продемонстрировало превосходную растяжимость по отношению к составляющему пириформному или ациниформному шелку, сравнимую с таковой у натурального жгутиковидного шелка17.

Производство рекомбинантных белков также позволяет напрямую встраивать функциональные пептидные или белковые сегменты в протеины шелка, что позволяет изготавливать биоматериалы со свойствами, адаптированными к конкретным областям применения. Например, генетическое и химическое слияние мотивов связывания клеток RGD с генетически модифицированным шелком, полученным из основных ампулативных спидроинов^{, привело} к образованию пленок, которые значительно усилили адгезию и пролиферацию фибробластов. В отдельном исследовании было продемонстрировано, что гибридная шелковая конструкция, состоящая из мотива, связывающего фактор роста нервов (β (NGF), слитая с химерным белком, содержащим два повторяющихся звена ациниформного спидроина и С-концевой домен основного ампулятного спидроина^{, поддерживает} рост и дифференцировку нейроноподобных клеток.

Учитывая успешную экспрессию и очистку рекомбинантного белка шелка, он может быть затем переработан в различные формы, такие как гидрогели, пленки, волокна, наночастицы, пены и губки, в зависимости от предполагаемого^{применения.} Для производства искусственного шелкового волокна были разработаны методы прядения, которые имитируют определенные аспекты очень сложного и жестко регулируемого процесса прядения натуральных волокон пауков. В натуральном большом ампуллатном шелке спидроины продуцируются эпителиальными клетками в большой ампуллатной железе и хранятся в растворимом состоянии в просвете в высоких концентрациях (до 50% (по объему)⁾²², образуя водный прядильный дурман. По мере того, как вращающийся допинг движется по вращающемуся каналу, он испытывает изменения pH, концентрации ионов, содержания воды и сил сдвига как из-за сужения протока, так и из-за процесса пультрузии волокна, что вызывает превращение жидких шелковых белков в твердые волокна^23,24. Таким образом, идентификация подходящего растворителя, который может растворять или суспензировать рекомбинантные белки шелка в высокой концентрации с образованием прядильного вещества, является критически важным первым шагом в процессе прядения искусственных волокон.

Широкий спектр растворителей был использован для составления прядильных препаратов на основе шелкового белка, и было показано, что выбор растворителя влияет на формирование волокна и механические свойства^25,26. Следовательно, тщательное рассмотрение выбора растворителя легана имеет важное значение для оптимизации характеристик получаемого волокна. Спиннинговые препараты могут быть составлены с использованием либо органических, либо водных растворителей, таких как 1,1,1,3,3,3-гексафторизопропанол (HFIP)²⁷, гексафторацетон (HFA)²⁸, смеси трифторуксусной кислоты (TFA) и 2,2,2-трифторэтанола (TFE)²⁶, муравьиной кислоты²⁹ и фосфата натрия/трис-буфера³⁰. Поскольку на растворимость белка обычно влияют такие факторы, как pH, ионная сила и концентрация, идентификация подходящего растворителя обычно включает в себя систематическую оценку различных растворителей, оптимизацию pH и концентраций белка, а в некоторых случаях использование смесей растворителя и воды для определения оптимальных условий спиннингового растворителя. Кроме того, вязкость прядильного легипа является важным параметром, который необходимо оценить до начала процесса прядения, поскольку высоковязкий раствор легипа может препятствовать потоку жидкости во время прядения, в то время как недостаточно вязкий легион, как правило, не подходит для формирования волокна^31,32. Следует отметить, что использование жестких условий спинового допинга может изменить структуру белка при длительном воздействии; Поэтому разработка экологически чистых растворителей Dope остается активным направлением исследований.

Ручное волочение и мокрое прядение являются двумя распространенными методами прядения рекомбинантного шелкового волокна. Механические свойства волокон, полученных каждым методом, в значительной степени зависят как от самих условий прядения, так и от последующей обработки. Ручное волочение, также называемое вытягиванием, представляет собой простой метод производства волокон, при котором волокна извлекаются из растворов очищенных белков, обычно с помощью наконечника пипетки, щипцов или пинцета, с последующей сушкой на воздухе и определением характеристик ^{33,34,35,36,37}. В то время как ручное рисование обеспечивает отличный подход к быстрому скринингу различных условий формирования шелкового волокна и общей классификации результирующего механического поведения волокна, этот метод не может быть легко масштабирован на длинные (т.е. многометровые длины) непрерывные волокна. В качестве альтернативы мы используем мокрое прядение, при котором непрерывное выдавливание прядильного вещества с постоянной скоростью в коагуляционную ванну, обычно водный или органический растворитель, состоящий из смеси воды и этанола или метанола 9,15,31,38,39,40 . Погружение прядильного дурмана в коагуляционную ванну вызывает быструю десольватацию белка, в результате чего образуются непрерывные волокна²⁴. Впоследствии волокна вытягиваются из коагуляционной ванны с постоянной скоростью, либо соответствующей скорости экструзии для получения волокон после прядения (AS), либо подвергают вытягиванию после отжима для получения волокон после прядения (PS), которые обычно имеют улучшенные механические свойства. Вытяжка после отжима обычно включает в себя растяжение волокон до соотношения в 2-8 раз больше их первоначальной длины на воздухе, в растворителе или после погружения в растворитель, при этом каждый параметр вносит свой вклад в определенные механические свойства 15,17,31,38.

Хотя этот протокол сосредоточен на методах рисования от руки и мокрого прядения, важно рассматривать эти методы в контексте. Сообщалось о методах электропрядения для рекомбинантного паучьего шелка как из водных, так и из органических условий, что позволяет производить волокнистые маты, выровненные волокна и пряжу, причем волокна обычно имеют нанометровый масштаб в диаметре⁴¹. Это обеспечивает потенциальное преимущество наноразмерных волокон и соответствующую проблему, если требуются волокна микронного масштаба, как правило, с требованием выполнения обработки после отжима для индуцирования трансформации в структуру листа β для улучшения механики и совместимости с водой. Многометровые рекомбинантные ленты из паучьего шелка шириной и толщиной в микронном масштабе были получены методом сухого прядения из органического растворителя⁴², при этом недавно было продемонстрировано, что включение ионов металлов на стадии спинового допинга улучшает механику⁴³. Прядение⁴⁴ на основе микрофлюидики, включая недавнюю комбинацию технологии 3D-печати с микроигольчатыми прядильными механизмами, разработанными для имитации натурального прядения⁴⁵, подходит для высококонтролируемого прядения рекомбинантного шелкового волокна. Несмотря на большое разнообразие методов, которые, как сообщается, подходят для производства шелкового (или шелкового) волокна, настоящий протокол подробно описывает производство рекомбинантного шелкового волокна путем ручного волочения и мокрого прядения, поскольку эти методы доказали свою пригодность для нескольких различных вариантов рекомбинантного шелка в наших руках и обеспечивают удобную отправную точку для разработки биоматериалов и сравнительной оценки.

После прядения и сбора волокон обычно используется комбинация оптических, механических и спектроскопических методов для определения характеристик свойств после прядения. Каждый метод дает ключевую информацию о процессе формирования волокна и его корреляции с характеристиками материала. Здесь мы сосредоточимся на подмножестве этих методов, отмечая, что существует множество других методологий, которые предоставляют ключевую информацию о свойствах и характеристиках шелкового волокна. Оптическая микроскопия используется для оценки морфологии волокон, что позволяет сравнивать диаметры волокон, скрученных как в идентичных, так и в различных условиях 17,31,38,46. Этот метод также важен для идентификации и устранения сегментов волокна с дефектами или аномалиями перед последующей характеризацией. Кроме того, поляризованная световая микроскопия может быть использована для оценки степени молекулярного выравнивания внутри волокна, поскольку более высокие уровни выравнивания обычно связаны с улучшенными механическими свойствами 17,26,47. Механические характеристики проводятся с помощью испытаний на растяжение, в ходе которых измеряются кривые зависимости напряжения от деформации и используются для количественной оценки таких параметров, как прочность на разрыв, растяжимость, модуль Юнга и ударная вязкость, что дает важную информацию для оценки пригодности волокна в конструкционных или биомедицинских приложениях 17,33,48. Последний метод, описанный здесь, инфракрасная спектромикроскопия с преобразованием Фурье, применяется для исследования вторичной структуры белка, в частности, степени образования β-листа, поскольку это играет решающую роль в стабильности волокна и механической^{прочности.} Вместе эти методы обеспечивают всестороннее понимание морфологии, структуры и механического поведения рекомбинантно произведенных шелковых волокон.

Протокол

В этом протоколе мы предполагаем, что отправной точкой является лиофилизированный протеиновый порошок шелка. Чаще всего в нашей работе это рекомбинантный белок паучьего шелка. Обзор протокола представлен на рисунке 1, каждый из следующих пяти шагов подробно описан ниже: (1) подготовка и оптимизация спиннингового допинга; (2) шелковое волокно ручного волочения или мокрого прядения; (3) диаметр и морфологическая оценка волокон с помощью оптической микроскопии; (4) механическая оценка путем испытания на растяжение; и (5) оценка вторичной структуры с помощью ИК-Фурье спектромикроскопии.

Рисунок 1: Схематический обзор основных этапов протокола производства, сбора и определения характеристик рекомбинантного волокна белка паучьего шелка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Подготовка и оптимизация спиннингового допинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимизации волокнистого прядильного раствора попытайтесь солюбилизировать различные концентрации рекомбинантного белка паучьего шелка в различных растворителях для приготовления растворов допинга (Таблица 1). Только растворители, которые растворяют белок, давая прозрачный раствор без осадка, следует использовать для попыток прядения волокна.

1. Приготовление растворителей
   1. Чтобы сделать 8:1:1 TFA/TFE/H₂O, отмерьте 800 μL TFA, 100 μL TFE и 100 μL сверхчистой воды типа 1 в стеклянной трубке внутри вытяжного шкафа. Тщательно перемешайте все компоненты. Закройте стеклянную трубку крышкой и накройте ее парапленкой, чтобы предотвратить испарение летучих компонентов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда готовьте свежий раствор для прядения волокна.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с ТФК и ТФЭ с осторожностью, ТФК очень коррозионны и летучи, в то время как ТФЭ легковоспламеняющиеся и токсичные. Носите соответствующие СИЗ, включая перчатки, лабораторные халаты и защитные очки, чтобы предотвратить контакт с кожей и вероятность вдыхания.
   2. Чтобы приготовить 3:1:1 TFA/TFE/H₂O, в вытяжной шкаф перелейте 300 μл TFA, 100 μL TFE и 100 μL сверхчистой воды типа 1 в стеклянную пробирку и смешайте компоненты. Закройте стеклянную трубку крышкой и накройте ее парапленкой, чтобы свести к минимуму испарение летучих компонентов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда готовьте свежий раствор для прядения волокна.
   3. Чтобы получить 7:3 HFIP/H₂O, смешайте 700 μL 1,1,1,3,3,3-гексафлюро-2-пропанола (HFIP) с 300 μL сверхчистой воды типа 1 для получения 1 мл раствора. При необходимости приготовьте раствор свежим.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с HFIP в вытяжном шкафу и избегайте вдыхания или контакта с кожей.
   4. Чтобы сделать 50 мМ буфера фосфата калия (pH 7,5), возьмите 800 мл деионизированной воды в стакане и растворите 1,199 г дигидрофосфата калия (KH₂PO_4-MW. 136. 09 г/моль) и 7,173 г двухосновного калийфосфата (К₂HPO 4-МВт 174,18 г/моль) в нем. Тщательно перемешайте все компоненты и отрегулируйте pH раствора с помощью NaOH или HCl. Долейте объем до 1 л деионизированной водой и храните при комнатной температуре.
   5. Чтобы сделать 10 мМ буфера Tris-Cl (pH 8,0), растворите 1,21 г трис-гидрохлорида (MW. 157,60 г/моль) в 800 мл деионизированной воды. Отрегулируйте pH с помощью NaOH и долейте окончательный объем до 1 л деионизированной водой. Храните раствор при комнатной температуре.
   6. Чтобы получить 20 мМ буфера из Na-ацетата (pH 5,0), в 450 мл деионизированной воды растворите 0,55 г ацетата натрия (MW. 82,03 г/моль) и 0,02 М (6 мл) уксусной кислоты. Долейте объем до 500 мл деионизированной водой и храните при комнатной температуре.
   7. Чтобы получить 1 М цитратфосфатный буфер (pH 7,0), растворите 11,69 г гидрофосфата натрия (Na₂HPO_4-MW. 141,96 г/моль) и 1,85 г лимонной кислоты (MW. 192,12 г/моль) в 400 мл деионизированной воды. Отрегулируйте pH раствора с помощью HCl или NaOH, а окончательный объем отрегулируйте до 500 мл с помощью деионизированной воды.
   8. Чтобы получить 98% раствор муравьиной кислоты-CaCl₂ , разбавьте муравьиную кислоту до 98%, смешав 98 мл муравьиной кислоты с 2 мл деионизированной воды, чтобы получить в общей сложности 100 мл раствора. Теперь добавьте 4 г CaCl₂ к 100 мл 98% раствора муравьиной кислоты для приготовления 4% w/v раствора муравьиной кислоты-CaCl₂ . Храните раствор при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу 1. Только растворители, которые растворяют белок, давая прозрачный раствор без осадка, следует использовать для попыток прядения волокна.
2. Приготовление волокно прядильного дурманного раствора
   1. Взвесьте лиофилизированный белок паучьего шелка в соответствии с желаемой концентрацией (например, 10 мг для 10% (по массе) раствору в 100 μL растворителя) и смешайте с соответствующим объемом растворителя (например, 100 μL для 10% (по w/v) концентрации).
   2. Перебивайте смесь вихрем до тех пор, пока протеиновый порошок полностью не растворится в растворителе.
   3. Поскольку растворимость белка паучьего шелка варьируется в зависимости от растворителя и типа белка, начните с низкой концентрации белка (10% по массе) и постепенно увеличивайте концентрацию (25-30% по массе) по мере необходимости.
   4. После полного растворения белка качественно оцените вязкость дурманского раствора. Если раствор дурмана оказывается недостаточно вязким, постепенно увеличивайте концентрацию белка до получения прозрачного вязкого раствора. Используйте воду в качестве эталона.

Растворитель	Концентрация белка (% - мас./об.)	Ссылка
8:1:1 TFA/TFE/H2O	10 – 25	19
3:1:1 TFA/TFE/H2O	10 – 30	26
7:3 HFIP/H2O	15 – 30	31
50 мМ калий-фосфатного буфера (pH 7,5)	10 – 25	50
10 мМ буфер Tris-Cl (pH 8,0)	10 – 20	34
20 мМ буфер из Na-ацетата (pH 5,0)	10 – 25	49
1 М цитратфосфатный буфер (pH 7,0)	10 – 25	51
98% муравьиной кислоты – CaCl2	20 – 25	52

Таблица 1: Рекомендуемые концентрации растворителей и белков для приготовления волокнистых прядильных препаратов.

2. Прядение и сбор волокна

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 приведено схематическое изображение рисунка от руки, а на рисунке 3 приведены различные конфигурации устройств мокрого прядения, подробно описанные ниже.

Рисунок 2: Ручной рисунок волокон паучьего шелка. (A) С-образная бумажная рамка подготавливается и прикрепляется к стеклянному предметному стеклу с прозрачной лентой слева и двусторонней лентой справа, чтобы можно было рисовать волокно слева направо. (B) Капля вращающегося дурмана помещается на прозрачную ленту, и одно волокно вручную притягивается к двусторонней ленте через отверстие С-образной рамки с помощью пластикового наконечника для дозатора. (C) Волокно крепится к бумажной раме на предметном стекле с помощью ленты с левой и правой стороны. (Д,Э) Демонстрация репрезентативного (D) ручного процесса рисования рекомбинантного паучьего шелка, эффективно растворенного в спиновом препарате, и (E) полученного волокна до его закрепления лентой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Мокрое прядение волокон паучьего шелка. Во всех случаях спиннинговый препарат помещают в стеклянный герметичный шприц и выдавливают с постоянной скоростью с помощью шприцевого насоса через металлическую иглу с тупым концом (т.е. фильеру) в коагуляционную ванну (например, 95% этанола). (A) Волокна As-spuned собираются на ролике 1, вращающемся под управлением компьютера со скоростью, соответствующей скорости экструзии. (B) Растяжение в воздухе после отжима осуществляется путем направления волокон через ролик 1 и сбора их на ролике 2, который вращается со скоростью, кратной скорости ролика 1 (например, в два раза больше скорости для коэффициента вытягивания 2x). Аналогичным образом, волокна могут быть получены (С) после погружения в растворитель (например, 40% этанола, воды и т.д., в зависимости от пригодности для данного шелка) путем направления волокон от ролика 1 к ролику 3 (погруженного в ванну с растворителем и вращающегося с той же скоростью, что и ролик 1) перед направлением их на ролик 2 (вращающегося со скоростью, кратной скорости роликов 1 и 3); или (D) в растворителе путем направления волокон от ролика 1 к ролику 3 (погруженному в ванну с растворителем и вращающемуся с той же скоростью, что и ролик 1), затем к ролику 4 (также погруженному в растворитель и вращающемуся со скоростью, кратной скорости роликов 1 и 3) перед сбором на ролике 2 (скорость, соответствующая скорости ролика 4). Модульная конфигурация означает, что различные перестановки в условиях прядения волокна могут быть легко протестированы, конечно, не ограничиваясь четырьмя схематически показанными здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Рисование от руки
   1. Подготовьте С-образную бумажную рамку с окном размером 1 см х 0,5 см (д х ш) и поместите ее на предметное стекло (рис. 2). Закрепите верхнюю часть бумажной рамы на предметном стекле с помощью клейкой ленты. Прикрепите прозрачную ленту к одному плечу бумажной рамы, чтобы создать гидрофобную поверхность для осаждения раствора дурмана, и прикрепите двусторонний скотч к противоположному рычагу для фиксации волокон.
   2. Нанесите на прозрачную ленту 10-20 μл вращающегося раствора дурмана при комнатной температуре (22 ± 2 °C).
   3. Погрузите пластиковый наконечник для пипетки объемом 200 мкл в каплю раствора и вертикально вытяните его из раствора с постоянной скоростью (~6 мм/с), позволяя волокнам извлекаться из раствора.
   4. Проведите натянутое вручную волокно через окно рамы и прикрепите его к двустороннему скотчу. Высушите волокно на воздухе при комнатной температуре, затем закрепите оба конца волокон дополнительной лентой.
   5. Сосредоточьтесь на части волокна, охватывающей бумажную рамку, для последующей характеристики.
2. Мокрый прядиль
   1. Постройте устройство для мокрого прядения, в котором описанное здесь устройство будет обладать расширенными возможностями управления двигателем по сравнению с более ранними итерациями^31,38.
      1. Изготовьте жесткую металлическую монтажную пластину, которая удерживается вертикально и обработана с соответствующей конфигурацией для крепления набора шаговых двигателей (см. рис. 3). Для каждого монтажа двигателя необходимо просверлить отверстия для надежного крепления шаговых двигателей болтами на задней части монтажной пластины (т. е. четыре отверстия соответствующего расстояния и размера) и пятое отверстие для прохода вала двигателя.
      2. Выбирайте биполярные шаговые двигатели с шагом 1,8°, крутящим моментом 45 Н∙см, длиной 24 мм и диаметром вала 5 мм с D-образным вырезом длиной 15 мм, корпусом 39 мм, номинальным током 1,50 А, фазным сопротивлением 2,3.
      3. Разработать систему для управления скоростью и направлением вращения для каждого двигателя, подобную той, которая использовалась ранее для различных типов шелкового волокна 17,53,54, в которой используется графический пользовательский интерфейс (GUI), закодированный на Python для Raspberry Pi, подключенный к нескольким контроллерам шаговых двигателей, как подробно описано в https://github.com/raineylab/MotorController.git.
      4. Для прядения прикрепите каждый двигатель, используемый в данной конфигурации прядения, к обработанному металлическому цилиндру (диаметр 6 см, длина 8 см для цилиндров в положениях 1 и 2 на рисунке 3, рифленые ролики диаметром 9 см с каждого конца, сужающиеся до диаметра 6 см в центре ролика, длина 7 см в положениях 3 и 4 на рисунке 3; см., например, рисунок 4 для примера конфигурации).
      5. Для спиннерета (рис. 3) используйте стеклянный шприц объемом 0,25 мл с постоянно прикрепленной металлической иглой с тупым концом (внутренний диаметр 0,127 мм), установленный в шприцевом насосе, который выдавливает спиновой препарат с контролируемой скоростью в коагуляционную ванну.
   2. Центрифугируйте раствор дурмана при 20 000-21 000 × г в течение 30 минут при комнатной температуре и соберите надосадочную жидкость для прядения волокна.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите остаточные частицы, чтобы предотвратить засорение экструзионной иглы во время мокрого отжима.
   3. Загрузите 50-80 мкл вращающегося раствора дурмана в шприц, который служит фильерой.
   4. Закрепите шприц в шприцевом насосе и установите скорость экструзии на 600 μл/ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте и оптимизируйте скорость экструзии, чтобы обеспечить образование волокна для заданного условия прядения белка.
   5. Приготовьте коагуляционную ванну (95% этанола/5% деионизированной воды, v/v).
   6. Расположите шприцевой насос так, чтобы игла шприца, содержащая раствор дурмана, была погружена в коагуляционную ванну.
   7. Прикрепите ролик (ролики) к прядильной аппаратуре, отрегулируйте скорость ролика с помощью программного обеспечения для управления двигателем и включите мотор (двигатели), необходимые для данной конфигурации прядения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сопоставьте скорость вращения ролика 1 со скоростью экструзии. Скорость экструзии 400 мкл/ч или 600 мкл/ч соответствует 6 об/мин или 9 об/мин для ролика 1. Если после вращения проводится розыгрыш, один или несколько роликов 2-4 должны быть настроены на более быстрое вращение.
   8. Запустите шприцевой насос и с помощью пинцета направляйте волокно, которое образуется в коагуляционной ванне, одним из следующих способов.
      1. Чтобы собрать волокна AS, направьте волокно, сформированное в коагуляционной ванне, на первый ролик (скорость, равная скорости экструзии) для сбора.
      2. Чтобы выполнить растяжение в воздухе после отжима, установите скорость вращения ролика 2, кратную скорости вращения ролика 1. Направьте волокно от свертывания через ролик 1, не огибая ролик 1, и соберите его на ролике 2.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент протяжки после вращения, равный 2x, требует, чтобы скорость вращения ролика 2 была в два раза выше, чем у ролика 1; 3х, тройной; и так далее.
      3. Чтобы выполнить растяжение после отжима после погружения в растворитель, заполните ванну с растворителем желаемым растворителем (например, деионизированной водой; 2:3 об/об. этанола/н₂О; и т. д.) и направьте волокно из коагуляционной ванны вокруг ролика 1 (скорость вращения соответствует скорости экструзии), вокруг ролика 3 (скорость вращения равна ролику 1) в ванне с растворителем, и соберите волокно на ролике 2 в воздухе (вращаясь быстрее, чем ролики 1 и 3).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость вращения ролика 2 относительно роликов 1 и 3 будет определять коэффициент протяжки после вращения, как показано в шаге 2.2.8.2.
      4. Чтобы выполнить растяжение в растворителе после отжима, заполните ванну с растворителем желаемым растворителем (например, деионизированной водой; 2:3 об/об. этанола/_H2O и т. д.) и направьте волокно из коагуляционной ванны вокруг ролика 1 (скорость вращения соответствует скорости экструзии), вокруг ролика 3 (скорость вращения равна ролику 1) в ванне с растворителем, вокруг ролика 4 в ванне с растворителем (скорость вращения кратна скорости вращения роликов 1 и 3) и соберите Волокно на ролике 2 в воздухе (скорость вращения соответствует ролику 2).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость вращения роликов 2 и 4 по отношению к барабанам 1 и 3 будет определять коэффициент протяжки после вращения, как показано на шаге 2.2.8.2.
         Собирайте волокна в контролируемых условиях окружающей среды, чтобы избежать влияния влажности и температуры на поведение волокна. Мы ориентируемся на относительную влажность ~ 28,2 ± 2,4% и температуру ~ 28,0 ± 2,2 °C.

Рисунок 4: Основные этапы мокрого прядения волокон паучьего шелка. (А) Спиннинговая экструзия допинга в ванну для свертывания крови с последующим сбором волокна (красный прямоугольник слева указывает на иглу, используемую для экструзии допинга; красный прямоугольник справа показывает траекторию шелкового волокна мокрого прядения. (B) Иллюстрация волокна, подвергающегося растяжению в воздухе после вращения (красный прямоугольник для направления глаза). (C) Иллюстрация растяжения волокна после спина после погружения в воду (красный прямоугольник для направления глаза). (D) Непрерывное рекомбинантное шелковое волокно, собранное на ролике (например, намотанное волокно в виде красной стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Оптическая микроскопическая оценка волокон

1. Оптоволоконный монтаж
   1. Создайте С-образный держатель для бумаги, вырезав квадрат размером 1 х 1 см из прямоугольного листа бумаги размером 3 х 2 см (рисунок 5).
   2. Прикрепите С-образный держатель к предметному стеклу стеклянного микроскопа с помощью скотча.
   3. Прикрепите два куска двустороннего скотча с каждой стороны от зазора в 1 см С-образного держателя для бумаги.
   4. Снимите волокно с валика, на котором оно было собрано, и отрежьте отрезок длиной примерно 2 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного усилия при работе с волокнами, чтобы предотвратить деформацию материала или другие изменения свойств.
   5. Поместите сегмент волокна на верхнюю часть двустороннего скотча, убедившись, что длинная ось волокна выровнена параллельно нижнему краю держателя (Рисунок 5).
   6. Закрепите волокно малярным скотчем поверх двустороннего скотча с обеих сторон.
   7. Прикрепите дополнительный кусок малярного скотча для прочной фиксации нижней части держателя бумаги к предметному стеклу, чтобы предотвратить движение волокна до момента использования.
   8. Храните смонтированные волокна в контейнере для хранения до использования для визуализации и испытаний на растяжение.
2. Определение диаметра и оценка дефектов
   1. Исследуйте смонтированные волокна с помощью оптической микроскопии. Во-первых, просмотрите всю длину волокна на наличие видимых дефектов, таких как горловина, скручивание, выпуклость или двойные волокна. Если наблюдаются какие-либо дефекты, исключите эти волокна из механических испытаний.
   2. Для волокон, которые выглядят бездефектными, сделайте три микрофотографии с 10-кратным увеличением вдоль длинной оси волокна, одну в середине и по одной возле каждого конца волокна.
   3. Измерьте диаметр волокна с помощью программного обеспечения ImageJ⁵⁵ :
      1. В ImageJ перейдите в меню «Анализ» и выберите «Установить масштаб » (Supplemental File 1 - Supplemental Figure S1). Отрегулируйте шкалу в соответствии с настройками калибровки микроскопа и установите единицу измерения на микрометры (мкм) (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S2).
      2. С помощью инструмента «Линия» проведите прямую линию, перпендикулярную длинной оси волокна, проходящую от одного края волокна до другого.
      3. Для каждой микрофотографии измерьте диаметр волокна в шести различных областях вдоль волокна.
      4. После рисования каждой линии нажмите кнопку «Измерить » в меню «Анализ », чтобы отобразить диаметр волокна (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S3).
3. Качественная оценка молекулярного выравнивания с помощью поляризационной световой микроскопии
   1. Используйте поляризационную световую микроскопию для оценки молекулярного выравнивания внутри волокна после оценки диаметра и дефекта с помощью оптической микроскопии.
      1. Исследуйте волокно с помощью инвертированного оптического микроскопа, оснащенного вращающимся предметным столиком, неподвижным ползунком анализатора и поляризатором, вращающимся на 90°.
      2. Поместите волокно примерно под углом 45° относительно падающего плоскополяризованного света, чтобы максимизировать яркость благодаря двойному лучепреломлению, улучшая видимость молекулярной структуры.
      3. Сделайте изображение волокна в этих условиях, чтобы оценить его двулучепреломление.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Высокое двулучепреломление предполагает хорошо выровненную молекулярную структуру, в то время как низкое двулучепреломление или его отсутствие предполагает более аморфную или случайно ориентированную структуру.

Иллюстрация 5: Крепление волокна паучьего шелка на предметное стекло для последующего анализа с использованием С-образного держателя для бумаги и ряда слоев ленты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Испытание на растяжение

Примечание: Устройство для испытаний на растяжение, подходящее для точной оценки шелковых волокон, может быть легко изготовлено при относительно низких затратах^25,56. Вкратце, изготовьте пару зажимов из нержавеющей стали, чтобы обеспечить надежный захват каждого конца каждого волокна в С-образной раме, которая тестируется (например, Рисунок 6). Прикрепите один из этих зажимов к грузу, помещенному на аналитические весы, а другой — к шприцевому насосу. Шприцевой насос должен быть сконфигурирован таким образом, чтобы обеспечить постоянное вытягивание с заданной скоростью деформации. Аналитические весы должны быть сопряжены с компьютером для сбора данных о весе/массе в зависимости от времени.

Рисунок 6: Принципиальная схема, показывающая подготовительные этапы испытания на растяжение. (A) Держатель для бумаги с волокном (см. Рисунок 5 для конфигурации) отсоединяется от предметного стекла и устанавливается вертикально с помощью зажима, прикрепленного к грузу. (B) Этот утяжеленный зажим помещается на аналитические весы, а верхняя часть держателя для бумаги прикрепляется к зажиму, прикрепленному к стержню, надежно прикрепленному к шприцевому насосу. Держатель бумаги разрезается горизонтально посередине перед началом испытаний на растяжение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Сбор данных кривой зависимости деформации от напряжения
   1. После измерения диаметра волокна проведите испытание на растяжение на том же волокне с помощью самодельного аппарата (рис. 6).
      1. Отсоедините С-образную бумажную рамку, удерживающую волокно, от предметного стекла и закрепите на зажиме, прикрепленном к грузу (Рисунок 6A).
      2. Подключите аналитические весы к программному обеспечению для регистрации и управления данными и перейдите к верстаку (дополнительный файл 1 — дополнительный рисунок S4).
      3. Настройте эксперимент в программе для управления весами, нажав на кнопку « Пуск ». Введите название эксперимента при появлении запроса (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S5).
      4. Убедитесь, что аналитические весы пусты, и установите на них утяжеленный зажим с волокном.
      5. Прикрепите верхнюю часть бумажной рамки к зажиму, соединенному с насосом для шприца, и отрежьте одну сторону держателя для бумаги, чтобы волокно могло свободно перемещаться (Рисунок 6B).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что оба зажима параллельны друг другу и что волокно центрировано внутри зажима на расчетной длине 10 мм.
      6. Отрежьте весы, чтобы обнулить массу груза и зажима, нажмите кнопку «Выполнить » на шприцевом насосе и нажмите OK в программном обеспечении для управления весами (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S6).
      7. Когда волокно обрывается, нажмите кнопку «Стоп » на шприцевом насосе и кнопку «Да » в программном обеспечении для управления весами (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S7), чтобы зарегистрировать измеренный вес в зависимости от времени.
      8. Перенос данных в электронную таблицу или другой подходящий для обработки пакет программного обеспечения для обработки данных. Скопируйте журнал данных о зависимости веса от времени в буфер обмена и вставьте в предоставленную таблицу механических испытаний (Дополнительный файл 2) или экспортируйте данные в виде текстового файла и импортируйте с соответствующим синтаксическим анализом.
2. Обработка данных кривой зависимости деформации от напряжения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол основан на таблице механических испытаний, отформатированной для использования в Microsoft Excel (Дополнительный файл 2).
   1. Убедитесь в правильности экспериментальных параметров (столбец C).
   2. Добавьте массовые записи в зависимости от времени в таблицу («Чистая масса» в столбце F). Если до начала растяжения были записаны массовые значения, удалите эти значения путем удаления соответствующих ячеек со сдвигом данных вверх. Если после разрыва волокна были записаны значения массы, удалите эти ячейки данных.
   3. Автоматически заполняйте значения индексов в столбце E путем добавления с шагом 1 таким образом, чтобы общее количество индексов совпадало с общим числом измеренных значений массы в столбце F.
   4. Измените масштаб массы нетто так, чтобы они начинались с 0 г и увеличивались во время эксперимента по растяжению, вычитая начальную массу нетто из каждого значения массы нетто и умножая эту разницу на -1 (столбец G).
   5. Рассчитайте изменение длины волокна при каждом измерении, умножив индекс измерения на скорость вытягивания шприцевого насоса и временную лагу между зарегистрированными измерениями массы (столбец H).
   6. Рассчитайте инженерную деформацию путем деления изменения длины волокна на исходную длину (столбец I).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот расчет дает инженерную деформацию в мм/мм. Чтобы преобразовать значения инженерной деформации в %, умножьте значения в столбце I на 100%.
   7. Запишите расширяемость как максимальное значение инженерной деформации (ячейка T3).
   8. Рассчитайте силу (в Н), необходимую для достижения каждого зарегистрированного изменения длины, путем преобразования массы из г в кг и умножения на стандартную силу тяжести (9,81 м/^с2; колонка J).
   9. Рассчитайте инженерное напряжение (в Па), разделив силу, определенную при заданной степени растяжения, на площадь поперечного сечения волокна и умножьте на ^10-6 , чтобы перевести в МПа (столбец К).
   10. Запишите максимальное наблюдаемое напряжение в качестве предельного напряжения (ячейка U3), а напряжение при разрыве — в качестве конечного значения напряжения, зарегистрированного до разрыва волокна (ячейка V3).
   11. Рассчитайте площадь под кривой зависимости деформации от напряжения для получения ударной вязкости с использованием трапециевидного правила для расчета площади под кривой после каждого измерения (столбец L). Суммируйте эти области, чтобы найти ударную вязкость (ячейка W3).
   12. Рассчитайте модуль Юнга (в МПа) путем определения наклона начальной линейной области кривой зависимости деформации напряжения с помощью функции ЛИНЕСТ. Преобразуйте в GPa путем умножения на 10,³ (ячейка X3).

5. Инфракрасная спектромикроскопия с преобразованием Фурье

1. Подготовьте образец для ИК-Фурье, приклеив второе предметное стекло к нижней части предметного стекла, подготовленного для оптической микроскопии.
2. Коллекция оптических изображений и спектральных ИК-Фурье спектров
   1. Заполните дьюар детектора жидким азотом для охлаждения детектора.
   2. Откройте программное обеспечение для управления прибором FTIR.
   3. В окне "Просмотр и сбор " (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S8) откройте вкладку "Сбор ", установите для параметра "Режим сбора " значение ATR, а для параметра "Детектор " - значение "Охлажденный" (дополнительный файл 1 - дополнительный рисунок S9).
   4. Поместите слайд в держатель слайдов и поместите держатель на рабочую область.
   5. Установите верхнюю подсветку на 100, а диафрагму и нижнюю подсветку на 0.
   6. Сфокусируйте центр поля зрения для изображения образца с помощью оптического микроскопа на волокно с помощью физического джойстика или цифрового джойстика в программном обеспечении для управления положением центра поля зрения и фокальной плоскости.
   7. Установите режим сбора на карту (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S8).
   8. Выберите регион для отображения и измерения с помощью инструмента Вид карты - Площадь. Щелкните и перетащите курсор, чтобы указать область, для которой должны быть получены спектры в предварительном просмотре микрофотографии (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S8). Каждый круг на изображении представляет один полученный спектр в этой позиции. При необходимости измените края этого блока, наведя курсор на заданный край блока, а затем щелкнув и перетащив его в нужное место. Переместите весь блок, щелкнув и перетащив его внутри прямоугольника. Измените область рамки и количество точек данных в разделах Область, Апертура и Отображение (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S10).
   9. Щелкните правой кнопкой мыши на предварительном просмотре микроснимка и выберите «Мозаика захвата », чтобы сохранить изображение (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S8).
   10. Установите давление ATR, щелкнув раскрывающееся меню Текущий профиль давления . Для белковых волокон используйте давление 2% (т. е. минимально возможное давление ATR), чтобы свести к минимуму повреждение клетчатки (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S8).
   11. Вставьте наконечник ATR FTIR.
   12. Нажмите кнопку «Собрать» (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S8), чтобы получить фоновый спектр, а затем спектр в каждой из выбранных точек. После завершения сбора данные будут показаны в новом окне.
3. Подготовка данных для последующего анализа
   1. Щелкните левой кнопкой мыши либо на тепловой карте, либо на микрофотографии, чтобы просмотреть спектр, полученный в соответствующей позиции (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S11).
   2. Щелкните правой кнопкой мыши на анализируемом спектре и выберите «Копировать» (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S11).
   3. Щелкните правой кнопкой мыши на панели Windows в верхней части экрана и выберите «Новое окно » (Supplemental File 1 - Supplemental Figure S11).
   4. Нажмите на кнопку «Вставить » в верхней части экрана, когда откроется новое окно (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S11).
   5. Используйте тот же подход для копирования и вставки любых других спектров, необходимых для анализа, в это окно.
   6. Выделите спектр или спектры, нажав клавишу Ctrl при щелчке по каждому нужному спектру или выделив нужные спектры в раскрывающемся меню.
   7. Нажмите кнопку Сохранить как... и сохраните файлы как файлы .spa для анализа данных в управляющем программном обеспечении спектрометра или как .csv для анализа данных в другом программном пакете (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S12).
4. Анализ вторых производных с использованием программного обеспечения, специфичного для прибора
   1. Откройте анализируемые спектры в программном пакете для обработки и анализа спектров для конкретного прибора.
   2. Для преобразования между режимами % пропускания и поглощения используйте Ctrl+A (% пропускания в абсорбцию) или Ctrl+T (абсорбция в % пропускания).
   3. Выберите интересующий регион, нажав кнопку Просмотр | Пределы отображения (или Ctrl+D) (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S13A). Чтобы просмотреть полосы Амид I (1,700-1,600 ^см-1) и Амид II (1,600-1,500 ^см-1), в частности, установите Начальный и Конечный пределы оси X на соответствующие номера волн. При анализе нескольких спектров выберите Применить ко всем спектрам. Нажмите OK (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S13B).
   4. Чтобы построить график второй производной, нажмите Process | Производная... и выберите «Второй » из выпадающего меню (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S14A). Выберите производную Норриса с длиной отрезка 5 и промежутком между отрезками 5 (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S14B). Минимумы спектра второй производной совпадают с пиками компонент в пределах исходного спектра поглощения.
      1. Если спектр слишком зашумлен для оценки минимумов, сгладьте спектр, нажав кнопку Процесс>Автоматическое сглаживание (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S15). Затем вычислите вторую производную и найдите минимумы.
   5. Соотнесите волновые числа в минимумах второй производной с характерными положениями полос для вторичных структур, используя справочную таблицу (например, таблицу 2), чтобы получить представление о вторичной структуре белка.
5. Деконволюция пиков с помощью программного обеспечения для анализа конкретных приборов
   1. Установите область отображения на область, которую необходимо деконволютировать, как показано на шаге 5.4.3. Только этот регион будет деконволютирован.
   2. Базовая коррекция выбранной спектральной области с помощью одного из следующих способов:
      1. Нажмите «Обработать» | автоматическая коррекция базового уровня (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S16); или
      2. Нажмите «Обработать» | Коррекция базовой линии (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S17A), а затем выберите Линейная из выпадающего меню и укажите область спектра, которая должна быть скорректирована базовой линией в спектре Положение, щелкнув и перетащив две точки, указывающие нижнюю и верхнюю границы области, которую необходимо скорректировать в целях деконволюции. Затем выберите «Добавить в окно » во втором выпадающем меню и нажмите кнопку « Добавить » (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S17B).
   3. Выбрав скорректированный по базовому уровню спектр, нажмите кнопку Анализ | Пиковая решимость... , чтобы открыть окно Peak Resolve (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S18).
   4. Выберите спектры и кривые для анализа с помощью панели выбора в левой части экрана.
   5. Выберите Гауссов/Лоренциан с настройкой чувствительности Низкая и настройкой FWHH равной 2 на вкладке Найти пики , а затем нажмите кнопку Найти пики (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S19).
   6. Нажмите на кнопку «Пики », чтобы открыть таблицу с описанием вершин.
      1. Если пиков выбрано больше, чем является физически целесообразным, нажмите кнопку "Удалить пик " до тех пор, пока не будет получено правильное количество пиков для анализа (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S20). Например, для области амида I в литературе обычно сообщается о 5-11 пиках (табл. 2).
      2. Чтобы убедиться, что все пики после установки положительные, нажмите кнопку Редактировать пик и установите минимальную высоту равной 0. Затем нажмите Next и повторите для каждого пика, а затем нажмите OK , чтобы закрыть окно редактирования (Supplemental File 1 - Supplemental Figure S21).
      3. Если есть определенные волновые числа, которые должны присутствовать в окончательной деконволюции, нажмите Редактировать пик и зафиксируйте центр пика на волновом номере, указанном в поле Значение , выбрав Фиксированный , или укажите диапазон с помощью полей Нижний предел и Верхний предел . Нажмите OK , чтобы применить эти настройки к заданному пику.
         ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе оптимально использовать положения пиков, найденные во время анализа второй производной, или пики из справочной таблицы вторичных структур ИК-Фурье, в идеале аннотированные для аналогичного типа образца шелка (например, Таблица 2).
   7. Нажмите кнопку «Подогнать пики» (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S22).
      1. Если алгоритм аппроксимации пиков не сходится, нажмите кнопку Подогнать пики еще раз, чтобы итеративно продолжить подгонку пиков.
   8. Нажмите на кнопку «Пики...», чтобы получить информацию о положении, высоте, FWHH и площади всех пиков, которые были установлены.
      1. Эти пики можно скопировать в буфер обмена, щелкнув по буферу обмена , чтобы их можно было вставить в другое окно или файл (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S23).
      2. Скопируйте пики и спектры в другое окно, выбрав пункт назначения в выпадающем меню выбора окна рядом с кнопкой « Добавить » (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S24).
      3. Нажмите кнопку «Выбрать все » и используйте команду «Файл» | Save As , чтобы сохранить пики и спектры в виде файлов .spa и/или .csv (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S25).
   9. Свяжите каждый пик компонента со вторичной структурой с помощью справочной таблицы. Относительная площадь пика (пиков), соответствующего данной вторичной структуре, по отношению к общей площади всех назначенных пиков обеспечивает долю белка, имеющего эту вторичную структуру.
6. Подготовка данных для последующего анализа с помощью стороннего программного обеспечения
   1. Откройте книгу и загрузите спектральные данные в стороннее программное обеспечение для обработки и анализа спектров, выбрав команду Data | Подключиться к файлу | Пункт меню "Текст/CSV " (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S26). Выберите нужный файл в проводнике и нажмите кнопку «Открыть».
   2. Построение графика спектра, выделение столбцов для построения графика и выбор параметра Plot | Базовый 2D | Пункт меню строки (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S27).
   3. Дважды щелкните по оси X и используйте вкладку «Масштаб », чтобы настроить диапазон в соответствии с пиком Amide I (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S28).
   4. Если данные сильно зашумлены, сгладьте кривую, выбрав опцию Анализ | Обработка сигнала>Сглаживание>Открыть диалоговое окно... (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S29A).
      1. Установите для параметра Пересчитать значение Авто, для параметра Метод — значение Савицкого-Голея, для Точек окна — значение 5, для параметра Граничное условие — значение None, а для параметра Порядок полиномов — значение 2 (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S29B).
      2. Нажмите OK для обработки.
7. Анализ вторых производных с использованием стороннего программного обеспечения
   1. Выберите пункт Анализ | Математика | Дифференциация | Открыть диалоговое окно... (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S30).
   2. Установите параметр Пересчитать в положение Авто, установите Порядок производных в значение 2, выберите параметр Построить кривую производной и нажмите OK (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S31).
   3. Если результирующая кривая второй производной сильно зашумлена, выполните шаги 5.7.1. и 5.7.2, выбрав Сглаживание по Савицкому-Голе на вкладке Сглаживание диалогового окна Дифференцировать .
   4. Как и в пункте 5.4.5, соотнесите волновые числа в минимумах второй производной со вторичными структурами.
8. Деконволюция пиков с помощью стороннего программного обеспечения
   1. После нажатия на график спектра поглощения амида I выберите команду Анализ | Пики и базовая линия | Анализатор пиков | Открыть диалоговое окно... (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S32).
   2. В диалоговом окне Цель - Подогнать пики (Pro) установите для параметра Пересчитать значение Авто, выберите Подогнать пики и нажмите кнопку Далее. (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S33A).
   3. В диалоговом окне Режим базовой линии установите параметр Режим базовой линии в положение Прямая линия и нажмите кнопку Далее (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S33B).
   4. В диалоговом окне "Базовая обработка" выберите "Автовычитание базовой линии", нажмите кнопку " Вычесть сейчас " и нажмите кнопку "Далее " (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S33C).
   5. В диалоговом окне Найти вершины отключите параметр Включить автоматический поиск и нажмите кнопку Добавить.
      1. Дважды щелкните мышью по окну, содержащему график спектра с пиками, которые нужно подогнать.
      2. Выбирать пики на основе минимумов, наблюдаемых во второй производной (шаг 5.7.4) или справочных таблицах (например, табл. 2).
      3. Нажмите кнопку Готово , а затем нажмите кнопку Далее (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S33D).
   6. В диалоговом окне "Посадка пиков (Pro)" выберите "Создать отчет на основе текущего результата подгонки " и нажмите кнопку "Подогнать". за которым следует Finish (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S33E).
   7. Оцените вкладку PeakProperties1 книги, чтобы увидеть центр, интегрированную область и FWHM каждого пика (Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S34). Как и в шаге 5.5.9, соотнесите пик каждого компонента с типом вторичной структуры и оцените процентное содержание белковой структуры в этой вторичной структуре.

Диапазон волновых чисел (см-1)	Задание
1605−1615 гг.	Цепи боковые Tyr/Агрегатные β-пряди
1616−1621 гг.	Агрегированные β-нити/Внутримолекулярные β-листы [слабые]
1622−1627 гг.	Межмолекулярные листы β [прочные]
1628−1637 гг.	Внутримолекулярные β-листы [прочные]
1638−1646 гг.	Случайная катушка/Удлиненные цепи
1647−1655 гг.	Случайная катушка
1656−1662 гг.	α-Helices
1663−1696 гг.	Превращает
1697-1703	Межмолекулярные листы β [слабые]

Таблица 2: Присвоение вибрационных полос области Amide I для шелка Bombyx mori основано на сравнительной оценке нескольких исследований Hu et ^al.57.

Результаты

Идеальным вращающимся раствором является прозрачный, не содержащий осадков и вязкий раствор, указывающий на полное растворение белка (рисунок 7A). И наоборот, неполное растворение приводит либо к образованию молочной суспензии, либо к видимым осадкам (рис. 7B, C). Время, необходимое для полного растворения белка, варьируется в зависимости от растворителя, при этом некоторые растворители, такие как смеси TFA/TFE/H₂O, обычно полностью растворяют белок в течение 30 минут, в то время как другие, такие как HFIP, могут требовать ночного перемешивания наряду с периодическим вихревым перемешиванием.

Рисунок 7: Оптимизация решения для спиннинговых наркотиков. (А) Растворитель, способный полностью растворять белок, дает прозрачный и вязкий вращающийся раствор допинга. Частичное растворение или суспензия белка при неоптимальном выборе растворителя может привести к (В) чрезмерно вязкому состоянию, обычно с видимым осадком, или (С) молочной суспензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

На рисунке 2E показано типичное волокно, нарисованное от руки, а на рисунке 4D показано намотанное волокно мокрого прядения. Перед любым последующим анализом оптическая микроскопия имеет важное значение для оценки качества волокна. Репрезентативные оптические микрофотографии рекомбинантных шелковых волокон мокрого прядения, пригодных для последующего анализа и прядения в двух различных условиях (см. Рисунок 3 для образцов конфигураций мокрого прядения), показаны на Рисунке 8. С помощью оптической микроскопии (рис. 8А) ясно, что эти волокна демонстрируют однородный диаметр, при этом уменьшенный диаметр становится очевидным при применении вытяжки после спиннинга (т.е. растянутых после спиннинга (AS) по сравнению с растянутыми после спиннинга в 40-кратном соотношении 40% этанола (4x-EtOH)). Большая степень двойного лучепреломления, приводящая к большему контрасту в микроскопии поляризованного света (рис. 8B), согласуется с улучшенным молекулярным выравниванием в волокне в результате процесса вытягивания после спина. Наконец, следует отметить, что дефекты, скорее всего, будут наблюдаться в некоторой части оцениваемых волокон, что делает данный сегмент волокна непригодным для последующего анализа. Два таких примера показаны на рисунке 9.

Рисунок 8: Репрезентативные оптические микрофотографии волокон рекомбинантного паучьего шелка мокрого прядения. Волокна в состоянии AS и после 4-кратного растяжения в этаноле (EtOH) после спина проиллюстрированы для химерной пириформно-ациниформной шелковой конструкции (Py₂W₂), наблюдаемой с помощью оптической микроскопии (левая колонка) и поляризованной световой микроскопии (правая колонка). Изображения воспроизводятся с разрешения Ghimire et ^al.17. Масштабные линейки = 30 μм. Сокращения: AS = as-spun; EtOH = этанол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 9: Пример потенциальных дефектов волокна, наблюдаемых с помощью оптической микроскопии. (A) Пример «выпуклого» дефекта. (В) Пример дефекта «горловины». Масштабные линейки = 20 μм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

После проверки отсутствия дефектов в данном сегменте волокна и определения диаметра (раздел 3.2 протокола) могут быть проведены испытания на растяжение (например, рис. 6). Репрезентативные кривые зависимости деформации от напряжения для химерного рекомбинантного паучьего шелка, спряденного с использованием различных условий, показаны на рисунке 10. В зависимости от условий прядения, получаемые волокна варьируются от хрупких (состояние AS) до высокорастяжимых с прочностью, аналогичной состоянию AS (состояние 2x-воздуха), до гораздо более прочных и менее растяжимых волокон (состояние 4x-EtOH). Следует отметить, что для однозначной и строгой оценки механических свойств необходимо оценивать несколько сегментов волокон и партий прядущихся волокон.

Рисунок 10: Репрезентативная кривая напряжения-деформации волокон, скрученных в различных условиях. Волокна анализировали либо в таком же состоянии (AS), либо в процессе производства с использованием автоматизированного растяжения после отжима (указывалось соотношение вытяжки и условия растяжения (воздух по сравнению с растворителем)). Рисунок адаптирован с разрешения Ghimire et al.(2024)¹⁷. Сокращение: AS = as-spun. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Наконец, вторичная структура волокна может быть оценена с помощью спектромикроскопии ATR-FTIR. Типичные спектры шелкового волокна, полученные с помощью этой методики (рис. 11A, B), будут иметь характерные белковые полосы, включая широкий амидный пик А (с центром вокруг ~3300 ^см-1), пик амида I (~1600-1700 ^см-1) и пик амида II (~1500-1600 ^см-1). Здесь мы сосредоточимся на оценке области амида I (например, рис. 11C, D). Анализ второй производной полезен в качестве средства идентификации ключевых компонентов пика амида I (рис. 11E,F), обеспечивая достоверность количественной деконволюции пика (рис. 11G-J), что позволяет оценить и сравнить пропорции вторичного типа структуры, наблюдаемые в шелковом волокне, скрученном в заданных условиях.

Рисунок 11: ИК-Фурье спектры и анализ вторичной структуры. (А,Б) ИК-Фурье спектры волокон Py₂,_W2 , полученных методом мокрого прядения в состоянии (A) по мере вращения (AS) и (B) с включением 4 растяжения после спиннинга в этаноле. (К,Г) Амидные I области спектров ИК-Фурье спектров показаны в точках A и B соответственно. (Э-Ж) Вторая производная областей амида I, показанных в C и D соответственно, рассчитана с использованием указанного программного пакета. (Г-Дж) Деконволюция пика амида I выполняется с использованием программных пакетов (G и I) OMNIC или (H и J) OriginPro, при этом панели G и I являются деконволюцией, соответствующей C и H и J к D . Сокращения: FTIR = инфракрасное преобразование Фурье; AS = как вращается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Выходя за рамки отдельных методов, корреляция данных вторичного структурирования, механических характеристик и (сверх)молекулярной ориентации, как правило, важна как для понимания влияния различных параметров прядения на получаемый материал, так и для рациональной оптимизации процесса прядения. Например, при деконволюции ИК-Фурье, показанной на рисунке 11, при сравнении условий AS с 4×-EtOH для химерного шелка, существенный вклад β листа в полосу амида I очевиден для обоих условий, но составляет большую долю общей вторичной структуры для растянутого состояния после прядения по отношению к состоянию AS, независимо от метода деконволюции (например, Рисунок 11G,H в сравнении с рисунком 11I,J). Это согласуется как со значительно более высокой концентрацией, наблюдаемой в состоянии 4×-EtOH, чем в состоянии AS (Рисунок 10), так и с улучшением молекулярного выравнивания в состоянии 4×-EtOH по сравнению с состоянием AS (Рисунок 9). Подробные характеристики и анализ, охватывающие диапазон условий, показанных на рисунке 10, были представлены ранее¹⁷. Поэтому мы не резюмируем здесь весь анализ, а вместо этого используем это парное сравнение в качестве демонстрации того, как эти три класса данных дополняют друг друга и позволяют развить гораздо более полное понимание поведения волокна, чем любой отдельный метод в отдельности.

Дополнительный файл 1: Файл, содержащий дополнительные рисунки S1-S34, изображающие измерение диаметра волокна, обработку механических данных, а также сбор и обработку данных ИК-Фурье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Электронная таблица, позволяющая определять ключевые механические свойства (т.е. напряжение, деформацию, модуль Юнга и ударную вязкость) на основе данных о зависимости массы от времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Производство рекомбинантных белков открывает захватывающий потенциал для изготовления материалов в самых разных форматах, при этом последние достижения подразумевают, что эти материалы на основе белка приближаются к более широкому промышленному^{использованию}. Здесь мы сосредоточились на производстве волокна из рекомбинантного шелка, поскольку это формат рекомбинантного шелка, напрямую связанный с нативным волокнистым паучьим шелком. Шелковые волокна рекламируются как имеющие множество потенциальных применений из-за известных механических свойств натурального паучьего шелка и из-за потенциала для устойчивого производства высокоэффективных^{волокон.} Предлагаемые области применения варьируются от высокоэффективного текстиля до энергопоглощающих материалов, средств личной гигиены и использования в здравоохранении^58,59. Устройства и материалы на основе паучьего шелка в носимых форматах или в других контекстах, где повышена электропроводность, также находятся в стадии активного изучения как для биомедицины, так и для более^{широкого применения.} Таким образом, существует широкий интерес к разработке, оптимизации и персонализации материалов на основе паучьего шелка. В этом протоколе мы описываем ряд процедур, направленных на быстрое производство волокна либо после получения нового рекомбинантного белка шелка, либо для модуляции свойств материалов рекомбинантного шелка, который уже был признан пригодным для прядения.

Независимо от используемого способа прядения, крайне важно определить условия, которые позволяют производить спиновой допинг путем скрининга условий растворителя/буфера и концентрации белка, как подробно описано в настоящем документе. Конечной целью является солюбилизация белка в достаточно высокой концентрации, чтобы обеспечить быстрое преобразование в волокно без самостоятельной сборки в агрегаты или другие нерастворимые виды, которые будут препятствовать «продуктивному» прядению. Как правило, это прозрачный, относительно вязкий раствор, более чем вероятно содержащий самоорганизующиеся соединения, такие как мицеллы/наночастицы^26,61 и/или фазовое разделение⁶² между жидкостью и жидкостью. В этом протоколе не детализируются методы всесторонней оценки состояния спинового допинга, поскольку успешное спиннинговое спиннингование может быть достигнуто путем итеративной оценки различных спиновых допинговых конфигураций и конфигураций спиннинга. Детальное молекулярное и супрамолекулярное понимание спинового состояния может быть достигнуто с помощью таких методов, как вискозиметрия, рассеяние света, спектроскопия кругового дихроизма в дальнем ультрафиолетовом диапазоне, спектроскопия ядерного магнитного резонанса и/или электронная^{микроскопия}. Следует также отметить, что сам рекомбинантный белок может быть модифицирован для улучшения его поведения при прядении, при этом включение глобулярных неповторяющихся N- и C-концевых доменов является одним из примеров способа повышения растворимости спидроина³². Короче говоря, без подходящей идентификации спинового допинга невозможно приступить к сравнительному тестированию условий спиннинга.

После того, как было выявлено одно или несколько условий спинового допинга, ручное рисование обеспечивает быстрый путь к оценке свойств шелкового волокна. Поскольку для продуктивного ручного рисования требуются значительно меньшие объемы допинга, требуются гораздо меньшие массы чистого белка, что делает его отличным предшественником автоматизированных подходов к мокрому прядению. Это также обеспечивает очень удобный и простой метод для прямого сравнения свойств волокна различных спидроинов³³, опять же с тем преимуществом, что производство волокна является относительно простым при небольших количествах белка. Это означает, что оптимизация экспрессии белка и протоколов очистки для получения более высоких выходов, необходимых для мокрого прядения, может быть сосредоточена на наиболее перспективных спидроинах. Недостатком, конечно, является то, что ручное волочение не способствует производству длинных непрерывных волокон или значительного количества волокна в упрощенном виде.

При наличии достаточного количества белка мокрое прядение дает преимущества для упорядоченного производства длинных непрерывных волокон³². Не только это, но и свойства волокна могут быть легко модулированы в процессе прядения. Выбор условий спиннингового допинга, например, обеспечивает один из четких путей улучшения механики волокна. Например, в случае рекомбинантного ациниформного белка шелка с молекулярным сопротивлением ~60 кДа, переход от одного спинового допинга к другому при сохранении всех остальных параметров спиннинга приводит к резким изменениям в растяжимости волокна²⁶. Это, в свою очередь, связано с тем, как ациниформный спидроин собирался в спиновом допинге перед вращением, при этом улучшенная гомогенность самоорганизующихся наночастиц в спиновом допинге коррелировала с улучшенной механикой волокон. Включение вытяжки после отжима с учетом того, что коэффициент вытяжки должен быть оптимизирован для данного типа волокна, также обычно улучшает механику шелкового волокна за счет некоторой комбинации улучшенного молекулярного выравнивания и улучшенного превращения, например, в кристаллиты β листов, которые укрепляют волокна³². Наконец, использование различных условий на этапе вытягивания после отжима позволяет модулировать свойства волокна. Воздействие растворителя непосредственно перед или во время вытягивания может существенно изменить механические и структурные свойства волокон ^17,38, отмечая, что различные спидроины будут иметь различные предпочтения в отношении растворителей и допуски (например, рекомбинантные ациниформные волокна обладают высокой совместимостью с^{водой26,31} по сравнению с рекомбинантными пириформными волокнами, подвергающимися сжатию в воде³⁸ в отличие от волокон химерного пириформно-ациниформного спидроина, демонстрирующих водную совместимость ациниформного спидроина, несмотря на то, что он составляет менее половины белка по массе¹⁷).

Описанный протокол обеспечивает гибко настраиваемый и универсальный подход к оценке и оптимизации прядильности и волоконных свойств рекомбинантного паучьего шелка. Во всех случаях результирующие свойства волокна должны быть последовательно и надежно проанализированы и сравнены. Здесь мы предлагаем использовать оптическую микроскопию, включая микроскопию поляризованного света, испытание на растяжение и ИК-Фурье-спектромикроскопию в качестве «стандартного инструментария» методов для этой цели. Дополнительные биофизические методы и методы определения характеристик материалов могут быть применены для расширения понимания полученных волокон, но этот набор методов обеспечивает превосходный охват ключевых свойств морфологии, внутрифибриллярного выравнивания/анизотропии, механических характеристик и вторичного структурирования белков. В частности, несмотря на то, что ИК-Фурье спектроскопия обеспечивает относительно простой способ оценки вторичной структуры шелкового волокна, а поляризованная световая микроскопия позволяет делать выводы о степени достигнутого улучшенного молекулярного выравнивания, другие методологии, такие как твердотельная ЯМР-спектроскопия^63,64, рентгеновская дифракция⁶⁴, поляризованная рамановская спектромикроскопия⁶⁵ и/или нелинейная оптическая микроскопия⁵⁴ следует рассмотреть для более всесторонней оценки кристалличности, выравнивания и структурирования в шелковых волокнах для полного выяснения взаимосвязи структуры и механики. Учитывая пригодность мокрого прядения для других типов белков⁶⁶, мы ожидаем, что этот протокол будет в целом применим за пределами рекомбинантного шелка.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,1,1,3,3,3-гексафторопропанол (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	445820500	Используется для приготовления
препарата 1725LTSN шприц с наконечником Люэра с цементированной иглой	Hamilton	81100	Используется для мокрого прядения
2,2,2-трифторэтанол (TFE)	Sigma-Aldrich	T63002-500G	Используется для приготовления абсолютного
этанола	Fisher Scientific	BP28184	Используется для коагуляционной ванны
Уксусная кислота	Fisher Scientific	A38-212	Используется для приготовления допинга
Аналитические весы	Mettler Toledo	XS105 Двухдиапазонное	устройство для испытаний на растяжение
Хлорид кальция (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C-3881	Используется для приготовления допинга
Лимонная кислота	Millipore Sigma	77-92-9	Используется для приготовления допинга
Computer	Raspberry Pi	Raspberry Pi 4 Model B	Технология мокрого прядения - обеспечивает возможность использования графического интерфейса пользователя для управления шаговыми двигателями
Гидрофосфат натрия (Na2HPO4)	Millipore Sigma	7558-79-4	Используется для приготовления препарата
Муравьиная кислота	Fisher Scientific	A118-500	Используется для приготовления допинга
Стеклянные стекла	Millipore Sigma	S8902-1PAK	Используется для монтажа волокна
Соляная кислота (HCl)	EM Science	HX0603-53	Используется для приготовления допинга
MCT-A Охлаждаемый детектор	Thermo Fisher Scientific	840-199300	ИК-Фурье оценка вторичной структуры волокна
Монтажная пластина	Изготовлено на собственном производстве		Устройство для мокрого прядения
NEMA 17 Биополярный шаговый двигатель	STEPPERONLINE	17HS15-1504S-X1	Устройство для мокрого прядения - примечание: для выполнения растяжения после спиннинга требуется несколько двигателей
Nicolet iN10 FTIR спектромикроскоп Thermo	Fisher Scientific	912A0604	ИК-Фурье оценка вторичной структуры волокна
Nicolet iN10 Mapping Stage	Thermo Fisher Scientific	840-198800	ИК-Фурье оценка вторичной структуры волокна
Nicolet iN10 Моторизованный джойстик Stage	Thermo Fisher Scientific	840-199800	ИК-Фурье оценка вторичной структуры волокон
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350	Thermo Fisher Scientific	840-194800	ИК-Фурье оценка вторичной структуры волокна
OMNIC Picta версия 1.7.224	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	программное обеспечение для управления приборами
OMNIC версия 9.11.745	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	программное обеспечение для обработки и анализа данных для специальных приборов
Оптический/поляризованный свет	микроскоп Zeiss Canada	Axio Observer A1	Инвертированный оптический микроскоп
OriginPro 2025 10.2 SR1	OriginLab Corporation	OriginPro 10.200196	Стороннее программное обеспечение для обработки и анализа ИК-Фурье данных
Дигидрофосфат калия (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-10	Используется для приготовления препарата
Двухосновной фосфат калия (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-500	Используется для приготовления допинга
Блок питания	ALITOVE	ALT-1205	Мокро-прядильное устройство - 12В 5А Адаптер питания Преобразователь переменного тока 100-240В Вход с выходным разъемом постоянного тока 5,5х2,5 мм - примечание: для оптимальной производительности может потребоваться отдельный блок питания для каждого мотора
Ацетат натрия	Sigma-Aldrich	S2889-1KG	Используется для приготовления препарата
Гидроксид натрия (NaOH)	Millipore Sigma	1310-73-2	Используется для приготовления
препарата Спиннинговые ролики	Изготовлен на собственном производстве		Используется для мокрого прядения
Кабели шагового двигателя	XMSJSIY	B0BD5FV3R2	Устройство мокрого прядения - обеспечивает подключение от контроллеров шаговых двигателей к шаговым двигателям
Контроллер шагового двигателя (Pi HAT)	Adafruit	DC & Шаговый двигатель HAT для Raspberry Pi	Перестановка контроллера двигателя мокрого спиннингового устройства 1 - обратите внимание: ограниченная скорость вращения мотора ~46 об/мин
Контроллер шагового мотора (USB)	Polulu	Tic T249	Перестановка контроллера мотора мокрого спиннингового устройства 2 - используйте, когда может потребоваться вращение быстрее 46 об/мин
Шприцевой насос	KD Scientific	Model 100	Устройство для испытаний на растяжение и устройство мокрого прядения
Трифторуксусная кислота (TFA)	Millipore Sigma	TX1276-7	Используется для приготовления дурмана
Трис-гидрохлорид	EMD Millipore	9310-500GM	Используется для приготовления допинга
USB Hub	Acasis	B07Q3TYF15	Устройство мокрого прядения - USB-концентратор мощностью 48 Вт - ACASIS 10 портов USB 3.0 Data Hub - с отдельными переключателями включения/выключения и USB-разветвителем адаптера питания 12 В/4 А - интерфейс между контроллерами шаговых двигателей Raspberry Pi и Tic T249