Method Article

Процедура пересечения/восстановления седалищного нерва у мышей для изучения восстановления нервов и его функционального восстановления

DOI:

10.3791/68724

⸱

January 16th, 2026

 , 
1Barshop Institute for Longevity and Aging Studies, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Cell Systems and Anatomy, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 3Department of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает модель пересечения седалищного нерва и реконструкции у мышей для изучения регенерации периферических нервов с использованием ганглиозных нейронов дорсального корня взрослого. Он позволяет in vivo анализировать рост аксонов, реиннервацию мышц и функциональное восстановление после повреждения нерва.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Восстановление нервов имеет решающее значение для восстановления функций после повреждения аксона. Однако зрелые нейроны центральной нервной системы (ЦНС) имеют ограниченную способность к регенерации аксонов после травмы из-за снижения внутренней способности роста и неблагоприятной среды. В отличие от этого, нейроны периферической нервной системы (ПНС) обладают устойчивым регенеративным потенциалом. Среди них нейроны ганглия дорсального корня (DRG) взрослых особенно известны своей способностью к эффективной регенерации после повреждений периферических нервов, что делает их идеальной моделью для изучения клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе восстановления нервов. Здесь описана модифицированная микрошва, называемая «петля перед пересечением», для создания модели пересечения седалищного нерва и решва у мышей, после чего проводится анализ регенерации аксонов. Также показано, что поведенческие оценки и мышечная реиннервация оценивают функциональное восстановление. После пересечения и повторного шва седалищного нерва у животных изначально наблюдаются поведенческие нарушения, но полное восстановление обычно наблюдается через 30 дней после травмы. Применение препаратов, способствующих аксональному сращению в месте повреждения, значительно ускоряет функциональное восстановление. Эта модельная система представляет собой мощный инструмент для изучения механизмов, управляющих восстановлением нервов млекопитающих in vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аксональное повреждение — это распространённое и тяжёлое следствие повреждения мозга и спинного мозга, часто вызванное травматическими повреждениями, нейротоксинами или неврологическими расстройствами, которые нарушают нейронную связь и затрудняют аксональнуюрегенерацию 1,2. Не все нейроны обладают внутренней способностью к регенерации, что крайне важно для восстановления отрезанных аксонов. Скорость аксональной регенерации зависит от множества факторов, включая внутренний потенциал роста нейрона, эффективность синтеза белка, динамику цитоскелета, очистку миелиновых остатков и наличие факторовроста 3,4.

У взрослой млекопитающей центральной нервной системы (ЦНС) аксональное повреждение приводит к снижению регенеративной способности, главным образом из-за отсутствия внутренних факторов, стимулирующих рост, и наличия тормозящих внешнихсигналов 1,5. В отличие от этого, аксоны в периферической нервной системе (ПНС) обладают устойчивой способностью к регенерации после травмы благодаря внутренним механизмам самовосстановления периферических нейронов и быстрой реактивации прорегенеративных программ роста. При повреждении дистальный сегмент аксона отсоединяется от нейронной сомы и подвергается валлерианской дегенерации, характеризующейся распадом и фрагментациейаксонов 6,7. Эффективное очищение аксональных и миелиновых остатков глиальными клетками крайне важно для успешной регенерации, так как предотвращает образование рубцов, которые могут замедлить ростаксонов 3,8. Этот процесс вместе с цитоскелетной ремоделировкой повреждённых аксонов поддерживает восстановление проксимального пня и способствует реиннервации мишеней. Эти события происходят частично перекрывающимися фазами, в ходе которых активация транскрипционных факторов, вызванных травмами, таких как ATF3 и c-Jun, способствует прорегенеративным программам экспрессиигенов 4,9,10.

Регенеративное аксональное слияние представляет собой эффективный механизм восстановления нейронной связности после поврежденияаксонов 11. Этот процесс был впервые описан у рака Procambarus clarkii в 1967 году12 и с тех пор задокументирован у несколькихвидов 13, 14, 15, 16, включая Caenorhabditiselegans 17. Хотя прямые доказательства аксонального слияния у млекопитающих остаются ограниченными, стратегии индуцирования слияния успешно применяются для улучшения восстановлениянервов 11. Примечательно, что химический вещество фузоген полиэтиленгликоль (ПЭГ) способствует повторному герметизации мембран и доказано, что способствует восстановлению после повреждений периферических нервов и спинного мозга у млекопитающихмоделей 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24. Недавние данные показывают, что истощение глутатион пероксидазы (GPX) достаточно для стимулирования аксонального слияния у C. elegans25. Аналогично, у условных нокаутных мышей с GPX4 или у тех, кто получал ингибитор GPX ML162, наблюдалось ускоренное функциональное восстановление после сечения седалищного нерва, возможно, за счёт усиленного аксональногосращения 25.

Седалищный нерв — это смешанный нерв, состоящий из сенсорного, соматического и автономного моторныхаксонов 26. Укрыс 27 он возникает из сегментов позвоночника L4 и L5, а у мышей — из сегментов L3 и L4. Благодаря своей доступности и анатомической консистенции повреждение седалищного нерва стало одной из самых широко используемых моделей для изучения регенерации периферическихнервов 29,30. Эти модели позволяют исследовать как внутренние нейронные механизмы, так и внешние факторы окружающей среды, влияющие на рост аксонов и функциональноевосстановление 3,4,9. Использование сдавления седалищного нерва как экспериментальной парадигмы в нейронауке восходит к концу XIXвека 29 года. Помимо моделей сжатия нервов, пересечение нервов широко используется для изучения регенерации аксонов и функционального восстановления. Однако классическое пересечение седалищного нерва с последующим швом у мышей часто менее воспроизводимо и надёжно, чем у крыс, из-за небольшого размера нерва и хрупкойтекстуры 31.

С помощью модифицированной модели пересечения седалищного нерва и повторного шива, называемой «петля перед пересечением», были успешно получены воспроизводимые модели пересечения седалищного нерва и шва25. Этот подход устраняет необходимость обработки нервов после пересечения, заранее вводя шов перед резкой, что снижает механическую нагрузку и минимизирует вариативность хирургической техники. Умеренные уровни модуляции GPX способствовали функциональному восстановлению после полного пересечения седалищногонерва мыши 25. Совместное лечение низкими концентрациями ML162 (0,25 мкм)32, ингибитора GPX и полиэтиленгликоля (PEG, 500 мМ)18,19,20,21,22,23,24 на сечении седалищного нерва (SNT) / поражения решива успешно улучшило поведенческий балл, оцениваемый с помощью теста с уколом иглики, асимметрии неисправности стопы и расширения пальцевног 25,33,34. Ампутированные фрагменты дистальных аксонов нейронов дорсального корня (DRG) у млекопитающих вырождаются в течение 3 дней, что приводит к нарушению нейромышечных соединений (NMJ)6,35, и регенеративные нейроны DRG реиннервируют мышцы для восстановления их функций. Группа совместного лечения SNT/resuture-ML162/PEG показала иннервированные NMJ и улучшенные поведенческие показатели на ранних этапах (через 3 дня после операции), что указывает на раннее восстановление нервно-мышечнойфункции 25.

Здесь описан метод микрошва «петля перед рассечением» и введение лекарств, которые позволили эти наблюдения на мышах. Ранее установленный протокол слияния ПЭГ, позволяющий быстро восстанавливать перерезанные нервы крыс, былмодифицирован 18. Изначально сообщалось, что полиэтиленгликоль (ПЭГ) способствует экзогенной реконекции медиальных гигантских аксонов резаных раков (MGA) in vitro36. Протоколы PEG-fusion улучшили поведенческие результаты в 25%–30% исследований, связанных с повреждениями седалищного нерва крысы, хотя функциональное восстановление не наблюдалось на раннихэтапах 34. Последующие усовершенствования включали концепцию эндогенного мембранногогерметизации 37. После повреждения нервов быстрая плазмалеммальная регенерация является нейропротекторной и предотвращает нейродегенерацию. Накопление мембранных пузырьков, вызванноеCa2+, облегчает этот процессуплотнения 38. Полное пересечение нерва нарушает аксолемму, а также эндонеуриальные, периневриальные и эпиневриальные оболочки в месте поражения. Микрошвы эпиневриальной оболочки выравниваются между проксимальной и дистальной нервными костями. Во время этапа шва использование гипотонического раствора без Ca2+ снижает образование мембранных пузырьков, сохраняя открытыми эндоневриальные и периневриальные оболочки и позволяя им быть близко приближены эпиневриальными швами. После этого применение физиологического раствора, содержащегоCa2+, вызывает накопление везикул, чтобы закрыть оставшееся плазмалеммальноенарушение 18.

В этом протоколе использовались взрослые мыши FVB (8-10 недель) и мыши C57BL/6, при этом различия в специфическом штамме не наблюдалось. Седалищный нерв у мышей расположен примерно в 1–2 мм ниже ягодичной мышцы на уровне середины бедра и заметно тоньше и хрупче, чем у крыс, что требует большей хирургической точности при вскрытии и наложении швов. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать чрезмерного растяжения нервов или чрезмерных манипуляций, которые могут затруднить функциональное восстановление. Этот подход предполагает полное пересечение нерва, что приводит к физическому зазору между проксимальными и дистальными вырубками. Поскольку этот разрыв подавляет прямую регенерацию аксонов, успешное восстановление обычно требует микрохирургического вмешательства или пересадки нервов.

Поскольку седалищный нерв мыши тоньше и нежнее, чем у крысы, требуется большая хирургическая точность. Хотя микрошвы часто применяются, оно может непреднамеренно вызвать дополнительную травму из-за чрезмерных манипуляций или повторных проходовиглы 39. Эти ограничения могут вводить изменчивость и потенциально затруднять оценку новых методов лечения. Поэтому достижение стабильных хирургических результатов при минимизации повреждения нервов, вызванных швами, крайне важно для надёжной оценки функционального восстановления в моделях пересечения нервов. С помощью этого метода «петля перед пересечением» были созданы воспроизводимые модели пересечения и решва седалищного нерва, а также оценены эффекты двойного лечения с помощью PEG и ML162 на функциональное восстановление. В целом, несмотря на широкое применение, модель пересечения седалищного нерва у мыши представляет технические трудности из-за небольшого размера и хрупкости нерва. Этот модифицированный метод повторного шива, описанный здесь, решает критическую потребность в воспроизводимом, стандартизированном микрохирургическом протоколе, минимизирующем механические повреждения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с животными проводились в соответствии с рекомендациями Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) при Медицинском научном центре Техасского университета в Сан-Антонио (номер протокола: 20200082AR). Для экспериментальных процедур, описанных здесь, использовались взрослые самцы и самки FVB мышей (8-10 недель, 20-25 г). Мыши C57BL/6 (8-10 недель, вес 20-25 г) использовались только в предварительных практических операциях перед формальными экспериментами для оптимизации точности обращения и накладки швов. Эти тренировочные сессии подтвердили, что процедура «петли перед транссекцией» дала сопоставимые результаты в обоих штаммах; поэтому все формальные данные, представленные в этой рукописи, были получены с мышей FVB. Всего было включено десять мышей FVB (пять самцов и пять самок) для пересечения седалищного нерва, после чего была проведена обработка ML162 + PEG. У одного животного наблюдалась врождённая анатомическая вариация, при которой седалищный нерв разделялся на две основные ветви перед местом пересечения, что привело к неполной операции и исключению из анализа. Поэтому были проведены поведенческие и гистологические анализы на девяти животных (n = 9). У обоих полов наблюдалось сопоставимое регенеративное и поведенческое восстановление, при этом различия по полу не наблюдались. Дополнительная мышь прошла двойное проникновение шва без пересечения нерва (фиктивный контроль) для оценки возможного влияния самой процедуры шва на поведенческие результаты. Заметных различий в регенеративном ответе между полами не наблюдалось. Животных содержали в стандартных условиях с 12-часовым циклом света и темноты, при температуре 75 °F и влажности 40%-60%, с иммиграционным доступом к корму и воде. Использовались как самцы, так и самки мышей, и заметных различий между самцами и самками животных не наблюдалось. Хирургические операции проводились под анестезией изофлурана в системе низкого потока анестезии SomnoSuite. Поведенческие тесты проводились с второго послеоперационного дня и повторялись на 4, 7, 10, 14, 18, 22 и 27 днях, как указано на соответствующих показателях. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Пересечение/повторное зашивание седалищного нерва и медикаментозное лечение

  1. Поместите животное на подогреваемую подушечку, чтобы ишиас можно было наблюдать под стереодисорационным микроскопом (рисунок 1A).
  2. Анестезируйте мышь с помощью системы низкого потока анестезии SomnoSuite.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом операции подтвердите глубину анестезии по отсутствию рефлекторных реакций, таких как реакция на защемление пальца ноги. Нанесите ветеринарную офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость роговицы.
  3. Побрейте волосы на бедре и вокруг ног.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите выбритые и выпавшие волосы как можно аккуратнее. В противном случае волосы прилипнут к нейлоновому шву 10-0 и загрязнят седалищный нерв. Остаточные волосы можно аккуратно удалять лабораторной лентой или скотчем после бритья, чтобы обеспечить чистоту хирургического поля. Дезинфицируйте место операции, последовательно протирая выбритое место 70% этанолом, бетадином, а затем 70% этанолом с помощью автоклавных ватных шариков.
  4. Определите бедренную кость и сделайте небольшой кожный разрез примерно 1,0 см (диапазон 0,8–1,2 см) на уровне середины бедра, примерно на ~1 мм сзади и параллельно бедренной кости, с помощью тонких хирургических ножниц.
    1. Аккуратно втяните большую ягодичную мышцу, чтобы обнажить подлежащий бицепс бедренного мышца. Затем используйте кончики ножниц, чтобы аккуратно разделить переднюю и заднюю головки бицепса бедренного мышца, не разрезая, чтобы открыть седалищный нерв под седалищной выемкой. Эти этапы выполняются под прямым визуальным наблюдением, а не под микроскопом.
  5. Извлечение седалищного нерва из тела с помощью микродиссекционных щипцов для проведения операции на седалищном нерве (рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Закрепите щипцы скотчем, чтобы предотвратить их распространение выше определённого уровня и минимизировать повреждение седалищного нерва. Положите кончик щипца под седалищный нерв и поднимите седалищный нерв вверх, используя мышиное бедро как точку опоры. Старайтесь поднимать нерв только настолько, насколько это необходимо для облегчения наложения швов, и избегайте натяжения или вытягивания наружу, так как чрезмерное растяжение может повредить аксоны или окружающие структуры.
  6. Сфокусируйте микроскоп на открытом седалищном нерве. После этого шага проходите шаг 15 с помощью микроскопа (рисунок 1A).
  7. Проникнуть вдвое в седалищный нерв нейлоновым швом 10-0 (рисунок 1B,C). Перейдите к шагам 1-8 для полного контроля. Перейдите к шагам 1-11 для пересечения нерва.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Два проникновения были проведены примерно на расстоянии одной ширины нерва друг от друга (~0,7 мм), расположенные симметрично по обе стороны от предполагаемого места пересечения. Такое расстояние обеспечивало правильное выравнивание проксимальных и дистальных пеньков, минимизируя механические нагрузки на месте поражения. Сделайте проникновение через центр седалищного нерва с помощью шва, убедившись, что два проникновения, сделанные швом, были точно параллельны. Швы размером 10-0 маленькие и должны контролироваться с помощью очень тонких пинцетов. Использовался неабсорбуемый нейлон 10-0, поскольку он обеспечивает отличную устойчивость на растяжение и минимальную реактивность тканей в течение 30-дневного наблюдения. Этот материал широко используется в микрохирургических моделях восстановления нервов у мышей икрыс 18,31. Рассыпающиеся швы не использовались, поскольку постепенное разрушение могло нарушить выравнивание перерезанных нервных пеньков до завершения функционального восстановления. Чтобы минимизировать вариативность, зависящую от оператора, все хирургические процедуры проводились одним обученным хирургом после обширной микрохирургической практики под стереомикроскопом. Сам метод «петли перед пересечением» дополнительно снижает вариабельность, устраняя необходимость манипуляций нервами после пересечения, обеспечивая таким образом равномерное выравнивание и напряжение у животных. Это требует значительной практики и высокого уровня контроля. Перед проведением операций на животных новичкам может быть полезно практиковать движение шва с использованием тонких синтетических нитей, таких как зубная нить, чтобы развить ловкость и контроль под стереомикроскопом.
  8. Аккуратно завяжите узел нейлоновым швом.
  9. Положите открытый седалищный нерв под мышечный слой и закройте кожу с помощью 4-0 нейлоновых швов.
  10. Определите, что двойное проникновение в седалищный нерв нейлоновым швом 10-0 не влияет на поведение мышей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения этого мыши, прошедшие двойное проникновение шва без пересечения, подвергались тем же поведенческим тестам, что и в экспериментальных группах, включая укол, асимметрию разлома стопы и распространение пальцев. Эти мыши стабильно набирали полные баллы, эквивалентные неоперированным диким контролям, что свидетельствует о том, что сама процедура шва не нарушала функцию седалищного нерва.
  11. Перережьте седалищный нерв посередине между двумя нейлоновыми швами 10-0 с помощью скальпеля (рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы минимизировать вариативность, все операции проводились одним и тем же обученным экспериментатором по стандартизированной процедуре. Кроме того, конструкция «петля перед пересечением» по своей сути минимизирует вариативность, избегая обработки нервов после пересечения, обеспечивая равномерное расположение шва и натяжение у всех животных. Положение швов проверялось под расщепляющим микроскопом для обеспечения равномерности у животных.
  12. Убери щипцы.
  13. Промыйте разрезанный нерв физиологическим раствором с буферомCa2+-без фосфатов (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4/2PO4, pH 7,4), приготовленным без хлорида кальция.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывайте перерезанный нервный пеньок кальциевым PBS примерно в течение 10-20 секунд, чтобы очистить кровь и предотвратить преждевременное герметизация. Повторное накладывание шва должно быть выполнено быстро в течение 1-2 минут для поддержания выравнивания и жизнеспособности тканей.
  14. Удалите PBS без Ca2+, впитая его с помощью салфетки.
  15. Аккуратно завяжите узел нейлоновым швом (рисунок 1E). Переходите к шагу 20, если лечение наркотиков не планируется или не обязательно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для микрошва использовался стандартный квадратный узел, состоящий из двух противоположных бросков, аккуратно затягиваемых тонким щипцом под стереомикроскопом. Два отделённых аксона, соединённых швом, возвращаются к форме, близкой к своей исходной форме. Повторное соединение перерезанного кровеносного сосуда может быть визуальным признаком правильного выравнивания проксимальных и дистальных нервов. Во время процедуры ткань должна выглядеть свежей и влажной, без бледности и сжатия. Избегайте слишком туго завязывания шва, так как это может схлопнуть кровеносные сосуды или деформировать нерв. Перед завязыванием последнего узла убедитесь, что нервные концы приблизились без натяжения. При необходимости аккуратно переместите конечность для естественного выравнивания, а не натягивайте нерв, так как чрезмерное напряжение может повысить риск невромы или фиброза.
  16. Поместите 0,25 мкм ML162 в DMSO, разбавленный в PBS, на зашитый седалищный нерв с помощью шприца. Дайте зашитому седалищному нерву погрузиться в препарат на 1 минуту.
  17. Удалите ML162, впитав его стерильной ватной палочкой.
  18. Поместите 500 мМ ПЭГ в дистиллированную воду, предварительно подогрев до 37 °C на сшитый седалищный нерв с помощью шприца. Дайте зашитому седалищному нерву погрузиться в препарат на 1 минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 500 мМ ПЭГ — это плотный раствор, который может стать твёрдым при температуре операционной. Во время работы положите шприц на подогретый прокладку, чтобы PEG оставался жидким. Считается, что ПЭГ способствует слиянию мембран, удаляя молекулы воды между соседними двуслоями липидов, что обеспечивает тесный контакт мембран и спонтанное слияние. Хотя точный молекулярный механизм остаётся в стадии изучения, этот подход показал, что способствует аксональной непрерывности и способствует функциональному восстановлению в моделях повреждения периферических нервов.
  19. Удалите ПЭГ, впитав его с помощью салфетки.
  20. Промыть зашитый нерв PBS, содержащейCa2+, (PBS с добавлением 1 мМCaCl2; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ фосфатного буфера, pH7,4).
  21. Удалите PBS, содержащуюCa2+, впитывая его с помощью ткани.
  22. Положите открытый седалищный нерв под мышечный слой и закройте кожу с помощью 4-0 нейлоновых швов.
  23. Когда животное оправится после наркоза, верните его в клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После закрытия кожи место операции было обработано местной антибиотиковой мазью с обезболивающим. Каждое животное наблюдалось на грелке, пока оно не пришло в себя достаточно, чтобы поддерживать грудинное лежачее положение. Животных затем содержали по отдельности и возвращали в группу только после полного восстановления моторной функции. Хотя хирургическая среда не поддерживалась под ламинарным капюшоном, все хирургические инструменты были стерилизованы, а процедуры проводились с использованием асептической техники с использованием перчаток и стерильных инструментов.

2. Тест на поведение — Pinprick

ПРИМЕЧАНИЕ: Оценить чувствительность механической чувствительности при высоком пороге послетравмы 33.

  1. Поместите мышь в сетку из проволочной сетки и дайте ей свободно перемещаться 30 минут, чтобы она привыкла к новой среде.
  2. Самая латеральная часть подошвенной поверхности задней лапы была разделена на 5 областей (от A до E). Аккуратно нанесите Аустерлиц (размер 000) на подошвенную поверхность ипсилатеральной лапы. Игольный укол применялся дважды от самого бокового пальца (область A) к пятке (область E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не проникайте в кожу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция считалась положительной, когда животное быстро убрало лапу с двух уколов в иголках. Мышь оценивалась на 1 по этой области, а затем тестировала для следующей (максимум 5). Если ни одна из заявок не получила положительного ответа, общая оценка составляла 0. Используйте подкожную область той же ипсилатеральной стороны в качестве положительного контроля. Это всегда вызывает положительный отклик.

3. Тест поведения — асимметрия неисправности стопы (FF)

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы измерить, насколько хорошо ишиасные аксоны иннервируют более проксимальныемышцы 34.

  1. Позвольте животным свободно передвигаться по сетке из проволочной сетки, установленной на клетке, чтобы привыкнуть к окружающей среде. Одно испытание состоит из 50 шагов на каждую заднюю конечность.
  2. Забивайте, когда животные ошибаются. Критерии подсчёта очков следующие.
    Оценка 1: Частичная неисправность. Оттянула назад, прежде чем нога полностью выпала на бедро.
    Оценка 2: Полная вина. Полностью упал в пах.
  3. Рассчитывайте суммарный балл неисправности стопы по травмированным и нездоровым задним конечностям всех животных на каждом послеоперационном этапе.
    Составный балл неисправности стопы = (# частичные разломы x 1) + (# полные разломы x 2)
  4. Разделите составный балл разлома стопы на 50 (общее количество шагов на ветку), чтобы получить процент разлома для каждой задней конечности.
    % ошибки стопы = Комплексный балл ошибки стопы/50 (всего шагов) x 100%
  5. Вычтите неисправности стопы в повреждённой задней конечности из доли повреждений стопы в целой задней конечности, чтобы получить асимметрию для каждого животного в определённый послеоперационный момент.
    Оценка асимметрии стопы (FF ) = %FF (целая конечность) - %FF (травмированная конечность)

4. Тест на поведение — расширение пальцев ног

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки моторного восстановления после травмы нерва. Согласно предыдущему исследованию, двигательный тест на расширение пальцев более чувствителен, чем анализ походки, чтобы выявить восстановление моторной функции после повреждения седалищногонерва 30.

  1. Аккуратно накройте животное кусочком ткани и поднимите хвост для чёткого наблюдения за задними лапами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернатива: Аккуратно возьмите мышь за затылок, поправьте хвост, поверните его и заставьте мышь извиваться, наблюдая за движением пальца.
  2. Оценивайте счёт за разброс пальцев следующим образом:
    Оценка 2: Полное распространение. Определите это как полное, широкое и устойчивое распространение всех пальцев не менее 2 секунд.
    Оценка 1: Промежуточное распространение. Любое движение, которое не достигает полного спред-счёта. Слегка дрожите, или частично двигайтесь.
    Счёт 0: Нет спреда. Никаких движений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все поведенческие оценки (укол игольки, неисправность стопы и расширение пальцев) были перепроверены экспериментатором, ослеплённым к группам лечения. Животные были случайным образом распределены по группам лечения на момент операции в соответствии с дизайном, использованным в нашем предыдущем исследовании (Ko et al.25), который включал четыре экспериментальных состояния (только восстановление, PEG, ML162, ML162 + PEG). В текущей статье представлены данные группы ML162 + PEG, проанализированные независимо при сохранении исходной экспериментальной строгости.

5. Перфузия тканей и обработка для гистологии

  1. Глубоко анестезировать животное и провести транскардиальную перфузию с помощью фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) через левый желудочек.
  2. Вырезайте правое предсердие, чтобы обеспечить полный отток крови.
  3. Погрузите собранные ткани в 4% параформальдегид (PFA) при 4 °C на ночь для фиксации.
  4. Промыйте фиксированные ткани три раза с помощью PBS, затем инкубируют их в PBS при 4 °C на ночь.
  5. Криозащитите ткани, погрузив их в сахарозу 30% при 4 °C на ночь.
  6. Внедрить ткани в состав ОКТ, заморозить их и разрезать толщиной 12 мкм с помощью криостата.
  7. Храните тканевые блоки при -80 °C и при -20 °C до использования.
  8. Только для набора седалищного нерва исключайте перфузию, так как содержание крови не влияет существенно на качество иммунного окрашивания в этих периферических тканях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предыдущий протокол слиянияPEG 18 был модифицирован для поддержания стабильных хирургических результатов и минимизации повреждения нервов, вызванных наложениемшвов 25. При прокладывании шва так, чтобы проникать через нерв перед пересечением, минимизировали повреждения, вызванные защипыванием пинцетом или уколом иглой после пересечения. Для проверки влияния связывания шва, проникающего в нерв, на его функцию шов дважды провёл через целый нер...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования регенерации нервов с использованием моделей нервного сечения широко проводятся на седалищном нервемыши 31,39. Однако из-за своего небольшого размера и мягкой текстуры седалищный нерв у мыши трудно обрабатывать хирургическими инструментами, а ткань склонна к разрывам при наложении швов. Микрошовный процесс, часто сопровождающийся чрезмерной манипуляцией, может привести к деформации нервов и травмам. Даже при минимализ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые нужно раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIA R01AG070214 до L.C., NIA R01AG071591 к L.C. и NIA 1R01AG085545 до L.C. Содержание полностью лежит на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения NIH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#55 ЩипцыДюмостар — биология11295-51По одному в каждой руке. Для захвата нейлонового шва размером 10-0 понадобятся два варианта.
Нейлоновый шов 10-0DemeTECHNL761000,4F0P
Нейлоновый шов 4-0Матрица Волшебника0197
Антибета-тубулинR& D SystemsMAB1195
Anti-NF-200Миллипор СигмаN4142
Аустерлиц размер 000Для теста Pinprick
CF488 конъюгированный-альфа-бунгаротоксинБиотиум00005
Вскрытие ножницKent Scientific 
Тонкие ножницы для шваKent Scientific 
Щипцы радужкиKent Scientific 
K& H — подогреваемый подогрев для маленьких животныхK& Продукты для животных с водородом
ML162Миллипор СигмаSML2561
Хирургический набор для мышиKent Scientific 
Держатель для иглыKent Scientific 
Полиэтиленгликоль (ПЭГ)Миллипор СигмаP5413
SCG10Novus BiologicalsNBP1-49461
SomnoSuiteKent Scientific Для анестезии изофлураном
Расщепляющая щипточкаИспользуется для обнажения седалищного нерва.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akram, R., et al. Axonal Regeneration: Underlying molecular mechanisms and potential therapeutic targets. Biomedicines. 10 (12), 10123186(2022).
  2. Sutherland, T. C., Geoffroy, C. G. The influence of neuron-extrinsic factors and aging on injury progression and axonal repair in the central nervous system. Front Cell Dev Biol. 8, 190(2020).
  3. Farah, M. H., et al. Reduced BACE1 activity enhances clearance of myelin debris and regeneration of axons in the injured peripheral nervous system. J Neurosci. 31 (15), 5744-5754 (2011).
  4. Mahar, M., Cavalli, V. Intrinsic mechanisms of neuronal axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 19 (6), 323-337 (2018).
  5. He, Z., Jin, Y. Intrinsic control of axon regeneration. Neuron. 90 (3), 437-451 (2016).
  6. Tsao, J. W., George, E. B., Griffin, J. W. Temperature modulation reveals three distinct stages of Wallerian degeneration. J Neurosci. 19 (12), 4718-4726 (1999).
  7. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu Rev Neurosci. 30, 153-179 (2007).
  8. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110(2011).
  9. Hussain, G., et al. Current status of therapeutic approaches against peripheral nerve injuries: A detailed story from injury to recovery. Int J Biol Sci. 16 (1), 116-134 (2020).
  10. Raivich, G., Makwana, M. The making of successful axonal regeneration: genes, molecules and signal transduction pathways. Brain Res Rev. 53 (2), 287-311 (2007).
  11. Neumann, B., Linton, C., Giordano-Santini, R., Hilliard, M. A. Axonal fusion: An alternative and efficient mechanism of nerve repair. Prog Neurobiol. 173, 88-101 (2019).
  12. Hoy, R. R., Bittner, G. D., Kennedy, D. Regeneration in Crustacean Motoneurons: Evidence for axonal fusion. Science. 156, 251-252 (1967).
  13. Birse, S. C., Bittner, G. D. Regeneration of giant axons in earthworms. Brain Res. 113, 575-581 (1976).
  14. Murphy, A. D., Kater, S. B. Specific reinnervation of a target organ by a pair of identified molluscan neurons. Brain Res. 156, 322-328 (1978).
  15. Deriemer, S. A., Elliott, E. J., Macagno, E. R., Muller, K. J. Morphological evidence that regenerating axons can fuse with severed axon segments. Brain Res. 272, 157-161 (1983).
  16. Bedi, S. S., Glanzman, D. L. Axonal rejoining inhibits injury-induced long-term changes in aplysia sensory neurons in vitro. J Neurosci. 21 (24), 9667-9677 (2001).
  17. Neumann, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H., Ben-Yakar, A., Hilliard, M. A. Axonal regeneration proceeds through specific axonal fusion in transected C. elegans neurons. Dev Dyn. 240 (6), 1365-1372 (2011).
  18. Bittner, G. D., et al. effective, and long-lasting behavioral recovery produced by microsutures, methylene blue, and polyethylene glycol after completely cutting rat sciatic nerves. J Neurosci Res. 90 (5), 967-980 (2012).
  19. Bamba, R., et al. A novel therapy to promote axonal fusion in human digital nerves. J Trauma Acute Care Surg. 81, S177-S183 (2016).
  20. Borgens, R. B., Shi, R., Bohnert, D. Behavioral recovery from spinal cord injury following delayed application of polyethylene glycol. J Exp Biol. 205, 1-12 (2002).
  21. Kim, C. Y., et al. Accelerated recovery of sensorimotor function in a dog submitted to quasi-total transection of the cervical spinal cord and treated with PEG. Surg Neurol Int. 7 (Suppl 24), S637-S640 (2016).
  22. Kim, C. Y., Oh, H., Hwang, I. K., Hong, K. S. GEMINI: Initial behavioral results after full severance of the cervical spinal cord in mice. Surg Neurol Int. 7 (Suppl 24), S629-S631 (2016).
  23. Liu, Z., et al. Restoration of motor function after operative reconstruction of the acutely transected spinal cord in the canine model. Surgery. 163 (5), 976-983 (2018).
  24. Shi, R., Borgens, R. B. Acute repair of crushed cuinea pig spinal cord by polyethylene glycol. Am Physiol Soc. 81 (5), 2406-2414 (1999).
  25. Ko, S. H., et al. GPX modulation promotes regenerative axonal fusion and functional recovery after injury through PSR-1 condensation. Nat Commun. 16 (1), 1079(2025).
  26. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
  27. Swett, J. E., Torigoe, Y., Elie, V. R., Bourassa, C. M., Miller, P. G. Sensory neurons of the rat sciatic nerve. Exp Neurol. 114 (1), 82-103 (1991).
  28. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: Implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  29. Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: A simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J Neurosci Methods. 227, 166-180 (2014).
  30. Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behav Brain Res. 219 (1), 55-62 (2011).
  31. Lee, J. I., et al. A novel nerve transection and repair method in mice: histomorphometric analysis of nerves, blood vessels, and muscles with functional recovery. Sci Rep. 10 (1), 21637(2020).
  32. Moosmayer, D., et al. Crystal structures of the selenoprotein glutathione peroxidase 4 in its apo form and in complex with the covalently bound inhibitor ML162. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (Pt 2), 237-248 (2021).
  33. Ma, C. H., et al. Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice. J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).
  34. Britt, J. M., et al. Polyethylene glycol rapidly restores axonal integrity and improves the rate of motor behavior recovery after sciatic nerve crush injury. J Neurophysiol. 104 (2), 695-703 (2010).
  35. Bittner, G. D., Schallert, T., Peduzzi, J. D. Degeneration, trophic interactions, and repair of severed axons: A reconsideration of some common assumptions. Neuroscientist. 6 (2), 88-109 (2000).
  36. Bittner, G. D., Ballinger, M. L., Raymond, M. A. Reconnection of severed nerve axons with polyethylene glycol. Brain Res. 367 (1-2), 351-355 (1986).
  37. Spaeth, C. S., Robison, T., Fan, J. D., Bittner, G. D. Cellular mechanisms of plasmalemmal sealing and axonal repair by polyethylene glycol and methylene blue. J Neurosci Res. 90 (5), 955-966 (2012).
  38. Spaeth, C. S., Boydston, E. A., Figard, L. R., Zuzek, A., Bittner, G. D. A model for sealing plasmalemmal damage in neurons and other eukaryotic cells. J Neurosci. 30 (47), 15790-15800 (2010).
  39. Félix, S. P., Pereira Lopes, F. R., Marques, S. A., Martinez, A. M. Comparison between suture and fibrin glue on repair by direct coaptation or tubulization of injured mouse sciatic nerve. Microsurgery. 33 (6), 468-477 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sciatic Nerve TransectionNerve RepairFunctional RecoveryAxon RegenerationPeripheral Nerve InjuryDorsal Root GanglionMicrosuture TechniqueMuscle ReinnervationAxonal FusionBehavioral Assessment
Video Coming Soon

Related Articles