В данной работе мы изучаем гепатотоксичность, вызванную лапатинибом и нератинибом, с помощью поляризации макрофагов, вызванной SASP, что обеспечивает более глубокое механистическое понимание по сравнению с традиционными тестами на токсичность. Этот подход демонстрирует, как стареющие гепатоциты влияют на иммунные реакции. Это особенно ценно для оценки долгосрочных эффектов лекарств и открытия новых терапевтических мишеней для управления лекарственно-индуцированной гепатотоксичностью.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Лекарственно-индуцированное старение в клетках печени способствует поляризации макрофагов М2: значение для гепатотоксичности, связанной с ингибитором тирозинкиназы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Лапатиниб и нератиниб являются ингибиторами тирозинкиназы (ИТК), одобренными для лечения HER2-положительного метастатического рака молочной железы, но их клиническое применение ограничено гепатотоксичностью. В гепатоцитах ферменты цитохрома Р450 продуцируют реактивные метаболиты этих препаратов, вызывая повреждение ДНК, митохондриальную дисфункцию и окислительный стресс, что приводит к повреждению гепатоцитов. Этот клеточный стресс вызывает старение гепатоцитов, состояние остановки роста, сопровождающееся секрецией провоспалительных и ремоделирующих тканей факторов, называемых секреторным фенотипом, связанным со старением (SASP). SASP значительно изменяет микроокружение печени, влияет на поведение иммунных клеток и ухудшает повреждение тканей. Мы показываем, что лапатиниб и нератиниб индуцируют старение и SASP в клеточной линии печени HepG2. Кроме того, SASP из этих стареющих клеток способствует M2-подобной поляризации макрофагов RAW264.7. Хотя М2-макрофаги связаны с противовоспалительными реакциями и восстановлением тканей, их чрезмерная или длительная активность может привести к повреждению тканей и фиброзу. Наши результаты подчеркивают механизм, с помощью которого индуцированное ИТК старение гепатоцитов и SASP модулируют иммунный ответ и могут способствовать токсичности для печени у пациентов с раком молочной железы. Это подчеркивает важность нацеливания на стареющие клетки или факторы SASP для снижения токсичности для печени и улучшения результатов лечения, что делает определение эффективных сенотерапетических клеток жизненно важным направлением исследований. Не было ни одного литературного отчета, демонстрирующего влияние индуцированного ИТК секретома клеток печени на поляризацию макрофагов.
Введение
Лапатиниб и нератиниб, оба низкомолекулярных ингибитора тирозинкиназы (ИТК), получили одобрение FDA в 2007 и 2017 годах для лечения метастатического рака молочной железы1. Известно, что эти препараты ингибируют рецептор эпидермального фактора роста человека 2, HER22, рецептор тирозинкиназы, который сверхэкспрессируется при некоторых видах рака молочной железы3. Несмотря на клинический успех, лапатиниб и нератиниб также связаны с побочными эффектами, в частности с гепатотоксичностью. Острое повреждение пече....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура клеток
- Культивируйте клетки HepG2 в модифицированной среде Eagle Medium (MEM) с высоким содержанием глюкозы с 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота (FBS) и клетками RAW264.7 в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы 10% FBS при 37 °C с 5% CO2 и обновляйте каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование антибиотиков не рекомендуется, если нет грибкового или бактериального загрязнения. Клетки RAW264.7 очень быстро растут и должны быть выведены через 2 дня.
2. Анализ МТТ
- Подсчет и покрытие ячеек
- Выра....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Был проведен ряд анализов для оценки влияния лапатиниба и нератиниба TKI на клетки гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) и их нисходящего паракринного воздействия на макрофаги. Клетки HepG2 обрабатывали различными концентрациями лапатиниба или нератиниба, а жизнеспособность клеток измеряли через 48 ч с помощью анализа МТТ (рис. 1A, B). На основании кривых выживаемости для дальнейших экспериментов была выбрана сублетальная д.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В настоящем исследовании изучается косвенное влияние лечения лапатинибом или нератинибом на поляризацию макрофагов через кондиционированные среды, собранные из клеток печени HepG2, обработанных ИТК. Используя макрофаги RAW264.7, мы наблюдаем фенотип M2 при воздействии кондиционированной среды, на что указывает повышенная регуляция ARG1. Морфологически обработанные макрофаги демонстрировали характерную увеличенную и удлиненную форму, что еще больше способствовало индукции М2-подобного сос.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Благодарности
Авторы благодарят Институт Преосвященства имени Шив Надара за поддержку инфраструктуры. Это исследование финансируется грантом Департамента науки и технологий CRG/2022/003242.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Клеточная линия HepG2 | NCCS | Клеточная линия | |
| Ячейковая линия RAW264.7 | NCCS | Клеточная линия | |
| DMEM (Модифицированный средний Eagle от Dulbacco) | Himedia | AT066 | Высокий уровень глюкозы, порошок |
| MEM (Модифицированный Eagle Medium | Gibco | 611100-053 | Порошок |
| PBS (Физиологический раствор с фосфатным буфером) | Himedia | TS1101 | Порошок |
| Решение трипсина-EDTA | Himedia | TCL007 | Решение |
| FBS (Сыворотка для плода быка) | Himedia | RM1112 | Жидкость |
| MTT Dye | Himedia | TC191 | Порошок |
| Лапатиниб | Селлекхем | S2111 | Порошок |
| Нератиниб | Cayman Chemical Company | 18404 | Порошок |
| DMSO (диметилсульфоксид) | Himedia | TC185 | Решение |
| Формальдегид | Ранкем | F0080 | Решение |
| Глутаральдегид | Сигма-олдрих | 340855 | Решение |
| Моногидрат лимонной кислоты, чистый | Himedia | GRM229 | Порошок |
| Дибазовый безводный фосфат натрия | Himedia | MB024 | Порошок |
| Калий ферроцианид, K4[Fe(CN)6] | Fisher Scientific | P-236-500 | |
| Калийферрицанид, K3[Fe(CN)6] | Fisher Scientific | P-232-500 | |
| NaCl | SRL | 41721 | Порошок |
| MgCl2 гексагидрат | Himedia | GRM-1068 | Порошок |
| X-Gal | SRL | 45904 | Порошок |
| Липополисахарид | Сигма-олдрих | L6529 | |
| Человеческий рекомбинантный интерферон и гамма; | Himedia | CF040-20MCG | |
| Реагент глубокого красного цвета клетки ROX | Thermo Fisher Scientific | C10422 | |
| Hoechst | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | H3570 | Порошок |
| MitoTRACKER Зелёный | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 1842298 | Порошок |
| Анти-ARG1 антитела | Сходство | DF6657 | Решение, рассчитано МВт — 35 кДа, наблюдаемое МВт — 65 кДа |
| Анти-NOS2 антитела | Корпорация клонов Клаудо. | PAA837Hu01 | Решение, рассчитано MW-130kDa, наблюдаемое MW - 65kDa |
| Антитела против iNOS | Сходство | Решение, рассчитано MW-130kDa, наблюдаемое MW - 120kDa | |
| Антиантитела к GAPDH | Biobharati LifeScience Pvt.Ltd | BB-AB0060 | Решение |
| Антитела к кроликам | Cayman Chemical Company | 10004301 | Решение |
| Мембрана нитроцеллюлозы | Merck Millipore Ltd. | HATF00010 (Номер продукта) | |
| femtoLUCENTTMPLUS HRP | G Bioscience | 786-003 | |
| 60-мм тарелки | НАК | 150462 | |
| 96-колодцевая пластина, | НАК | 165306 | |
| Инкубатор клеточной культуры | Термо Фишер Сайентифик | 371 | |
| Microscope | 1. Инвертированный микроскоп LEICA 2. Конфокальный микроскоп Nikon | 1. DMIL LED 2. Ti2E, A1R | Оба имеют номера моделей |
| Система iBright Imaging | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | CL1500 (номер модели) | |
| Считыватель пластин | Bio-RAD | Считыватель микропластин iMark | |
| Центрифуга | Термо Фишер Сайентифик | Sorvall ST 8R (номер модели) |
Ссылки
- Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
- Yang, X., Wu, D., Yuan, S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
