Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лекарственно-индуцированное старение в клетках печени способствует поляризации макрофагов М2: значение для гепатотоксичности, связанной с ингибитором тирозинкиназы

914 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68725

⸱

17 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы изучаем гепатотоксичность, вызванную лапатинибом и нератинибом, с помощью поляризации макрофагов, вызванной SASP, что обеспечивает более глубокое механистическое понимание по сравнению с традиционными тестами на токсичность. Этот подход демонстрирует, как стареющие гепатоциты влияют на иммунные реакции. Это особенно ценно для оценки долгосрочных эффектов лекарств и открытия новых терапевтических мишеней для управления лекарственно-индуцированной гепатотоксичностью.

Аннотация

Лапатиниб и нератиниб являются ингибиторами тирозинкиназы (ИТК), одобренными для лечения HER2-положительного метастатического рака молочной железы, но их клиническое применение ограничено гепатотоксичностью. В гепатоцитах ферменты цитохрома Р450 продуцируют реактивные метаболиты этих препаратов, вызывая повреждение ДНК, митохондриальную дисфункцию и окислительный стресс, что приводит к повреждению гепатоцитов. Этот клеточный стресс вызывает старение гепатоцитов, состояние остановки роста, сопровождающееся секрецией провоспалительных и ремоделирующих тканей факторов, называемых секреторным фенотипом, связанным со старением (SASP). SASP значительно изменяет микроокружение печени, влияет на поведение иммунных клеток и ухудшает повреждение тканей. Мы показываем, что лапатиниб и нератиниб индуцируют старение и SASP в клеточной линии печени HepG2. Кроме того, SASP из этих стареющих клеток способствует M2-подобной поляризации макрофагов RAW264.7. Хотя М2-макрофаги связаны с противовоспалительными реакциями и восстановлением тканей, их чрезмерная или длительная активность может привести к повреждению тканей и фиброзу. Наши результаты подчеркивают механизм, с помощью которого индуцированное ИТК старение гепатоцитов и SASP модулируют иммунный ответ и могут способствовать токсичности для печени у пациентов с раком молочной железы. Это подчеркивает важность нацеливания на стареющие клетки или факторы SASP для снижения токсичности для печени и улучшения результатов лечения, что делает определение эффективных сенотерапетических клеток жизненно важным направлением исследований. Не было ни одного литературного отчета, демонстрирующего влияние индуцированного ИТК секретома клеток печени на поляризацию макрофагов.

Введение

Лапатиниб и нератиниб, оба низкомолекулярных ингибитора тирозинкиназы (ИТК), получили одобрение FDA в 2007 и 2017 годах для лечения метастатического рака молочной железы1. Известно, что эти препараты ингибируют рецептор эпидермального фактора роста человека 2, HER22, рецептор тирозинкиназы, который сверхэкспрессируется при некоторых видах рака молочной железы3. Несмотря на клинический успех, лапатиниб и нератиниб также связаны с побочными эффектами, в частности с гепатотоксичностью. Острое повреждение печени, проявляющееся повышенным уровнем аминотрансферазы, встречается примерно у 14% пациентов, проходящих лечение лапатинибом или нератинибом6. Гепатотоксичность в значительной степени объясняется печеночным метаболизмом этих препаратов, в котором участвуют ферменты цитохрома Р450 (CYP), преимущественно CYP3A4/5 7,8. Эти ферменты катализируют образование хинон-иминовых промежуточных соединений, которые являются электрофильными и высокореакционноспособными 9,10. Эти реактивные метаболиты, включая O-деалкилированный лапатиниб, N-деалкилированный лапатиниб и N-гидроксилапатиниб, O-деалкилированный нератиниб и N-деметилированный нератиниб, могут образовывать ковалентные аддукты с клеточными макромолекулами, тем самым нарушая нормальные клеточные функции и в конечном итоге приводя к повреждениюпечени.

Реактивные метаболиты лапатиниба и нератиниба также могут вызывать окислительный стресс, ключевой триггер клеточного старения12. Клеточное старение — это состояние с задержкой роста, но метаболически активное состояние, характеризующееся секрецией различных провоспалительных цитокинов, факторов роста и протеаз. Этот секреторный фенотип известен как секреторный фенотип, ассоциированный со старением (SASP)13,14,15. SASP может оказывать глубокое воздействие на окружающее микроокружение, часто способствуя воспалению и ремоделированию тканей. В контексте терапии рака SASP может обогащать популяцию раковых стволовых клеток и модифицировать иммунный ответ, способствуя выживаемости опухоли16. Кроме того, воспалительные цитокины могут усугубить повреждение тканей. Мы предположили, что у пациентов, получавших лапатиниб и нератиниб, повреждение печени частично обусловлено старением, вызванным ИТК, и провоспалительной продукцией SASP.

Наши эксперименты показали, что лапатиниб и нератиниб индуцируют выработку активных форм кислорода (АФК) в клетках печени, что приводит к повреждению ДНК и митохондриальной дисфункции, что, в свою очередь, запускает клеточное старение. Это старение может способствовать гепатотоксичности, вызванной лапатинибом/нератинибом, путем высвобождения факторов SASP, которые могут влиять на поляризацию макрофагов.

Макрофаги играют решающую роль в иммунном ответе, и их функциональный фенотип может меняться в ответ на различные стимулы17,18. Классический фенотип макрофагов М1 обычно связан с провоспалительными реакциями, включая продукцию цитокинов, таких как TNF-α и IL-1β, и обычно считается маркером острого воспаления19,20. Напротив, фенотип макрофагов M2 связан с фиброзом, восстановлением тканей21, иммуносупрессией и ответом на хроническое воспаление22,23. Воспалительные цитокины в SASP могут влиять на поляризацию макрофагов, способствуя превращению макрофагов M1 в M2-подобный фенотип23. Этот сдвиг в поляризации может иметь значительные последствия для иммунного микроокружения, потенциально приводя к иммуносупрессии, прогрессированию опухоли и ремоделированию архитектуры тканей.

Для исследования поляризации макрофагов, индуцированной лапатинибом и нератинибом, мы использовали клеточную линию RAW264.7, мышиную макрофагоподобную клеточную линию, обычно используемую в иммунологических исследованиях24,25. Клетки RAW264.7 получены от мышей BALB/c и широко используются для изучения воспаления, фагоцитоза и иммунных реакций25. Они реагируют на различные стимулы, включая липополисахариды (ЛПС), и особенно ценны для изучения функции макрофагов, продукции цитокинов и биологиирака. В этом исследовании HepG2, клеточную линию гепатомы человека, обрабатывали лапатинибом и нератинибом, чтобы имитировать гепатотоксические эффекты, наблюдаемые у пациентов. Клеточная линия HepG2 часто используется в качестве модели исследования метаболизма лекарств и гепатотоксичности из-за ее человеческого происхождения и линии гепатоцеллюлярной карциномы27. После обработки клеток HepG2 с помощью ИТК кондиционированные среды собирали и добавляли к клеткам RAW264.7. Последующие фенотипические изменения макрофагов контролировались, уделяя особое внимание тому, вызывает ли лечение сдвиг от провоспалительного фенотипа М1 к иммуносупрессивному фенотипу М2.

Лекарственно-индуцированная гепатотоксичность обычно изучается с помощью анализов цитотоксичности, оценки маркеров воспаления и использования животных моделей. По сравнению с этим, наш метод изучения гепатотоксичности ИТК, лапатиниба и нератиниба через факторы секреторного фенотипа, связанные со старением (SASP), и их влияние на поляризацию макрофагов имеет ряд преимуществ. Во-первых, наш метод устанавливает связь между факторами SASP, продуцируемыми лекарственными старением клеток печени, и врожденным иммунитетом, который может быть в дальнейшем связан с ремоделированием тканей, хроническим воспалением и канцерогенезом 28,29,30,31. Обычные скрининги токсичности не могут помочь нам зафиксировать краткосрочные взаимодействия между печенью и иммунными клетками, а также не могут выявить долгосрочное влияние ИТК на воспаление и фиброз печени, особенно в контексте хронического воздействия лекарств. В сочетании с подходящим протеомным подходом к идентификации составляющих SASP, этот метод может помочь идентифицировать прогностические биомаркеры гепатотоксичности, вызванной ИТК, и информировать о разработке терапевтических вмешательств для ее смягчения 29,30,31.

Для реализации исследователи должны использовать системы совместного культивирования или кондиционированных сред с печеночными и иммунными клеточными линиями, как описано, и оценить биомаркеры старения, а также макрофаги M1 и M2. Этот метод наиболее эффективен для оценки лекарственно-индуцированного острого или хронического повреждения печени или для изучения стратегий минимизации побочных эффектов терапии рака 29,30,31.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура клеток

  1. Культивируйте клетки HepG2 в модифицированной среде Eagle Medium (MEM) с высоким содержанием глюкозы с 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота (FBS) и клетками RAW264.7 в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы 10% FBS при 37 °C с 5% CO2 и обновляйте каждые 3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование антибиотиков не рекомендуется, если нет грибкового или бактериального загрязнения. Клетки RAW264.7 очень быстро растут и должны быть выведены через 2 дня.

2. Анализ МТТ

  1. Подсчет и покрытие ячеек
    1. Выращивайте клетки HepG2 в культуральной чашке диаметром 60 мм в инкубаторе для клеточных культур в полной питательной среде (MEM + 10% FBS).
    2. Когда клетки слились примерно на 80%, удалите питательную среду, быстро промойте 1 мл 1x PBS и добавьте 600 мкл 0,5x трипсина. Выдерживать 5-6 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться в шкафу для клеточных культур BSL 2.
    3. Нейтрализуйте трипсин, добавив 1,2 мл полной питательной среды внутрь BSL 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения чрезмерной трипсинизации следует добавлять полную среду, в два раза превышающую объем добавленного трипсина.
    4. Возьмите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку (MCT) объемом 5 мл и измельчите ее путем центрифугирования при 180 г (1000 об/мин) в течение 3-4 минут при комнатной температуре (RT).
    5. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды, пипеткой смешайте как одиночную клеточную суспензию и подсчитайте с помощью гемоцитометра под микроскопом.
    6. Далее помещают клетки HepG2 в 96-луночный планшет по 5000-7000 клеток на лунку, в полной питательной среде, в трех экземплярах на каждую дозу препарата, и выдерживают в инкубаторе в течение 12-16 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слияние клеток должно составлять 50-60% для медикаментозного лечения, и этот этап следует выполнять внутри капюшона.
  2. Медикаментозное лечение
    1. Готовят постепенно увеличивающиеся рабочие концентрации лапатиниба и нератиниба в диметилсульфоксиде (ДМСО) от исходной концентрации (30 мМ и 3,5 мМ соответственно) внутри вытяжки. Конечные концентрации составляют 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50 мкМ для лапатиниба и 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 мкМ для нератиниба в питательных средах (MEM + 5% FBS). Соблюдайте один контроль, не проводящий лечения для обоих препаратов.
    2. Удалите предыдущую среду из 96-луночного планшета, содержащего клетки, добавьте 100 мкл среды вместе с препаратом и инкубируйте в течение 48 ч внутри инкубатора.
  3. Окрашивание и количественное определение
    1. Через 48 ч добавьте 10 мкл 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида красителя (МТТ; 5 мг/мл), растворите в 1x фосфатном буферном растворе (PBS) в каждой лунке и инкубируйте не менее 2 ч внутри инкубатора до появления кристаллов фиолетового цвета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте краситель непосредственно в лекарственные среды и не инкубируйте клетки с красителем более 4 часов.
    2. После инкубации удалите краситель, растворите кристаллы в 100 мкл ДМСО в каждой лунке и инкубируйте в течение 15 минут, после чего измельчите оптическую плотность (OD) при 595 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно проводить вне вытяжки.

3. Анализ галактозидазы SA-β

  1. Медикаментозное лечение
    1. Пластинчатые клетки HepG2 в чашках 35 мм с плотностью 40 х 10 по4 клетки в тарелке в трех комплектах, один для лапатиниба, один для нератиниба и один необработанный контроль.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы подсчета ячеек и нанесения покрытия соответствуют описанию в шаге 2.1.
    2. Добавьте 1 мкл лапатиниба из 5 мМ рабочего состава и 1,43 мкл нератиниба из 3,5 мМ основного запаса в 2 мл среды для получения окончательной концентрации 2,5 мкМ (сублетальная доза) лапатиниба и нератиниба.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сублетальная доза препарата подбирается в соответствии с графиком выживаемости клеток в анализе МТТ.
    3. Удалите предыдущую среду из посуды и вымойте 500 мкл 1x PBS один раз, добавьте содержащую лекарство среду (внутри вытяжки) и выдержите в течение 48 часов внутри инкубатора.
  2. Фиксация и окрашивание
    1. Через 48 ч удалить препарат, дать быстро промыться 500 мкл 1x PBS однократно и зафиксировать 1,5 мл 2% формальдегида и 0,2% глутаральдегида в 1x PBS в течение 10 мин на RT.
    2. После фиксации дважды промойте пластины 1 мл 1x PBS и убедитесь, что фиксирующий раствор удален правильно. Добавьте 1,5 мл окрашивающего раствора (40 мМ буфер лимонной кислоты/Na-фосфата, 5 мМ K4[Fe(CN)6], 5 мМ K3[Fe(CN)6], 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl 2, 1 мг/мл X-gal в автоклавированной воде) и инкубируйте в течение 8 ч при 37 °C без CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационный период может варьироваться в зависимости от типа клеток; для HepG2 инкубационный период не должен превышать 8 ч.
    3. После окрашивания быстро промойте пластины в 1 мл 1x PBS дважды и сделайте снимки в светлом поле с 20-кратным и 40-кратным увеличением с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Захватите как минимум четыре-пять полей для каждой группы обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем фиксирующего и окрашивающего раствора будет варьироваться в зависимости от размера пластины, и все шаги могут выполняться вне капюшона.
  3. Количественная оценка изображений
    1. Сделайте снимок с одного поля, посчитайте общее количество ячеек, а также ячеек, показывающих синий сигнал. Вручную рассчитайте процент ячеек с синим сигналом. Рассчитайте как минимум четыре изображения, возьмите среднее значение, нанесите график в таблицу и проведите t-тест.

4. Обнаружение АФК

  1. Покрытие клеток и медикаментозное лечение
    1. Пластинчатые клетки HepG2 в чашках со стеклянным дном 35 мм при плотности 40 х 10 по4 клетки на тарелке в трех комплектах: один для лапатиниба, один для нератиниба и один необработанный контроль.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы подсчета ячеек и нанесения покрытия соответствуют описанию в шаге 2.1.
    2. Следуйте той же стратегии лечения, которая описана в шаге 3.1.
  2. Окрашивание и визуализация
    1. После 48 ч обработки добавьте 2 мкМ клеточный реагент ROX deep red (5 мМ стока), 1 мкМ Mito Tracker Green (1 мМ стоковый) в течение 30 мин и контразеринг 500 нМ ядерным красителем Hoechst (500 мкМ стоковый).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель следует добавлять внутрь капюшона, и следует избегать прямого воздействия света. Противоокрашивание производится путем добавления ядерного окрашивающего красителя Hoechst во время введения других красителей.
    2. Через 30 минут удалите краситель и промойте 1x PBS, чтобы удалить излишки красителя и получить изображение с помощью конфокального микроскопа при 100-кратном увеличении (масляная вспышка, длина волны возбуждения 640 нм, 488 нм и 405 нм соответственно).
  3. Количественная оценка изображений
    1. Количественно оцените сигнал ячейки ROX red с помощью программного обеспечения Fiji ImageJ и сравните его с сигналом необработанного контроля. Используйте зеленый цвет MitoTracker, чтобы указать, что сигнал исходит от митохондрий. После построения гистограмм со средними значениями провести t-критерий.

5. Сбор кондиционированных сред (CM)

  1. Обрабатывайте клетки HepG2 2,5 мкМ лапатиниба или нератиниба в течение 48 ч (стратегия лечения аналогична шагу 3.1, за исключением этого эксперимента, планшет 70 х 104 клеток в чашке 60 мм).
  2. Через 48 ч удалить препарат и промыть 500 мкл 1x PBS один раз.
  3. В максимальный день старения (после 48 ч лечения препаратом) добавьте 4 мл бессывороточной МЕМ среды (без FBS или любых других добавок) в клетки, обработанные препаратом, а также в контрольную группу необработанного состава в течение 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем среды, не содержащей сыворотки, будет зависеть от размера пластины.
  4. Затем соберите бессывороточную среду, содержащую весь секретом, так называемые кондиционированные среды, и храните при температуре -80 °C для использования в будущем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора КМ его следует центрифугировать в течение 5 минут при 2800 g (4000 об/мин) для удаления мертвых клеток и другого клеточного мусора. Клетки RAW264.7 обычно культивируются в DMEM, но CM собирается в MEM в соответствии с условиями культивирования HepG2. Для обеспечения совместимости кондиционированные среды следует смешивать с бессывороточными DMEM в соотношении 1:1 перед инкубацией RAW264.7.

6. Поляризация M1/M2 в RAW264.7

  1. Покрытие ячеек
    1. Выполните подсчет и нанесение покрытий на клетки, как описано в шаге 2.1, за исключением этапа трипсинизации. Во время трипсинизации клеток RAW264.7 добавить 600-700 мкл 0,5х трипсина, инкубировать в течение 15-20 мин в инкубаторе, а для нейтрализации трипсина добавить 2 мл питательной среды (DMEM + 10% FBS) и планшет 70х104 клеток в чашку 60 мм в трех наборах: лапатиниб, нератиниб и один необработанный контроль.
  2. Индукционная обработка в формате RAW264.7
    1. Удалите обычную питательную среду, промойте 1 мл 1x PBS один раз и добавьте соответствующую CM на 48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед добавлением CM обязательно кондиционируйте его с бессывороточным DMEM в соотношении 1:1, так как клетки RAW264.7 растут в DMEM, поэтому хранение клеток в MEM вызовет стресс, который может помешать результату. Культивирование RAW264.7 в CM (бессывороточная среда) в течение 48 ч также может вызвать стресс; В этом случае перед сбором данных можно провести инкубацию в течение 24-30 часов.
    2. После инкубации выбросьте CM, промойте 1 мл 1x PBS, добавьте 600 μL трипсина в каждую пластину, инкубируйте в течение 10 минут, а затем гранулируйте при 180 г (1000 об/мин) в течение 3 минут при RT. Используйте гранулу для очистки белка или храните ее при температуре -80 °C для дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время трипсинизации зависит от типа клетки, и центрифугирование не рекомендуется проводить при давлении более 180 г.
  3. Выделение белка и вестерн-блоттинг
    1. Приготовьте буфер для лизиса, смешав буфер для лизиса радиоиммунопреципитации (RIPA) и коктейль ингибиторов протеазы в соотношении 100:1. Добавьте буфер для лизиса в клеточную гранулу, восстановите и инкубируйте на льду в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера для лизиса будет варьироваться в зависимости от размера клеточной палитры, и лизис может быть выполнен вне колпака. Если гранула хранится при температуре -80 °C, то сначала разморозьте гранулу на льду, дайте короткий отжим и удалите остатки среды.
    2. После инкубации раскрутите лизат клеток при 20 000 г в течение 30 минут при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость и приступайте к вестерн-блоттингу или храните при температуре -20 °C для дальнейшего использования.
    3. Подготовьте образец белка, взяв 35-40 г белка, добавьте 1x загрузочный краситель, нагрейте в течение 5-6 минут при 95 °C, запустите SDS-PAGE (10% и 12% акриламидный гель) при 90 В и перенесите на нитроцеллюлозную мембрану.
    4. ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробной информации о вестерн-блоттинге обратитесь к Joubert et al.32.
    5. Проверьте экспрессию поляризационных маркеров M1 и M2 путем разработки блоттинга с использованием проявителя пероксидазы хрена (HRP), iNOS (M1) и аргиназы1 (M2) соответственно, используя антитела против NOS2 и анти-ARG1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация обоих первичных антител, анти-NOS2 и анти-ARG1, составляет 1:1000, а вторичных антител против кролика составляет 1:10 000.
  4. Поляризация макрофагов с помощью ЛПС и ИФН-γ
    1. Тарелка 70 x 104 ячейки RAW264.7 в двух тарелках 60 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура нанесения покрытия аналогична шагу 6.1.
    2. Через 12-16 ч смешайте 4 мкл 1 мкг/мл липополисахарида (ЛПС, исходная концентрация 1 мг/мл) и 1,33 мкл 33 нг/мл интерферона-γ (ИФН-γ, исходная концентрация 100 мкг/мл) в 4 мл питательной среды (DMEM + 10% FBS) и добавьте к предварительно нанесенному покрытию RAW264.7, сохраняя один неиндуцированный контроль.
    3. Через 48 ч соберите клеточную гранулу с помощью трипсинизации, изолируйте белок, проведите вестерн-блот и проверьте экспрессию iNOS (M1) и ARG1 (M2) соответственно с помощью антител против iNOS и анти-ARG1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все отходы клеточных культур и биохимические отходы должны быть выброшены в контейнер для биологически опасных веществ, надлежащим образом автоклавированы, а затем утилизированы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Был проведен ряд анализов для оценки влияния лапатиниба и нератиниба TKI на клетки гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) и их нисходящего паракринного воздействия на макрофаги. Клетки HepG2 обрабатывали различными концентрациями лапатиниба или нератиниба, а жизнеспособность клеток измеряли через 48 ч с помощью анализа МТТ (рис. 1A, B). На основании кривых выживаемости для дальнейших экспериментов была выбрана сублетальная д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящем исследовании изучается косвенное влияние лечения лапатинибом или нератинибом на поляризацию макрофагов через кондиционированные среды, собранные из клеток печени HepG2, обработанных ИТК. Используя макрофаги RAW264.7, мы наблюдаем фенотип M2 при воздействии кондиционированной среды, на что указывает повышенная регуляция ARG1. Морфологически обработанные макрофаги демонстрировали характерную увеличенную и удлиненную форму, что еще больше способствовало индукции М2-подобного сос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Институт Преосвященства имени Шив Надара за поддержку инфраструктуры. Это исследование финансируется грантом Департамента науки и технологий CRG/2022/003242.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клеточная линия HepG2NCCSКлеточная линия
Ячейковая линия RAW264.7NCCSКлеточная линия
DMEM (Модифицированный средний Eagle от Dulbacco)HimediaAT066Высокий уровень глюкозы, порошок
MEM (Модифицированный Eagle MediumGibco611100-053Порошок
PBS (Физиологический раствор с фосфатным буфером)HimediaTS1101Порошок
Решение трипсина-EDTAHimediaTCL007Решение
FBS (Сыворотка для плода быка)HimediaRM1112Жидкость
MTT DyeHimediaTC191Порошок
ЛапатинибСеллекхемS2111Порошок
НератинибCayman Chemical Company18404Порошок
DMSO (диметилсульфоксид) HimediaTC185Решение
Формальдегид РанкемF0080Решение
ГлутаральдегидСигма-олдрих340855Решение
Моногидрат лимонной кислоты, чистыйHimediaGRM229Порошок
Дибазовый безводный фосфат натрия HimediaMB024Порошок
Калий ферроцианид, K4[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-236-500
Калийферрицанид, K3[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-232-500
NaClSRL41721Порошок
MgCl2 гексагидратHimediaGRM-1068Порошок
X-GalSRL45904Порошок
ЛипополисахаридСигма-олдрихL6529
Человеческий рекомбинантный интерферон и гамма;HimediaCF040-20MCG
Реагент глубокого красного цвета клетки ROXThermo Fisher ScientificC10422
HoechstInvitrogen, Thermo Fisher ScientificH3570Порошок
MitoTRACKER ЗелёныйInvitrogen, Thermo Fisher Scientific1842298Порошок
Анти-ARG1 антителаСходствоDF6657Решение, рассчитано МВт — 35 кДа, наблюдаемое МВт — 65 кДа
Анти-NOS2 антителаКорпорация клонов Клаудо.PAA837Hu01Решение, рассчитано MW-130kDa, наблюдаемое MW - 65kDa
Антитела против iNOSСходствоРешение, рассчитано MW-130kDa, наблюдаемое MW - 120kDa
Антиантитела к GAPDHBiobharati LifeScience Pvt.LtdBB-AB0060Решение
Антитела к кроликамCayman Chemical Company10004301Решение
Мембрана нитроцеллюлозы  Merck Millipore Ltd. HATF00010 (Номер продукта)
femtoLUCENTTMPLUS HRPG Bioscience 786-003
60-мм тарелкиНАК150462
96-колодцевая пластина, НАК165306
Инкубатор клеточной культуры Термо Фишер Сайентифик371
Microscope 1. Инвертированный микроскоп LEICA    2. Конфокальный микроскоп Nikon 1. DMIL LED        2. Ti2E, A1R  Оба имеют номера моделей
Система iBright ImagingInvitrogen, Thermo Fisher ScientificCL1500 (номер модели)
Считыватель пластинBio-RADСчитыватель микропластин iMark
Центрифуга Термо Фишер СайентификSorvall ST 8R (номер модели)

Ссылки

  1. Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
  2. Yang, X., Wu, D., Yuan, S. Tyrosine kinase inhibitors in the combination therapy of HER2-positive breast cancer. Technol Cancer Res Treat. 19, 1533033820962140(2020).
  3. Slamon, D. J., et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 235 (4785), 177-182 (1987).
  4. Viganò, M., et al. Hepatotoxicity of small molecule protein kinase inhibitors for cancer. Cancers (Basel). 15 (6), 1766(2023).
  5. Chan, A., et al. Final efficacy results of neratinib in HER2-positive hormone receptor-positive early-stage breast cancer from the Phase III ExteNET trial. Clin Breast Cancer. 21 (1), 80-91.e87 (2021).
  6. Hoofnagle, J. H., Serrano, J., Knoben, J. E., Navarro, V. J. LiverTox: a website on drug-induced liver injury. Hepatology. 57 (3), 873-874 (2013).
  7. Guengerich, F. P. Cytochrome P-450 3A4: regulation and role in drug metabolism. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 39, 1-17 (1999).
  8. Jackson, K. D., Durandis, R., Vergne, M. J. Role of cytochrome P450 enzymes in the metabolic activation of tyrosine kinase inhibitors. Int J Mol Sci. 19 (8), 2367(2018).
  9. Paludetto, M. N., Puisset, F., Chatelut, E., Arellano, C. Identifying the reactive metabolites of tyrosine kinase inhibitors in a comprehensive approach: implications for drug-drug interactions and hepatotoxicity. Med Res Rev. 39 (6), 2105-2152 (2019).
  10. Kalgutkar, A. S., Dalvie, D. K. Drug discovery for a new generation of covalent drugs. Expert Opin Drug Discov. 7 (7), 561-581 (2012).
  11. Andreu, I., et al. Protein binding of lapatinib and its N- and O-dealkylated metabolites interrogated by fluorescence, ultrafast spectroscopy and molecular dynamics simulations. Front Pharmacol. 11, 576495(2020).
  12. Lin, W., et al. Promoting reactive oxygen species accumulation to overcome tyrosine kinase inhibitor resistance in cancer. Cancer Cell Int. 24 (1), 239(2024).
  13. Choi, Y. W., et al. Senescent tumor cells build a cytokine shield in colorectal cancer. Adv Sci (Weinh). 8 (4), 2002497(2021).
  14. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34 (23-24), 1565-1576 (2020).
  15. Dong, Z., et al. Cellular senescence and SASP in tumor progression and therapeutic opportunities. Mol Cancer. 23 (1), 181(2024).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Lichtnekert, J., Kawakami, T., Parks, W. C., Duffield, J. S. Changes in macrophage phenotype as the immune response evolves. Curr Opin Pharmacol. 13 (4), 555-564 (2013).
  18. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat Immunol. 12 (11), 1035-1044 (2011).
  19. Wang, N., Liang, H., Zen, K. Molecular mechanisms that influence the macrophage M1-M2 polarization balance. Front Immunol. 5, 614(2014).
  20. Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: a systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
  21. Novak, M. L., Koh, T. J. Macrophage phenotypes during tissue repair. J Leukoc Biol. 93 (6), 875-881 (2013).
  22. Kanterman, J., Sade-Feldman, M., Baniyash, M. New insights into chronic inflammation-induced immunosuppression. Semin Cancer Biol. 22 (4), 307-318 (2012).
  23. Mazzoni, M., et al. Senescent thyrocytes and thyroid tumor cells induce M2-like macrophage polarization of human monocytes via a PGE2-dependent mechanism. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 208(2019).
  24. Hartley, J. W., et al. Expression of infectious murine leukemia viruses by RAW264.7 cells, a potential complication for studies with a widely used mouse macrophage cell line. Retrovirology. 5, 1(2008).
  25. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogenesis study: phenotype and stimuli. J Cell Mol Med. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  26. Li, Y., et al. D(-)-Salicin inhibits the LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and mouse models. Int Immunopharmacol. 26 (2), 286-294 (2015).
  27. Castell, J. V., Jover, R., Martínez-Jiménez, C. P., Gómez-Lechón, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
  28. Huang, Y., et al. The hepatic senescence-associated secretory phenotype promotes hepatocarcinogenesis through Bcl3-dependent activation of macrophages. Cell Biosci. 11 (1), 173(2021).
  29. Wang, B., Han, J., Elisseeff, J. H., Demaria, M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (12), 958-978 (2024).
  30. Ohtani, N. The roles and mechanisms of senescence-associated secretory phenotype (SASP): can it be controlled by senolysis. Inflamm Regen. 42 (1), 11(2022).
  31. Cuollo, L., Antonangeli, F., Santoni, A., Soriani, A. The senescence-associated secretory phenotype (SASP) in the challenging future of cancer therapy and age-related diseases. Biology (Basel). 9 (12), 485(2020).
  32. Joubert, O., Nehmé, R., Bidet, M., Mus-Veteau, I. Heterologous expression of human membrane receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 601, 87-103 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Старение клеток печениингибиторы тирозинкиназымеханизмы гепатотоксичностисекреторный фенотипсвязанный со старениемклетки HepG2кондиционированная средаактивные формы кислородавестерн-блоттинг
Лекарственно-индуцированное старение в клетках печени способствует поляризации макрофагов М2: значение для гепатотоксичности, связанной с ингибитором тирозинкиназы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.