Методическая статья

Поддающееся лечению in vivo перепрограммирование опухолевых клеток в обычные дендритные клеточные клетки 1-го типа

DOI:

10.3791/68739

⸱

1 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Medicine and Gene Therapy, Science for Life Laboratory, Lund Stem Cell Centre, Lund University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 3Centre for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает in vivo перепрограммирование раковых клеток мыши в дендритноподобные клетки 1-го типа в микроокружении опухоли посредством принудительной экспрессии транскрипционных факторов PU.1, IRF8 и BATF3.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективность иммунотерапии рака зависит от рекрутирования и активации цитотоксических ответов Т-клеток против солидных опухолей обычными дендритными клетками 1-го типа (cDC1s). Тем не менее, генерация cDC1 для иммунотерапии рака сталкивается со значительными ограничениями, включая низкий выход клеток, функциональную гетерогенность и восприимчивость к иммуносупрессии в опухолевом микроокружении (TME). Недавно мы разработали метод иммунотерапии, основанный на перепрограммировании in vivo раковых клеток в иммуногенные cDC1-подобные клетки, что позволило раковым клеткам представлять опухолевые антигены в виде cDC1 и вызвать поликлональные цитотоксические ответы Т-клеток и стойкий системный противоопухолевый иммунитет. В данной работе мы описываем гибкий протокол для генерации cDC1-подобных клеток в TME путем сверхэкспрессии минимальной cDC1-специфичной генной регуляторной сети PU.1, IRF8 и BATF3 (совместно именуемых PIB) в раковых клетках с последующей подкожной имплантацией смеси трансдуцированных и родительских клеток. Сверхэкспрессия PIB приводит к постепенному приобретению гемопоэтического маркера CD45 и профессионального комплекса презентации антигена MHC класса II на опухолевых клетках, служащих в качестве считывания клеточной поверхности для перепрограммирования cDC1 in vivo . По сравнению с процессом перепрограммирования in vitro, перепрограммирование модели меланомы мыши YUMM1.7 in vivo продемонстрировало более быструю кинетику и более высокую эффективность. cDC1-подобные клетки индуцировали быстрое ремоделирование TME путем привлечения иммунных клеток хозяина в течение первых 3 дней и приводили к формированию третичной лимфоидной структуры к 9-му дню. Перепрограммированные cDC1-подобные клетки сохранялись в опухолях в течение как минимум 9 дней, но не были обнаружены на 15-й день. Описанный здесь протокол перепрограммирования cDC1 in vivo представляет собой удобный и надежный метод эффективного преобразования «иммунохолодных» опухолей в «иммунно-горячие». В целом, он предлагает мощную платформу для изучения механизмов, лежащих в основе cDC1-опосредованного противоопухолевого иммунитета, и выявления синергетических комбинаций с другими методами иммунотерапии рака.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Последние достижения в области иммунотерапии рака, включая блокаду контрольных точек иммунного ответа (ICB), адоптивную клеточную терапию (ACT) и вакцины, изменили ландшафт лечения рака1. При меланоме частота ответа на ингибирование белка запрограммированной гибели клеток 1 (PD-1) и цитотоксического белка 4, ассоциированного с Т-лимфоцитами (CTLA-4), может достигать 60%2. Тем не менее, более 40% пациентов с меланомой не реагируют на ICB, а частота ответа при менее иммуногенных видах рака, таких как рак молочной железы, микросателлитный стабильный колоректальный рак и глиобластома, остается ниже 5%, что подчеркивает клинические пробелы 3,4,5. Основным препятствием для широкого клинического успеха является слабая активация цитотоксических Т-клеточных ответов, которые зависят от эффективной презентации антигена в микроокружении опухоли (TME)6.

Обычные дендритные клетки 1-го типа (cDC1) встречаются редко, но необходимы для инициации опухолеспецифичного иммунитета, предлагая три ключевых сигнала для прайм-клеточного ответа: (1) профессиональная обработка и презентация антигенов на основных комплексах гистосовместимости (MHC) класса I и II, (2) костимуляция через CD80 и CD86 и (3) провоспалительная передача сигналов цитокинов, включая IL-12 7,8. Среди субпопуляций дендритных клеток (DC) cDC1 преобладают в перекрестном представлении антигенов, ассоциированных с опухолевыми клетками, для праймирования наивных или реактивации CD8+ Т-клеток памяти или для дифференцировки CD4+ Т-клеток к Т-хелперам (TH1) типа1 9. Кроме того, cDC1 являются основными продуцентами хемокинов, C-X-C мотивных хемокиновых лигандов 9 и 10 (CXCL9/10), которые опосредуют рекрутирование Т-клеток в опухолевую ткань 10,11,12,13. За последние несколько лет многочисленные исследования показали, что отторжение опухоли и эффективные ответы на ICB или ACT сильно коррелируют с наличием внутриопухолевых cDC112,13. Таким образом, cDC1 стали привлекательной мишенью для иммунотерапии рака, и успешное использование их уникальных особенностей может иметь значительный трансляционный потенциал.

Современные методы получения cDC1 основаны на выделении крови или дифференцировке от предшественников CD34+ или плюрипотентных стволовых клеток 14,15,16. Преобладающие клинические стратегии основаны на выделении смеси аутологичных субпопуляций ДК из крови и стимуляции их ex vivo агонистами толл-подобных рецепторов или провоспалительными цитокинами для индуцирования зрелой иммуногенной программы перед реинфузией. Однако эти стратегии ограничены плохой клеточной зрелостью, иммуносупрессивными барьерами в ТМЭ и гетерогенностью подмножеств в инфузионной смеси DC, где присутствует лишь небольшая доля cDC17. Кроме того, выделение только cDC1 для иммунотерапии рака или вакцинации является сложной задачей из-за их чрезвычайно низкой концентрации в периферической крови (<0,3%)16. Кроме того, cDC1 могут быть получены из клеток-предшественников CD34+ или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием цитокинов и передачи сигналов NOCCH. Тем не менее, эти методы требуют сложных и длинных протоколов и дают небольшое количество и гетерогенные популяции подмножеств DC 17,18,19.

Чтобы устранить эти ограничения, перепрограммирование in vivo обеспечивает подходящую стратегию иммунотерапии рака для получения cDC1-подобных клеток, которые напоминают фенотипические, транскрипционные и функциональные свойства cDC1s20. Благодаря сверхэкспрессии специфичной для cDC1 минимальной генной регуляторной сети - PU.1, IRF8 и BATF3 (совместно именуемых PIB) - фибробласты, стромальные клетки и раковые клетки были постепенно перепрограммированы в cDC1-подобные клетки, что позволяет обрабатывать опухолевые антигены и презентовать их на MHC класса I и II, костимулирующую передачу сигналов через CD80 и CD86 и секрецию цитокинов/хемокинов, включая CXCL9/10 и IL-1220. 21,22,23. Перепрограммирование cDC1 происходило быстрее и эффективнее в ксенотрансплантатах человека in vivo и независимо от иммуносупрессии, генерируя cDC1-подобные клетки со зрелой иммуногенной сигнатурой20. В сингенных опухолях меланомы мы наблюдали, что cDC1-подобные клетки ремоделируют свою TME, индуцируют образование третичной лимфоидной структуры (TLS), а также рекрутируют и расширяют поликлональные TH1 и цитотоксические Т-клетки памяти, что приводит к долгосрочному системному иммунитету. Наконец, мы разработали новый метод иммунотерапии рака, основанный на перепрограммировании in situ раковых клеток в cDC1-подобные клетки путем внутриопухолевого введения аденовирусных векторов20. Эти результаты прокладывают путь к клиническому переводу перепрограммирования cDC1 в качестве нового метода иммунотерапии рака, который может использовать функциональные свойства cDC1.

Здесь мы представляем управляемый протокол для генерации cDC1-подобных клеток в TME на основе перепрограммирования cDC1 in vivo . Лентивирусная доставка PIB в раковые клетки и последующая имплантация в виде определенной смеси трансдуцированных раковых клеток с нетрансдуцированными родительскими раковыми клетками позволяет in vivo перепрограммировать контролируемую фракцию раковых клеток в пределах TME. Кроме того, этот способ не ограничен эффективностью доставки вирусных векторов in situ 20. Мы описываем шаги для эффективного производства лентивирусных векторов, функционального титрования и перепрограммирования cDC1 in vivo на примере модели сингенной меланомы YUMM1.7. Мы подробно описываем экспериментальную установку и стратегию гейтирования для анализа in vivo перепрограммированных cDC1-подобных клеток с помощью проточной цитометрии после диссоциации опухоли. Мы также предлагаем шаги для оценки изменений в TME путем выполнения криоконсервации, срезов и иммунофлуоресцентного окрашивания участков опухоли с последующей конфокальной микроскопией. Наконец, мы рассмотрим, как контролировать иммунитет, индуцированный cDC1, путем измерения роста и выживаемости опухоли. Этот гибкий и масштабируемый подход предлагает исследователям ценный инструмент для оценки комбинаторных стратегий лечения с перепрограммированием cDC1 in vivo , для характеристики изменений в неогенезе TME и TLS на моделях рака или для проведения больших скринингов, модифицирующих экспрессию различных иммунных путей, например, презентацию антигена или секрецию цитокинов/хемокинов, и раскрытия их влияния на противоопухолевый иммунитет.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальные процедуры на животных проводились в соответствии со шведскими нормами после одобрения Шведского совета по сельскому хозяйству.

1. Подготовка реагентов

  1. Для приготовления модифицированной полной среды Eagle's medium (DMEM) от Dulbecco добавьте 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 100 Ед/мл пенициллина (Pen), 2 мМ заменителя глутамина и 100 мг/мл стрептомицина (стрептококка).
  2. Для приготовления готовой среды RPMI 1640 добавьте 10% (v/v) FBS, 2 мМ заменителя глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 ЕД/мл Pen и 100 мг/мл стрептококка.
  3. Для приготовления полнорационной среды DMEM/F12 добавьте 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ заменимых аминокислот, а также 100 ЕД/мл Pen и 100 мг/мл стрептококка.
  4. Для приготовления 1 мг/мл полиэтиленимина (ПЭИ) растворите 100 мг порошка ПЭИ в 100 мл стерильной деионизированной воды в стеклянном стакане или конической пробирке. Поместите стакан на магнитную мешалку и перемешайте при комнатной температуре (RT), чтобы создать вихрь до полного растворения. Отрегулируйте pH до 6,9-7,1, добавляя по каплям соляную кислоту (HCl)/гидроксид натрия (NaOH), и отфильтруйте раствор через мембранный фильтр PES 0,22 мкм.
  5. Для приготовления 1 мМ бутирата натрия растворить 1,10 мг в 10 мл стерильной деионизированной воды.
  6. Для приготовления полибрена 8 мг/мл растворите 80 мг порошка полибрена в 10 мл стерильной деионизированной воды.
  7. Для приготовления буфера FACS добавьте 2% FBS и 1 мМ ЭДТА в фосфатно-солевой буфер (PBS).

2. Производство лентивирусов

  1. Разморозьте клетки HEK 293T, добавив 1 мл клеток к 9 мл предварительно подогретой полной среды DMEM, и центрифугируйте клетки при 350 × г в течение 5 минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 20 мл полной среды DMEM и культивируйте клетки в 150 мм планшете при 37 °C с 5%CO2.
  2. Расширяйте и разделяйте клетки HEK 293T, когда они достигают 80-90% конфлюенции. Чтобы разделить клетки, промойте один раз PBS, добавьте 5 мл трипсина, чтобы отделить их от планшета, и инкубируйте 5-10 минут при 37 °C с 5%CO2.
  3. Соберите клетки с 5 мл полной среды DMEM, центрифугируйте их при 350 × г в течение 5 мин и разделите их в соотношении 1:6 на новые 150-миллиметровые планшеты за 48 ч до трансфекции.
    Примечание: Качество клеточной линии, продуцирующей лентивирус, имеет решающее значение для получения высоких титров. Не допускайте, чтобы конфлюенция клеток превышала 95% и избегайте их засеивания на уровне <30% конфлюенции.
  4. Через 48 ч или когда клетки достигнут 70-80% конфлюенции, приготовьте смесь для трансфекции в конической пробирке объемом 50 мл. Используйте следующую транспортную плазмиду: 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-полицистронный лентивирусный вектор, содержащий факторы транскрипции PU.1, IRF8, BATF3, внутренний рибосомный сайт входа (IRES) и усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) в качестве репортера флуоресцентной трансдукции; или 2) SFFV-eGFP, контрольный лентивирусный вектор с множественным сайтом клонирования и eGFP; или 3) SFFV-mCherry, лентивирусный вектор, экспрессирующий mCherry. Добавьте 10 г трансферной плазмиды, 7,5 г упаковочной плазмиды psPAX2 и 2,5 г конвертной плазмиды pMD2.G. Долейте в пробирку с помощью Opti-MEM, чтобы общий объем достиг 2 мл. Наконец, добавьте 60 мкл реагента для трансфекции PEI (из запаса 1 мг/мл) в смесь для трансфекции.
    Лентивирусный вектор SFFV-eGFP используется в качестве регулятора трансдукции для экспериментов по перепрограммированию с учетом лентивирус-опосредованной иммуногенности, в то время как SFFV-mCherry используется для создания флуоресцентно меченых линий раковых клеток.
  5. Вихревую трансфекцию тщательно перемешивают в течение 1 мин и инкубируют в течение 15 мин в РТ, чтобы обеспечить образование ДНК-липидных комплексов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Confluency существенно влияет на титры вируса. Трансфекция клеток при конфлюенции менее 70% приведет к снижению титров вируса из-за меньшего количества клеток, получающих плазмиды.
  6. Аспирируйте среду клеток HEK 293T и добавьте 10 мл DMEM без Pen/Step и с 10% стерильно отфильтрованного FBS.
  7. Добавьте трансфекционную смесь по каплям в планшеты диаметром 150 мм и выдерживайте в течение 16 часов при температуре 37 °C с 5%CO2.
  8. После трансфекции замените среду 20 мл полной среды DMEM с добавлением 1 мМ бутирата натрия и инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C с 5%CO2.
    Бутират натрия является ингибитором гистондеацетилазы (HDAC) класса 1 и может усиливать экспрессию генов в клетках HEK 293T, индуцируя гиперацетилирование гистонов, которое открывает структуру хроматина и облегчает транскрипцию вирусной упаковки и трансферных плазмид. Эффективность трансфекции можно оценить, проверив экспрессию eGFP с помощью флуоресцентного микроскопа.
  9. Через 48 ч и 60 ч после трансфекции соберут лентивируссодержащий надосадочный слой в конические пробирки объемом 50 мл. После первого сбора добавьте 12 мл предварительно подогретой полной среды DMEM на пластину диаметром 150 мм для второго сбора. Храните коллекции при температуре 4 °C, фильтруйте их через фильтр PES с низким содержанием белка 0,45 мкм и объедините их.
  10. Чтобы сконцентрировать вирус, пипетку 37 г среды, содержащей лентивирус, в тонкостенные полипропиленовые пробирки объемом 38,5 мл с открытым верхом. Измерьте вес трубок с помощью настольных весов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измеряйте вес среды, содержащей лентивирус, а не ее объем, так как вес обеспечивает большую точность балансировки. Вес пробирок должен быть хорошо сбалансирован, чтобы не повредить ультрацентрифугу.
  11. Поместите пробирки в ведра для ультрацентрифугирования, закройте крышки и поместите ведра в ротор с качающимся ведром. Центрифугируйте при 25 000 × г в течение 90 мин при 4 °C.
  12. После центрифугирования извлеките пробирки из ведер и аспирируйте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одни и те же пробирки могут быть заполнены многократно и использованы в общей сложности для трех циклов центрифугирования для производства более крупной гранулы лентивируса на пробирку.
  13. Поместите тонкостенные полипропиленовые трубки с открытым верхом вверх дном на 5 минут на лабораторную салфетку или аналогичный абсорбирующий материал, чтобы дать стечь лишней жидкости и высушить гранулу.
  14. Добавьте 200 μL ледяного DMEM с добавлением HEPES или PBS в каждую гранулу. Поместите микроцентрифужные пробирки в конические пробирки объемом 50 мл и закройте крышку для поддержания стерильности.
  15. Инкубируйте гранулу в течение ночи при температуре 4 °C, чтобы обеспечить повторную суспензию.
  16. Соедините ресуспендированные гранулы, аликвоту, и храните их при температуре -80 °C до года.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать потери титра при повторных циклах замораживания-размораживания, используйте меньшие объемы аликвоты (например, 50-200 мкл).

3. Функциональное титрование вирусов

Примечание: Этот шаг следует повторять для каждой партии лентивируса, чтобы определить оптимальную дозу вируса, необходимую для достижения соотношения трансдуцированных (eGFP+) и нетрансдуцированных (eGFP-) клеток 1:1.

  1. Размораживание и экспансия раковых клеток в соответствующих питательных средах (например, клеточная линия мышиной меланомы YUMM1.7 в полной среде DMEM/F12).
    Примечание: Клетки должны пройти по крайней мере один раунд деления перед экспериментом по перепрограммированию. Проходы клеток должны быть схожими между экспериментами.
  2. За день до образования опухоли вырастите раковые клетки, аспирировав их питательную среду, промыв один раз PBS и добавив 2 мл или 5 мл трипсина на 100 мм планшет или 150 мм. Инкубировать в течение 5-10 мин при 37 °C с 5%CO2 и собрать клетки, добавив 8 мл или 5 мл полной среды на 100 мм или 150 мм планшет соответственно в конические пробирки объемом 50 мл.
  3. Центрифугируйте клетки при 350 × г в течение 5 мин для удаления трипсина и ресуспендирования в полной среде.
  4. Возьмите аликвоту клеток объемом 10 μл, добавьте 10 μл Trypan Blue и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра.
  5. Перенесите 6 × 105 клеток в новую коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 12 мл готовой среды, и добавьте 12 мкл полибрена 8 мг/мл в клеточную суспензию до достижения рабочей концентрации 8 мкг/мл.
  6. Пипеткой внесите по 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку на 6-луночный планшет для культуры тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости увеличьте количество клеток до 1,2-1,8 х 106 на 6-луночный планшет.
  7. Добавляйте увеличивающиеся объемы лентивируса в каждую лунку, чтобы определить оптимальный объем, необходимый для достижения соотношения трансдуцированных (eGFP+) и нетрансдуцированных (eGFP-) клеток 1:1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте рекомендуемые объемы лентивируса 1, 2, 4, 8, 16 и 32 мкл в трех экземплярах. Выполните функциональное титрование для пустого контрольного лентивирусного вектора SFFV-eGFP и SFFV-mCherry.
  8. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C с 5%CO2.
  9. В день 0 удалите среды, содержащие лентивирус, замените их свежими и инкубируйте в течение 72 ч при 37 °C с 5%CO2.
  10. На 3-й день проверьте клетки на экспрессию eGFP под флуоресцентным микроскопом.
    Примечание: Этот шаг обеспечивает быструю верификацию клеточной трансдукции, но не заменяет анализ, выполненный с помощью проточной цитометрии на шаге 3.14 для определения точного соотношения eGFP+ и eGFP-клеток.
    В некоторых раковых клетках (например, в клетках меланомы мышей B16) сигнал eGFP может быть слабым, и его трудно обнаружить с помощью флуоресцентного микроскопа. Рекомендуется приступать непосредственно к проточной цитометрии.
  11. Отсадите среду, промойте клетки один раз PBS и добавьте 500 мкл трипсина на лунку. Выдерживать в течение 5-10 минут при 37 °C с 5%CO2.
  12. Поднимите клетки в каждой лунке с помощью 1,5 мл буфера FACS и пипетируйте клеточную суспензию в полистирольные пробирки объемом 5 мл. Возьмите аликвоту и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра и окрашивания Трипановым синим.
  13. Центрифугируйте клеточную суспензию при 350 × г в течение 5 мин, повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл буфера FACS и приступайте к анализу проточной цитометрии.
  14. Количественно определите точное соотношение трансдуцированных (eGFP+) и нетрансдуцированных (eGFP-) клеток с помощью проточной цитометрии. Для тестирования in vivo используйте объем лентивируса, который ближе всего к соотношению 1:1.
    Примечание: Чтобы точно определить соотношение eGFP+ и eGFP-клеток, включите нетрансдуцированные раковые клетки в качестве отрицательного контроля для гейтинга.

4. Установление подкожных опухолей для перепрограммирования in vivo

  1. Размораживайте и размножайте раковые клетки в соответствующей питательной среде для получения клеток, экспрессирующих mCherry.
    Примечание: экспрессия mCherry облегчает дифференциацию раковых клеток во время анализа проточной цитометрии от других популяций опухоли, например, эндогенных стромальных и иммунных клеток.
  2. Выполнить шаги 3.2-3.4 и ресуспендировать клетки в полноценных средах в концентрации10-5 клеток/мл.
  3. Добавьте 8 мкг/мл полибрена и определенный объем лентивируса SFFV-mCherry в клеточную суспензию для достижения эффективности трансдукции >90%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, если достижение >90% трансдукции ставит под угрозу жизнеспособность клеток, отсортируйте клетки mCherry+ с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) через 72 ч после трансдукции и размножите отсортированные клетки в культуре.
  4. Планшет 5 мл клеточной суспензии (содержащей 5 × 105 клеток) на 100 мм планшет и инкубируют клетки при 37 °С с 5%СО2 в течение 24 ч.
  5. Через 24 ч замените среду на 10 мл полной среды и расширьте клетки, культивируя их при 37 °C с 5%CO2 в течение не менее 7 дней до начала экспериментов по перепрограммированию.
  6. После расширения выполните шаги 3.2-3.4 для подготовки клеточных суспензий к последующей трансдукции с заранее определенным объемом SFFV-PIB-IRES-eGFP, в результате чего на 3-й день будет получено наиболее близкое соотношение трансдуцированных (eGFP+) и нетрансдуцированных (eGFP-) клеток 1:1.
  7. Добавьте 8 мкг/мл полибрена в клеточную суспензию вместе с ранее определенным объемом лентивируса в клеточную суспензию в конических пробирках объемом 50 мл. Хорошо перемешайте, не создавая пузырей.
  8. Пипетку пипетку 2 мл клеточной суспензии (содержащей 105 клеток) на лунку в 6-луночный тканевый культуральный планшет и инкубируют в течение 24 ч при 37 °С с 5%СО2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно поместить клетки в 5 мл трансдукционной среды в 100 мм планшетах для культуры тканей. Однако следует учитывать, что эффективность трансдукции может быть снижена в больших объемах и должна быть определена эмпирически, как описано в шагах 3.1-3.13.
    Рекомендуется трансдуцировать по меньшей мере на 10% больше клеток, чтобы компенсировать потенциальную потерю клеток в процессе трансдукции и обеспечить достаточный объем для пипетирования или инъекции во время формирования опухоли.
  9. Через 24 ч удалить лентивируссодержащую среду, дважды промыть PBS, добавить в каждую лунку по 500 мкл трипсина и выдерживать в течение 5-10 мин при 37 °C с 5%CO2.
  10. Проверьте под световым микроскопом, полностью ли диссоциировали клетки от планшетов, а затем соберите их с помощью полной среды в конические пробирки объемом 50 мл.
  11. Гранулируйте ячейки, центрифугируя их в течение 5 минут при 350 × г, промойте гранулу PBS и снова центрифугируйте в течение 5 минут при 350 × г. Возьмите аликвоту и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра и окрашивания Трипановым синим.
  12. Ресуспендировать гранулу в ледяном PBS до достижения концентрации 2-4 × 107 клеток на мл, что соответствует 1-2 × 106 клеток в 50 мкл объема инъекции на одну опухоль.
    Примечание: Важно отметить, что эти цифры были проверены для опухолей меланомы YUMM1.7 с целью выделения in vivo перепрограммированных cDC1-подобных клеток для анализа проточной цитометрии. Для других клеточных линий и для других экспериментальных данных, таких как эксперименты по росту опухоли и выживанию, цифры должны быть эмпирически проверены. Для экспериментов по росту опухоли и выживанию рекомендуется использовать более низкое количество клеток — от 100 000 до 250 000 клеток на опухоль.
  13. Переместитесь в рабочую зону, где проводятся эксперименты на животных, и держите клетки на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После подготовки клеток выполняйте инъекции клеток как можно быстрее, так как жизнеспособность клеток со временем снижается.
  14. Приготовьте раствор для анестезии, содержащий 3 мкл ксилазина (20 мг/мл), 27 мкл кетамина (100 мг/мл) и 30 мкл PBS на каждую мышь.
  15. Обезболивайте мышей CD45.1 путем внутрибрюшинного введения 60 мкл анестетика. Рандомизируйте мышей и держите их на грелке, чтобы избежать падения температуры тела. Нанесите крем для глаз на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание глаз во время анестезии.
    Примечание: Крайне важно использовать мышей CD45.1 для обеспечения различия между перепрограммированными cDC1-подобными клетками in vivo , экспрессирующими аллель CD45.2 дикого типа, и эндогенными иммунными клетками. Если клеточная линия CD45.1, то в качестве реципиентов могут быть использованы мыши C57BL/6 (CD45.2). Мыши должны быть сопоставимы по полу и возрасту между экспериментальными группами и рандомизированы до образования опухоли.
  16. Подождите 5-10 минут, пока все мыши полностью не обезболится.
  17. Побрейте правый бок мышей с помощью бритвы; При желании отметьте их с помощью машинки для стрижки ушей. Продезинфицируйте область и смахните оставшиеся волосы с помощью 70% этанола.
  18. Ресуспендирование раковых клеток путем пипетирования вверх и вниз с помощью пипетки P1000. Загрузите суспензию элемента в шприц 30 г объемом 0,5 мл.
  19. Аккуратно приподнимите кожу выбритого бока мыши с помощью двух пальцев и введите кончик иглы туда, где кожа образует складку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проколоть пальцы иглой.
  20. Отпустите кожу, удерживайте шприц на месте одной рукой, а двумя пальцами другой руки растяните кожу мыши.
  21. Медленно введите 50 мкл суспензии раковых клеток, чтобы создать овальную выпуклость (подкожный отек) в месте инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если выпуклость не образуется, суспензия могла просочиться в окружающую подкожную клетчатку, что может привести к непоследовательному или неудачному образованию опухоли.
  22. После процедуры следите за тем, как все мыши просыпаются, чтобы обеспечить выживание после анестезии.
  23. Поддерживайте мышей в контролируемой температуре 23 ± 2 °C и фиксированном 12-часовом цикле света/темноты и свободном доступе к пище и воде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы хотите контролировать рост опухоли, выполните шаги 4.24-4.26. В противном случае пропустите эти шаги и сразу перейдите к следующим разделам.
  24. Чтобы следить за ростом опухоли, аккуратно удерживайте мышь одной рукой, что позволяет четко визуализировать опухоль.
  25. С помощью электронного штангенциркуля измерьте длину (l), ширину (w) и высоту опухоли (h). Рассчитайте объем опухоли (V) по формуле: V = (l x w x h) / 2.
  26. Измеряйте размеры опухоли каждые два-три дня. Когда опухоль достигает объема, соответствующего критерию гуманной конечной точки (например, 1500 мм³), усыпляют животное в соответствии с этическими и институциональными принципами.

5. Выделение опухоли для анализа проточной цитометрии

  1. Подготовьте ножницы, щипцы, буфер FACS и 12-луночные планшеты для нетканевых культур с ледяной средой RPMI для сбора образцов опухолей.
  2. Приготовьте раствор для расщепления опухоли, смешав 30 мкл 100 мг/мл коллагеназы D и 3 мкл 10 мг/мл ДНКазы I в 3 мл полной среды RPMI для каждой опухоли (для достижения рабочей концентрации 1 мг/мл коллагеназы D и 10 мкг/мл ДНКазы I).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если эффективность пищеварения неоптимальна, добавьте 2-5 мМ CaCl2 для поддержки активности коллагеназы.
  3. Усыпьте мышей путем вывиха шейки матки или удушьяСО2 в день изоляции.
  4. Подкожные опухоли иссекают ножницами и щипцами и помещают каждую опухоль в лунку 12-луночного планшета для нетканевых культур с ледяным охлаждением RPMI. Постарайтесь свести к минимуму иссечение неопухолевой ткани.
  5. Разрежьте образцы опухоли на3 части размером 1-2 мм с помощью ножниц, соберите кусочки в конические пробирки объемом 50 мл, содержащие 3 мл раствора для пищеварения, и инкубируйте при температуре 37 °C, встряхивая при 200-250 об/мин в течение 30-45 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Делайте вихрь или пипетку каждые 15 минут, чтобы облегчить процесс пищеварения.
  6. После разложения энергично пипетируйте смесь в течение 1 минуты с помощью серологической пипетки объемом 5 мл. Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 70 мкм в новую коническую пробирку объемом 50 мл.
  7. С помощью поршня шприца объемом 10 мл раздавите непереваренные кусочки о сетчатый фильтр размером 70 μм и промойте фильтр 10 мл полной среды RPMI.
  8. Центрифугируйте клеточную суспензию при 350 × г в течение 5 мин при 4 °C, ресуспендируйте в 1 мл буфера FACS и подсчитайте жизнеспособные клетки.
  9. Перенесите клеточную суспензию в полистирольные пробирки объемом 5 мл, гранулированные ячейки по 350 × г в течение 5 мин и ресуспендируйте 106 жизнеспособных клеток на 100 мкл буфера FACS.
  10. Отдельные ячейки для одноцветного (SC) и FMO управления в отдельные полистирольные трубки.
  11. Приготовьте мастер-смесь для окрашивания антител, содержащую сыворотку крови крысы (1:100) для блокирования неспецифического связывания; корректируемый краситель жизнеспособности (1:100) для исключения мертвых клеток в анализе; и флуоресцентно меченные антитела против CD45.1, анти-CD45.2 и анти-MHC-II в их оптимальной концентрации. Добавьте 100 μL исходной смеси в каждый образец и инкубируйте в течение 20 минут при 4 °C в темноте.
  12. Промойте образцы 2 раза 2 мл буфера FACS и приступайте к анализу проточной цитометрии.
  13. Количественно оцените процентное содержание cDC1-подобных клеток, экспрессирующих CD45.2 и/или MHC-II, путем гейтирования в трансдуцированных (eGFP+) раковых клетках (CD45.1-mCherry+).
    Примечание: Этот протокол может быть использован для выполнения иммунофенотипирования опухолей после перепрограммирования cDC1 in vivo путем дополнения окрашивающей панели антителами против эндогенных лимфоидных и/или миелоидных иммунных клеточных популяций.

6. Замораживание и срезы опухоли для конфокального микроскопического анализа

  1. Подготовьтесь к выделению опухоли, выполнив шаги 5.1 и 5.3. Иссекайте подкожные опухоли ножницами и щипцами.
  2. Фиксируйте опухоли в свежеприготовленном 4% параформальдегиде (PFA) в PBS при температуре 4 °C с помощью легкого встряхивания. Отрегулируйте время фиксации в зависимости от размера опухоли, используя в качестве ориентира 1 час на мм³ ткани.
  3. Перенесите опухоли в 15% сахарозу в PBS и инкубируйте при 4 °C, осторожно встряхивая ткани, пока они не опустятся на дно пробирки. Затем переместите их до 20% сахарозы в PBS при тех же условиях.
  4. После того, как опухоли поселятся на дне пробирки, инкубируйте их в смеси 20% сахарозы в соотношении 1:1 в PBS и OCT соединении в течение 30 минут при 4 °C с встряхиванием.
  5. Извлеките смесь, погрузите ткани в криомолд со 100% ОКТ и заморозьте с помощью жидкого азота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты (криоперчатки, лицевой щиток и лабораторный халат), чтобы предотвратить холодовые ожоги или травмы от быстрого расширения пара. Работайте в хорошо проветриваемом помещении, чтобы избежать риска удушья.
    1. Хранить блоки при температуре -80 °C в закрытых контейнерах для предотвращения обезвоживания.

7. Иммунофлуоресцентное окрашивание участков опухоли

  1. С помощью криостата разрежьте опухоли на участки толщиной примерно 8 мкм и закрепите их на предметных стеклах микроскопа. При необходимости храните предметные стекла при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сохранения целостности тканей держите блоки и предметные стекла с установленными опухолевыми разрезами на сухом льду во время транспортировки к криостату и обратно. Убедитесь, что криостат поддерживается на уровне -20 °C во время секционирования.
  2. Разморозьте предметные стекла в PBS в течение 5 минут и зафиксируйте их в 4% растворе PFA на 10 минут при RT.
  3. После фиксации промойте предметные стекла в PBS в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы ткани оставались увлажненными; Всегда держите их в жидкости на всех последующих этапах окрашивания. Если эксперимент необходимо приостановить, слайды могут храниться в PBS at RT в течение 3 часов. Не храните слайды в PBS на ночь.
  4. Для извлечения антигена наполните пароварку водой и включите ее. Поместите банку с деионизированной водой и банку с 10 мМ цитрата натрия (pH 6) в пароварку и закройте отверстие алюминиевой фольгой. Не снимая крышку, вставьте термометр через вентиляционные отверстия крышки пароварки, проткните алюминиевую фольгу и следите за температурой, следя за тем, чтобы растворы достигали ~99 °C.
  5. Когда буферы достигнут ~99 °C, опустите предметные стекла в деионизированную воду на 10 с, а затем быстро перенесите их в раствор для извлечения антигена.
  6. Инкубируйте предметные стекла при температуре ~99 °C в течение 15 минут.
  7. Вымойте предметные стекла в 1x PBS в течение 3 x 5 минут.
  8. Используйте гидрофобный барьерный пап-ручку, чтобы очертить каждый участок ткани, образуя гидрофобный периметр, который предотвращает утечку любой жидкости, добавленной в ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие промывания PBS могут нарушить гидрофобный периметр, окружающий ткани, и потребовать обновления. При необходимости нарисуйте его еще раз.
  9. Блокируйте и пермеабилизируйте ткани 150 мкл блокирующего буфера (5% сыворотки и 0,5% Triton X-100 в 1x PBS) в течение 60 мин во время ЛТ. Для всех этапов окрашивания используйте сыворотку того же вида, что и хозяин вторичного антитела.
  10. Вымойте предметные стекла в 1x PBS в течение 3 x 5 минут.
  11. Инкубировать ткани с 20 мкг/мл первичного антитела к CD45 в блокирующем буфере (5% сыворотки и 0,5% Triton X-100 в 1X PBS) в течение ночи при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы использовать другие антитела, эмпирически подтвердите концентрацию антител.
  12. Вымойте предметные стекла в 1x PBS в течение 3 x 5 минут.
  13. Инкубируйте срезы ткани с козьим вторичным антителом против крыс, конъюгированным с AlexaFluor-647 в разведении 1:250 в блокирующем буфере (5% сыворотка) в течение 2 ч в темноте при ЛТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ После добавления вторичного антитела выполняйте все последующие действия в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивание флуорофоров.
  14. Вымойте предметные стекла в 1x PBS в течение 3 x 5 минут.
  15. Инкубировать ткани с 1 мкг/мл DAPI и 20 мкг/мл конъюгированных антител AlexaFluor-594 в блокирующем буфере (5% сыворотке) в течение 1 ч в темноте при ЛТ.
  16. Вымойте предметные стекла в 1x PBS в течение 3 x 5 минут.
  17. Добавьте каплю монтажного раствора на каждый участок опухоли, затем нанесите несколько капель монтажного средства на покровное стекло. Быстро переверните покровное стекло на предметное стекло, чтобы закрепить его и убедиться в отсутствии пузырьков рядом с новообразованиями.
  18. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи и сделайте их снимки с помощью конфокальной микроскопии.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематический обзор протокола перепрограммирования in vivo представлен на рисунке 1. Сначала мы получили полицистронный лентивирусный вектор SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), кодирующий инструктирующие cDC1 факторы перепрограммирования PU.1, IRF8, BATF3, за которым последовал внутренний рибосомный сайт входа (IRES) и усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) в упаковочной клеточной линии HEK 293T. Для контроля лентивирус-опосредованной иммуногенности мы получили пустой вектор SFFV-MCS-eGFP (eGFP), содержащий сайт множественного клонирования (MCS) и IRES-eGFP, но исключающий факторы перепрограммирования. После получения вируса мы собрали челентивируссодержащую надосадочную жидкость и концентрировали ее с помощью ультрацентрифугирования. Мы функционально титровали вирус, чтобы определить количество, необходимое для достижения соотношения трансдуцированных (eGFP+) и нетрансдуцированных (eGFP-) клеток 1:1, которое мы оценили на 3-й день после трансдукции. Затем мы использовали полученное количество вируса для трансдукции выбранной линии раковых клеток в день -1. Через 24 ч мы собрали клетки и имплантировали их подкожно, чтобы установить опухоли. Эта стратегия гарантировала, что трансдуцированные клетки перепрограммируются в cDC1-подобные клетки in vivo, в пределах ТМЭ. В указанные моменты времени после приживления мы иссекали и обрабатывали опухоли для последующего анализа, включая проточную цитометрию диссоциированных опухолевых клеток для количественной оценки эффективности перепрограммирования in vivo или иммунофлуоресцентное окрашивание криоконсервированных участков опухоли для характеристики изменений в TME.

Во-первых, чтобы обеспечить выработку высоких титров лентивирусов, мы контролировали клетки HEK 293T перед трансфекцией, стремясь достичь 70-80% конфлюенции, а через 24 ч мы оценили эффективность трансфекции через экспрессию eGFP с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 2A). Затем через 48 ч и 60 ч после трансфекции мы собрали вируссодержащую среду, ультрацентрифугировали ее и хранили в аликвотах при -80 °C (рис. 2В). Затем мы определили оптимальное количество вируса, необходимое для достижения соотношения eGFP+ и eGFP-клеток в клетках меланомы YUMM1.7 1:1. Мы засевали 105 клеток YUMM1.7 в лунку в 6-луночный планшет, трансдуцировали клетки с возрастающими объемами лентивируса и заменяли вируссодержащую надосадочную жидкость свежей полной средой DMEM/F12 через 24 ч (рис. 2C). На 3-й день мы оценили экспрессию eGFP с помощью флуоресцентной микроскопии, прежде чем приступить к количественной оценке точного процентного соотношения клеток eGFP+ с помощью проточной цитометрии (рис. 2C). Чтобы количественно оценить отношение eGFP+ к eGFP-клеткам, мы стробировали живые, одиночные клетки, чтобы исключить мертвые клетки и дублеты (рис. 2D). Оптимальный объем полученной партии лентивируса был определен как для PIB-eGFP, так и для контрольного вируса eGFP как 2 мкл на 105 клеток YUMM1,7, в результате чего было получено 50,0 ± 0,3% и 63,0 ± 0,9% клеток eGFP+ соответственно (рис. 2E).

Затем, чтобы оценить эффективность перепрограммирования in vivo, мы создали флуоресцентно меченую (mCherry+) линию раковых клеток (YUMM1.7-mCherry). Это гарантировало, что мы можем различать раковые клетки и стромальные или иммунные клетки путем гейтирования живых клеток mCherry+ в анализе проточной цитометрии (рис. 3A, B). Затем мы трансдуцировали клетки YUMM1.7-mCherry с 2 мкл PIB-eGFP или контрольного вируса eGFP на 105 клеток для достижения соотношения 1:1 eGFP+ к eGFP-. Мы подкожно имплантировали 1,6 × 10-6 клеток на опухоль мышам с CD45.1 и сохранили аликвоту клеток для культивирования in vitro для сравнения. Мы оценили эффективность перепрограммирования с помощью проточной цитометрии, гейтирования живых клеток mCherry+ eGFP+ и CD45.1- для исключения иммунных клеток хозяина, которые поглотили eGFP или mCherry (рис. 3B). С 1-го по 9-й день мы наблюдали постепенное приобретение экспрессии CD45.2 и/или MHC-II, маркируя частично перепрограммированные cDC1-подобные клетки (CD45.2+ MHC-II- или CD45.2-MHC-II+) и полностью перепрограммированные cDC1-подобные клетки (CD45+ MHC-II+) (рис. 3C). Мы подтвердили, что перепрограммирование раковых клеток мышей in vivo привело к более высокому проценту cDC1-подобных клеток на 9-й день по сравнению с условиями in vitro (9,54 ± 1,54% CD45+ MHC-II+ in vivo против 4,72 ± 1,1 % CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,018). Кинетика перепрограммирования также была ускорена, поскольку мы наблюдали более высокий процент cDC1-подобных клеток уже на 4-й день (8,7 ± 3,3% CD45+ MHC-II+ in vivo против 0,3 ± 0,1 % CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,05), что указывает на то, что присутствие сигналов окружающей среды способствует более быстрому и эффективному перепрограммированию в сторону cDC1-подобных клеток19. В то время как перепрограммированные cDC1-подобные клетки in vitro присутствовали до 15-го дня, in vivo cDC1-подобные клетки сохранялись в течение 9 дней, но не были обнаружены к 15-му дню, что свидетельствует об истощении TME иммунной системой хозяина (рис. 3C). 

Наконец, мы стремились охарактеризовать ранние изменения TME как результат перепрограммирования cDC1 in vivo в первые 9 дней. Мы проводили иммунофлуоресцентное окрашивание криоконсервированных и срезированных опухолевых тканей из опухолей eGFP и PIB-eGFP через 3 и 9 дней перепрограммирования in vivo , уделяя особое внимание инфильтрации иммунных клеток, маркированных пангемопоэтическим маркером CD45. Примечательно, что cDC1-подобные клетки легко рекрутировали значительно больше CD45-клеток в TME на 3-й день по сравнению с опухолями eGFP (49,6 ± 17,0 против 8,0 ± 5,8 eGFP средняя интенсивность флуоресценции окрашивания CD45 на площадь опухоли; Рисунок 4А, В). Интересно, что мы обнаружили TLS в TME опухолей после 9 дней перепрограммирования in vivo . Это говорит о том, что cDC1-подобные клетки могут быстро ремоделировать TME из «иммунно-холодной» в «иммунно-горячую» среду в течение 3 дней, что впоследствии приводит к образованию TLS на 9-й день.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор протокола для генерации cDC1-подобных клеток путем перепрограммирования раковых клеток in vivo. В линии упаковочных клеток HEK 293T производятся лентивирусные векторы SFFV-PIB-IRES-eGFP-кодирующие PU.1, IRF8 и BATF3 в полицистронной кассете под контролем промотора вируса, образующего селезеночный фокус (SFFV), и eGFP после внутреннего сайта входа рибосом (IRES) для отслеживания трансдуцированных клеток методами проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии. Затем лентивирусные векторы ультрацентрифугируют и функционально титруют для определения количества вируса, необходимого для трансдуцирования раковых клеток в соотношении 1:1 трансдуцированных eGFP+ к нетрансдуцированным eGFP-клеткам. Для экспериментов по перепрограммированию in vivo раковые клетки покрываются оптимальным количеством лентивируса на 1-й день. На следующий день эта смесь трансдуцированных GFP+ и нетрансдуцированных GFP-клеток в соотношении 1:1 промывается и собирается для создания подкожных опухолей у мышей. Параллельные культуры in vitro поддерживаются для валидации трансдукции на 3-й день с помощью проточной цитометрии. Животные контролируются каждые 2-3 дня на предмет роста опухоли и выживаемости. Опухоли собирают в определенные моменты времени, диссоциируют и окрашивают для экспрессии поверхностных маркеров для анализа проточной цитометрии. В качестве альтернативы целые ткани фиксируются, криоконсервируются и разрезаются для иммунофлуоресцентного окрашивания и анализа конфокальной микроскопии. Эффективность перепрограммирования in vivo оценивается с помощью анализа проточной цитометрии, в то время как изменения в микроокружении опухоли характеризуются конфокальной визуализацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Производство и функциональное титрование лентивируса для перепрограммирования cDC1 in vivo.(A) Когда клетки HEK 293T достигают ~70-80% конфлюенции, их трансфицируют смесью, содержащей 10 мкг трансферной плазмиды либо SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP), либо пустого лентивирусного вектора контроля SFFV-eGFP (eGFP), вместе с 7,5 мкг psPAX2, 2,5 мкг mPD2.G и 60 мкл 1 мг/мл PEI. Светлопольные и флуоресцентные микроскопические изображения клеток HEK 293T, показывающие экспрессию eGFP через 24 ч после трансфекции, что указывает на успешную доставку плазмиды. Масштабные линейки = 200 мкм. (B) Схематическое изображение рабочего процесса ультрацентрифугирования для концентрирования лентивируса. Лентивируссодержащий надосадочный слой клеток HEK 293T собирают через 48 ч и 60 ч после трансфекции, фильтруют через фильтр PES с низким содержанием белка 0,45 мкм, а 37 г взвешивают в тонкостенных полипропиленовых пробирках с открытым верхом с помощью настольных весов. Пробирки ультрацентрифугируются в роторе с качающимся ковшом, надосадочная жидкость аспирируется, а гранулы сушатся в течение 5 минут. Затем гранулы ресуспендируют в ледяном DMEM, содержащем HEPES, и инкубируют в течение ночи перед аликвотированием и хранением при -80 °C. (C) Экспериментальная стратегия функционального титрования для определения оптимальной дозы вируса для достижения соотношения GFP+ к GFP-клеткам 1:1. Изображения светлой и флуоресцентной микроскопии, показывающие экспрессию eGFP в клетках меланомы YUMM1.7 через 72 ч после трансдукции, указывают на успешную доставку факторов перепрограммирования и eGFP. Масштабные линейки = 100 мкм. (D) Репрезентативные графики проточной цитометрии, показывающие стратегию стробирования для количественной оценки соотношения клеток eGFP+. Живые клетки были закрыты для жизнеспособности популяции с отрицательным красителем (DAPI) с последующим исключением дублета. (E) Количественная оценка эффективности трансдукции с помощью проточной цитометрии с увеличением доз вируса для определения оптимального объема для получения GFP+/GFP-клеток 1:1. Как для PIB-eGFP, так и для лентивируса eGFP объем 2 мкл на 105 клеток достигал желаемого соотношения. Сокращения: cDC1s = обычные дендритные клетки типа 1; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; PIB = PU.1, IRF8 и BATF3; PEI = полиэтиленимин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Оценка эффективности перепрограммирования cDC1 in vivo. (A) Схематическое изображение экспериментального рабочего процесса для оценки эффективности перепрограммирования cDC1 in vivo. Раковые клетки первоначально трансдуцируются лентивирусом, экспрессирующим mCherry для создания флуоресцентно меченой клеточной линии (YUMM1.7-mCherry), после чего следует трансдукция оптимизированной дозой лентивируса PIB-eGFP на 1-й день. Затем клетки вводят подкожно в соотношении 1:1 клеток eGFP+/eGFP-в 0-й день для образования опухолей у мышей CD45.1 и позволяют PIB-трансдуцированным клеткам перепрограммироваться в cDC1-подобные клетки в пределах TME. Затем опухоли выделяют в указанные временные точки, диссоциируют и окрашивают на CD45.1, CD45.2 и MHC-II с помощью проточной цитометрии. Это позволяет исключить иммунные клетки хозяина CD45.1 для количественной оценки in vivo эффективности перепрограммирования cDC1 путем экспрессии CD45.2 и MHC-II. Параллельные культуры in vitro сохраняются на протяжении всех временных точек в качестве сравнения с перепрограммированием in vivo. (B) Репрезентативные графики проточной цитометрии, иллюстрирующие стратегию стробирования на 9-й день. Клетки были гейтированы на mCherry+ и GFP+ для идентификации успешно трансдуцированных раковых клеток. Иммунные клетки хозяина были исключены путем гейтирования CD45.1+ клеток. (C) Количественная оценка in vivo эффективности перепрограммирования (слева) клеток YUMM1.7-mCherry методом проточной цитометрии в процентном соотношении CD45+ клеток MHC-II+ (полностью перепрограммированных) и CD45.2+ HLA-DR- или CD45.2-HLA-DR+ cDC1-подобных клеток (частично перепрограммированных), стробированных в eGFP+ mCherry+ Клетки. Репрезентативные графики проточной цитометрии (справа), показывающие постепенное приобретение экспрессии CD45.2 и MHC-II в PIB-eGFP-трансдуцированных клетках YUMM1.7-mCherry в указанные временные точки. В качестве контроля использовали eGFP-трансдуцированные клетки YUMM1.7-mCherry, а для сравнения использовали перепрограммированные cDC1-подобные клетки in vitro. Данные на рисунке (C) указывают на среднее значение ± SD в 3-5 экспериментах с биологической репликацией. Статистический анализ в (C) проводили для CD45+ клеток MHC-II+ с использованием теста Манна-Уитни. *P < 0,05. Сокращения: cDC1s = обычные дендритные клетки типа 1; PIB = PU.1, IRF8 и BATF3; TME = опухолевое микроокружение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Анализ иммунной инфильтрации в микроокружении опухоли после перепрограммирования cDC1 in vivo . (A) Репрезентативные конфокальные изображения, показывающие CD45+ клетки в опухолях YUMM1.7 после подкожной имплантации PIB-eGFP- или контрольных eGFP-трансдуцированных клеток (соотношение 1:1 трансдуцированных к родительским клеткам) на 3 и 9 день. Масштабные линейки = 500 мкм. (B) Количественная оценка MFI для окрашивания CD45 в опухолях YUMM1.7, обработанных PIB и контрольных eGFP, на 3-й и 9-й дни. Данные в (В) указывают на среднее значение ± SD в 3-6 экспериментах с биологической репликацией. Статистический анализ в (В) проводили с использованием критерия Манна-Уитни. *P < 0,05 и ***P < 0,001. Сокращения: cDC1s = обычные дендритные клетки типа 1; PIB = PU.1, IRF8 и BATF3; MFI = средняя интенсивность флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы описываем гибкий метод генерации cDC1-подобных клеток, основанный на перепрограммировании in vivo раковых клеток из солидных опухолей. Наши результаты показывают, что сверхэкспрессия PU.1, IRF8 и BATF3 приводит к постепенному приобретению фенотипа cDC1 в ТМЭ до 9-го дня, после чего cDC1-подобные клетки истощаются из опухолей. В конечном счете, это приводит к увеличению инфильтрации клеток CD45 в ТМЭ к 3-му дню, что приводит к ремоделированию «иммунно-холодной» ТМЭ в «иммунно-горячую».

Современные протоколы для получения cDC1 включают обогащение аутологичных ДК из периферической крови, дифференцировку от CD34+ гемопоэтических клеток-предшественников или дифференцировку от плюрипотентных стволовых клеток 14,15,16,17,18,19. Тем не менее, эти методы имеют ограничивающие факторы: недостаточное созревание, сниженная презентация антигена и способность к производству цитокинов/хемокинов in vivo, восприимчивость к иммуносупрессии, высокая гетерогенность ДК и низкое количество генерируемых клеток7. Здесь мы предоставляем протокол, который позволяет масштабировать генерацию cDC1-подобных клеток in vivo для функциональных и механистических исследований.

С помощью этого метода мы проверили, достаточна ли экспрессия комбинации транскрипционных факторов PU.1, IRF8 и BATF3 для того, чтобы стимулировать перепрограммирование in vivo. Этот протокол позволяет точно контролировать эффективность доставки, так как изменение дозы имплантированных генетически модифицированных клеток напрямую влияет на эффективность лечения. Ранее мы показали, что 2% трансдуцированных клеток, которые соответствуют 0,15% CD45+ и MHC-II+ cDC1-подобных клеток, достаточно для формирования противоопухолевого иммунитета20. Кроме того, быстрая иммунная инфильтрация, наблюдаемая на 3-й день, позволяет предположить, что частично перепрограммированные cDC1-подобные клетки функционально активны in vivo, поскольку в этот момент времени не наблюдается существенного увеличения полностью перепрограммированных cDC1-подобных клеток. В будущем будет интересно разгадать функциональную роль частично или полностью перепрограммированных cDC1-подобных клеток в противоопухолевой эффективности с использованием модифицированных векторов, содержащих ген самоубийства, чтобы вызвать гибель клеток в выбранных клеточных популяциях в определенные моменты времени24. Этот протокол может быть в дальнейшем использован для изучения комбинации с эпигенетическими адъювантами, которые могутповысить эффективность перепрограммирования. Наконец, этот метод может быть также адаптирован для генерации других подтипов ДК in vivo, запуская различные типы иммунных реакций, например, противовирусные или толерогенныереакции. Кроме того, мы можем использовать перепрограммирование in vivo в качестве платформы для проведения скрининга со штрих-кодами комбинаций факторов транскрипции для создания различных типов иммунных клеток. Эта возможность может повысить гибкость лечения за счет использования различных функциональных свойств конкретных иммунных субпопуляций.

В нашем предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что иммуносупрессивная среда in vivo не препятствует перепрограммированию раковых клеток человека в иммуногенные cDC1s20. В этой статье мы показываем, что у мышей перепрограммирование происходит быстрее и эффективнее in vivo, чем in vitro, предполагая, что наблюдаемое in vivo усиленное перепрограммирование является консервативным явлением у обоих видов. Однако одним из ограничений этого метода является отсутствие среды in vivo во время первоначальной доставки вектора; Таким образом, он не может определить, влияют ли сигналы окружающей среды на эффективность доставки in vivo. Это должно быть определено на месте путем сравнения различных фрагментов. Аденовирусные векторы, которые мы определили как более эффективные, чем лентивирусные векторы для доставки in situ 20 , могут быть сравнены с невирусными фрагментами, такими как линейные, кольцевые и самоамплифицирующиеся РНК или низкомолекулярные коктейли2 6,27.

Ранее мы показали, что перепрограммирование cDC1 наделяет раковые клетки провоспалительными цитокинами и рекрутингом лимфоцитов, секрецией хемокинов, а также профессиональной обработкой и представлением антигена на MHC-I и MHC-II в моделях меланомы23,28. Это приводит к ремоделированию ТМЭ из «иммунно-холодного» в «иммунно-горячее» состояние путем индуцирования образования TLS, что увеличивает инфильтрацию цитотоксических эффекторных Т-клеток, NK-клеток и В-клеток, а также снижает иммуносупрессивные популяции, такие как регуляторные и истощенные Т-клетки20. У пациентов положительные ответы на иммунотерапию были связаны с наличием СЛО в опухолях, где устойчивый прайминг Т- и В-клеток против опухолевых антигенов генерирует опухолеспецифичные ответы антител29,30. В будущем мы планируем использовать этот податливый протокол перепрограммирования cDC1 in vivo для раскрытия механизмов индуцированного неогенеза TLS, ремоделирования ТМЭ и противоопухолевого иммунитета при различных типах рака, а также для определения того, стимулируется ли производство опухолеспецифичных антител.

Ранее мы наблюдали синергизм между перепрограммированием cDC1 in vivo и ICB с анти-PD-1 или анти-CTLA-420. Это говорит о том, что «иммуногорячая» ТМЭ, созданная путем перепрограммирования cDC1, может обеспечить благоприятную среду для возможных комбинаций с другими иммунотерапическими препаратами, такими как ACT, включая Т-клеточные рецепторы (TCR)-Т-клетки, химерные антигенные рецепторы (CAR)-Т-клетки или инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TILs). Еще одним преимуществом этого метода является возможность проведения больших несмещенных комбинаторных или CRISPR-скринингов, в которых иммунологические рецепторы, цитокины, хемокины или лимфотоксины могут быть сверхэкспрессированы или истощены в cDC1-подобных клетках в резистентных типах опухолей, тем самым раскрывая роль отдельных путей в повышении cDC1-опосредованного иммунитета. В заключение следует отметить, что текущий протокол представляет собой ценный ресурс для широкого научного сообщества, поскольку перепрограммирование cDC1 in vivo является гибкой и мощной платформой для механистических исследований и терапевтических инноваций в иммунотерапии рака.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.-F.P. имеет долю в акционерном капитале и занимает руководящие должности в компании Asgard Therapeutics AB, которая разрабатывает иммунотерапию рака на основе технологий перепрограммирования ДК in vivo. C.-F.P является изобретателем по выданным патентам US 11,345,891, JP 7303743 и CN ZL201880005047.3 и патентным заявкам WO 2018/185709 и WO 2022/243448 (вместе с E.A.), принадлежащих Asgard Therapeutics, которые охватывают описанный здесь подход к перепрограммированию клеток.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Мариану Лопес и Камиль Шатлен, сотрудников Лаборатории перепрограммирования клеток в кроветворении и иммунитете, за редактирование и корректуру рукописи.

Это исследование было проведено в рамках Национальной исследовательской школы ATMP, финансируемой Шведским исследовательским советом. Обсуждаемые здесь проекты были софинансированы Европейским исследовательским советом в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза Horizon 2020 (866448-TrojanDC и 101189370), Novo Nordisk Fonden (NNF22C0079466), Европейским советом по инновациям (101130218-RESYNC), Cancerfonden (23 2932 Pj), Шведским исследовательским советом (2020-00615), Шведским агентством инноваций (2024-02178), ALF (44410), FCT (2022.02338.PTDC) и Plano de Recuperação e Resiliência de Portugal pelo fundo NextGenerationEU (C644865576-00000005). Фонд Кнута и Алисы Валленберг, медицинский факультет Лундского университета и регион Сконе получили высокую финансовую поддержку.

Наличие материалов:

Конструкции и векторы, используемые для перепрограммирования, доступны в Asgard Therapeutics в соответствии с соглашением о передаче материалов с компанией. Все остальные данные, необходимые для оценки выводов в статье, присутствуют в основном тексте или дополнительных материалах.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,45 мкм; m фильтр с низким содержанием белка, вакуумный фильтр 150 млНаучный Фишер15983297
2-Меркаптоэтанол 50 мМThermoFisher Scientific31350010
Моноклональное антитело к мышиному CD45 (клон: 30-F11), IgG2b крысы, κThermoFisher Scientific14-0451-82
В6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)Лаборатория Джексона002014
Инсулиновые шприцы BD Micro-Fine U-100 (0,5 мл)Научный центр Фишера11395751
Мыши C57BL/6JЛаборатория Джексона000664
Коллагеназа DСигма Олдрич11088882001
Сетчатый фильтр Corning Falcon для использования с коническими трубками объемом 50 млСигма ОлдричCLS352340
Чехол Corning 24 x 50 мм Сигма ОлдричCLS2975245
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)ThermoFisher ScientificД1306
ДНКаза IСигма Олдрич10104159001
Изменяемый жизнеспособный краситель eBioscience eFluor 450Инвитроген65-0863-14
Раствор для извлечения антигена eBioscience IHC - низкий pH (10x)ThermoFisher Scientific00-4955-58
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ThermoFisher ScientificA5256701
Монтажная среда Fluoromount-GThermoFisher Scientific00-4958-02
Антитела к GFP [Alexa Fluor 594]Novus BiologicalsНБ600-308АФ594
Gibco DMEM/Питательная смесь F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific31331028
Gibco MEM Раствор заменимых аминокислот (100x)ThermoFisher Scientific11140035
Gibco Opti-MEM IThermoFisher Scientific11058021
Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumThermoFisher Scientific52400025
Пируват натрия Gibco (100 мМ)ThermoFisher Scientific11360070
Gibco Трипан Синий раствор, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061
Добавка GlutaMAX ThermoFisher Scientific35050061
Козье антикрысиное антитело IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией вторичного антитела, поликлональное, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificА-11006
Элементы HEK 293TАТТКЦРЛ-11268
Гексадиметрина бромид (Полибрен)Сигма ОлдричН9268
Модифицированная орлиная среда (DMEM) от HyClone Dulbecco с высоким содержанием глюкозыЦитиваSH30243.01
HyClone Пенициллин Стрептомицин 100x раствор (Pen/Strepp)ЦитиваSV30010
Гидрохлорфосфатный буферный солевой раствор (PBS)ЦитиваSH30028.02
Кетаминол ветеринарный. Раствор для инъекций 100 мг/млMSD Animal Health ШвецияQN01AX03
Лезвие для микротома - C35ПФМ медицинский207500005
Мышь anti-CD45.2 (104), Surface, APC, МоноклональнаяБиолегенда109814
Мышь Anti-MHCII (M5/114.15.2), поверхностная, PE-Cy7, моноклональнаяБиолегенда107630
Обычная козья сывороткаАбкамАБ7481
Нормальная сыворотка от крыс (стерильная)АбкамАБ7488
Тонкостенные полипропиленовые трубки с открытым верхомBeckman Coulter Медико-биологические науки326823
Параформальдегид, 16% по объему раствора, без метанолаThermoFisher Scientific043368.9М
pFUW-tetO-Batf3, моноцистронная кассетная мышь с кодированием Batf3Адджен139837
pFUW-tetO-Irf8 — моноцистронная кассетная мышь Irf8Адджен139838
pFUW-tetO-Pu.1 — моноцистронная кассетная мышь с кодированием Pu.1Адджен139839
Плазмида pMD2.GАдджен12259
Плазмида psPAX2Адджен12260
Плазмида SFFV-eGFP (eGFP)Клонирование в домашних условиях-
Плазмида SFFV-mCherry (mCherry)Клонирование в домашних условиях-
Плазмида SFFV-PIB-eGFP,  полицистронная кассета для кодирования мышей PU.1, IRF8 и BATF3 (PIB) Клонирование в домашних условиях-Конструкции и векторы, используемые для перепрограммирования, доступны в Asgard Therapeutics в соответствии с соглашением о передаче материалов с компанией
Полиэтиленимин (ПЭИ), линейный, MW 25000, трансфекционныйПолинауки23966
ReadyProbes Гидрофобный барьер Пап-ручкаThermoFisher ScientificР3777
Бутират натрияСигма Олдрич303410
СахарозаСигма-ОлдричС7903
Предметные стекла адгезионного микроскопа SuperFrost PlusЭпредияJ1800AMNZ
Ткань-Тек О.К.Т. КомпаундСакура Финетек4583
TrypLE Express Enzyme (1x) без фенола красныйThermoFisher Scientific12604021
TT Cryomold Intermediate, квадратный (15 x 15 x 5 мм)Сакура Финетек4566
UltraPure 0,5 М ЭДТА, pH 8,0Инвитроген15575020
Xysol vet. Раствор для инъекций 20 мг/млВМ ФармаQN05CM92
Ячейки YUMM1.7Антинео

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oliveira, G., Wu, C. J. Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).
  2. Larkin, J., et al. Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 381 (16), 1535-1546 (2019).
  3. Adams, S., et al. Pembrolizumab monotherapy for previously untreated, PD-L1-positive, metastatic triple-negative breast cancer: cohort B of the phase II KEYNOTE-086 study. Ann Oncol. 30 (3), 405-411 (2019).
  4. Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer. Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).
  5. Reardon, D. A., et al. Randomized phase 3 study evaluating the efficacy and safety of nivolumab vs bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: CheckMate 143. Neuro Oncol. 19 (suppl_3), iii21-iii21 (2017).
  6. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  7. Heras-Murillo, I., Adán-Barrientos, I., Galán, M., Wculek, S. K., Sancho, D. Dendritic cells as orchestrators of anticancer immunity and immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 21 (4), 257-277 (2024).
  8. Heras-Murillo, I., et al. Immunotherapy with conventional type-1 dendritic cells induces immune memory and limits tumor relapse. Nat Commun. 16 (1), 3369(2025).
  9. Theisen, D. J., et al. WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens. Science. 362 (6415), 694-699 (2018).
  10. Meiser, P., et al. A distinct stimulatory cDC1 subpopulation amplifies CD8+ T cell responses in tumors for protective anti-cancer immunity. Cancer Cell. 41 (8), 1498-1515.e10 (2023).
  11. Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy. Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).
  12. Hubert, M., et al. IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer. Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).
  13. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567(2024).
  14. Ascic, E., Pereira, C. -F. Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells. Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).
  15. Silk, K. M., et al. Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells. Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).
  16. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).
  17. Makino, K., et al. Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling. J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).
  18. Balan, S., et al. Large-scale human dendritic cell differentiation revealing Notch-dependent lineage bifurcation and heterogeneity. Cell Rep. 24 (7), 1902-1915.e6 (2018).
  19. Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Rep. 23 (12), 3658-3672.e6 (2018).
  20. Ascic, E., et al. In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy. Science. 386 (6719), eadn9083(2024).
  21. Rosa, F. F., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).
  22. Rosa, F. F., et al. Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).
  23. Zimmermannova, O., et al. Restoring tumor immunogenicity with dendritic cell reprogramming. Sci Immunol. 8 (85), eadd4817(2023).
  24. Bouquet, L., et al. RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells. Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).
  25. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol. 26 (11), 1269-1275 (2008).
  26. Rojas, L. A., et al. Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer. Nature. 618 (7963), 144-150 (2023).
  27. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  28. Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells. Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).
  29. Cabrita, R., et al. Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma. Nature. 577 (7791), 561-565 (2020).
  30. Ng, K. W., et al. Antibodies against endogenous retroviruses promote lung cancer immunotherapy. Nature. 616 (7957), 563-573 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

cDC1CD45

Похожие статьи