Рабочий процесс определения характеристик нейропептидов от отбора проб до масс-спектрометрии, не зависящей от данных

Summary

Этот протокол описывает комплексный рабочий процесс нейроптидомики в тканях мозга крыс, который сочетает в себе масс-спектрометрию с независимым от данных сбором-параллельным накоплением-серийной фрагментацией (DDA-PASEF) и независимым от данных (DIA).

Abstract

Эндогенные нейропептиды являются ключевыми модуляторами функции мозга, играя важнейшую роль в поведении, стрессе, боли и гомеостатической регуляции, но их анализ остается сложным. С биологической точки зрения, они имеют низкую распространенность, быстро разлагаются и перерабатываются по-разному из белков-предшественников, при этом экспрессия ограничена небольшими локализованными клеточными популяциями. Технически их обнаружение осложняется широким динамическим диапазоном, разнообразными посттрансляционными модификациями и разреженными сигналами в наборах масс-спектрометрических данных. Этот протокол описывает комплексный рабочий процесс анализа нейропептидов в тканях мозга Rattus norvegicus с использованием как данных-зависимого сбора данных (DDA), так и дата-независимого сбора данных (DIA) масс-спектрометрии (MS) на платформе timsTOF. После оптимизированной подготовки образцов мозга, включая вскрытие, экстракцию пептидов и очистку, проводится наножидкостная хроматография (ЖХ)-МС с фракционированием газообразной фазы с ионной подвижностью для повышения чувствительности и точности обнаружения. Спектральная библиотека, созданная DDA, поддерживает количественную оценку на основе DIA в Skyline, обеспечивая измерения на уровне MS2 с высокой степенью достоверности. Этот интегрированный рабочий процесс увеличивает покрытие нейропептидов и улучшает количественную воспроизводимость, обеспечивая надежную платформу для изучения нейропептидов в сложных тканях мозга.

Introduction

Нейропептиды представляют собой функционально разнообразный класс эндогенных сигнальных молекул, которые служат важнейшими модуляторами нейронной коммуникации, функций нервной и нейроэндокринной системы. Действуя как нейромодуляторы, гормоны или ко-трансмиттеры, они влияют на широкий спектр физиологических процессов, включая модуляцию боли, реакцию на стресс, циркадную регуляцию и контроль аппетита. В отличие от классических нейротрансмиттеров, которые синтезируются в виде малых молекул, нейропептиды кодируются в крупных белках-предшественниках, которые синтезируются путем трансляции мРНК. Белки-предшественники, или прогормоны, затем подвергаются протеолитической обработке для высвобождения активных пептидов, которые упаковываются в везикулы с плотным ядром (DCV). При стимуляции нейропептиды высвобождаются для оказания модулирующего, как правило, более медленного и длительного эффекта за счет взаимодействия с рецепторами, связанными с G-белком. Их важность в поддержании функции центральной и периферической нервной системы сделала их областью интенсивного биологического и клинического интереса 1,2,3,4,5.

Несмотря на свою актуальность, нейропептиды по-прежнему сложно охарактеризовать с аналитической точки зрения. Их крайне гетерогенные структуры, варьирующиеся от коротких до протяженных последовательностей, часто несущие различные посттрансляционные модификации (ПТМ), такие как амидирование, ацетилирование, фосфорилирование, изомеризация аминокислот или усечение, приводят к изменчивости ионизации и фрагментации в масс-спектрометрии (МС)1,6,7,8 . Кроме того, они, как правило, присутствуют в низких концентрациях по отношению к компонентам биологического матрикса, легко разлагаются и локализуются пространственно ограниченным образом в сложной ткани нервной системы. Эти особенности усложняют как идентификацию, так и количественную оценку, особенно при использовании традиционных подходов протеомики, которые полагаются на предсказуемое ферментативное расщепление и однородные пептидные свойства ^9,10,11.

В данной статье мы представляем комплексную стратегию идентификации и количественной оценки эндогенных пептидов в мозге Rattus norvegicus, уделяя особое внимание нейропептидам. Рабочий процесс здесь начинается с оптимизированных процедур отбора проб мозга, за которыми следует обширное разделение с помощью жидкостной хроматографии (LC), и завершается анализом МС с высоким разрешением с использованием параллельной аккумулятивно-последовательной фрагментации (PASEF) на платформе спектрометрии подвижности захваченных ионов (TIMS) 12,13,14,15,16. Благодаря включению газофазного фракционирования с ионной подвижностью (IM-GPF) перед отбором прекурсоров, подход PASEF (DDA-PASEF), основанный на данных, позволяет улучшить разделение прекурсоров и более эффективное обнаружение нейропептидов с низкой концентрацией, многие из которых в противном случае были бы пропущены в одномерных рабочих процессах DDA^.

В то время как ДДА остается наиболее часто используемой стратегией для идентификации пептидов из-за его высококачественных спектров МС/МС, он по своей сути ограничен своей зависимостью от отбора ионов-предшественников по интенсивности, что делает предвзятым отношение к видам с низкой численностью 18,19,20. Кроме того, его полустохастическая выборка приводит к отсутствию значений в репликациях, что препятствует воспроизводимой количественной оценке. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы создали надежную спектральную библиотеку на основе данных DDA-PASEF, которая впоследствии может быть использована для анализа независимых от данных данных (DIA). В отличие от DDA, DIA отбирает все ионы-предшественники в пределах определенных m/z окон, обеспечивая последовательный отбор проб как обильных, так и редких пептидов, а в сочетании со спектральной библиотекой и целевым анализом в Skyline позволяет проводить чувствительную и воспроизводимую количественную оценку на уровне MS2 21,22,23,24.

Этот интегративный подход, охватывающий экстракцию пептидов мозга, хроматографическое разделение, получение РС с усилением подвижности ионов и гибридное количественное определение на основе DDA/DIA, был разработан с учетом сложности нейропептидов. Он максимизирует покрытие пептидов при минимизации потерь данных, устраняя ключевые ограничения более простой пептидомики, управляемой DDA. Таким образом, мы представляем собой гибкую и мощную платформу для изучения нейропептидного ландшафта в мозге млекопитающих, который может быть легко адаптирован к широкому спектру экспериментальных вопросов и образцов тканей.

Protocol

Все эксперименты на животных в этом исследовании проводились в соответствии с протоколом использования животных, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию в учреждениях штата Иллинойс (23228), со строгим соблюдением как национальных, так и ARRIVE-стандартов этичного обращения и ухода за животными.

1. Вскрытие животных и изоляция мозга

1. Выполняйте перфузию холодным физиологическим раствором сразу с последующей мгновенной заморозкой тканей для сохранения целостности нейропептида, минимизации артефактов деградации и повышения качества данных для последующего пептидомного анализа.
2. Усыпьте крысу методом CO₂ в соответствии с рекомендациями по уходу за животными в учреждении. Подтвердить смерть можно отсутствием сердцебиения и отсутствием рефлексов.
3. Положите крысу на спину; Сделайте разрез, чтобы обнажить грудную полость.
4. Сделайте небольшой разрез в левом желудочке сердца.
5. Сделайте небольшой разрез в правом предсердии, чтобы обеспечить отток крови и перфузионного раствора.
6. Введите в левый желудочек пластиковый наконечник для пипетки, прикрепленный к шприцу объемом 60 мл, наполненному 50 мл ледяного физиологического раствора (например, 0,9% физиологического раствора или мГБСС).
7. Перфузируйте тело животного раствором. Обезглавите крысу с помощью острых ножниц или гильотины.
8. Удалите кожу и череп, покрывающие мозг, с помощью ронжеров или ножниц.
9. Осторожно поднимите мозг из полости черепа, при необходимости перерезав черепно-мозговые нервы.
10. Немедленно заморозьте мозг на сухом льду или заморозьте его в охлажденном на сухом льду изопентане.
11. Переложите на маркированные криовиалы или фольгу, затем храните при температуре -80 °C.

2. Экстракция пептидов из тканей мозга крыс

1. Для образцов всего мозга быстро взвесьте каждую замороженную ткань с помощью аналитических весов. Гомогенизируйте ткань с помощью раствора класса LC-MS, содержащего 10% ледяной уксусной кислоты и 1% воды в метаноле, используя соотношение растворителя к ткани 10:1 (v/w).
2. Инкубируйте гомогенизированные образцы на льду в течение 20 минут.
3. Центрифугируйте образцы при 16 000 × г в течение 20 минут при 4 °C. Осторожно соберите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы.
4. Повторно суспендируйте гранулу в воде класса LC-MS, используя соотношение растворителя и ткани 10:1 (v/w), и повторите инкубацию на льду в течение 20 минут.
5. Снова центрифугируйте в тех же условиях (16 000 × г, 20 мин, 4 °C) и соберите вторую надосадочную жидкость.
6. Объедините оба надосадочных пласта и переведите 1/10 от общего объема в новую пробирку для последующей обработки. Высушите эту аликвоту с помощью вакуумного концентратора до полного высыхания. Оставшийся экстракт храните при температуре -80 °C для дальнейшего использования.

3. Твердофазная экстракция (SPE) с использованием спиновых колонок C18

ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворители должны быть класса LC-MS. Если не указано иное, этапы центрифугирования выполняют при температуре 1500 × g при комнатной температуре с использованием настольной центрифуги.

1. Подготовка реагентов
   1. Приготовьте раствор активации (А): 50% ацетонитрил/50% 0,1% муравьиную кислоту в воде.
   2. Приготовьте уравновешивающий и промывочный раствор (В): 0,1% муравьиной кислоты в воде.
   3. Приготовьте раствор для элюирования (С): 50% ацетонитрил/50% 0,1% муравьиной кислоты в воде.
2. Подготовка образцов
   1. Восстановите высушенный пептидный экстракт в 200 мкл раствора (В).
   2. Центрифугируйте образец при 16 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
   3. Тщательно соберите надосадочную жидкость для SPE.
3. Кондиционирование и уравновешивание колонны
   1. Добавьте 150 мкл раствора (А) в спиновую колонку C18.
   2. Центрифугируйте в течение 1 мин при 1 500 × г.
   3. Повторите шаги 3.3.1 и 3.3.2 два раза, чтобы обеспечить полную активацию.
   4. Добавьте 150 мкл раствора (В).
   5. Центрифуга в течение 1 мин.
   6. Повторите шаги 3.3.4 и 3.3.5 два раза.
4. Загрузка и промывка образцов
   1. Загрузите в колонку 200 μл приготовленного раствора образца.
   2. Центрифуга в течение 1 мин.
   3. Трижды перезагрузите проточный канал обратно на колонку, чтобы максимально сохранить пептид.
   4. Добавьте 150 мкл раствора (В).
   5. Центрифуга в течение 1 мин.
   6. Повторите шаги 3.4.4 и 3.4.5 три раза, чтобы удалить незадержанные загрязнения.
5. Элюирование пептидов
   1. Добавьте в колонку 150 мкл элюирующего раствора (С).
   2. Центрифуга в течение 1 мин.
   3. Повторите шаги элюирования 3.5.1-3.5.2 еще раз.
   4. Соедините оба элюата и храните на льду или приступайте к сушке под вакуумом.

4. Анализ ЖХ-МС/МС

1. Приготовьте раствор (А): 0,1% муравьиной кислоты в воде, раствор; (В): 0,1% муравьиной кислоты в растворе ацетонитрила; (C): 25 фмоль/мкл стандартного времени удержания (iRT) 0,1% муравьиной кислоты в воде.
2. Повторно суспендируйте образцы в 20 мкл раствора (C) перед введением LC-MS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Были проанализированы два биологических образца, и каждый из них был введен пять раз для прогонов DDA и DIA, в результате чего было получено пять технических повторений на метод на образец.
3. Разделение пептидов проводят с помощью высокоэффективной системы жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с подвижной фазой А, состоящей из раствора (А), и подвижной фазой В, состоящей из раствора (В).
4. Загрузите 1 мкл образцов в двадцать пять аналитических колонок C18 (150 мкм × 250 мм, частицы 1,9 мкм, размер пор 120 Å) и поддерживайте при температуре 40 °C в течение всего цикла.
5. Провести сепарацию ЖК при расходе 600 нл/мин с использованием следующего профиля градиента: 0-5 мин: 2-10% В; 5-85 мин: 10-45% В; 85-87 мин: 45-50% В; За этим следует высокая органическая промывка и восстановление баланса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: LC был напрямую связан с timsTOF MS через ионный источник.
6. Для анализа DDA используйте метод приложения по умолчанию DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime на timsTOF MS.
   1. Вкратце, работа масс-спектрометра в режиме PASEF с включенным динамическим исключением . Настройте каждый цикл таким образом, чтобы он состоял из 10 сканирований PASEF MS/MS в течение рабочего цикла 1,1 с.
   2. Установите диапазон масс на м/з 100-1700, а диапазон подвижности ионов от 0,60 до 1,60 В·с/^см2, используя время нарастания 100,0 мс. Увеличьте энергию столкновения от 20,0 до 59,0 эВ в зависимости от подвижности ионов.
7. Фракционирование газовой фазы с подвижностью ионов (IM-GPF)
   1. Разделите диапазон подвижности ионов 0,6-1,6 В·с/^см2 на три перекрывающихся окна: 0,6-1,0, 0,9-1,3 и 1,2-1,6 В·с/^см2.
   2. Для этого измените начальные и конечные значения мобильности в настройках TIMS timsControl или редактора timsControl на соответствующие значения окна.
   3. Получение данных для каждого окна. Для всех окон регистрации подвижности ионов используйте постоянное время накопления и нарастания 100 мс.
   4. Сбор данных в режиме DDA-PASEF с использованием тех же параметров, которые описаны в шаге 4.6.
8. Для анализа DIA используйте изолирующее окно шириной 25 м/з в диапазоне масс 400-1200 м/з. Используйте те же настройки экспериментальной ионной подвижности (IMEX), которые используются в методе DDA.
   1. Дополнительные настройки DIA включают одно нарастание MS1, за которым следует 16 MS/MS за цикл, что дает общее время цикла 1,8 с.
   2. Используйте метод протеомики DIA-PASEF по умолчанию в качестве шаблона для разработки метода DIA. После создания метода DIA загрузите его на вкладку методов Hystar. Активация режима DIA не требуется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метод DIA будет автоматически зарегистрирован после успешной загрузки.

5. Обработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора данных идентификация пептидов должна быть выполнена с использованием инструментов биоинформатики, таких как PEAKS Online, PEAKS Studio, MSFragger, Maxquant или аналогичных платформ. В этом исследовании использовался Peaks Online, способный работать с сырыми данными в формате .d.

1. Поиск по базе данных
   1. Для поиска пептидов используйте соответствующую справочную базу данных, такую как курируемая база данных сигнальных пептидов крыс, протеом крысы или протеома человека, или курируемая база данных сигнальных пептидов на основе источника образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти базы данных могут быть получены из надежных источников, таких как NCBI или UniProt (https://www.uniprot.org/). Обратите внимание, что будут идентифицированы только белки или пептиды в базе данных. Данные о сигналах крыс курировали путем фильтрации протеома крысы по аннотации «Сигнальный пептид» в UniProt. В терминах Uniprot фильтрация по «сигнальному пептиду» означает сужение протеома до белков, участвующих в секреции, локализации мембраны или компартментном транспорте. Эта пользовательская база данных содержит 5630 белков. Ограничение размера базы данных белков от 50 000 до 5 000 дает несколько преимуществ. Во-первых, это повышает уверенность в идентификации за счет снижения вероятности случайных совпадений пептид-спектра, тем самым повышая точность присвоения пептидов. Во-вторых, меньший размер базы данных повышает эффективность вычислений, позволяя сократить время обработки и снизить потребность в вычислительных ресурсах. В-третьих, более лаконичная база данных может привести к лучшему контролю над частотой ложных открытий (FDR), что приведет к более надежной и статистически устойчивой идентификации белков. Тем не менее, база данных должна быть относительно большой, чтобы избежать искусственного раздувания оценок доверия и неточной оценки FDR.
   2. Настройте поиск по базе данных в графическом интерфейсе программы со следующими рекомендуемыми параметрами: Допустимая ошибка массы прекурсора: 10-25 ppm; погрешность по массе фрагмента: 0,01-0,05 Да; ферментная специфичность: отсутствует (неспецифическое пищеварение); Диапазон длины пептидов: 4-45 аминокислот.
   3. Определите набор PTM, которые должны быть включены в поиск.
   4. После завершения поиска в базе данных экспортируйте файлы pepxml и mzXML (или MGF), соответствующие каждому окну ионной подвижности, включая стандартный полный диапазон подвижности (0,6-1,6 В·с/^см2).
2. Строительство библиотеки Skyline
   1. Откройте Skyline и создайте новый документ, убедитесь, что выбран интерфейс Proteomics , и используйте настройки по умолчанию , если не указано иное.
   2. Перейдите в раздел Файл > Импорт > поиск пептидов.
   3. В мастере поиска пептидов импорта выберите Построить и добавьте соответствующие файлы pepxml (убедитесь, что соответствующие файлы mzXML или MGF находятся в том же каталоге).
   4. Установите для стандартных пептидов iRT значение «Автоматически», выберите DIA в качестве рабочего процесса, затем нажмите «Далее».
   5. После создания библиотеки выберите примерно 10-15 пептидов в качестве стандартов iRT для выравнивания между репликами. Если появится запрос на повторную калибровку iRT, нажмите OK , чтобы продолжить.
   6. На странице «Извлечение хроматограмм» нажмите «Обзор », чтобы выбрать и импортировать все необработанные файлы DIA, затем нажмите «Продолжить».
   7. В окне Настройки перехода установите диапазон зарядов прекурсора на 1-5, диапазон зарядов продукта на 1-3, типы ионов на ,p,y,b и определите выбор ионов продукта От иона 2 до последнего иона. Другие рекомендуемые настройки: допуск ионного соответствия: 0.05 Да, пики для выбора: 5.
   8. В окне Настройки пептидов установите изменения, которые соответствуют настройке поиска Пики, описанной в пункте 4.1.3.
   9. На странице Схема изоляции введите имя изоляции и схемы и выберите Предварительно указанные окна изоляции. Нажмите « Импорт » и загрузите один из файлов DIA, чтобы автоматически импортировать конфигурацию окна изоляции эксперимента.
   10. Задайте параметры полного сканирования со следующими параметрами. Метод получения: DIA; Массовый анализатор продукта: Центроидный; Схема изоляции: Используйте схему, определенную выше; Погрешность по массе: 10-20 ppm; Разрешающая способность подвижности: 30-50; Включить параметр Использовать только сканирования в пределах 5 минут от прогнозируемого времени RT; При необходимости измените фильтрацию MS1 , если требуется импорт хроматограмм MS1. Выберите подходящий масс-анализатор и разрешение для оптимального извлечения хроматограммы MS1.
   11. Импортируйте FASTA и генерируйте ложные цели. Задайте метод генерации приманки: Shuffle Sequence.
   12. Выберите фермент: пищеварение неспецифично при эндогенном пептидном анализе. Отредактируйте фермент, выбрав «Добавить » в раскрывающемся меню ферментов. Задайте имя фермента, введите оба типа, расщепите c-конмульцу на KR и расщепите N-концевое на KR, разрешите полурасщепление и нажмите OK. Установите пропущенные декольты на 3.
   13. Импортируйте целевой файл FASTA и нажмите кнопку «Готово». При появлении запроса подтвердите страницу «Ассоциированные белки ».
   14. Убедитесь, что спектральная библиотека успешно создана и что данные DIA были импортированы. Вручную изучите список идентифицированных пептидов и приступайте к последующему количественному и качественному анализу.
3. Качественные и количественные измерения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Качественный и количественный анализ проводится в Skyline. Для получения подробной информации об анализе данных DIA в Skyline посетите https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath.
   1. Если загружены данные DDA, выберите в меню «Настройки» > «Настройка перехода », выберите «DDA » в поле «Метод сбора»; в разделе Настройки > Настройка пептида выберите уровень MS 1 для количественной оценки.
   2. Если загружены данные DIA, Настройки > Настройка перехода, выберите DIA в поле Метод сбора; в разделе Настройки > Настройка пептидов выберите уровень MS 2 для количественной оценки.
   3. В окне «Просмотр > сетке документа» выберите «Количественная оценка пептидов», а затем «Экспортировать таблицу». Объедините таблицы из результатов DDA и результатов DIA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице обобщены пиковые площади для всех пептидов в библиотеке по всем образцам. В этом эксперименте участки пептидных пиков были нормализованы до стандартного времени удержания пептида GISNEGQNASIK, который входит в смесь времени удержания Пирса. Нормализация проводилась путем вычисления отношения пиковой площади каждого пептида к стандартной.

Results

Репрезентативная экспериментальная схема показана на рисунке 1. Анализ данных DDA-PASEF (Рисунок 2), полученных с использованием как стандартного диапазона подвижности ионов, так и IM-GPF, показал значительно более высокое покрытие пептидов при подходе IM-GPF (Рисунок 2B). Примечательно, что большинство пептидов, идентифицированных с помощью стандартного метода DDA-PASEF, перекрываются с пептидами, обнаруженными в наборе данных IM-GPF. Чтобы максимизировать охват пептидной идентификации, была создана всеобъемлющая спектральная библиотека путем интеграции идентификаций из обоих подходов.

Дальнейший анализ базы данных реплицитных наборов данных, полученных с помощью DDA- и DIA-PASEF (рис. 3), с использованием курируемой базы данных сигнальных пептидов крыс, выявил 217 белков, общих для обоих методов. Кроме того, 115 белков были однозначно идентифицированы с помощью DIA-PASEF, в то время как 69 были эксклюзивными для DDA-PASEF. Исследовательский анализ с использованием спектральных библиотек, полученных на основе данных DDA и IM-GPF, показал, что DIA-PASEF позволяет уверенно обнаруживать нейропептиды, такие как NPAFLFQPQRF (нейропептид SF) и YGGFMRRVGRPEWWMDYQ (производные из проэнкефалина). Эти нейропептиды не были надежно обнаружены в соответствующих наборах данных DDA-PASEF из-за плохого присвоения пиков (рис. 3B, C).

С количественной точки зрения, диаграмма рассеяния на рисунке 4A показывает умеренную положительную корреляцию между интенсивностью предшественника DDA и интенсивностью ионов фрагмента DIA, как и ожидалось, учитывая, что оба подхода количественно оценивают одни и те же пептиды, но захватывают разные типы ионов. Ящичковые диаграммы для выбранных пептидов, показанные на рисунке 4B , дополнительно иллюстрируют воспроизводимость количественных измерений, полученных с помощью обоих подходов. Ящичковые диаграммы показывают относительные пиковые площади для каждого пептида, измеренные с помощью DIA и DDA, с полосами погрешности, представляющими изменчивость измерений между техническими репликами. Выбранные пептиды получены из опиоидных прогормонов, включая проэнкефалин (PENK) и продинорфин (PDYN), оба из которых играют центральную роль в модуляции боли и обезболивании.

Рисунок 1: Обзор рабочего процесса пептидомики для идентификации и количественного определения эндогенных пептидов из тканей мозга крыс. Рабочий процесс включает в себя диссекцию тканей, экстракцию и очистку пептидов, сбор данных LC-ION MOBILITY-MS (LC-IM-MS) с использованием газофазного фракционирования (IM-GPF), а также обработку данных для создания спектральных библиотек и выполнения количественного анализа. Части фигуры были созданы в BioRender. Тан, Ю. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Идентификация пептидов и белков в базе данных. (A) Гистограмма, сравнивающая общее количество предшественников, совпадений пептид-спектра (PSM) и уникальных пептидов, идентифицированных в различных окнах подвижности ионов. (B) Круговая диаграмма, иллюстрирующая долю пептидов, обычно идентифицируемых во всех окнах мобильности, и тех, которые однозначно обнаруживаются в пределах отдельных окон. (К,Г) Тепловые карты, отображающие распределение ионных сигналов по м/з и размерам подвижности ионов для всего диапазона подвижности (0,6-1,6 В·с/^см2) (C) и окна ограниченной подвижности (0,6-1,0 В·с/^см2) (D). (E) Диаграмма расстройства, показывающая количество белков, идентифицированных в наборах данных, полученных с использованием методов DDA и DIA, с выделением общих и уникальных идентификаций белков. (F) Тепловая карта, представляющая пептиды, полученные из предшественника проэнкефалина, идентифицированного в репликатах, полученных методом DIA (верхняя панель) и репликатах, полученных методом DDA (нижняя панель). Лей-энкефалин не был обнаружен в двух из четырех репликат DDA, что указывает на потенциальные недостающие значения при получении на основе DDA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Сравнительный и исследовательский анализ данных DDA-PASEF и DIA-PASEF с использованием спектральных библиотек . (A) Выравнивание по времени удержания нейропептида SF по репликациям DIA и DDA-PASEF. (B) EIC PENK (212-229) фрагментирует ионы из наборов данных DIA (вверху) и DDA (внизу). (C) Фрагментные ионные хроматограммы нейропептида SF из репликат DIA, демонстрирующие высокое коэлюирование и спектральное качество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Сравнение количественных измерений между DIA-PASEF (уровень MS2) и DDA-PASEF (уровень MS1). (A) Эта диаграмма рассеяния сравнивает интенсивности пептидного сигнала, полученные с использованием режимов DIA и DDA. В частности, ось x представляет собой пиковую площадь log_{10-преобразованного} предшественника от DDA, в то время как ось y показывает пиковую площадь log_{10-преобразованного} фрагмента от DIA для каждого пептида. (B) Ящичковые диаграммы представляют собой относительные пиковые площади четырех репрезентативных пептидов: PENK 107-133, PENK 188-195, PDYN 221-233 и PDYN 235-248. Полосы погрешностей представляют собой изменчивость между техническими репликами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Discussion

В пептидомике, особенно при анализе эндогенных пептидов, сохранение нативного пептидного профиля имеет важное значение для целостности данных и биологической интерпретации. Холодная перфузия солевым раствором не только удаляет кровь, но и охлаждает мозг, что значительно снижает посмертную протеолитическую деградацию, протекающую быстро из-за активности эндогенных протеаз. При снижении температуры мозга ферментативная активность замедляется, а циркулирующие протеазы вымываются из сосудистой сети, а также уменьшаются посмертные метаболические изменения^25,26. Перфузия ледяным физиологическим раствором также вымывает кровь из сосудистой сети мозга. Этот шаг особенно важен, так как кровь содержит большое количество белков (таких как альбумин и глобулины) и циркулирующие протеазы, которые могут препятствовать обнаружению нейропептидов. Посмертная деградация обильных белков крови может увеличить сложность нейропептидных экстрактов и маскировать сигналы с низким содержанием белка, что в конечном итоге ставит под угрозу как идентификацию, так и количественную оценку 25,26,27. Немедленное замораживание мозговой ткани, будь то на сухом льду или с помощью мгновенной заморозки в охлажденном изопентане, останавливает ферментативные процессы почти мгновенно. Эта сохранность особенно важна для обнаружения малораспространенных и полноразмерных зрелых нейропептидов и обеспечения надежного количественного определения. Без этих шагов деградация пептидов может привести к повышенной вариабельности и артефактам, которые ставят под угрозу как идентификацию, так и количественную оценку. Таким образом, удаление крови, холодовая перфузия и быстрое охлаждение мозга являются основополагающими методами, которые напрямую влияют на качество, чувствительность и воспроизводимость данных пептидомики перед измерениями.

Анализ пептидов, извлеченных из мозга крысы, выявил наличие двух различных шлейфов ионной подвижности (рис. 2C, D). Это явление можно отнести либо к различным молекулярным классам, либо к различным зарядовым состояниям пептидов. Если плюмы соответствуют различным молекулярным классам, то коэлюирующие непептидные виды могут конкурировать с пептидами за отбор и фрагментацию. Кроме того, если разделение происходит из-за различий в зарядовых состояниях, то можно ожидать, что шлейф, содержащий высокозаряженные пептиды, будет давать спектры MS/MS более высокого качества, способствуя более уверенной идентификации пептидов.

Чтобы исследовать это, мы реализовали стратегию фракционирования ионной подвижности, собирая данные по трем дискретным окнам подвижности: 0,6-1,0, 0,9-1,3 и 1,2-1,6 В·с/см². Эти окна в совокупности охватывают полный диапазон подвижности ионов, обычно анализируемый в стандартных экспериментах DDA-PASEF для пептидов. Как показано на рисунке 2, хотя общее количество обнаруженных прекурсоров было самым высоким в полном диапазоне сканирования (0,6-1,6 В·с/^см2), значительно большее количество совпадений пептидного спектра (PSM) наблюдалось в пределах 0,6-1,0 В·с/^см2 . Это открытие позволяет предположить, что наличие двух шлейфов действительно может быть связано с интерференцией других молекул.

Фракционирование прекурсоров на основе ионной подвижности привело к увеличению покрытия пептидов на 30% по сравнению с обычным методом полного сканирования. Примерно 82% пептидов, идентифицированных в наборе данных полного сканирования, перекрывались с пептидами, идентифицированными с помощью фракционирования (рис. 2B), что подчеркивает согласованность и надежность стратегии фракционирования. На основе этих наблюдений мы использовали фракционирование ионной подвижности и данные полного сканирования для построения спектральных библиотек для количественного анализа нейроэндокринных пептидов с использованием DIA-PASEF.

Анализ базы данных реплицированных наборов данных, полученных с помощью DDA и DIA, выявил большее количество идентификаций пептидов и белков в данных DIA, включая 115 белков, однозначно идентифицированных DIA (рис. 2E). К ним относились нейропептиды, такие как пептиды, связанные с Pro-FMRFамидом, FF и VF. В отличие от этого, 69 белков были идентифицированы исключительно с помощью DDA, многие из которых связаны с клеточной адгезией и развитием нейронов. Эти результаты свидетельствуют о том, что методологии DDA и DIA могут применяться взаимодополняющим образом для достижения более широкого охвата пептидами.

Дальнейший анализ показал, что получение DIA эффективно решает некоторые проблемы недостающих значений, часто встречающиеся при анализе эндогенных пептидов с использованием DDA. Например, лей-энкефалин был обнаружен только в двух из четырех реплик DDA (рисунок 2F, нижняя панель), в то время как он был последовательно идентифицирован во всех четырех репликациях DIA (рисунок 3F, верхняя панель).

Skyline, платформа, широко используемая для количественной протеомики, была использована для анализа наборов данных DDA и DIA-PASEF²⁸. Программное обеспечение облегчает идентификацию пептидов за счет сопоставления спектральной библиотеки, коэлюирования ионов фрагментов и выравнивания по времени удержания. Чтобы оценить способность DIA-PASEF уменьшать отсутствующую идентификацию, мы провели качественную оценку пептидов, обнаруженных исключительно в наборе данных DIA.

Как показано на рисунке 3D, нейропептид SF был последовательно обнаружен во всех репликациях DIA в течение одного и того же временного окна. Обнаружение в репликах DDA продемонстрировало значительную вариабельность, время удержания варьировалось от 25 до 45 минут (рисунок 3A). Наблюдаемые несоответствия, включая неправильные присвоения пиков с низкими показателями достоверности, вероятно, были связаны с ограниченным или некачественным покрытием фрагмент-ионов, как показано на рисунке 3B. В отличие от этого, на рисунке 3C показано, что ионы фрагментов, соответствующие нейропептиду SF, были хорошо выровнены по всем репликам DIA, что способствовало уверенной автоматической идентификации.

Сравнение спектрального качества МС/МС для пептида PENK (212-229), полученного из проэнкефалина, еще раз продемонстрировало преимущества DIA-PASEF. Спектры, полученные из DIA, показали более высокую интенсивность и улучшенное качество ионов фрагментов по сравнению с DDA (рис. 3), что особенно полезно для детектирования эндогенных пептидов с низким содержанием золота.

Количественный анализ подтвердил, что DIA-PASEF дает последовательные и воспроизводимые измерения среди биологических репликатов с эффективностью, сопоставимой с DDA (рис. 4). Кроме того, DIA позволил количественно оценить на уровне MS2, обеспечив специфичность на уровне ионов фрагментов и повышенную уверенность в идентификации пептидов по сравнению с DDA на основе MS1. Эти результаты подтверждают использование DIA-PASEF в качестве надежного и эффективного подхода к таргетному количественному определению нейропептидов в сложных биологических матрицах, особенно когда полнота и воспроизводимость данных имеют решающее значение.

В этом протоколе изложена комплексная стратегия анализа и количественного определения нейропептидов. Подход IM-GPF облегчает создание высококачественных спектральных библиотек. В то время как DIA-PASEF обеспечивает улучшенную воспроизводимость и увеличенное покрытие пептидов по сравнению с DDA-PASEF, он также улучшает количественное определение на основе MS2. Сочетание обеих стратегий получения увеличивает общий охват пептидов, поскольку каждый метод вносит уникальный вклад в идентификацию отдельных пептидов (рисунок 2E). Ограничением этого протокола является требование к обширному материалу образцов для поддержки как генерации спектральных библиотек, так и сбора данных с помощью методов DDA- и DIA-PASEF.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1% муравьиной кислоты в воде	Fisher Scientific	LS118-500	Уксусная кислота марки LC/MS
	Fisher Scientific	A11350	LC/MS марка
ацетонитрил	Fisher Scientific	AA47138K7	марки LC/MS
	Fisher Scientific	PI28905	Метанол марки LC/MS
	Fisher Scientific	AA47192K7	Марка LC/MS
nanoELute2	Bruker	N/A
Pierce C18 спиновые колонки	Fisher Scientific
Калибровочная смесь для калибровки времени удержания пептидов Pierce	Thermo Fisher	A11351	LC/MS класса SpeedVac
	Genevac	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	Конкретная модель, использованная в этом исследовании, больше не доступна у производителя. Ссылка на текущую аналогичную модель приведена для справки
timsTOF Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific	AA47146M6	Класс LC/MS