Методическая статья

SCAnED - макрос сегментации кожи с открытым исходным кодом для полуавтоматического обнаружения клеток и ядер в эпидермальных и дермальных отделах кожи

DOI:

10.3791/68746

⸱

8 августа 2025 г.

 ,  , 
1Department of Dermatology, Medical University of Vienna

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем полуавтоматический протокол для идентификации и количественного определения иммунных и неиммунных клеток в срезах кожи с помощью SCAnED, бесплатного макроса на основе ImageJ для сегментации кожи.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пространственное распределение иммунных и неиммунных клеток в тканях и экспрессия клеточно-специфических маркеров дают важную информацию о функции клеток in situ. Кожа человека является очень сложным органом с определенными компартментами, состоящими из различных клеток с различными фенотипами. С помощью мультифлуоресцентного мечения можно определить и охарактеризовать отдельные популяции клеток кожи. Тем не менее, в настоящее время доступность некоммерческих инструментов для анализа изображений образцов кожи, которые позволяют in silico сегментировать клетки конкретно в эпидермисе или дерме с разрешением одной клетки, ограничена. Здесь мы представляем пошаговый протокол иммунофлуоресцентного окрашивания участков кожи, конфокальной микроскопии и анализа изображений с использованием нашего бесплатного инструмента SCAnED (Skin Compartment Analysis of E.pidermis и D. ermis). Макрос SCAnED позволяет точно идентифицировать и классифицировать клетки и ядра как в эпидермальном, так и в дермальном отделах кожи человека. Мы предоставляем рекомендации о том, как определить средние уровни интенсивности экспрессии Maker в различных клетках и клеточных компартментах, таких как цитоплазма и ядро, а также о том, как количественно оценить клетки, экспрессирующие различное количество этих маркеров, с помощью прилагаемого конвейера Python, предоставленного в виде готового к использованию блокнота Jupyter, выполненного в Google Colab. Этот протокол позволит неопытным пользователям определить специфичные для клеток профили экспрессии в тканях кожи и даст представление о пространственном распределении клеток в эпидермальном и дермальном компартментах, что позволит глубже понять сложную структуру тканей и клеточный состав кожи человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание тканей кожи на клеточном уровне и распознавание клеточных фенотипов, морфологии и их локализации как в эпидермальном, так и в дермальном компартментах имеют решающее значение в дерматологических исследованиях и гистопатологии 1,2. Клеточный состав эпидермиса, охватывающий кератиноциты, меланоциты и клетки Лангерганса в здоровых условиях, становится сильно дисбалансированным при воспалительных заболеваниях кожи и раке. Более того, фенотип и локализация клеток в дерме, расположенной под эпидермисом и содержащей фибробласты и большинство иммунных клеток, могут значительно меняться при заболевании. Следовательно, сегментация клеток и ядер является обязательным условием для оценки клеточных характеристик, таких как количество клеток, экспрессия белка, морфология и пространственная организация, а также характеристик ядра, таких как размер, форма и экспрессия факторов транскрипции, тем самым способствуя пониманию гомеостаза кожи и заболеваний 3,4,5.

Несмотря на наличие универсальных платформ для анализа изображений, таких как QuPath6, CellProfiler7 и ilastik8, эти инструменты часто требуют обширной настройки и написания сценариев для адаптации к структурной сложности и гетерогенной клеточной морфологии кожной ткани. Лишь немногие инструменты были специально разработаны для автоматизированной сегментации эпидермальных и дермальных компартментов, а многие доступные решения являются коммерческими и не находятся в свободном доступе. Эти ограничения затрудняют для неспециалистов внедрение эффективных конвейеров для анализа, специфичного для кожи.

В этой статье мы представляем комплексный протокол анализа клеток и ядер в тканях кожи и ее компартментах, охватывающий все жизненно важные этапы от окрашивания тканей до анализа изображений с использованием нашего полуавтоматического конвейера анализа изображений. Мы начнем с подробной информации об иммунофлуоресцентном окрашивании тканей кожи, включая окрашивание E-кадгерином для сегментации эпидермиса/дермы и 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для обнаружения клеток/ядер. Два представляющих интерес маркера, Vimentin (VIM) и CD90, были включены для целей валидации. Мы рекомендуем использовать антитела в оптимизированных концентрациях (см. Таблицу 1) и получать изображения с помощью конфокальной микроскопии с постоянными настройками интенсивности лазера, времени экспозиции и разрешения для обеспечения воспроизводимости.

Кроме того, мы представляем наш специально разработанный макро SCAnED ImageJ9 , который расшифровывается как Skin Compartment Analysis of E.pidermis и D.ermis, и мы обеспечиваем все необходимые шаги для сегментации in silico и обнаружения ядер и клеток как в эпидермисе, так и в дерме. Пользователи могут выбрать один из двух различных методов обнаружения ядер, используя либо простой и быстрый порог, либо инструмент глубокого обучения StarDist10 и нашу обученную модель кожи, прежде чем продолжить работу с протоколом SCAnED. В отличие от общих инструментов, SCAnED был разработан специально для гистологии кожи и превосходит их, обеспечивая автоматическую компартментализацию эпидермальных и дермальных областей и интегрированную количественную оценку нескольких маркеров в обеих областях. Это особенно полезно для исследователей, которым не хватает опыта в программировании или глубоком обучении, предлагая готовый к использованию инструмент, предназначенный для анализа изображений кожи.

Кроме того, мы показываем, как извлекаются средние уровни интенсивности для каждой клетки из иммунофлуоресцентных изображений до пяти различных маркеров, представляющих интерес. Наконец, мы предоставляем код на Python для статистического анализа полученных данных из одной ячейки, записанных и выполненных в GoogleColab 11 и опубликованных в виде блокнота Jupyter. Наш протокол и макрос SCAnED направлены на то, чтобы предоставить исследователям кожи, не имеющим продвинутых знаний в области иммунофлюоресценции и вычислительной техники, практический инструмент для маркировки и полуавтоматического количественного определения клеток и экспрессии маркеров в коже человека, уделяя особое внимание эпидермальному и дермальному компартментам.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Иммунофлуоресцентное мечение E-кадгерина, VIM и CD90 и ядерное окрашивание DAPI в срезах кожи, залитых парафином

ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе указаны шаги для секций, залитых парафином. Для свежих и замороженных образцов тканей зафиксируйте срезы ткани и перейдите к шагу 1.3 протокола.

  1. Растопите парафин с помощью вентилятора или духовки.
  2. Регидратируйте секции путем пропускания через дифференцированные спирты с повышенным содержанием воды (например, ксилол → 100% этанола → 85% этанола → 70% этанола → воде).
  3. Выполните этапы извлечения антигенов в соответствии с антигенами.
  4. Пермеабилизируйте срезы тканей 0,3% Triton X в PBS (3 x 20 мин) (см. Таблицу 2).
  5. Вымойте слайды с помощью PBS (1 x 5 мин).
  6. Обведите каждый образец гидрофобным маркером для слайдов, чтобы предотвратить утечку жидкости и свести к минимуму объем реагентов, и дайте высохнуть.
  7. Применяют первичные антитела (буфер для Abs: PBS + 2% BSA) (см. Таблицу 1 и Таблицу 2). Поместите предметные стекла во увлажненный камерный бокс (влажный бокс) и выдержите в течение ночи.
  8. Промойте предметные стекла с 0,3% Triton X в PBS (3 x 5 мин).
  9. Удалите излишки моющего средства, вымыв предметные стекла PBS (1 x 5 мин).
  10. Применяют вторичные антитела и козью сыворотку (см. Таблицу 1). Высиживайте предметные стекла в темном месте в течение 1 ч.
  11. Промойте предметные стекла с 0,3% Triton X в PBS (3 x 5 мин).
  12. Удалите излишки моющего средства, вымыв предметные стекла PBS (1 x 5 мин).
  13. Добавьте DAPI для окрашивания ядер (см. табл. 1). Выдержать горки в темном месте в течение 30 минут.
  14. Промойте предметные стекла с 0,3% Triton X в PBS (3 x 5 мин).
  15. Вымойте слайды с помощью PBS (1 x 5 мин).
  16. Нанесите по 1 капле (~5-15 μл) флуоресцентного монтажного средства на каждый образец и осторожно установите покровные стекла (при необходимости удалите пузырьки). Дайте предметным стеклам высохнуть в темноте.
Антитела и красителиРабочая концентрацияРазбавление
антитела к виментину0,8 мкг/мл1:50
антитела к Е-кадгерину1 мкг/мл1:333
антитела к CD901:1000
Антимышь AF4881:500
AF568 антикроличья1:500
Антимышь AF6471:500
DAPI1 мкг/мл

Таблица 1: Антитела и краситель.

1. Буфер для окрашивания
РеагентКонечная концентрацияКоличество
БСА2%1 г
ПБС1x50 мл
Итогн/д50 мл
2. Буфер пермеабилизации
РеагентКонечная концентрацияКоличество
Тритон Х0.30%300 μл
ПБС1x100 мл
Итогн/д100 мл

Таблица 2: Рецепты растворов.

2. Конфокальная визуализация

Примечание: Для этого протокола был использован конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, оснащенный 10-кратным объективом (NA 0,4) и 4 лазерными линиями (405 нм, 488 нм, 561 нм, 640 нм).

  1. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа (см. пример изображения на рисунке 1).
  2. Используйте следующий параметр размера сканирования для создания макроса, обучения модели StarDist и, в идеале, для получения изображения: Размер изображения = 4,096 x 4,096 пикселей (или 1,273 x 1,273 микрона), битовая глубина = 16-бит, минимальный размер пикселя = 0,3 микрона, отношение сигнал/шум (SNR) = минимум 3.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Иммунофлюоресцентное окрашивание участка кожи. DAPI: помечает ядра, CD90: маркер фибробластов, E-кадгерин: используется для маркировки эпидермиса, VIM: клетки, экспрессирующие VIM, Merge: слияние DAPI (пурпурный), CD90 (синий), E-кадгерин (желтый) и окрашивание VIM (зеленый). Масштабные линейки = 100μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Анализ изображений с помощью макроса SCAnED (Дополнительный файл 1, Дополнительное видео S1 и Дополнительное видео S2)

  1. Запустите макрос (SCAnED.mp4 фильм).
    1. Откройте иммунофлуоресцентные изображения в Fiji/ImageJ с использованием био-форматов с настройками по умолчанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не разделяйте каналы на этом шаге.
    2. Загрузите и запустите макрос SCAnED, перейдя в раздел Плагины | Макросы | Запустите и выберите макроскрипт SCAnED (Дополнительный файл 1).
    3. Следуйте пошаговым инструкциям на экране, предоставленным макросом.
  2. Сегментация эпидермиса и дермы in silico с помощью макроса SCAnED.
    1. Выберите канал E-кадгерина при появлении запроса.
    2. Настройте порог вручную, перейдя в раздел Изображение | Настройка | Порог и нажмите OK для канала E-кадгерина для полного захвата эпидермальной области.
    3. При необходимости подтвердите шаг Flood Fill, чтобы закрыть пробелы в маске E-cadherin, выбрав значок инструмента Flood Fill Tool на ImageJ, щелкнув по верхней части эпидермиса и нажав OK (Дополнительный рисунок S1A-E и советы по устранению неполадок в разделе обсуждения).
    4. Если маска инвертирована, выберите «Да » и «ОК» при появлении запроса на инвертирование выделения; в противном случае выберите «Нет » и «ОК» (см. дополнительный рисунок S1F,G и советы по устранению неполадок в разделе обсуждения).
    5. Выберите канал DAPI при появлении запроса. Изображения ядер до и после эпидермально-дермальной сегментации показаны на рисунке 2.
  3. Сегментация ядер с помощью пороговой функции
    1. Автоматическое определение уровней интенсивности.
  4. Сегментация ядер с помощью StarDist
    1. Откройте StarDist в ImageJ (рис. 3).
    2. Загрузите модель обнаружения ядер (дополнительный файл 2) в графический интерфейс StarDist (рисунок 4). Соответствующая обучающая пара для создания модели StarDist показана на дополнительном рисунке S2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При возникновении ошибки StarDist для этой модели следует использовать тензорный поток версии 1.15 (см . дополнительный рисунок S3).
    3. Сначала нажмите на канал ядра.
    4. Отрегулируйте настройки плитки соответствующим образом (убедитесь, что количество плиток соответствует ожидаемому размеру патча (256 x 256 пикселей) (см. Рисунок 3 и Рисунок 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация StarDist может занять некоторое время в зависимости от количества ядер.
  5. Измерение интенсивности и количественная оценка ядерных белков
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед запуском SCAnED перейдите в раздел Анализ | Установите Measurement (Измерения) и настройте параметры для обеспечения точного и актуального вывода данных (рис. 5).
    1. При появлении запроса выберите Да , чтобы измерить интенсивность маркеров в ядрах.
    2. Выберите подходящий канал маркера (возможно до пяти).
    3. Сохраните результаты в виде файлов CSV в соответствии с инструкциями макроса.
    4. Повторите для каждого канала.
    5. После обработки всех каналов сохраните результаты в виде файлов CSV в соответствии с инструкциями макроса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей визуализации мы включили увеличенное изображение определенной области кожи в оставшуюся часть анализа (Рисунок 6).
  6. Сегментация клеток (цитоплазматическая область)
    Примечание: Сегментация клеток основана на расширении ядерной ROI и поэтому должна быть начата после сегментации ядер.
    1. После того как пороговая функция была использована для сегментации ядер, примените бинарную дилатацию.
    2. Если StarDist используется для сегментации ядер, используйте расширение увеличения, которое имеет более длительное время обработки (см . дополнительный рисунок S4).
  7. Измерение интенсивности и количественная оценка цитоплазматических белков
    1. Выберите Да , чтобы измерить интенсивность маркеров во всех ячейках.
    2. Сохраните полученные CSV-файлы в соответствии с инструкциями макроса.
    3. Повторите для каждого маркерного канала по порядку.
    4. Сохраняйте одинаковый порядок каналов для измерений ядра и клетки, чтобы обеспечить согласованность выходных данных.
    5. Выберите «Отбросить » всякий раз, когда макрос подает запрос, чтобы избежать смешивания данных ядер между эпидермисом и дермой. На рисунке 7 показаны все этапы сегментации на основе пороговых значений.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Канально-специфический анализ ядер и разделение в эпидермальных и дермальных ядрах. Иммунофлуоресцентное окрашивание DAPI демонстрирует морфологию и пространственное распределение ядер во всей коже (левое изображение). Представление ядра эпидермальных каналов, окрашенных DAPI, дает представление о распределении ядер в эпидермальном компартменте (среднее изображение). Представление ядровых каналов дермальных ядер, окрашенных с помощью DAPI, обеспечивает визуализацию распределения ядер в дермальном отделе (изображение справа). Масштабные линейки = 100μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Использование опции "StarDist". Скриншот, показывающий расположение опции "StarDist 2D" в меню/Плагины/StarDist/StarDist 2D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-4
Рисунок 4: Инструкции по использованию модели обнаружения ядер. Скачайте файл "nuclei_detection_model.zip" и укажите путь к нему в разделе "Обзор ". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-5
Рисунок 5: Настройка параметров измерений. (A) Скриншот, показывающий расположение опции Set Measurement в меню, позволяющей настраивать параметры измерений для последующего анализа. (B) Установите окно Измерения , отображающее интерфейс для настройки параметров измерений, позволяющий пользователям задавать параметры для сбора и анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-6
Рисунок 6: Увеличенное изображение определенной области. (A) Слияние окрашивания DAPI (пурпурный) и VIM (зеленый). (B) Увеличенное изображение определенной области из точки А, обеспечивающее детальную визуализацию экспрессии VIM в тканях кожи. Обратите внимание на различную морфологию ядер в эпидермисе и дерме. Масштабные линейки = 100 μм (А), 20 μм (В). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-7
Рисунок 7: Сегментация SCAnED в эпидермисе и дерме для ядер и клеток с использованием порога. (A) Все изображение: Слияние окрашивания DAPI (пурпурный) и VIM (зеленый). Верхняя часть: (B) Слияние ядер эпидермиса, окрашенных DAPI и VIM после разделения. (В) Маскировка эпидермальных ядер с помощью порога. (D) Сегментация ядер эпидермиса с наложением на слияние DAPI и VIM, что способствует визуализации распределения ядер в эпидермальном компартменте. (E) Сегментация клеток ядра эпидермиса, наложенная на слияние DAPI и VIM, помогающая в визуализации распределения ядер в эпидермальном компартменте с помощью порога и расширения, поскольку это показывает, что область отбора больше, чем ядра. Нижняя часть: (F) Слияние дермальных ядер, окрашенных DAPI и VIM после разделения. (G) Маскировка дермальных ядер с помощью порога. (H) Сегментация ядер дермальных ядер, наложенная на слияние DAPI и VIM, способствующая визуализации распределения ядер в дермальном компартменте. (I) Сегментация клеток дермальных ядер, наложенная на слияние DAPI и VIM, способствующая визуализации распределения ядер в дермальном компартменте. Масштабные линейки = 20 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Классификация и визуализация извлеченных данных по отдельным ячейкам (Дополнительное видео S3)

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый маркер иммунофлюоресценции генерирует два файла CSV: один для эпидермального компартмента и один для дермального компартмента.

  1. Установите пороговые значения интенсивности, специфичные для маркеров, с помощью контрольных образцов изотипа.
    1. Импортируйте выходные файлы CSV, созданные макросом SCAnED, в Google Colab с помощью предоставленного блокнота Jupyter. Сначала скачайте соответствующий Jupyter Notebook (например, Supplemental File 3 или Supplemental File 4), перейдите в Google Colab (https://colab.research.google.com/), нажмите File, откройте блокнот, выберите файл, запустите ячейки кода одну за другой. Когда появится запрос « Выбрать файлы», нажмите кнопку и загрузите файл .csv.
    2. Для каждого антитела рассчитайте среднюю интенсивность флуоресценции по контрольным изотипам. Чтобы определить пороговое значение для каждого антитела, откройте блокнот DotPlot (дополнительный файл 4), загрузите соответствующий файл управления изотипом и запустите код.
    3. Основываясь на распределении точек на графиках контроля изотипа и специфических антител, выберите подходящий порог интенсивности для отделения фона (контроль изотипа) от сигнала (специфическое окрашивание). Используйте эти значения в качестве пороговых значений, чтобы классифицировать отдельные ячейки как положительные или отрицательные для экспрессии маркеров.
  2. Сравните интенсивность маркеров в экспериментальных образцах с рассчитанными пороговыми значениями.
    1. Классифицируйте клетки с интенсивностью ≥ порогом как положительные.
    2. Классифицируйте клетки с интенсивностью < пороге как отрицательные.
    3. Классифицируйте субпопуляции на основе комбинаций экспрессии маркеров, например, идентифицируйте популяции клеток с одним положительным, двойным положительным или тройным положительным результатом.
  3. Визуализируйте распределение и взаимосвязи экспрессии маркеров с помощью двух типов графиков:
    1. Создавайте гистограммы и накладывайте гистограммы для сравнения распределения интенсивности между условиями (например, контрольная и больная кожа), запустив код гистограммы (загрузите дополнительный файл 3, перейдите в Google Colab (https://colab.research.google.com/), нажмите «Файл», откройте блокнот, выберите файл, запустите код) (рис. 8).
    2. Создание точечных диаграмм для моделирования диаграмм рассеяния в стиле проточной цитометрии для оценки шаблонов коэкспрессии с помощью кода DotPlot (загрузите дополнительный файл 4, перейдите в Google Colab (https://colab.research.google.com/), нажмите «Файл», откройте записную книжку, выберите файл, запустите код) (рисунок 9).
    3. Экспорт обработанных данных для дополнительного анализа и оценки существенных различий с помощью статистических тестов.

figure-protocol-8
Рисунок 8: Наложенная гистограмма, сравнивающая среднюю интенсивность VIM-положительных клеток. Наложение гистограммы, сравнивающее среднюю интенсивность клеток VIM в здоровых образцах (H) в синем цвете и образцах псориаза (P) в оранжевом цвете дермы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-protocol-9
Рисунок 9: Двойные положительные сигналы на точечной диаграмме. Демонстрация точечной диаграммы с двойным окрашиванием, которая может помочь в лучшей визуализации популяций с одинарным положительным результатом, двойным положительным результатом и двойным отрицательным результатом. В этом примере показано двойное окрашивание CD90 и VIM в дерме (А) здоровой и (В) псориазной кожи, а также в эпидермисе (С) здоровых и (D) псориазных образцов кожи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В предыдущем исследовании мы успешно использовали SCAnED для обнаружения и количественного определения клеток и уровней экспрессии лизилоксидазы (LOX), цитоплазматического белка, и фактора транскрипции, индуцируемого гипоксией 1 (HIF-1) в клетках дермы кожичеловека12 , что подчеркивает применимость этого инструмента для исследований кожи.

Для дальнейшей оценки точности нашего макроса сегментации кожи при идентификации клеток и ядер в эпидермальном и дермальном компартме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол SCAnED представляет собой полуавтоматический метод компартмент-специфичного анализа как иммунных, так и неиммунных клеток в тканях кожи человека. Рабочий процесс включает в себя протокол окрашивания на основе E-кадгерина для обеспечения сегментации эпидермиса и дермы, обнаружения ядер и клеток на основе DAPI с последующей количественной оценкой экспрессии маркеров в ядрах и клетках с помощью нашего макроса на основе ImageJ. Кроме того, мы проводим пользователей через анализ наше...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка этого конвейера анализа изображений финансировалась Land Niederösterreich в рамках Дунайского кластера исследований аллергии и Fellinger Krebsforschung.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,3% Triton X Сигма-ОлдричT9284
BSA (бычий сывороточный альбумин)Сигма Олдрич
CD90Клеточная сигнализацияD3V8A
DAPI Рош10236276001
Деионизированная вода
E-cadherin AbcamAB1416
Флуоресцентная монтажная среда  ДакоS3023
Козла против мышей IgG1 с перекрёстно адсорбированным вторичным антителом, Alexa Fluor 488  (AF 488 антимышиный сигнал)Термо Фишер СайентификA-21121
Козла против мышей IgG2a с перекрёстно адсорбированным вторичным антителом, Alexa Fluor 647 (AF 647 против мышей)Термо Фишер СайентификA-21241
Козий антикроликовый антител IgG (H+L) с перекрёстно адсорбированным вторичным антителом, Alexa Fluor 568 (AF 568 против кроликов)Термо Фишер СайентификA-11011
Козья сыворотка Agilent Technologies и OUML; sterreich GmbH, DakoX0907
PBS Gibco14190-094
Vimentin ДакоM7020
<прочные>материалы
Камера (мокрая коробка)
Coverslips Термо Фишер
Жидкоотталкивающая слайд-маркерная ручка для окрашивания (гидрофобных) Дайдо СангёZ37782124x50мм
<Сильные>Решения
Буфер проницаемости (0,3% Triton X в PBS) См. таблицу 2
Буфер для окрашивания (2% BSA в PBS) См. таблицу 2
<сильно>программное обеспечение и наборы данных
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп и nbsp;ОлимпFV3000 на базе инвертированного IX83оснащён объективом 10x (NA 0.4), 4 лазерными линиями (405 нм, 488 нм, 561 нм, 640 нм, когерентный)
Фиджи (ImageJ) V1.54 часа
Google ColabGoogle
GraphPad Prism GraphPad Software Inc.Призма 10для дальнейшего статистического анализа
ОРЕОЛIndica Labs
Программа на PythonPython 3.11.12
QuPathоткрытое программное обеспечение (Bankhead, P. и др., https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5)v0.5.1
StarDistУстановите версию процессора TF1.15.0

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lichtenberger, B. M., Kasper, M. Cellular heterogeneity and microenvironmental control of skin cancer. J Intern Med. 289 (5), 614-628 (2021).
  2. Watt, F. M. Mammalian skin cell biology: at the interface between laboratory and clinic. Science. 346 (6212), 937-940 (2014).
  3. Bergstresser, P. R., Pariser, R. J., Taylor, J. R. Counting and sizing of epidermal cells in normal human skin. J Invest Dermatol. 70 (5), 280-284 (1978).
  4. Régnier, M., Patwardhan, A., Scheynius, A., Schmidt, R. Reconstructed human epidermis composed of keratinocytes, melanocytes and Langerhans cells. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 821-824 (1998).
  5. Régnier, M., Staquet, M. J., Schmitt, D., Schmidt, R. Integration of Langerhans cells into a pigmented reconstructed human epidermis. J Invest Dermatol. 109 (4), 510-512 (1997).
  6. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  7. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biol. 16 (7), e2005970(2018).
  8. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018. Frangi, A., Schnabel, J., Davatzikos, C., Alberola-Lopez, C., Fichtinger, G. 11071, Springer. Cham. Lecture notes in Computer Science 265-273 (2018).
  11. Google Colab. , Google. https://colab.research.google.com/ (2025).
  12. Balsini, P., et al. Stiffness-dependent lysyl oxidase regulation through hypoxia-inducing factor 1 drives extracellular matrix modifications in psoriasis. J Invest Dermatol. 1145 (7), 1653-1669.e10 (2024).
  13. Mahrle, G., Bolling, R., Osborn, M., Weber, K. Intermediate filaments of the vimentin and prekeratin type in human epidermis. J Invest Dermatol. 81 (1), 46-48 (1983).
  14. de Waal, R. M., Semeijn, J. T., Cornelissen, M. H., Ramaekers, F. C. Epidermal Langerhans cells contain intermediate-sized filaments of the vimentin type: an immunocytologic study. J Invest Dermatol. 82 (6), 602-604 (1984).
  15. Bata-Csorgo, Z., Hammerberg, C., Voorhees, J. J., Cooper, K. D. Flow cytometric identification of proliferative subpopulations within normal human epidermis and the localization of the primary hyperproliferative population in psoriasis. J Exp Med. 178 (4), 1271-1281 (1993).
  16. Nakamura, Y., et al. Expression of CD90 on keratinocyte stem/progenitor cells. British Journal of Dermatology. 154, 1062-1070 (2006).
  17. Wetzel, A., et al. Increased neutrophil adherence in psoriasis: role of the human endothelial cell receptor Thy-1 (CD90). J Invest Dermatol. 126 (2), 441-452 (2006).
  18. RRID:SCR_018350. , Indica Labs. https://www.indicalab.com/halo/ (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

StarDist

Похожие статьи