Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Получение мейотических хромосомных спредов из ооцитов мышей для оценки синапсоса и рекомбинации

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68749

⸱

18 июля 2025 г.

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

В этой статье

Краткое содержание

Мейотические ошибки в синапсах и рекомбинации являются общими для ооцитов млекопитающих. Тщательный анализ белков, участвующих в этих процессах, необходим для понимания того, как и почему оогенез часто идет не так. Представленные здесь методы позволяют проводить всесторонний мониторинг рекомбинации и синапсов для оценки качества ооцитов у мышей.

Аннотация

Три критических и взаимозависимых процесса определяют мейотическую профазу I: гомологичные хромосомы должны соединяться друг с другом, белковая структура, называемая синаптонемным комплексом, образует для связывания гомологов вместе (синапсис), а гомологи подвергаются рекомбинации, взаимно обмениваясь генетическим материалом с образованием кроссинговеров (СО). Ошибки в этих процессах могут привести к преждевременной недостаточности яичников, анеуплоидии и, в конечном итоге, потере беременности и бесплодию. Мейотическая рекомбинация особенно подвержена ошибкам в ооцитах: более 7% ооцитов человека содержат по крайней мере одну пару хромосом без кроссинговера, и от 20% до 80% яйцеклеток против 2,5-7% сперматозоидов являются анеуплоидными. Тем не менее, остается неясным, почему хромосомные аномалии демонстрируют такие поразительные половые различия. В настоящем протоколе описаны методы получения и анализа распространения хромосомы профазы I и метафазы I ооцитов от эмбриональных и ювенильных мышей соответственно. Чтобы проследить критическую динамику хромосом на протяжении мейотической профазы I, в этом протоколе используется иммунофлуоресцентное окрашивание общих маркеров мейотической рекомбинации (RAD51 для двухцепочечных разрывов, MSH4 для промежуточных CO и MLH1/MLH3 для идентификации большинства CO) и синапсов (SYCP3 для осей хромосом, SYCP1 для синапсов и HORMAD1 для азинапсов). Кроме того, в этом протоколе используется созревание in vitro собранных ооцитов для оценки количества парных хромосом (бивалент) и общего числа кроссинговеров (хиазмат) в метафазе I. Вместе эти методы обеспечивают всестороннюю и количественную основу для изучения механизмов, регулирующих раннюю динамику хромосом при женском мейозе.

Введение

Мейоз — это специализированное деление клеток, необходимое для производства гаплоидных гамет. Во время профазы I гомологичные хромосомы (каждая из которых состоит из сестринских хроматид, удерживаемых вместе когезином) должны выполнять три важнейшие задачи: 1) распознавать и спариваться друг с другом, 2) соединяться друг с другом, образуя синаптонемный комплекс (SC) между своими боковыми осями, и 3) обмениваться ДНК посредством гомологичной рекомбинации, что приводит к кроссоверам (СО) между несестринскими хроматидами 1,2. Физическая связь, возникающая в результате формирования кроссинговера, поддерживаемая когезином, обеспечивает правильную биориентацию хромосом и сегрегацию во время метафазы I 3,4,5.

Мейотическая профаза I состоит из пяти стадий, каждая из которых определяется статусом синапса6. При лептонеме (в переводе с греческого «тонкая нить») хромосомы конденсируются по мере того, как осевой элемент (обозначенный SYCP3) формируется вдоль осей хромосом. Во время зигонемы (соединенных нитей) гомологи начинают синаптически по мере того, как поперечный элемент SC (SYCP1) образуется между осями7. У пахинемы (толстой нити) хромосомы синапсированы по всей длине. Затем СК разбирается во время диплонемы (два потока), оставляя гомологи соединенными только в местах кроссинговера (хиазматы). Хиазматы являются продуктом гомологичной рекомбинации, процесса, инициированного запрограммированной индукцией двухцепочечных разрывов ДНК (DSB). Из сотен DSB только ~10% становятся CO. У мышей большинство (90%-95%) образуется через путь CO класса I, которому способствует MutLγ (MLH1-MLH3), а остальные CO, образующиеся через MUS81-EME1, через путь CO класса II 8,9,10,11.

Спаривание, синапс и рекомбинация являются строго регулируемыми и взаимозависимыми процессами. Ошибки обычно запускают механизмы контрольных точек, что приводит к гибели клеток. У женщин потеря зародышевых клеток из-за ранних ошибок профазы I может вызвать преждевременную недостаточность яичников12,13, в то время как поздние ошибки (например, неспособность гомологов образовывать СО, неправильное размещение СОв или преждевременная потеря когезина) могут привести к промаху хромосом и анеуплоидии. У людей мейотические ошибки являются основной причиной потери беременности и бесплодия. Женский мейоз особенно подвержен ошибкам. Около 20-80% человеческих яйцеклеток (по сравнению с 2,5-7% сперматозоидов) несут аномальное количество хромосом, большинство из которых являются результатом ошибок в первом мейотическом делении 14,15,16,17. Несмотря на то, что возраст был определен как единственная основная причина анеуплоидии у матерей, причина, по которой ооциты так восприимчивы к ошибкам, остается неясной.

Несмотря на важность понимания факторов, лежащих в основе высокой частоты ошибок в ооцитах, большая часть наших знаний о регуляции событий профазы I получена из исследований мужского мейоза. Поскольку небольшой фрагмент материала яичек взрослого человека предоставляет достаточный материал для оценки всех стадий мейотических и постмейотических половых клеток, мужской мейоз долгое время был более доступен для исследователей. В отличие от него, женский мейоз протекает прерывисто. У мышей профаза I прогрессирует полусинхронно в яичнике плода, начиная примерно через 14 дней после коитума (dpc; Рисунок 1A), вскоре после определения пола в гонадах 18,19,20. Примерно во время рождения яйцеклетки вступают в процесс остановки диктиата до месяцев овуляции (у мышей) или десятилетий (у людей) 21,22,23. Следовательно, специфические стадии профазы I доступны только в течение ограниченных окон развития (рис. 1A), при этом события после профазы I происходят только в нескольких ооцитах одновременно у ювенильных и взрослых особей. Несмотря на то, что технический прогресс улучшил исследования мейоза ооцитов млекопитающих, эти методы остаются сложными и трудоемкими по сравнению с аналогичными методами, используемыми в исследованиях у мужчин.

Женский мейотический анализ еще больше осложняется ограничением в подстадировании пахитеновых ооцитов, что имеет решающее значение для изучения назначения кроссинговера и созревания. Мужские исследования выигрывают от хорошо описанной динамики спаривания половых хромосом и наличия гистонового варианта H1t, который служит маркерами ранней, средней и поздней пахинемы 24,25,26. Тем не менее, не было формализовано надежного метода для субстадирования пахитеновых ооцитов.

Представленные здесь протоколы облегчают всесторонний анализ синапсов и рекомбинации в ооцитах мышей от ранней профазы I до метафазы I. Эта работа основана на классических методах распространения хромосом, разработанных Peters et al.27 и Tarkowski28 , а также на более ранних усовершенствованиях этих методов Hunt29 и Sun and Cohen30. Этот протокол был разработан для того, чтобы подчеркнуть: 1) обогащение и идентификацию специфических подстадий профазы I, 2) максимизацию количества выполненных аппликаций на пару фетальных яичников и 3) тщательные, доступные метрики для оценки дефектов синапсов и рекомбинации из очагов в хиазмы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры по обращению с животными и их обработке были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Корнелльского университета (IACUC) в соответствии с протоколом 2004-0063.

1. Приготовление профазы I хромосомы ооцита слайдом

  1. Ближе к вечеру организуйте спаривание самок мышей C57BL/6J (в возрасте от 2 до 6 месяцев) с самцами (в возрасте от 2 до 12 месяцев). Начиная со следующего дня, проверяйте самок каждое утро (до 9 утра) на наличие копулятивной пробки. Полдень в день установки вилки определяется как 0,5 dpc.
  2. Приготовьте следующее, прежде чем приносить в жертву беременных мышей.
    1. Установите увлажненную камеру с комнатной температурой H2O.
    2. Приготовьте 10 мл гипотонического экстракционного буфера (HEB; см. таблицу 1), состоящего из 30 мМ Tris-HCl, 50 мМ сахарозы, 17 мМ цитрата натрия, 5 мМ ЭДТА, 2,5 мМ DTT и 0,5 мМ PMSF в воде Milli-Q. Перед добавлением DTT и PMSF отрегулируйте pH до 8,2 - 8,4, используя 50 мМ борной кислоты. Сделайте HEB свежим и используйте в течение 2 часов после добавления DTT.
    3. Приготовьте 100 мМ сахарозы, добавив 342 мг сахарозы к 10 мл сверхчистого H2O. Хранить при температуре 4 °C, когда она не используется.
    4. Разогрейте сверхчистый H2O в стандартной микроволновой печи в течение 1 минуты (до 90 - 95 °C). Под вытяжной шкаф добавьте нагретый ультрачистый H2O к 0,5 г параформальдегида (PFA). Добавьте две капли 1 N NaOH, перемешайте вортекс и дайте остыть до комнатной температуры. Отрегулируйте pH до 9,2 - 9,3 с помощью 50 мМ борной кислоты и добавьте Triton X-100 до 0,15 % (v/v). Добавьте сверхчистый H2O в конечный объем 50 мл (1% раствор фиксатора PFA) и налейте фиксатор в стеклянную баночку для окрашивания Coplin объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был оптимизирован с использованием воды, близкой к кипящей, для приготовления PFA; однако нагревание PFA в растворе выше 65 °C может привести к разложению и выделению токсичных паров. В качестве альтернативы можно разогреть сверхчистый H2O до 60 °C на водяной бане.
    5. Очистите стекла предметного стекла микроскопа с содержанием этанола 70%. С помощью гидрофобного барьерного пера PAP нарисуйте до трех квадратов (примерно 20 x 20 мм; см. рисунок 1E). Одна пара завязей обеспечит достаточный материал для шести квадратов (или двух слайдов по 3 квадрата каждый).
  3. Умерните беременных мышей от 14,5 - 18,5 dpc от удушья CO2 и вывиха шейки матки в соответствии с рекомендациями IACUC.
    1. Временные точки для обогащения конкретных стадий профазы I у мышей C57BL/6J показаны на рисунке 1A. Для данных временных точек развития приблизительный процент ооцитов на каждой стадии профазы I был предоставлен с использованием данных Evans et al. (1982)31. Для зиготеновых ооцитов собирают по 16,5 дпк; ранний пахитен на 17,5 dpc; и среднепахитеновый - диплотен при 18,5 дпк.
  4. С помощью ножниц для вскрытия брюшной полости и удаления маточных рогов следует использовать ножницы.
  5. Препарируйте плод мышей из маточного рога, децидуальной ткани и желточного мешка. Поместите эмбриональных мышей в чашку Петри диаметром 100 мм с 1x фосфатным буферным раствором (PBS).
  6. Препарируйте яичники одного плода женского пола за раз, сохраняя остальные в 1x PBS. Принесите в жертву эмбриональных мышей путем обезглавливания в соответствии с рекомендациями IACUC. С помощью штифтов из нержавеющей стали закрепите брюшную поверхность туловища до силиконовой прокладки в чашке для вскрытия.
  7. Используйте ножницы для микродиссекции, чтобы сделать разрез брюшной полости чуть ниже пупка, стараясь не повредить артерии. Используйте тонкие щипцы для смещения кишечника до тех пор, пока не станут видны рога матки плода.
  8. Чтобы определить местонахождение яичников, проследите за каждым маточным рогом наружу от мочевого пузыря к почке. Яичник и яйцевод будут выглядеть как небольшие глобулочные структуры на концах маточных рогов, расположенных чуть ниже почки и рядом с задней частью брюшинной полости (рис. 1B).
  9. С помощью тонких щипцов отщипните яичники и соберите их в небольшой стакан для часов, наполненный 750 мкл 1x PBS.
  10. Отделите яичник от окружающих тканей и поместите оба яичника в стекло часов, содержащее 750 μл HEB, следя за тем, чтобы яичники были полностью погружены в воду (см. Рисунки 1C и 1D). Инкубируйте яичники в течение 15 минут при комнатной температуре.
  11. Пипетка 35 мкл 100 мМ сахарозы нанесите на вогнутое предметное стекло. Используйте тонкие щипцы для переноса обоих яичников из HEB в сахарозу.
  12. Используйте иглу 25G, чтобы прикрепить яичник к предметному стеклу, в то время как с помощью второй иглы, скосите вниз, чтобы выдавить ооциты из яичника.
    1. Когда яичник станет прозрачным и желеобразным, удалите яичник из HEB и повторите процесс со вторым яичником. Аккуратно пипеткой нанесите раствор для диспергирования клеток.
  13. Опустите предметное стекло в банку для окрашивания PFA Coplin и кратко промокните край предметного стекла о бумажное полотенце. После того, как PFA была собрана в небольшие капли вдоль гидрофобной границы каждого квадрата (рис. 1E), пипетка вводит 5 мкл раствора ооцитов и сахарозы в каждую каплю PFA.
  14. Распределите ооциты по квадратным участкам, осторожно наклоняя предметные стекла вперед и назад. Будьте осторожны, чтобы раствор из какого-либо одного квадрата не перетек в соседние квадраты.
  15. Поместите предметное стекло во влажную камеру и продолжайте делать предметные стекла до тех пор, пока раствор ооцитов и сахарозы не закончится.
  16. Повторяйте шаги 1.6 - 1.15 до тех пор, пока не будут использованы все плоды женского пола. Инкубируйте предметные стекла во влажной камере при комнатной температуре в течение 2 ч.
  17. После инкубации откройте влажную камеру. Поскольку большая часть (если не все) жидкости/фиксатора все еще должна присутствовать на поверхности предметного стекла (примерно 10 μL в каждом квадратном сечении), аккуратно перенесите слайды на бумажное полотенце и дайте предметным стеклам полностью высохнуть на воздухе при комнатной температуре на лабораторном столе (этот процесс обычно занимает 30-60 минут, в зависимости от местной влажности).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предметные стекла также можно сушить на воздухе под вытяжным шкафом, чтобы снизить потенциальное воздействие остаточных паров PFA. Это также сократит время сушки примерно до 20 - 30 минут.
  18. Промойте предметные стекла в 0,4% смачивающем агенте в ультрачистом H2O в течение 2 минут. Дайте предметным стеклам полностью высохнуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе предметные стекла могут храниться при температуре -80 °C; однако некоторые эпитопы нестабильны (например, по нашему опыту, MLH1 окрашивается плохо, а окрашивание SYCP3 имеет значительные артефакты после замораживания). Настоятельно рекомендуется немедленно окрашивать предметные стекла под иммунитет.

2. Иммунофлуоресцентное окрашивание профазы I хромосомы

  1. Приготовьте 10-кратный буфер для разведения антител (ADB; см. Таблицу 2), содержащий 10% (v/v) нормальной козьей сыворотки, 3% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,05% Triton X-100 в 1x PBS. Фильтр простерилизовать с помощью фильтра 0,45 мкм и хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
  2. Промойте предметные стекла в банке для окрашивания Coplin с 0,4% смачивающим агентом в 1x PBS в течение 10 минут. Постирайте предметные стекла в баночке для окрашивания Coplin 0,1% Triton X-100 в 1x PBS в течение 10 минут. Заблокируйте предметные стекла в банке для окрашивания Coplin 1x ADB в течение 10 минут.
  3. Разведите выбранные первичные антитела в 10x ADB (список антител и их соответствующие разведения см. в Таблице материалов ).
    1. Приготовьте четыре комбинации антител для мультиплексного иммуноокрашивания: (1) SYCP332,33, SYCP133, HORMAD133; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332; (3) SYCP332,33, MSH432, MLH332; и (4) SYCP334, MLH1 32,33,34, CREST 35.
  4. Извлеките предметные стекла из ADB, слейте лишнюю жидкость и поместите предметные стекла во увлажненную камеру с водой комнатной температуры. Вносите 30 мкл разведенных антител на квадратный участок каждого предметного стекла, следя за тем, чтобы антитела из одного квадрата не перетекли в соседние квадраты.
  5. Закройте увлажненную камеру и дайте предметным стеклам поинкубироваться в течение ночи при комнатной температуре.
  6. На следующее утро откройте влажную камеру и вытряхните разбавленные антитела из предметных стекол. Повторите шаг 2.2.
  7. Разведите выбранные вторичные антитела в 10-кратном ADB (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента предметные стекла и антитела становятся светочувствительными. Завершайте все последующие инкубации в темное время суток.
  8. Извлеките предметные стекла из ADB, слейте лишнюю жидкость и поместите предметные стекла во влажную камеру с водой комнатной температуры. Внесите 30 мкл выбранных разведенных антител на квадратный участок каждого предметного стекла, следя за тем, чтобы антитела из одного квадрата не перетекли в соседние квадраты.
  9. Закройте увлажненную камеру и дайте предметным стеклам инкубироваться в течение 2 часов при комнатной температуре.
  10. Промойте предметные стекла 3 раза по 5 минут каждый в банках для окрашивания Coplin 0,4% смачивающего агента в 1x PBS. Постирайте предметные стекла в течение 5 минут в банке для окрашивания Coplin с 0,4% смачивающим агентом в ультрачистом H2O.
  11. Нанесите небольшую каплю (примерно 10 мкл) монтажной среды, препятствующей выцветанию, с 4', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) или эквивалентным красителем для нуклеиновых кислот. Поместите стеклянный покровный лист 60 мм x 24 мм No 1,5 на каждое предметное стекло и тщательно промокните лишнюю жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут быть запечатаны прозрачным лаком для ногтей или резиновым цементом. При использовании отверждаемого крепежа герметизация слайдов не требуется. Слайды следует хранить в слайд-боксе или папке при температуре 4 °C. Несмотря на то, что лучше всего фотографировать предметные стекла вскоре после окрашивания, по нашему опыту, предметные стекла, хранящиеся в темноте при температуре 4 °C, могут сохранять интенсивность сигнала в течение нескольких месяцев или года. Для более длительного хранения предметные стекла можно хранить при температуре -20 °C в течение нескольких лет без существенной потери качества сигнала.
  12. Изображение клеток с 63-кратным увеличением с помощью эпифлуоресцентной микроскопии (см. Таблицу материалов). Используйте программное обеспечение для анализа изображений (например, Zen или ImageJ, см. Таблицу материалов) для измерения длины SC и интенсивности флуоресценции всех каналов вдоль оси. Проследите длину каждой оси хромосомы (SYCP3), начиная с центромеры (плотная область CREST или DAPI).
    1. Для анализа HORMAD1 и SYCP1 запишите длины пиков флуоресцентного сигнала. Вычислите общую длину пиков HORMAD1 или SYCP1 и разделите их на длину оси хромосомы.
    2. Для анализа MSH4 количественно определите количество пиков флуоресцентного сигнала для каждого измерения SYCP3. Запишите как общее количество пиков MSH4 на ядро, так и количество пиков MSH4, перекрывающих пики MLH3. Подтвердите количество MSH4, сравнив пики с соответствующим количеством очагов.

3. Препараты диакинеза/прометафазы для наблюдения за хиазматами

  1. Чтобы максимизировать выход мейотически компетентных ооцитов, используйте молодых самок мышей (в возрасте 25 - 28 дней).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стимуляция путем внутрибрюшинного введения самкам мышей 5 МЕ гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы (PMSG) за 48 ч до сбора ооцитов может быть выполнена для повышения продуктивности. Тем не менее, для целей анализа хиазмат можно собрать достаточное количество ооцитов зародышевых везикул (GV) у нестимулированных самок.
  2. Перед тем как приносить мышей в жертву, приготовьте следующие реагенты и растворы.
    1. Дайте M2 (3 мл на мышь) и KSOM (1 мл на мышь) сбалансироваться в инкубаторе для клеточных культур (37 °C, 5 %CO2) в течение не менее 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирки с аликвотами замороженных сред можно помещать в инкубатор с ослабленными крышками вечером накануне сбора ооцитов, что обеспечивает равновесие примерно в течение 14 часов.
    2. Приготовьте среду М2 с 2,5 мкМ милриноном (ингибитором изофермента фосфодиэстеразы, препятствующим возобновлению мейотики)36. Пипеткой нанесите пять капель по 20 мкл M2 + милринон в чашку Петри диаметром 35 мм и посыпьте ее легким минеральным маслом (рис. 2C).
    3. Пипетка пять 20 мкл КСОМ капает в чашку Петри диаметром 35 мм и покрывается легким минеральным маслом (рис. 2С).
      ВНИМАНИЕ: Контроль температуры и pH имеет решающее значение для созревания ооцитов in vitro. Забор ооцитов следует проводить на столе с подогревом (37 °C). Все среды следует хранить в инкубаторе до тех пор, пока они не будут использованы, а тарелки со средой следует убирать по одной, чтобы ограничить разрушения, вызванные воздействием окружающего воздуха.
    4. Очистите стекло микроскопа предметными стеклами с 70% этанолом и дайте высохнуть на воздухе. На обратной стороне предметного стекла микроскопа слегка надрежьте (алмазным пером) или нарисуйте (водостойкими чернилами) сетку 5 x 5 из квадратов ~ 4 мм x 4 мм (пример показан на рисунке 2B и может быть использован для обводки сетки).
  3. Собирайте ооциты у одной мыши за раз. Принесите в жертву самку мыши путем удушья CO2 и вывиха шейки матки в соответствии с рекомендациями IACUC.
  4. Используйте ножницы для вскрытия брюшной полости. Используйте тонкие щипцы для смещения кишечника.
  5. Проследите за каждым маточным рогом от мочевого пузыря к почке. Яичники и яйцеводы будут связаны с небольшим жировым пакетом возле почки.
  6. С помощью ножниц для микродиссекции удалите яичники и поместите их в газообразную среду M2 с милриноном.
  7. Используйте ножницы для микродиссекции, чтобы удалить весь жир и другие ткани (включая бурсу) из яичников. Используйте иглы 25G для разрыва антральных фолликулов.
  8. С помощью переводной пипетки распределите ооциты в M2 + милринон тонким слоем в чашке Петри диаметром 100 мм, следя за тем, чтобы среда не касалась стенок чашки (рис. 2C).
  9. Используйте диссекционный микроскоп (увеличение 25x - 50x) для визуализации ооцитов GV (рис. 2F). Ооциты GV могут быть связаны с кучевыми клетками в комплексе кумулус-ооцит (COC). Удаляют кумулюсные клетки с помощью повторного пипетирования.
  10. Соберите ооциты GV с помощью стеклянной пипетки с ротовым приводом (диаметр 100 - 150 мкм; Рисунок 2А). Перенесите ооциты GV в каплю объемом 20 мкл M2 + милринон, покрытую легким минеральным маслом (рис. 2C). Не помещайте более 30 ооцитов в одну каплю.
  11. Когда все ооциты GV будут собраны, пропустите их через две или три капли по 20 мкл M2 + милринон, покрытые легким минеральным маслом, чтобы удалить любые соматические клетки.
  12. Перенесите ооциты GV (с минимальным количеством среды) в каплю КСОМ объемом 30 мкл. Промойте милринон, пропустив ооциты через пять капель КСОМ (рис. 2В).
  13. Перенесите все ооциты GV в капли КСОМ по 20 μл, покрытые легким минеральным маслом, максимум 30 ооцитов на одну каплю КСОМ (рис. 2В). Поместите ооциты в инкубатор для клеточных культур (37 °C, 5 %CO2).
  14. Инкубируйте ооциты в течение примерно 5 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пробой GV (обозначение исчезновения ядерной оболочки и мейотического возобновления); Рисунок 2G) Обычно происходит через 2 ч в культуре, но скорость созревания ооцитов может варьироваться в зависимости от штамма мышей или гормональной стимуляции. По нашему опыту, в общей сложности 5 часов в культуре лучше всего оптимизируют для распространения хиазмат у большинства линий мышей. Если оставить созревать слишком долго, может произойти первое мейотическое деление и экструзия полярного тела (Рисунок 2H).
  15. Перенесите 5 - 10 ооцитов (с минимальным количеством КСОМ) в каплю гипотонического раствора объемом 30 мкл (0,9 % цитрата натрия в ультрачистомН2О). Инкубировать ооциты в гипотоническом растворе в течение 5 - 10 мин.
  16. Пипеткой нанесите небольшую каплю (~1 μл) подкисленной воды (8 капель ледяной уксусной кислоты в 50 мл сверхчистой H2O) на один из квадратов на подготовленных предметных стеклах (рисунок 2В).
  17. Используйте стеклянную пипетку диаметром 100 - 150 мкм для быстрого переноса одного ооцита из капли в подкисленную воду. Переносите как можно меньше гипотонического раствора с ооцитом. С помощью той же пипетки удалите часть жидкости до тех пор, пока ооцит не прилипнет к предметному стеклу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем жидкости вокруг ооцита имеет решающее значение. Жидкости должно быть достаточно, чтобы ооцит не пересох перед фиксацией, но не настолько, чтобы ооцит не смог прилипнуть к предметному стеклу.
  18. Быстро переключитесь на стеклянный наконечник для дозатора диаметром 150 μм. Добавьте в ооцит одну каплю свежего фиксатора Карноя (три части абсолютного метанола на одну часть ледяной уксусной кислоты). Дайте фиксатору разойтись по предметному стеклу. Ооцит должен казаться менее отчетливым и плавиться, поскольку кислота из фиксатора растворяет пеллюцидную зону, и клетки лопаются.
  19. Как только лицевая сторона фиксатора начнет сокращаться, быстро добавьте еще 2 – 3 капли фиксатора. Аккуратно подуйте на предметное стекло, чтобы ускорить высыхание.
  20. Повторите шаги 3.16 - 3.19 с дополнительными ооцитами из гипотонического раствора.
  21. Повторяйте шаги 3.15 - 3.20 до тех пор, пока все ооциты не будут зафиксированы. Проверьте распространение хромосом с помощью фазово-контрастного микроскопа.
  22. Когда предметное стекло полностью высохнет на воздухе, поместите предметное стекло в банку для окрашивания Coplin с 50 мл 4% Giemsa (v/v) в ddH2O. Окрашивайте предметные стекла в Giemsa в течение 6 минут при комнатной температуре.
  23. Вымойте предметные стекла 3 раза по 3 минуты каждый в ddH2O при комнатной температуре. Дайте предметным стеклам полностью высохнуть.
  24. Нанесите тонкий слой (~60 мкл) Permount на стеклянную крышку размером 60 мм x 24 мм No 1,5. Установите предметные стекла, перевернув их на покровных стеклах и тщательно промокнув лишнюю жидкость. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи, прежде чем получать изображения с 63-кратным увеличением на светлом поле.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оценка дефектов синапсоса в пахитен-подобных клетках
В этом эксперименте оцениваются дефекты синапсов в пахитеновых ооцитах и отслеживается прогрессирование профазы I (рис. 3A). Иммуноокрашивание на SYCP3 (аксиальные/латеральные элементы СК), SYCP1 (центральный элемент СК) и HORMAD1 (оси несинапсов/дезинапсомы хромосом) позволяет определить стадию и оценить синапсис. HORMAD1 колокализуется с SYCP3 во время...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ооциты млекопитающих особенно подвержены ошибкам по сравнению со сперматоцитами. В то время как менее эффективная контрольная точка сборки веретена (SAC) ооцита способствует этой уязвимости 14,52,53, Хассолд и Хант предполагают, что множественные попадания приводят к анеуплоидии, при этом дефектная рекомбинация является основным фактором54. Исследования на людях связывают...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У автора нет никаких конфликтов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

Финансирование этого проекта было предоставлено премией K99 от Национального института детского здоровья и развития имени Юнис Кеннеди Шрайвер (HD112986 TH).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,45 и мю; m Шприцовый фильтрМиллипор СигмаSLHAR33SBдля изготовления пипетки с ротовым приводом
0,5 M EDTA, pH 8,0Корнинг46-034-CI для HEB
1 мл стерильный шприц с иглой 25 калибра 16 ммFisher Scientific14-817-125 Для разрыва яичников
Чашка Петри 100 x 15 ммVWR25384-302 
14,6 см одноразовые боросиликатные пипетки PasteurFisher Scientific13-678-20B для изготовления пипетки с ротовым приводом
Чашка Петри 35 x 10 ммКорнинг351008
40 мм x 0,45 мм #3 штифты из нержавеющей стали для энтомологииAmazonB0CSSPW5S7Для закрепления мышей плода для вскрытия
Уксусная кислота, ледникFisher ScientificA38-212для фиксатива Карноя
Сборки аспираторных трубок для калиброванных микрокапиллярных пипетокМиллипор СигмаA5177-5EAдля изготовления пипетки с ротовым приводом
B.P.I. Watch GlassNDS Technologies 1580-00Альтернативно используйте эмбриональную тарелку диаметром 30 мм на 12 мм глубины (Electron Microscopy Sciences SKU: 70543-30)
Борная кислотаFisher ScientificBP168-1для корректировки pH HEB, PFA
Бычий сывороточный альбуминМиллипор СигмаA7906-100Gдля ADB
Баллон с CO2для инкубатора
Микроскопические слайды CorningМиллипор СигмаCLS294875X25L x W 75 мм x 25 мм, с одной стороны матовая
Микроскопические стекли Corning, с одной стороны, с одной стороны — матомVWR294875X25
Стекло — прямоугольное покрытие. 60 x 24 мм, #1.5VWR48393-251
Дистрибутивная тарелкаНауки об электронной микроскопии70540
Микроскоп для рассеченияЛюбая стандартная модель
Ножницы для вскрытия, острый наконечник, 4,5"VWR82027-578
Очень тонкие, острые щипцы на кончикахVWR76548-836
Гимса СтейнМиллипор СигмаGS500-500Для окрашивания хиазмат спредов
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP PenVector LaboratoriesH-4000
ИнкубаторЛюбая стандартная модель с технологией CO2 и водяной рубашки
Рабочая станция ЭКОK-SystemsЛюбая модель с подогреваемой столешницей
Решение Kodak Photo-Flo 200BH Photo & Видео1464510для слайдовых промыв
МетанолFisher ScientificA412-4для фиксатива Карноя
MP Biomedicals Банка для окрашивания КоплинаFisher ScientificICN17006201
Обычная козья сывороткаGibco16210-072для ADB
Параформальдегид, электромагнитный класс, очищенный приллНауки об электронной микроскопии19200
ПермонтFisher ScientificSP15-100for  Монтажные слайды для разворотов хиазмат
Крепление ProLong Glass Antifade с морилкой NucBlueThermo ScientificP36985Для монтажа иммуноокрашенных стеклян
Силиконовая трубка, внутренний диаметр: 0,125", внешний диаметр: 0,25"VWR89068-474для изготовления пипетки с ротовым приводом
Дигидрат натрия цитратFisher ScientificS279-500для HEB — гипотоническое решение
Система окрашивания слайдов StainTrayНауки об электронной микроскопии71396-BДля использования в качестве увлажняемой камеры. Обязательно использовать чёрную крышку для иммунофлуоресцентного окрашивания. Может также застилать дно непрозрачной коробки или посуды влажными бумажными полотенцами для использования в качестве увлажнённой камеры и nbsp;
Чаевые для стриптизершей — 100Cooper SurgicalMXL3-100для ротовой пипетки
Советы для стриптизершей — 150Cooper SurgicalMXL3-150для ротовой пипетки
СахарозаМиллипор СигмаS-8501для HEB — гипотонический раствор сахарозы
База ТрисFisher ScientificBP152-5для HEB
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100 для PFA, ADB и Triton-PBS
Банка для окрашивания Coplin United ScientificFisher ScientificS17495Aнепрозрачный белый пластик для промывки и блокировки стекло после добавления светочувствительных вторичных антител
Стеклянные вогонутые слайды United ScientificFisher ScientificS139533Толщина 1,3 мм, количество 2 колодцев
Микродиссекционные ножницы Vannas 5 мм прямыеVWR76457-358
Zeiss Axio Imager.Z2, Colibri 7Карл Цейсс000000-2624-307
Программное обеспечение Zen Blue 3.11Карл ЦейссПрограммное обеспечение для получения и анализа изображений
Антитела
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Mouse IgG, специфичный для FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-546-071использовано разбавление 1:1 000
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Фрагментный козёл против кроликов IgG, специфичный для FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-546-046использовано разбавление 1:1 000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Human IgG, Fc и гамма; Специфичный фрагментJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.109-606-170использовано разбавление 1:1 000
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Guinea IgG, специфичность фрагмента FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.106-605-008использовано разбавление 1:1 000
Подопытная свинка против MLH3 pAbна заказ с использованием Thermo-Fisher, с разбавлением 1:500
Подопытная свинка против SYCP1 pAbот Christer Hö ö g (Kouznetsova et al. 2005), используется разбавление 1:200
Белок pAb человека с антицентромернымиAntibodies Inc.15-234использовано разбавление 1:1 000
Мыши с анти-MLH1 mAbBD Biosciences550838использовано разбавление 1:100
Мышь с анти-SYCP3 mAbAbcamab97672использовано разбавление 1:1 000
Анти-HORMAD1 pAb у кроликовProteintech13917-1-APиспользовано разбавление 1:500
Кролик анти-MSH4 pAbAbclonalA8556использовано разбавление 1:100
Кролик с анти-RAD51 pAbМиллипорPC130использовано разбавление 1:500
Кролик анти-SYCP3 pAbAbcamab15093использовано разбавление 1:1 000
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Mouse IgG, специфичный для FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-296-071использовано разбавление 1:1 000
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Фрагментный козёл против кроликов IgG, специфичный для FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-296-046использовано разбавление 1:1 000

Ссылки

  1. Gray, S., Cohen, P. E. Control of Meiotic Crossovers: From Double-Strand Break Formation to Designation. Annu Rev Genet. 50, 175-210 (2016).
  2. Hunter, N. Meiotic Recombination: The Essence of Heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7, a016618(2015).
  3. Kudo, N. R., et al. Resolution of Chiasmata in Oocytes Requires Separase-Mediated Proteolysis. Cell. 126, 135-146 (2006).
  4. Murdoch, B., et al. Altered Cohesin Gene Dosage Affects Mammalian Meiotic Chromosome Structure and Behavior. PLoS Genet. 9, 1003241(2013).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1β-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37, 1351-1355 (2005).
  6. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances Between Homologs. Ann Rev Genet. 57, 1-63 (2023).
  7. Billmyre, K. K., et al. SYCP1 head-to-head assembly is required for chromosome synapsis in mouse meiosis. Sci Adv. 9, eadi1562(2023).
  8. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171, 447-458 (2005).
  9. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31, 385-390 (2002).
  10. Oh, S. D., Lao, J. P., Taylor, A. F., Smith, G. R., Hunter, N. RecQ Helicase, Sgs1, and XPF Family Endonuclease, Mus81-Mms4, Resolve Aberrant Joint Molecules during Meiotic Recombination. Mol Cell. 31, 324-336 (2008).
  11. Holloway, J. K., Booth, J., Edelmann, W., McGowan, C. H., Cohen, P. E. MUS81 generates a subset of MLH1-MLH3-independent crossovers in mammalian meiosis. PLoS Genet. 4, e1000186(2008).
  12. Edelmann, W., et al. Mammalian MutS homologue 5 is required for chromosome pairing in meiosis. Nat Genet. 21, 123-127 (1999).
  13. Kneitz, B., et al. MutS homolog 4 localization to meiotic chromosomes is required for chromosome pairing during meiosis in male and female mice. Genes Dev. 14, 1085-1097 (2000).
  14. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13, 493-504 (2012).
  15. Capalbo, A., Hoffmann, E. R., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human female meiosis revised: new insights into the mechanisms of chromosome segregation and aneuploidies from advanced genomics and time-lapse imaging. Hum Reprod Update. 23, 706-722 (2017).
  16. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365, 1466-1469 (2019).
  17. Gruhn, J. R., Hoffmann, E. R. Errors of the Egg: The Establishment and Progression of Human Aneuploidy Research in the Maternal Germline. Ann Rev Genet. 56, null(2022).
  18. Soygur, B., et al. Intercellular bridges coordinate the transition from pluripotency to meiosis in mouse fetal oocytes. Sci Adv. 7, eabc6747(2021).
  19. Bowles, J., et al. Retinoid Signaling Determines Germ Cell Fate in Mice. Science. 312, 596-600 (2006).
  20. Bullejos, M., Koopman, P. Germ cells enter meiosis in a rostro-caudal wave during development of the mouse ovary. Mol Reprod Dev. 68, 422-428 (2004).
  21. Borum, K. Oogenesis in the mouse: A study of the meiotic prophase. Exp Cell Res. 24, 495-507 (1961).
  22. Grive, K. J., Freiman, R. N. The developmental origins of the mammalian ovarian reserve. Development. 142, 2554-2563 (2015).
  23. Hu, M., et al. PRC1-mediated epigenetic programming is required to generate the ovarian reserve. Nat Commun. 13, 4510(2022).
  24. Drabent, B., Bode, C., Bramlage, B., Doenecke, D. Expression of the mouse testicular histone gene H1t during spermatogenesis. Histochem Cell Biol. 106, 247-251 (1996).
  25. Goetz, P., Chandley, A. C., Speed, R. M. Morphological and temporal sequence of meiotic prophase development at puberty in the male mouse. J Cell Sci. 65, 249-263 (1984).
  26. Solari, A. J. The spatial relationship of the X and Y chromosomes during meiotic prophase in mouse spermatocytes. Chromosoma. 29, 217-236 (1970).
  27. Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
  28. Tarkowski, A. K. An Air-Drying Method for Chromosome Preparations from Mouse Eggs. Cytogenetics. 5, 394-400 (2008).
  29. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  30. Sun, X., Cohen, P. E. Studying Recombination in Mouse Oocytes. Mammalian Oocyte Reg Meth Protoc. , 1-18 (2013).
  31. Evans, C. W., Robb, D. I., Tuckett, F., Challoner, S. Regulation of meiosis in the foetal mouse gonad. Development. 68, 59-67 (1982).
  32. Horan, T. S., et al. The DNA helicase FANCJ (BRIP1) functions in double strand break repair processing, but not crossover formation during prophase I of meiosis in male mice. PLoS Genet. 20, e1011175(2024).
  33. Wood, A. J., et al. CNTD1 is crucial for crossover formation in female meiosis and for establishing the ovarian reserve. J Cell Biol. 224, e202401021(2025).
  34. Horan, T. S., et al. Replacement Bisphenols Adversely Affect Mouse Gametogenesis with Consequences for Subsequent Generations. Curr Biol. 28, 2948-2954.e3 (2018).
  35. Lee, C., Oh, J. S. Novel BRCA1-PLK1-CIP2A axis orchestrates homologous recombination-mediated DNA repair to maintain chromosome integrity during oocyte meiosis. Nuc Acid Res. 53, gkae1207(2025).
  36. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biol Reprod. 71, 1142-1149 (2004).
  37. Wojtasz, L., et al. Mouse HORMAD1 and HORMAD2, Two Conserved Meiotic Chromosomal Proteins, Are Depleted from Synapsed Chromosome Axes with the Help of TRIP13 AAA-ATPase. PLoS Genet. 5, e1000702(2009).
  38. Kogo, H., et al. Differential phosphorylation of two serine clusters in mouse HORMAD1 during meiotic prophase I progression. Exp Cell Res. 440, 114133(2024).
  39. Jiao, X., et al. Aberrant activation of chromosome asynapsis checkpoint triggers oocyte elimination. Nat Commun. 16, 2260(2025).
  40. Cloud, V., Chan, Y. L., Grubb, J., Budke, B., Bishop, D. K. Rad51 Is an Accessory Factor for Dmc1-Mediated Joint Molecule Formation During Meiosis. Science. 337, 1222-1225 (2012).
  41. Lan, W. H., et al. Rad51 facilitates filament assembly of meiosis-specific Dmc1 recombinase. Proc Natl Acad Sci. 117, 11257-11264 (2020).
  42. Hinch, A. G., et al. The Configuration of RPA, RAD51, and DMC1 Binding in Meiosis Reveals the Nature of Critical Recombination Intermediates. Mol Cell. 79, 689-701.e10 (2020).
  43. Snowden, T., Acharya, S., Butz, C., Berardini, M., Fishel, R. hMSH4-hMSH5 recognizes Holliday Junctions and forms a meiosis-specific sliding clamp that embraces homologous chromosomes. Mol Cell. 15, 437-451 (2004).
  44. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA Damage Checkpoint Eliminates Mouse Oocytes with Chromosome Synapsis Failure. Mol Cell. 67, 1026-1036.e2 (2017).
  45. Premkumar, T., et al. Genetic dissection of crossover mutants defines discrete intermediates in mouse meiosis. Mol Cell. 83, 2941-2958.e7 (2023).
  46. Polani, P. E., Crolla, J. A., Seller, M. J., Moir, F. Meiotic crossing over exchange in the female mouse visualised by BUdR substitution. Nature. 278, 348-349 (1979).
  47. Imai, H. T., Moriwaki, K. A re-examination of chiasma terminalization and chiasma frequency in male mice. Chromosoma. 85, 439-452 (1982).
  48. Kanda, N., Kato, H. Analysis of crossing over in mouse meiotic cells by BrdU labelling technique. Chromosoma. 78, 113-121 (1980).
  49. Hultén, M., Lawrie, N. M., Laurie, D. A. Chiasma-based genetic maps of chromosome 21. Am J Med Genet. 37, 148-154 (1990).
  50. Lawrie, N. M., Tease, C., Hultén, M. A. Chiasma frequency, distribution and interference maps of mouse autosomes. Chromosoma. 104, 308-314 (1995).
  51. Speed, R. M. The effects of ageing on the meiotic chromosomes of male and female mice. Chromosoma. 64, 241-254 (1977).
  52. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139, 1941-1946 (2012).
  53. Sebestova, J., Danylevska, A., Dobrucka, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11, 3011-3018 (2012).
  54. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: recombination and human aneuploidy. Prenatal Diagnos. 41, 584-590 (2021).
  55. Oliver, T. R., et al. New Insights into Human Nondisjunction of Chromosome 21 in Oocytes. PLoS Genet. 4, e1000033(2008).
  56. Ghosh, S., Feingold, E., Dey, S. K. Etiology of Down syndrome: Evidence for consistent association among altered meiotic recombination, nondisjunction, and maternal age across populations. Am J Med Genet A. 149A, 1415-1420 (2009).
  57. Wang, S., et al. Inefficient crossover maturation underlies elevated aneuploidy in human female meiosis. Cell. 168, 977-989.e17 (2017).
  58. Shin, Y. H., McGuire, M. M., Rajkovic, A. Mouse HORMAD1 Is a Meiosis I Checkpoint Protein That Modulates DNA Double-Strand Break Repair During Female Meiosis. Biol Reprod. 89, 29(2013).
  59. Kogo, H., et al. HORMAD1-dependent checkpoint/surveillance mechanism eliminates asynaptic oocytes. Genes Cells. 17, 439-454 (2012).
  60. Ward, J. O., et al. Mutation in Mouse Hei10, an E3 Ubiquitin Ligase, Disrupts Meiotic Crossing Over. PLoS Genet. 3, e139(2007).
  61. Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
  62. Hodges, C. A., Hunt, P. A. Simultaneous analysis of chromosomes and chromosome-associated proteins in mammalian oocytes and embryos. Chromosoma. 111, 165-169 (2002).
  63. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome Spreads with Centromere Staining in Mouse Oocytes. Mammal Oocyte Regul Method Protoc. , 203-212 (2013).
  64. Yun, Y., Ito, M., Sandhu, S., Hunter, N. Cytological Monitoring of Meiotic Crossovers in Spermatocytes and Oocytes. Homologous Recomb Method Protoc. , 267-286 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Получение мейотических хромосомных спредов из ооцитов мышей для оценки синапсоса и рекомбинации
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.