Методическая статья

Разработка органоидных линий, полученных от мышей, из эпителиальных клеток фаллопиевых труб для моделирования высокодифференцированной серозной карциномы яичников

DOI:

10.3791/68753

⸱

6 августа 2025 г.

 ,  , 
1Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описывается разработка моделей мышей с серозной карциномой яичников высокой степени злокачественности (HGSOC) in vitro и in vivo. Из получения органоидов фаллопиевых труб мышей, их генетической модификации для повторения генетики HGSOC человека и их введения в яичниковую сумку сингенных мышей для развития опухолей in vivo .

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективное моделирование заболеваний в реалистичных условиях имеет решающее значение для улучшения нашего понимания различных патологий. В этом аспекте органоиды предлагают более достоверную окружающую среду, чем их классические двумерные аналоги in vitro. Аналогичным образом, сингенные модели мышей также позволяют исследователям исследовать более полные взаимодействия опухоли и хозяина, такие как с иммунной системой, in vivo. В данной работе мы представляем полный протокол извлечения эпителиальных клеток фаллопиевых труб, клеток происхождения серозных карцином яичников высокой степени злокачественности (HGSOC), у мыши и получения их в качестве первичных органоидных культур, а также их культивирования и поддержания in vitro . Затем мы описываем, как использовать методы генной инженерии, такие как сверхэкспрессия лентивирусных или ретровирусных генов, а также делеция гена CRISPR-Cas9, чтобы модифицировать эти линии и трансформировать их в предраковые опухолевые опухоли. Мы также сообщаем, как использовать их для валидации in vitro путем экстракции генетических материалов и иммунофлуоресцентного окрашивания. Наконец, мы указываем, как эффективно вводить эти опухолевые опухоли в яичниковую сумку, аутохтонное место HGSOC, для инициации опухоли.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Серозная карцинома яичников высокой степени злокачественности (HGSOC) остается малоизученным и высоколетальным заболеванием. Исторически сложилось так, что отсутствие достоверных моделей in vitro и in vivo, представляющих биологию HGSOC и ответ на терапию, было основным препятствием на пути прогресса. Например, в многочисленных (если не в большинстве) исследованиях использовались клеточные линии, которые не разделяют ключевые геномные/генетические особенности HGSOC, что ставит под сомнение актуальностьих результатов. Например, общая сингенная модель мыши ID8 получена из эпителия поверхности яичников (OSE) и относится к Trp53-wild типа5. Напротив, большинство, если не все, HGSOC возникает в эпителии фаллопиевых труб (FTE)6, а HGSOC почти всегда является мутантным TP53или молчащим 7. С тех пор исследователи пытались исправить эту линию, интегрируя в нее мутации Trp53, но поскольку мутация Trp53 является ранним событием в патогенезе HGSOC, эта модификация, возможно, происходит слишком поздно в трансформации этой клеточной линии и, вероятно, не представляет собой нормальное развитие HGSOC.

В течение последнего десятилетия предпринимались попытки исправить такое положение дел путем создания более реалистичных моделей HGSOC. Например, генетически модифицированные модели мышей (GEMM), которые содержат соответствующие мутации на клетках линии мюллерова тракта, часто в системе Cre-рекомбиназы для контроля патогенеза, позволяют исследователям лучше имитировать болезнь in vivo 8,9,10. К сожалению, эти модели часто сложны в создании и могут иметь другие проблемы, такие как Cre-leaking, Cre-effect или «полевые эффекты»11,12,13. В этом отношении модели сингенных органоидов представляются надежным компромиссом для исследователей, которые хотят лучше имитировать заболевание как in vitro, так и in vivo14,15,16,17,18,19. Действительно, в то время как большинство доступных и используемых в настоящее время моделей HGSOC являются двумерными, они, к сожалению, не могут должным образом смоделировать сложность внеклеточного матрикса (ECM), ключевого элемента, влияющего на клеточную биологию. Органоиды представляют собой самоорганизующиеся трехмерные ткани, часто генерируемые из стволовых клеток, которые могут воссоздать раннюю структурную и функциональную сложность органа в чашкеПетри 20. Их генерация обычно работает путем суспензии отдельных клеток, которые являются плюрипотентными, в матрице базальной мембраны (BMM), такой как Matrigel21. In vitro эти модели сравнительно более точны при повторении условий in vivo, чем 2D-модели. Кроме того, благодаря своей сингенной природе, эти модели могут быть пересажены мышам с полностью функционирующей иммунной системой, что позволяет более точно реконструировать патогенези развитие. Это явное преимущество по сравнению с ксенотрансплантатами, полученными от пациентов, которые, обладая наиболее реалистичной генетикой опухоли, требуют приживления в моделях мышей с ослабленным иммунитетом.

В этом протоколе мы описываем, как разрабатывать сингенные модели органоидов HGSOC. От создания оригинальной органоидной культуры FTE дикого типа, извлеченной из мыши, их генной инженерии для получения генотипов, учитывающих болезнь, до, наконец, их трансплантации обратно в яичниковую сумку для создания полностью развитых опухолей. Мы также включили несколько дополнительных протоколов, чтобы помочь в проведении общих экспериментов, таких как иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание органоидов in vitro и 2D-конверсия клеточных линий для крупномасштабного производства клеток, например, для инъекций. Этот протокол предназначен для исследователей, которые хотят разработать органоидные сингенные модели HGSOC с контролем над их генетическим составом, с особым намерением изучить биологию HGSOC в более реалистичных условиях in vitro , а также взаимодействия, присутствующие в микроокружении опухоли in vivo.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Весь сбор тканей животных и процедуры были выполнены с соблюдением этических норм с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Александрийском центре наук о жизни и Онкологического центра Перлмуттера при NYU Langone Health, Нью-Йорк, Нью-Йорк.

1. Подготовка материалов

  1. Приготовление мышиных органоидных сред (MOM)
    1. Приготовьте базальную среду, комбинируя пункты из таблицы 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда стабильна в течение месяца при температуре 4 °C.
  2. Подготовка 2D носителей
    1. Объедините рекомбинантную мышиную EGF 50 нг/мл, инсулин-трансферрин-селен (конечные концентрации 10 мг/л инсулина, 5,5 мг/л трансферина, 6,7 мкг/л), 3% инактивированную при нагревании фетальную бычью сыворотку (FBS) и пенициллин-стрептомицин (100 ЕД/мл) в DMEM (с пируватом и высоким содержанием глюкозы).
  3. Приготовление смеси для метанчания
    1. Сочетайте коллагеназу/гиалуронидазу (3000 Ед/мл коллагеназы, 1000 Ед/мл гиалуронидазы) с DMEM (с пируватом и высоким содержанием глюкозы) в соотношении 1:10. Приготовьте аликвоты по 1 мл в микропробирках объемом 1,5 мл. Хранить аликвоты при температуре -20 °C и разморозить на льду.
    2. Приготовьте одноразовые аликвоты ДНКазы I (10 000 ЕД/мл) и диспазы (5 ЕД/мл).
    3. После того, как аликвота коллагеназы/гиалуронидазы в DMEM будет разморожена, добавьте DNAseI (10 μL, 100 единиц) и Dispase (25 μL, 0,1 единицы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор для пищеварения также полезен для переваривания до 0,5 г опухоли.
  4. Работа с BMM
    1. Хранить BMM при температуре -80 °C длительное время. Чтобы избежать замораживания-размораживания BMM, приготовьте 1 мл аликвот в пробирках объемом 1,5 мл. Разморозьте аликвоту, положив ее на лед на 2 часа, или на ночь при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: BMM затвердевает при комнатной температуре (RT). Поэтому рекомендуется всегда держать тубу BMM на льду или на холодной решетке для трубок. Используйте наконечники для пипеток, предварительно охлажденные в морозильной камере при температуре -20 °C в течение не менее 2 часов.

2. Выделение клеток из мышиного FTE

  1. Разморозьте аликвоту BMM, предварительно подогрейте фермент TrypLE Express и планшет на 24 лунки при температуре 37 °C (для достижения наилучших результатов храните планшет в инкубаторе в течение 24 часов). Затем подготовьте операционную зону: инструменты для диссекции и очистки тканей на рассекающем микроскопе, планшет с холодным PBS + P/S и теплой смесью для пищеварения.
  2. Усыпить самок мышей C57BL/6J путем удушения углекислым газом. Выполните метод вторичной эвтаназии (вывих шейки матки) в соответствии с требованиями IACUC.
  3. Препарируйте и удалите яичники и фаллопиевы трубы и перенесите их в стерильную чашку Петри, содержащую DMEM + P-S при температуре 4 °C. С помощью препарирующего микроскопа тонким набором щипцов и ножниц удаляют остаточное количество жира из яичника и изолируют маточную трубу (инфундибулум и часть дистальной ампулы) от яичника и матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не прикасайтесь к коже или волосам мыши инструментами, чтобы предотвратить микробное загрязнение.
  4. Перенесите ткань в трубку, содержащую полную смесь для пищеварения, и с помощью тонких ножниц разрежьте фаллопиеву трубу на мелкие кусочки (<0,5 мм). Выдерживать 40-50 минут при температуре 37 °C.
  5. После диссоциации центрифугируйте клетки при 350 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 500 мкл предварительно подогретого TrypLE Express. Инкубировать в течение 15 минут при 37 °C.
  6. Гашение трипсинизации 500 мкл 3% FBS в DMEM (2D среда). Процедите смесь через клеточное ситечко 70 мкм в новую микропробирку. Вращайте в течение 5 минут при 350 г и выбросьте надосадочную жидкость.
  7. Ресуспендируйте клеточную гранулу (едва заметную в зависимости от количества используемых FTs) в 12,5 μл органоидной мышиной среды и кратковременно инкубируйте на льду. Смешайте с 37,5 мкл ледяного BMM и засейте весь объем (50 мкл) на дно лунки предварительно нагретой 24-луночной пластины.
  8. Поместите пластину при температуре 37 °C не менее чем на 20 минут, но не более чем на 48 часов, чтобы установить BMM. Будьте осторожны, чтобы не потревожить купола при переносе пластины в инкубатор.
  9. Добавьте 500 μL предварительно подогретого MOM в каждую лунку, осторожно дозируя среду вниз по стенке лунки. Никогда не добавляйте фильтрующий материал непосредственно на купол, так как это может привести к повреждению или отслоению. Накройте тарелку крышкой и инкубируйте при температуре 37 °C и 5% CO2.

3. Поддержание мышиных органоидов, полученных из ЭПЗ

  1. Смена носителя
    1. С помощью нефильтрованного, стерильного наконечника объемом 10 мкл отсасывайте среду со дна лунки, удерживая планшет под углом 45°. Если купол отделяется от пластины, осторожно отсасывайте среду из верхней части лунки, пока отдельно стоящий купол находится внизу.
    2. Медленно добавьте 750 мкл MOM, предварительно подогретого до 37 °C, прижав кончик к боковой стенке лунки.
    3. Меняйте носитель каждые 2–3 дня или до тех пор, пока он не изменит цвет с розового на желтый. Если среда становится желтой менее чем через 24 ч после ее замены, органоиды готовы к прохождению.
  2. Пассаж органоидов
    1. Удалите среду и промойте каждую лунку 500 μл холодной (4 °C) PBS. Отсадите PBS и добавьте 500 мкл холодного (4 °C) раствора для восстановления клеток непосредственно в купол BMM для его растворения. Продолжайте пипетирование до полного растворения BMM и переложите его в пробирку объемом 1,5 мл.
    2. Поместите трубку на лед на 30 минут и верните тарелку в инкубатор, чтобы она оставалась теплой. Если вы используете новую пластину, убедитесь, что она предварительно прогрета до 37 °C в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При прохождении куполов объемом более 2 x 50 мкл, например, во время расширения, описанного ниже, для достижения наилучших результатов может потребоваться продлить инкубацию на льду более чем на 30 минут.
    3. Центрифугировать при 350 г в течение 5 минут при 4 °C. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не отсасывая гранулу, и промойте 500 мкл холодной PBS. Повторите этот шаг три раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если холодная центрифуга недоступна, дайте пробирке остыть между промывками, поместив ее на лед или холодную решетку.
    4. После последней промывки центрифугируйте при 350 г в течение 5 минут, удалите надосадочную жидкость и добавьте 500 мкл предварительно подогретого (37 °C) фермента TrypLE Express. Чтобы избежать потери клеток в результате пипетирования, притяните трубку к вентиляционной решетке в шкафу для культуры тканей, чтобы гомогенизировать клетки.
    5. Инкубируйте пробирку при температуре 37 °C в течение 30–60 минут.
      Примечание: Время может быть адаптировано в зависимости от генотипа органоида и времени прохождения, так как некоторым может потребоваться более длительная трипсинизация для получения суспензий одиночных клеток.
    6. Остановите процесс диссоциации клеток, добавив 500 мкл DMEM + 3% HI FBS, и перемешайте пипетированием вверх и вниз до гомогенизации раствора.
    7. Центрифугируйте при 350 × г в течение 5 минут и отсасывайте надосадочную жидкость, пока не останется ~20 μл объема. Вручную удалите оставшуюся надосадочную жидкость с помощью пипетки P20, а не вакуумного аспиратора, так как на этом этапе обычно происходит аспирация гранулы.
    8. Суспендируйте клетки в 100 мкл холодного (4 °C) MOM и измерьте концентрацию клеток. Приготовьте клеточные разведения по желанию и держите их на льду. Затем смешайте с ледяным BMM с помощью наконечников для дозатора, которые до этого хранились при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подготовить два купола объемом 50 мкл при соотношении 2 × 105 ячеек/мл, где соотношение MOM к BMM составляет 1:4. Следовательно, вы должны иметь; 25 мкл ячеек в MOM при 8 ×10 5 мкКл/мл, и 75 мкл BMM всего 100 мкл, разделенных на 2 купола. Таким образом, мы эффективно засеем 1 ×10 4 ячейки на купол.
    9. Засейте каждый купол объемом 50 мкл в середину лунки предварительно прогретой 24-луночной пластины. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 не менее чем на 30 минут, чтобы BMM затвердел. Добавьте 500 мкл MOM при температуре 37 °C, как показано ранее на шаге 3.1.2, и верните планшет в инкубатор.
  3. Расширение
    1. Чтобы расширить культуру органоидных клеток до (предварительно подогретого) 6-луночного планшета, подготовьте пять куполов объемом 50 мкл при давлении 8 × 105 клеток/мл. Повторно суспендируйте элементы в общей сложности 62,5 мкл MOM и смешайте с 187,5 μл ледяного BMM и засейте 5 куполов в ту же лунку.
    2. Переместите планшет в инкубатор на 30 минут, чтобы BMM затвердел. Добавьте 2 мл MOM при температуре 37 °C, как показано ранее в шаге 3.1.2, и верните планшет в инкубатор. При необходимости меняйте среду до тех пор, пока клетки не сольются.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора клеток для пассирования используйте 1 мл раствора для восстановления клеток вместо 500 мкл и инкубируйте на льду в течение 45 минут вместо 30 минут.
  4. Криоконсервация
    1. При длительном хранении органоидов пассаж описан в пунктах 3.2.1-3.2.7. Затем повторно суспендируйте в 250 мкл органоидной замораживающей среды (80% MOM, 10% FBS и 10% диметилсульфоксид (ДМСО)) и перенесите в криопробирку. Заморозьте 1 × 105 клеток на криовиальную камеру.
    2. Храните пробирку в криогенном контейнере для заморозки флакона (например, Mr. Frosty) и дайте ему остыть в морозильной камере при температуре -80 °C. Для длительного хранения клетки следует хранить в хранилище с жидким азотом или в морозильной камере при температуре -150 °C.

4. Генетическая модификация органоидов, полученных из мышиных ЭПЗ, для создания новых клеточных линий

  1. Трансдукция методом спинокуляции (лентивирусная или ретровирусная)
    1. Приготовьте смесь из 25 μЛ MOM и 75 μL BMM и добавьте ее в одну лунку холодной (4 °C, позволяет BMM полностью «намочить» лунку) 48-луночную пластину. Инкубируйте при 37 °C в течение 30–60 минут, чтобы дать BMM затвердеть перед засевом ячеек.
    2. Получить отдельные клетки, полученные из органоидов (шаг 3.2.5), и засеять примерно 2 × 104 поверх BMM. Добавьте 200 μL теплого (37 °C) MOM и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение 48 часов.
    3. Добавьте вирус в нужной концентрации. Определение MOI экспериментальным путем; рекомендуется приблизительный MOI ниже 30%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды особенно трудно инфицировать по сравнению с 2D-клеточными линиями, и даже при высоких титрах вируса ожидается низкий MOI. Центрифугируйте ячейки при 600 × г в течение 60 мин при 32 °C. Верните тарелку в инкубатор после окончания спинокуляции.
    4. Через 8 часов удалите среду и добавьте смесь из 25 μL MOM и 75 μL BMM поверх клеток, чтобы «сэндвичить» их в BMM, что позволит органоидам расти естественным образом в 3 измерениях. Дайте BMM застыть, поместив пластину в инкубатор на 30-60 минут. Затем добавьте 250 мкл теплого (37 °C) MOM.
    5. После того, как ячейки сливаются, приступайте к их прохождению, как описано в шаге 3.2, расширяя весь объем ячеек в 2 купола в 24-луночной пластине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании выбора антибиотика рекомендуется выполнять выбор непосредственно в 48-лунке, начиная через 48 ч после первоначальной спинокуляции. При выполнении флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) рекомендуется дополнительно расширить 6-луночный планшет, как описано выше, чтобы получить достаточное количество клеток. Более длительное время трипсинизации (1 час) также рекомендуется для обеспечения одиночных клеток перед фильтрацией образцов на поток.
  2. Трансформация с помощью CRISPR-Cas9 на основе электропорации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения информации о концентрациях и приготовлении комплекса рибонуклеопротеинов (RNP) обратитесь к Руководству по гомологии-направленной репарации IDT (стр. 9-11)22. Однако для нокаутов не используйте HDR Enhancer V2, так как он рекомендуется только для редактирования генома, требующего гомологичной рекомбинации.
    1. Приготовьте одноклеточную суспензию, полученную из органоидов (шаг 3.2.7). Промойте PBS и измерьте концентрацию клеток. Перенесите клеточную суспензию, содержащую количество в пределах 10-4 порядков величины (1 × 10,4 до 9 × 10,4 клеток), в пробирку объемом 1,5 мл.
    2. Центрифугировать при 350 × г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 10 мкл буфера для редактирования генома. Если для электропорации требуется >1 × 104 ячейки, подготовьте достаточный объем для серийной электропорации, следя за тем, чтобы каждые 10 мкл содержали от 1 × 104 до 9 × 104 ячейки.
    3. С помощью системы электропорационных пипеток соберите 10 мкл клеточной суспензии, следя за тем, чтобы не было пузырьков. Электропорация при следующих условиях: напряжение 1200 В, длительность импульса 20 мс, всего 4 импульса. Поместите клетки в пробирку с холодной MOM.
    4. После того, как клетки будут электропорированы, центрифугируйте всю суспензию при 350 × г в течение 5 минут. Повторно суспендируйте гранулу в ледяных MOM и BMM (соотношение 1:4), подготовив достаточно для посева одного купола за раунд электропорации (1 купол на 1 104 ячейки).
    5. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 не менее чем на 30 минут, чтобы BMM затвердел. Добавьте 500 мкл MOM при температуре 37 °C, как показано ранее на шаге 3.1.2, и верните планшет в инкубатор.
  3. Выбор одиночных клонов
    1. Чтобы получить клон, происходящий из одной клетки, пассаживают клетки, как описано выше, но засеивают от 50 до 100 клеток на купол (4 × 10,от 3 до 8 × 103 клеток/мл в клеточную суспензию перед смешиванием с BMM).
    2. Меняйте MOM каждые 3 дня. Убедитесь, что органоиды растут правильно, и отметьте, какие из них хорошо отделены от других.
    3. Когда органоиды вырастут до заметных размеров (около 500 мкм), с помощью светового микроскопа можно выделить 4-5 крупных органоидов, которые достаточно отделены друг от друга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Они должны быть видны невооруженным глазом, но полезно отметить нижнюю часть пластины маркером с тонким наконечником, нарисовав круг вокруг области пластины, где находится органоид.
    4. С помощью пипетки объемом 20 мкл в стерильном колпаке осторожно вставьте наконечник в BMM и аспирируйте один органоид (аспирируйте объемом около 12,5 мкл). Поместите органоид в пробирку для сбора объемом 1,5 мл с 500 мкл MOM.
    5. Центрифугировать при 350 × г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 500 мкл фермента TrypLE Express. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут.
    6. Погасить реакцию диссоциации клеток 500 мкл 3% FBS в DMEM (2D-среда) и центрифугировать при 350 × г в течение 5 мин. Очень осторожно удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте в 12,5 мкл холодной МОМ, смешайте с 37,5 мкл ледяной ВММ и засейте всю суспензию в виде одного купола объемом 50 мкл в 24-луночный планшет, как описано выше.
    7. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 не менее чем на 30 минут, чтобы BMM затвердел. Добавьте 500 мкл MOM при температуре 37 °C, как показано ранее на шаге 3.1.2, и верните планшет в инкубатор.
    8. Меняйте среды каждые 3-4 дня и проходите, когда купол сливается.

5. Получение 2D клеточной линии из органоидов

  1. Культура переходных клеток
    1. Начните с одноклеточной суспензии, как при прохождении органоидов.
    2. Действуйте так же, как если бы вы засевали 6-луночный планшет (шаг 3.3), но вместо этого используйте предварительно охлажденный (4 °C в течение 24 часов). Поместите купола на 6-луночный планшет, храните при температуре 4 °C в течение ночи и дайте планшету отдохнуть в стерильном колпаке в течение 5-10 минут, прежде чем вводить его в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволит клеткам мягко опуститься в нижнюю часть пластины, чтобы приспособиться к условиям 2D-роста, сохраняя при этом доступ к компонентам ECM BMM.
    3. Инкубируйте планшет при 37 °C и 5%CO2 в течение 30 минут, затем добавьте 2 мл MOM при 37 °C. При необходимости смените носитель.
    4. Когда органоиды достигают слияния, проход описан в шагах 3.2.1-3.2.7. После окончательной промывки PBS лунки для удаления остатков BMM, добавьте в лунку 2 мл предварительно подогретого 2D материала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление BMM не удаляет ячейки, прикрепленные к скважине, и теперь они могут свободно проникать в остальную часть скважины, адаптируясь к 2D-условиям/средам.
    5. После того, как суспензия одиночных клеток была достигнута с клетками, оставшимися в ТКМ, засейте половину объема клеток, повторяя шаг 5.1.2. Добавьте вторую половину исходной лунки, позволив большему количеству клеток засечься, что ускорит слияние.
    6. Смените 2D-носитель через 24 часа, чтобы удалить неприкрепленные элементы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Должно быть много неприкрепленных клеток, так как клетки, выращенные в BMM, не привыкли к пластиковым подложкам и не будут легко прикрепляться.
    7. Повторите шаг 5.1.4. Затем ресуспендируйте весь объем клеток в 4 мл 2D среды и затравите по 2 мл в каждую из ранее использованных лунок. Меняйте 2D носители каждые 3-4 дня.
  2. 2D клеточная культура для экспансии
    1. Как только клетки достигнут примерно 80% конфлюенции, приступайте к первому пассации.
    2. Для прохождения аспирируйте среду, промойте один раз 1 мл PBS и добавьте 1 мл 0,25% трипсина. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в течение 5–10 минут.
      Примечание: Разные клеточные линии могут иметь разные адгезивные свойства, что делает продолжительность трипсинизации варьирующейся. Проверьте под микроскопом, не отделились ли клетки, прежде чем переходить к следующему этапу. Легкое постукивание рукой по планшету для клеточной культуры может помочь отделить клетки.
    3. После того, как все клетки отделятся, погасите диссоциацию с помощью DMEM + 10% FBS и центрифугируйте при 350 × г в течение 5 минут.
    4. Для первого расширения (когда 80-100% сливается) повторно засейте в соотношении 1:1. Повторяйте шаг 5.1.6 и меняйте 2D носители каждые 2-3 дня.
    5. При втором расширении (80-100% конфлюенции) засейте все клетки в 100-миллиметровую чашку, повторно суспендировав клетки в 10 мл 2D-среды при 37 °C. Повторяйте шаг 5.1.6 и меняйте носители каждые 2-3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс занимает много времени и может занять до целого месяца. При работе с клеточными линиями, которые имеют вирусно-интегрированные гены сверхэкспрессии белка, рекомендуется сохранять присутствие селекционных антибиотиков в питательных средах на протяжении всего процесса. Если маркером является флуоресцентный белок, как можно скорее проведите флуоресцентно-активируемую сортировку клеток (т.е. окончание 100-мм расширения чашки).
  3. Криоконсервация
    1. Для хранения этих ячеек проход описан в пунктах 5.2.1-5.2.3. Затем ресуспендируйте ~1 × 106 клеток в 1 мл 2D замораживающей среды, которая состоит из 80% 2D среды, 10% FBS и 10% ДМСО, и перенесите в криопробирку. Сохраните ячейки, следуя шагу 3.5.2.

6. Валидация органоидных линий

  1. Выделение генетического материала из органоидов
    1. Начиная с суспензии с одной клеткой, засейте два купола с удвоенной плотностью клеток (1 × 106 клеток/мл). Смените MOM на 3 день.
    2. На 5-й день удалите среду, промойте один раз PBS и добавьте 350 мкл предпочтительного буфера для лизиса непосредственно на купола. После 5 минут инкубации в ОТ-или до растворения BMM перенесите лизат в пробирку объемом 1,5 мл.
    3. При длительном использовании храните лизат при температуре -80 °C. В противном случае следует следовать протоколу экстракции ДНК и/или РНК с использованием предпочтительного метода экстракции или коммерческого набора.
  2. Иммунофлюоресцентное (ИФ) окрашивание
    1. Для подготовки клеток пассаж описан в пунктах 3.2.1-3.2.5. Ресуспендируйте в смеси 37,5 мкл MOM и 112,5 μL ледяного BMM (достаточно для трех куполов по 50 μL, которые будут действовать как биологические реплики). Выполните шаг 3.2.6 и смените носитель на 3-й и 5-й день.
    2. На 7-й день аспирируйте MOM и промойте клетки 500 μл PBS. Закрепите каждый купол отдельно, добавив 500 мкл предварительно нагретого (37 °C) 4% раствора параформальдегида (PFA) в PBS непосредственно на купол. Инкубировать при 37 °C в течение 60 минут до растворения BMM.
    3. С помощью наконечника для дозатора P1000 с широким отверстием (если его нет, просто отрежьте обычный наконечник P1000 примерно в 0,5 см от тонкого конца) соберите органоиды в 4% PFA и перенесите объем в пробирку объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование стандартного наконечника для пипетки приведет к поломке органоидов.
    4. Подождите от 2 до 3 минут, пока органоиды опустятся на дно пробирки. Аспирируйте 4% PFA (при этом оставьте безопасное количество объема, чтобы не аспирировать органоиды) и добавьте 500 μL PBS для промывания органоидов. Повторите этот шаг еще два раза, всего получится 3 стирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидание, пока органоиды опустятся на дно, предпочтительнее, чем центрифугирование, чтобы сохранить форму органоида.
    5. Для длительного хранения (4-6 недель) храните органоиды в PBS при температуре 4 °C. Чтобы приступить к окрашиванию, пермеабилизируйте PBS + 1% Triton-X в течение 30 минут на RT. Один раз вымойте PBS.
    6. Заблокируйте PBS + 0,2 % Triton-X + 4 % FBS + 1% сыворотку мыши на 60 мин в режиме RT. Один раз умыться PBS и оставить 100 мкл объема в пробирке.
    7. Подготовьте рабочий буфер для окрашивания антителами: PBS + 0,2% Triton-X, 0,4% FBS, 0,1% сыворотку крыс. Этот буфер будет работать как для первичных, так и для вторичных антител.
    8. Чтобы приготовить первичное окрашивание антителами, рассчитайте, что разведение будет в два раза концентрированнее, чем фактическое необходимое разведение. Приготовьте достаточное количество раствора, чтобы добавить 100 мкл антитела к 100 мкл PBS, оставшимся в каждой пробирке. Например, для исходного разведения 1:1000 приготовьте 100 мкл раствора 1:500.
    9. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C. После этого трижды промойте 500 μл PBS.
    10. Приготовьте окрашивание вторичного антитела, как описано в шаге 6.2.8. Инкубировать в течение 1 ч при РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, обязательно накрывайте рабочую зону алюминиевой фольгой / предпочтительным темным ящиком, чтобы избежать фотообесцвечивания флуоресцентных антител.
    11. После того, как вторичное окрашивание закончится, трижды промойте 500 мкл PBS. Удалите как можно больше жидкости из пробирки после последней промывки, чтобы подготовить образец к монтажу. Используйте пипетку объемом 20 мкл, чтобы избежать аспирации органоидов.
    12. С помощью широкоугольного или обрезанного наконечника для дозатора добавьте 20 μл монтажного фильтрующего материала по вашему выбору и хорошо гомогенизируйте раствор, избегая образования пузырьков.
    13. Поместите каплю органоидов в монтажном растворе на прямоугольный покровный лист. С помощью щипцов поместите круглую защитную салфетку поверх капли, избегая образования пузырей, и оставьте на ночь для высыхания в темноте при RT. Повторите этот шаг на том же предметном стекле, если необходимо разместить более одного образца на предметном стекле.
    14. Добавьте еще 20 мкл монтажного материала непосредственно на верхнюю часть круглого защитного стекла. Теперь создайте монтажный «бутерброд», перевернув прямоугольный покровный лист на 180° и поместив его поверх предметного стекла микроскопа. Оставьте сохнуть в темноте при RT не менее чем на 8 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предметное стекло должно быть расположено в следующем порядке снизу вверх: предметное стекло микроскопа, круговое защитное стекло, органоиды, прямоугольное предметное стекло. Это создает оптимальные условия для визуализации.

7. Разработка моделей опухолей у мышей

  1. Подготовка клеток
    1. Разморозьте один флакон с 2D-ячейками по выбору в 2D-среде. Позвольте этим клеткам расти и расширяться до 150-миллиметровой пластины. Если клетки имеют маркеры выбора антибиотиков, выберите клетки до инъекции, чтобы обеспечить чистую популяцию желаемых клеток.
    2. Для 5 инъекций мыши разверните клетки до двух 150-мм пластин. Когда планшеты на 80% сливаются, соберите клетки, выполнив следующие шаги 5.2.2-5.2.3. Ресуспензируйте клетки в 1 мл сыворотки Opti-MEM I Reduced и измерьте концентрацию клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая инъекция содержит 4 × 106 клеток; Тем не менее, рекомендуется подготовиться к дополнительной инъекции, чтобы учесть мертвый объем шприцев. В этом случае подготовьте 24 × 106 клеток вместо 20 × 106 клеток.
    3. Поместите весь объем клеток для всех инъекций в пробирку объемом 1,5 мл. Приготовьте в общей сложности 44 мкл на одну инъекцию, состоящую из 1 части ячеек в недополненном Opti-MEM I и 1 части ледяного BMM. Например, для 24 × 106 клеток (6 инъекций) ресуспендировать в 132 мкл Opti-MEM I и 132 мкл BMM.
    4. Тщательно перемешайте клетки и держите на льду до выполнения инъекции.
  2. Подготовка к процедуре
    1. Изгоняйте пузырьки воздуха из мертвого объема шприца (У-100 инсулин 28 Г) при холодном ПБС.
    2. Используя клетки в пробирке объемом 1,5 мл, приготовьте пять инъекций объемом 40 мкл, медленно загружая шприц, чтобы избежать лизирования клеток из-за сил сдвига внутри иглы. Держите на льду, пока мыши не получат успокоительное.
    3. Как только все будет подготовлено к инъекциям, поместите шприцы рядом с нагревательной лампой, чтобы BMM мог нагреться и стать вязким, облегчая инъекцию и приживление. Не размещайте их непосредственно под нагревательной лампой, так как перезастывший BMM не пройдет через шприц должным образом. В общем, работайте быстро, чтобы этого не произошло.
  3. Внутрибурсальная инъекция (ИМК) в яичник
    1. Обезболите мышь C57BL/6J с помощью кетамина (100 мг/мл). Вводите 0,1 мл на 10 г массы тела путем внутрибрюшинного введения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Молодым самкам мышей часто требуется всего 0,2 мл инъекций, но может потребоваться больше, если они старше. Это обеспечит анестезию в течение 20-40 минут, но не обеспечит обезболивания.
    2. Поместите мышь в клетку, которая была нагрета нагревательной лампой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не помещайте мышей непосредственно под нагревательную лампу, так как это может вызвать некроз хвоста и гипертермию, которая может привести к летальному исходу.
    3. После того, как первая мышь будет полностью обезболена, используя асептическую технику, сделайте разрез <1 см вдоль бока мыши C57BL/6J в области живота и над бедром. Обязательно пройдитесь через эпидермис и гиподерму, прежде чем добраться до области бурсы.
    4. Аккуратно вытяните завязь (легко найти по прикрепленной к ней жировой подушке). Возьмите один из подготовленных шприцев и медленно вводите клетки через жировую подушку сразу за яичником, через сам яичник, в мешок яйцевода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная инъекция приведет к тому, что баллон из мешка для яйцевода будет установлен с помощью BMM. Смесь, скорее всего, также будет протекать по всему жировому подушечке, что является нормальным явлением.
    5. Осторожно поместите яичник обратно в бурсу и закройте разрез с помощью хирургических скоб или с помощью швов.
    6. Поместите мышь обратно в клетку. Используйте нагревательную лампу, чтобы согреть мышей, пока они восстанавливаются после операции до полубессознательного состояния (>15 минут). На следующий день проверьте мышь, чтобы убедиться, что сепсис не произошел за одну ночь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема, обобщающая рабочий процесс создания и валидации рака яичников HGSOC, показана на рисунке 1. Этот процесс начинается с извлечения ткани фаллопиевой трубы у самки мыши дикого типа C57BL/6J (Рисунок 2A). Рекомендуется начать с большого куска ткани, чтобы обеспечить правильный сбор. Использование препарирующего микроскопа позволяет точно изолировать дистальный отдел фаллопиевой трубы при одновременном удалении окружающих ткан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на значительные успехи в исследованиях в области онкологии, HGSOC остается наиболее агрессивным типом гинекологических злокачественных новообразований и ведущей причиной смертности среди всех видов рака яичников23,24. По мере развития исследований в области гинекологической онкологии должны развиваться и модели, используемые в них. Действительно, многие исторические модельные клеточные линии рака яичников были признаны н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения под номером R01 (CA257507). Схемы фигур были созданы с помощью BioRender. Мы хотим поблагодарить доктора Бенджамина Нила за его поддержку на протяжении всего проекта, доктора Шуан Чжан за разработку оригинального протокола и доктора Киёми Араки за ее помощь в его оптимизации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсина, 0,1% ЭДТА в HBSS без кальция, магния и бикарбоната натрияКорнинг25053CI
A83-01Tocris Bioscience2939
Продвинутый DMEM/F12Gibco12-634-028
Возраст C57BL/6J (женщина)Лаборатория Джексона000664
Мини-набор для ДНК/РНК AllPrepQIAGEN80204Для экстракции ДНК/РНК
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3Интегрированные ДНК-технологии10008100
Антитела к Ki67Abcamab15580
Система AutoClipТонкие научные инструменты12020-00Для закрытия раны после IBI
Добавка B-27 (50 раз), без сывороткиGibco17-504-001
Бластицидин HCl (10 мг/мл) 50 мгInvivoGenANT-BL-05
Бычий сывороточный альбуминСигма ОлдричA9647
Buffer RLT PlusQIAGEN1053393Для лизирования клеток до экстракции ДНК/РНК
Решение для восстановления клетокКорнинг354253
Коллагеназа/гиалуронидазаТехнологии STEMCELL07912
CoraLite 594-Phalloidin (красный)ProteintechPF00003
Крышное стекло 15CIR-1Фишербранд12-545-83
Крышное стекло 24 мм и острое; 40 мм-1Фишербранд12-544-12
Добавка КТС (системы клеточной терапии) N-2GibcoA1370701
DAPIРош10236276001
Дезоксирибонуклеаза I (ДНКза I) из поджелудочной железы крупного рогатого скотаСигма ОлдричD5025
Обезжиренное молоко DifcoБектон Дикинсон232100
DispaseТехнологии STEMCELL07913
DMEM с L-глутамином, 4,5 г/л глюкозы и пируватом натрияКорнинг10013CV
Рекомбинантная ДНКаза I, без РНазыРош04716728001
Фосфатно-буферный раствор DulbeccoСигма ОлдричD8537
Dumont #5 - Керамические щипцыТонкие научные инструменты11252-50Для рассечения маточной трубы
Сыворотка плода для быкаКорнинг35-010-CVТермо-инактивация при 56 градусах; C на 60 минут.
Тонкие ножницы — ToughCutТонкие научные инструменты14058-09Для сбора маточных труб и разреза ИБИ
Селективный антибиотик на основе генетикина (сульфат G418) (50 мг/мл)Gibco10131027
Добавка GlutaMAX (100 раз)Gibco35-050-061
Козий антикроликовый антител IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией вторичного антитела, цианин3ИнвитрогенA10520
Щипцы ГрефеТонкие научные инструменты11053-10Для обработки тканей
Буфер HEPESКорнинг25060CI
Рекомбинантный белок R-Спондина 1 человекаPeproTech120-38
Инсулиновый шприц, U-100 0,5 мл 0,36 мм (28 г) x 12,7 мм (1/2")BDBD329461
Инсулин-трансферрин-селен (ITS -G) (100x)Gibco41-400-045
L-глутамин 200 мМ (100x)Gibco25-030-081
Матрица базальных мембран Matrigel GFRКорнинг356231BMM
Рекомбинантный белок EGF мышиPeproTech315-09
FGF-базовый рекомбинантный белок мышиPeproTech450-33
Рекомбинантный белок мышиного ноггинаPeproTech250-38
Рекомбинантный белок Wnt-3a мышиPeproTech315-20
Дополнение N2Gibco17502048
N-ацетилцистеин амидСигма ОлдричA0737
Neon NxT система электропорацииИнвитрогенNEON1SДля электропорации CRISPR-Cas9
Neon NxT Electroporation System 10-μ Комплект L с одноканальными лампамиИнвитрогенN1025Расходники для электропорации, включая буфер редактирования генома
НикотинамидСигма ОлдричN3376
Обычная мышиная сывороткаИнвитроген10410
Обычная крысиная сывороткаТехнологии STEMCELL13551
Редуцированная сывороточная среда Opti-MEM IGibco31985070
Поликлональное антитело PAX8Proteintech10336-1-AP
Пенициллин-стрептомицин (10 000 U/мл)Gibco15-140-122
ПуромицинСигма ОлдричP8833
Selectfrost 25 мм и острый; 75 мм и остро; 1,0 ммФишербранд12-550-003
Triton X-100Биореагенты FisherBP151
Фермент TrypLE Express (1 раз), без фенолового красногоGibco12-604-013
Пружинные ножницы Vannas — режущая кромка 4 ммТонкие научные инструменты15019-10Для рассечения маточной трубы
Y27632Технологии STEMCELL72304Ингибитор ро-киназы (ROCK );

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korch, C., et al. DNA profiling analysis of endometrial and ovarian cell lines reveals misidentification, redundancy and contamination. Gynecol. Oncol. 127 (1), 241-248 (2012).
  2. Domcke, S., Sinha, R., Levine, D. A., Sander, C., Schultz, N. Evaluating cell lines as tumour models by comparison of genomic profiles. Nat Commun. 4, 2126(2013).
  3. Anglesio, M. S., et al. Type-specific cell line models for type-specific ovarian cancer research. PLoS One. 8 (9), e72162(2013).
  4. Beaufort, C. M., et al. Ovarian cancer cell line panel (OCCP): Clinical importance of in vitro morphological subtypes. PLoS One. 9 (9), e103988(2014).
  5. Walton, J., et al. CRISPR/Cas9-mediated Trp53 and Brca2 knockout to generate improved murine models of ovarian high-grade serous carcinoma. Cancer Res. 76 (20), 6118-6129 (2016).
  6. Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nat. Commun. 8 (1), 1093(2017).
  7. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).
  8. Kim, J., Coffey, D. M., Creighton, C. J., Yu, Z., Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3921-3926 (2012).
  9. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. J Pathol. 233 (3), 228-237 (2014).
  10. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
  11. Vooijs, M., Berns, J. A. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2 (4), 293-297 (2001).
  12. Semprini, S., et al. Cryptic loxP sites in mammalian genomes: genome-wide distribution and relevance for the efficiency of BAC/PAC recombineering techniques. Nucleic Acids Res. 35 (5), 1402-1410 (2007).
  13. Loonstra, A., et al. Growth inhibition and DNA damage induced by Cre recombinase in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9209-9214 (2001).
  14. Zhang, S., et al. Genetically defined, syngeneic organoid platform for developing combination therapies for ovarian cancer. Cancer Discov. 11 (2), 362-383 (2021).
  15. Yver, S., et al. Genetically defined syngeneic mouse models of ovarian cancer as tools for the discovery of combination immunotherapy. Cancer Discov. 11 (2), 384-407 (2021).
  16. Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nat. Commun. 11 (1), 2660(2020).
  17. Maniati, E., et al. Mouse ovarian cancer models recapitulate the human tumor microenvironment and patient response to treatment. Cell Reports. 30 (2), 525-540.e7 (2020).
  18. Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protoc. 3 (1), 101164(2022).
  19. Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32, 51-60 (2018).
  20. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2, 94(2022).
  21. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. J Exp Med. 145 (1), 204-220 (1977).
  22. Homology-directed repair using the Alt-R CRISPR-Cas9 System and HDR Donor Oligos. , Integrated DNA Technologies (IDT). https://idtsfprod.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/protocol/homology-directed-repair-using-the-alt-r-crispr-cas9-system-and-hdr-donor-oligos.pdf?sfvrsn=47121607_6 (2022).
  23. Santoro, A., et al. The multiple facets of ovarian high grade serous carcinoma: A review on morphological, immunohistochemical and molecular features. Crit Rev Oncol Hematol. 208, 104603(2025).
  24. Lisio, M. -A., Fu, L., Goyeneche, A., Gao, Z., Telleria, C. High-grade serous ovarian cancer: Basic sciences, clinical and therapeutic standpoints. Int J Mol Sci. 20 (4), 952(2019).
  25. Silva-Pedrosa, R., Salgado, A. J., Ferreira, P. E. Revolutionizing disease modeling: The emergence of organoids in cellular systems. Cells. 12 (6), 930(2023).
  26. Claassen, D. A., Desler, M. M., Rizzino, A. ROCK inhibition enhances the recovery and growth of cryopreserved human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells. Mol Reprod Dev. 76 (8), 722-732 (2009).
  27. Leibowitz, M., et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Genet. 53 (6), 895-905 (2021).
  28. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  29. Kossaï, M., Leary, A., Scoazec, J. -Y., Genestie, C. Ovarian cancer: A heterogeneous disease. Pathobiology. 85 (1-2), 41-49 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPR Cas9

Похожие статьи